resistiendo el estrés oxidativo: la travesía de trypanosoma cruzi a la infección

Resistiendo el estrés oxidativo:

La travesía de Trypanosoma cruzi

a la infección

Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi

Tomado de “The Trypanosoma cruzi Proteome” Atwood III et al; Science Vol 309; 2005

Respuesta inmune innata

2- Sistema del complemento

Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

1- Respuesta celular

Activación de macrófagos residentes,

células de Langerhans y NK

Producción de interleuquinas proinflamatorias

Rol central de los macrófagos en el control de la infección

Fagocitosis como primera línea de defensacontra la infección por T. cruzi

Villalta et al, 1984

8 min

Interacciones Macrófagos - T cruzi

Rápida activación de la NADPH oxidasa durante la fagocitosis

2 O2 + NADPH 2 O2

• – + NADP+ + H+

Alvarez, MN et al, 2007

Actvadores: IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6,

productos derivados de patógenos

(virales, bacterianos y de protozoarios)

Inhibidores: IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β

Interacción con células apoptóticas

Óxido Nítrico Sintasa

● NO Óxido Nítrico

NO2¯ Nitrito

Dióxido de Nitrógeno

● NO2

NO3¯

Nitrato

RNH2 L-Arginina

- 1e-

- 1e-

- 1e-

i NOS

Especies Reactivas del Nitrógeno

Peroxidasa/H2O2 (MPO)

- 5e-

Superóxido(anion radical)

+

Peróxido de

Hidrógeno

OH● Radical Hidroxilo

H2O2

2 H2O

O2

Especies Reactivasdel Oxígeno

NADPHoxidasa

OH¯

SOD

+ 1e-

+ 1e-

+ 1e-

+ 1e-

O2●

_

peroxinitrito

●NO2 + CO3●¯

ONOO

ONOOH

●NO2 + OH●

H+ CO2

ONOOCO2¯

-

●NO2 + CO3●¯

Oxidantes intrafagosomales

Macrófago no estimulado

2 hrs de infección

Oxidantes intrafagosomales

Macrófago estimulado con IFN-ϒ

2 hrs de infección

0

20

40

60

80

100

Infe

cció

n (

%)

Apocinina

O2

●-

*

+●NO

Amastigotas intracelulares

O2

●-

Citotoxicidad de macrófagos contra Tripomastigotas rol del ONOO- en el control parasitario

Defensas Antioxidantes en T. cruzi

NADPH

NADP +

TRox

TRred

T(SH)2

TS2

TXNox

TXNred

TcCPXRed

TcCPXOx

ONOOH

NO2-

Las peroxiredoxinas de Trypanosoma cruzi tienen actividad peroxinitrito-oxidoreductasa in vitro

TR = tripanotiona reductasa

T(SH)2= tripanotiona

TXN = triparedoxina

TcCPX= triparedoxina peroxidasa citosólica

10 6 M-1s-1

(10 3 M-1s-1) (10 3 M-1s-1)

Trujillo et al, 2004

Células Control Células Control + ONOO- TcCPX + ONOO-

Resistencia de TcCPX a la citotoxicidad

mediada por ONOO-

Resistencia de cepa TcCPX

0

20

40

60

80

100

120

Infe

cció

n

(%)

Tc CPXsalvaje

O2●- ONOO-

O2●-

*

ONOO-

Infección en macrófagos

In vitro

Infección en ratones

In vivo

Días post-infección

Trip

om

ast

igo

tas

en

50

ca

mp

os

Evaluación in vivo

TCC CL-WT

Caracterización de las cepas

Contenido de Enzimas Antioxidantes

Anticuerpos específicos

TcCPX TcMPX TcTS TcCPX TcMPX TcTS

Con

teni

do r

ela

tivo

de e

nzim

a

Epimastigotas de 3 días

Tripomastigotas Metacíclicos

Tripomastigotas en 100 campos Tripomastigotas en 100 campos

Co

nte

nid

o r

ela

tivo

de

en

zim

a

(trip

om

ast

igo

ta m

eta

cícl

ico

)

Enzimas antioxidantes: factores de virulencia

Respuesta inmune innata

2- Sistema del complemento

Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

1- Respuesta celular

Activación de macrófagos residentes,

células de Langerhans y NK

Producción de interleuquinas proinflamatorias

Muerte Celular Programada en T. cruzi

Activación del complemento

sobre la superficie del parásito,

Influjo de Ca2+ y disfunción

mitocondrial

Irigoín, F et al., 2009

Tinción de núcleos apoptóticos

Estímulo de muerte: suero humano fresco (SHF)

CTL SHI SHF Control SHF

Exposición de fosfatidil-serina

Fragmentación ADN

Ctl

SHF

O2- como mediador de la MCP

Smith and Murphy, 2003

HEMito-Hidroetidio

(Mitosox)Detección de O2

- mitocondrial en T. cruzi

Dimetoxi naftoquinona (DMNQ)

O2- mitocondrial como mediador de la MCP

Exposición a suero humano fresco

MitoSOX oxidado Tinción nuclear

Protección de la MCP por Fe-SOD

Control TcSODA

SHI SHF SHF SHIbp

Sobreexpresión de la Fe-SODA

2 O2• – + 2H+ O2 + H2O2

k = 109 M-1 s-1

Macrófagos peritoneales

Souza EM et al., 2003 Cell and Tissue Research.

Infección in vivoCorazón(14 dpi)

Infección in vitroCardiomiocitos

Parásitos apoptóticos en el huesped vertebrado

Activación Clásica

Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363

Activación Alterna

Activación Clásica

Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363

Determinantes de la eficiencia de la infecciónpor Trypanosoma cruzi

Establecimiento temprano de una respuesta proinflamatoria con

inducción de la iNOS en macrófagos

Niveles de enzimas antioxidantes en los tripomastigotas metacíclicos

Presencia de parásitos apoptóticos en el inóculo infectivo

PERSPECTIVAS

Búsqueda de inhibidores específicos que interfieran

con la red antioxidante de Trypanosoma cruzi en vistas

a un tratamiento coadyuvante

Evaluación de la MCP en nidos de amastigotas

dilucidando las señales que llevan a la inducción

del proceso de muerte

Howard Hughes Medical Institute PEDECIBA (Uruguay)CONICYT (Uruguay)

PDT (Uruguay)

Departamento de Bioquímica

María Noel Alvarez Gonzalo Peluffo Florencia IrigoínMadia TrujilloCarlos RobelloRafael Radi

Colaboración Internacional

Shane WilkinsonMartin Taylor

John Kelly

Paola ZagoMiguel Basombrio