recuento de coliformes totales y termotolerantes e coli
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“Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann”FACULTAD DE CIENCIAS- ESBI
PRÁCTICA DE LABORATORIO:
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES, TERMOTOLERANTES: Técnica del número más probable (NMP) y aislamiento de E.coli
INTEGRANTES:-Tania Arias Ch. -Germán Mamani
COLIFORMES
Son bacilos Gram negativos no
esporulados, forma bacilar.
Aerobias o anaerobias facultativas.
Fermentan la lactosa con producción de Ácido y gas a 30-37ºC en 48 horas
Capacidad para crecer en presencia
de sales biliares.
Se encuentra en:
Intestino del hombre, animales, y en
otros ambientes como:
Suelo, plantas, cáscaras de huevo,
etc.
COLIFORMES
Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:
Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso: Mesófilos aerobios (o cuenta total) , cuenta de
hongos y levaduras y cuenta de coliformes totales.
Indicadores de contaminación fecha o bacterias entéricas: Coliformes fecales, E. coli y enterococos.
COLIFORMES
La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de:
Los riesgos implicados
Lo que se requiera saber para: liberar, controlar o mejorar el alimento,
manteniendo el enfoque preventivo.
COLIFORMES
E. coli, es un microorganismo indicador pues:
Ser detectables y estar presentes. Su crecimiento y número debe ser
correlativamente negativa a la calidad. Contados y diferenciados de otros
microorganismos. Contables en poco tiempo. Su crecimiento no debe ser alterado por
otro componente de la flora.
COLIFORMES
Se consideran excelentes indicadores de la eficiencia de los procesos de sanitización y desinfección, así como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos procesados.
Su determinación se basa generalmente en la capacidad de fermentar lactosa
COLIFORMES
Los coliformes fecales o Termotolerantes,
fermentan la lactosa entre 43,.5 – 45,5ºC, y la
facultad de producir Indol en agua peptonada
(Pascual,1922).
COLIFORMES
Los coliformes totales, fermentan la lactosa a 35 +-1ºC generalmente:
Escherichia Enterobacter
Citrobacter Klebsiella.
COLIFORMES
Existen 3 fases o etapas:
Prueba presuntiva.
Prueba confirmatoria.
Prueba concluyente.
Análisis de Coliformes en Agua y Alimentos
Fuente: Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos – Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.
TABLA 1: Métodos de análisis de coliformes
Pruebas presuntivas, confirmativas y concluyentes en el análisis de coliformes de alimentos
Fuente: Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos – Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.
Procedimiento según la FDA:MUESTRA + Tampón fosfato Butterfield
Homogenizar la muestra con
solución diluyente
10 -1 10 -2 10 -3
INCUBAR
1. Prueba presuntiva de
coliformes
Consultar tabla NMP para 3 diluciones
2. Prueba confirmativa de coliformes totales
4. Prueba completa para
E.coli
3. Prueba confirmativa de
coliformes tolerantes
FUENTE: FDA
MÉTODO NORTEAMERICANO MÉTODO BRITÁNICO MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE
BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES
MÉTODO NORTEAMERICANO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)
1ml 1ml10 -1
10 -210 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
LST
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA + 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
Prueba presuntiva:
+ + + ++ +---
Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
10 ml Caldo Brilla
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 –
48 h.
+ + - - - -
2 0 0
caldo LST
Fuente: ICMS. Segunda Edición. Editorial Acribia.
MÉTODO BRITÁNICO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10 mL
Caldo Mac Conkey
(Púrpura de Bromocresol) INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA +
225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Caldo Mac Conkey
(Púrpura de Bromocresol)
+ + + ++ +---
3 12
MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
Brilla
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA
+ 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
Prueba presuntiva:
+ - - -+ +---
Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
caldo brilla
INCUBAR:Con VRBA (Agar bilis lactosa rojo neutro cristal violeta): 24 horas/ 35 – 37ºC
Con Agar ENDO: 48 horas/ 35 – 37ºC
Siembra en superficie de tubos positivos
MÉTODO NORTEAMERICANO MÉTODO BRITÁNICO MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE
BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
RECUENTO DE COLIFORMES
TERMOTOLERANTES
MÉTODO NORTEAMERICANO
RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
LST
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA
+ 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
Prueba presuntiva:
+ + + ++ +---
Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
10 ml Caldo Brilla
INCUBAR: 44,5 +- 0,2 °C por 24 – 48 h.
+ + - - - -
2 0 0
caldo LST
Tomar asadas
MÉTODO BRITÁNICO
RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10 mL
Caldo Mac Conkey
(Púrpura de Bromocresol) INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA
+ 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
+ + + ++ +---
+ + + ++ +---
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
10 ml Caldo Brilla
INCUBAR: 44°C +- 0,1 °C por 24 – 48 h.
