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Propiedades implicadas en la alergenicidad de

proteínas alimentarias. Efecto del procesado.

F. Javier Moreno(j.moreno@ifi.csic.es)

Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC)

Vitoria, 13 de diciembre de 2007

Esquema de la presentacióni. Alimentos con un mayor índice de alergenicidad.

ii. Principales alérgenos de origen animal y vegetal.

iii. Propiedades implicadas en la alergenicidad de proteínas alimentarias.

iv. Empleo del procesado de alimentos en la reducción de la alergenicidad.

v. Líneas de evolución.

¿Qué alimentos están implicados?� Alrededor de 200 alimentos descritos causantes

de reacciones alérgicas [Hefle y col., Critical Reviews in Food Science and Nutrition 36, S69, 1996].

90%"TopEight"

10%Resto

Cacahuetes

Frutos secos

Mariscos

Pescados

Huevos

Leche y derivados

Soja y derivados

Trigo y cereales

Incidencia de episodios alérgicos� Niños ~6%; Adultos 3-4% [Sampson, Journal of Allergy

and Clinical Immunology 113, 805, 2004]

Incidencia de alergias alimentarias en Estados Unidos.

Alimento Niños Adultos

Leche 2.5% 0.3%

Huevos 1.3% 0.2%

Cacahuetes 0.8% 0.6%

Frutos secos 0.2% 0.5%

Pescado 0.1% 0.4%

Marisco 0.1% 2.0%

Total 6% 3.7%

Incidencia de episodios alérgicos� Dificultad de determinar el nivel exacto de

incidencia debido al uso de diversas metodologías.

� Proyecto europeo www.europrevall.org

� Grado de incidencia de 12.000 recién nacidos en 12 paises de la UE

Mills y col., Allergy 62, 717, 2007

Esquema de la presentacióni. Alimentos con un mayor índice de alergenicidad.

ii. Principales alérgenos de origen animal y vegetal.

iii. Propiedades implicadas en la alergenicidad de proteínas alimentarias.

iv. Empleo del procesado de alimentos en la reducción de la alergenicidad.

v. Líneas de evolución.

Principales alérgenos de origen animal

� Presentes únicamente en 11 de las 9318 familias de proteínas recogidas en la base de datos Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/).[Finn y col., Nucleic Acids Research 34, D247, 2006]

Serpinas (ovoalbúmina)

HuevoInhibidores de serina-

proteasas (Kazal) (ovomucoide)

Glicosil hidrolasas 22 (α-lactoalbúmina)

Caseinas Leche

Lipocalinas (β-lactoglobulina)

PescadoParvalbúminas

Moluscos y crustáceosTropomiosinas

AlimentoFamilia

Principales alérgenos de origen animal

Principales alérgenos de origen vegetal

� Presentes únicamente en 31 de las 9318 familias de proteínas recogidas en la base de datos Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/).[Finn y col., Nucleic Acids Research 34, D247, 2006]

Principales alérgenos de origen vegetal

65% de los alérgenos de origen vegetal

Jenkins y col., Journal of Allergy and Clinical Immunology 115, 163, 2005

Principales alérgenos de origen vegetal

Frutos secos, soja, etc.

Cupinas (Vicilinas, Leguminas, Germinas)

FrutasProfilinas

Frutos secos, frutasHomólogos de Bet v 1

Frutos secos, semillas de aceites,

frutas, etc…

Prolaminas (2S albúminas; Proteínas de transferencia de

lípidos; Inhibidores de tripsina y α-amilasa; Proteínas de reserva

de cereales)

AlimentoFamilia

Esquema de la presentacióni. Alimentos con un mayor índice de alergenicidad.

ii. Principales alérgenos de origen animal y vegetal.

iii. Propiedades implicadas en la alergenicidad de proteínas alimentarias.

iv. Empleo del procesado de alimentos en la reducción de la alergenicidad.

v. Líneas de evolución.

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Abundancia de la proteína en el alimento.

� Estables al procesado de alimentos.

� Resistentes a las condiciones del tracto gastrointestinal (pH ácido, proteasas, acción de surfactantes).

� Tamaño y estructura de la proteína.

� Capacidad de alcanzar y estimular el sistema inmunológico para producir una reacción alérgica.

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Abundancia de la proteína en el alimento

� Todos los alérgenos principales de alimentos indispensables en la dieta humana (leche, huevo, patatas…) representan entre el 20-60% del contenido proteico total.

� Ovoalbúmina: Mayoritaria en la clara de huevo (54% fracción proteica total).

� Patatina: 40% de la fracción proteica soluble en agua en patatas.

� Excepciones: 1.- Alérgenos principales sin presentar gran abundancia: parvalbúmina en pescado.

2.- Proteínas abundantes que no son alérgenos: Rubisco (plantas); actina/miosina (carne) etc…

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Estabilidad al procesado de alimentos

� Gran parte de alimentos se ingieren cocinados y no crudos.

� Mayoría de alérgenos alimentarios estructuralmente estables al efecto del procesado convencional.

� Excepciones: 1.- Alérgenos lábiles al procesado como los presentes en frutas y verduras.

2.- Proteínas muy estables al procesado que no son alérgenos (inhibidores de proteasas en leguminosas)

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Resistentes a las condiciones del tracto gastrointestinal

� Mayoría de alérgenos alimentarios sensibilizan a través del tractogastrointestinal y son estables a pH extremos (ácidos) y proteolisis.

� Resistencia a la digestión con pepsina es un parámetro relevante para evaluar la alergenicidad de proteínas.

1. Alérgenos estables