+ + + + + +
23 1
caldo LST
Tomar asadas de los tubos
positivos
Tomar asadas de los tubos positivos
Prueba Indol44 ºC
Producción de gas e Indol positivo+ + + + + +
Coliformes termotolerantes
PRUEBAS IMViC PARA
IDENTIFICACION DE COLIFORMES
Fuente: ICMS. Segunda Edición. Editorial Acribia.
Pruebas de identificación de organismos coliformes: IMViC
Gas en caldo lactosado
biliado a 44-45.5° C
Prueba de indol
Prueba rojo de metilo
Prueba de Vogues
Proskauer
Crecimiento en citrato
E. ColiTipo ITipo II
+-
+-
++
--
--
IntermediosTipo ITipo II
--
-+
++
-b-b
++
Enterobacter aerogenes
Tipo ITipo II
--
-+
--
++
++
Enterobacter cloacae
- - - + +
IrregularesTipo ITipo IITipo IV
-++
+--
++-
--+
--+
Fuente: ICMS
NMP PARA AGUA POTABLE25 gr
MUESTRA +
225ml AP
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
10 ml
1 ml 0,1 ml
Serie de diluciones con 9ml de diluyente
10 -2
10 -3
10 -4
NMP PARA AGUA DE MAR25 gr
MUESTRA +
225ml AP
Pre incubación: 35 -37 ºC por 3 horasIncubación a Baño María: 44,5°C x 21 a 23 horas
10 ml
1 ml 0,1 ml
Serie de diluciones con 9ml de diluyente
10 -2
10 -3
10 -4
CALDO: AL
FUENTE: MINISTERIO DE SALUD
Pruebas de identificación de organismos coliformes: IMViC
Indol (+)Rojo de
metilo (+)
Voges Proskauer
(-)
Citrato (-)
INVESTIGACIÓN DE E. coli
FUENTE: NORMA ISO
Uso de las Petrifilm:
Estas placas contienen un medio selectivo para E.coli coloreándose las colonias de azul violeta si esta esta presente, sin necesidad de realizas pruebas de identificación.
VENTAJAS: Evita errores humanos Ayudan a los procesadores de alimentos a muestrear
fácilmente, una detección rápida del microorganismo
MÉTODOS ALTERNATIVOS:
PETRIFILM
E.coli en MUG en presencia de luz UV
EN NUESTRO
LABORATORIO…
UTILIZAREMOS EL MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
MATERIALES
MUESTR
A
•Refresco presuntamente contaminado
DILUYENTE
•Agua peptonada
MEDIO
•Caldo lactosa 2% bilis verde brillante (brilla)
PROCEDIMIENTO (ICMSF)
1ml 1ml10 -1
10 -2 10
-3 C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
Brilla
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
VACIAR LA MUESTRA AL
BEAKER
25 ml
AP
Agregar 1ml a cada tubo
1ra Lectura
VERIFICAR SI HUBIERA GAS Y TURBIDEZ
caldo brilla
+ + - -+ ----
INCUBAR:Con Agar ENDO: 48 horas a 35 – 37ºC
Sembrar en superficie tubos
positivos
Inocular con un asa los tubos positivos
INCUBAR:24 horas a 44ºC a baño maría
Realizar las pruebas de identificación: IMViC
Luego de analizar la muestra de refresco, se obtuvo una cepa sospechosa para E. coli, y luego de las pruebas bioquímicas IMViC:
RESULTADOS
Resultados
Prueba del INDOL
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol.Al añadir dos gotas del reactivo. Esperar 10 minutos para observar el color del halo formado.
Halo rojo: reacción +
ResultadosPrueba del ROJO
DE METILO
Esta prueba se fundamenta en el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan de la fermentación de la glucosaLa fermentación n ácido-mixta
Reactivo prueba de RM: solución indicadora Rojo de Metilo
Halo rojo: reacción (+)
ResultadosPrueba de VOGUES
PROSKAUER
Voges-Proskauer buscavía de fermentación del butanodiolGlucosa acetil-metil-carbinol butanodiolReactivo prueba de VP: Solución de naftol e K(OH)
Color marrón: reacción (–)
ResultadosPrueba del
CITRATO SODICO
Determinación sobre la capacidad de un organismo de utilizar citrato como única fuente de carbono y energía. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, liberarán iones amonio lo cual basificará el medio. Sin crecimiento y color verde: reacción –
- Tener todo listo antes de iniciar la práctica - No demorar al momento de realizar las
diluciones - Homogenizar bien las diluciones - Marcar las pipetas que se usan para cada
dilución
Sugerencias:
I.C.M.S.F. 2000. Los Microorganismos de los Alimentos. Vol. I: Su significado y métodos de enumeración. 2a edición. Editorial Acribia, S.A. - Zaragoza (España).
Food and Drug Administration. 2001. Bacteriological Analytical Manual. 8th Edition. USA.
Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.
Bibliografía:
GRACIAS !!
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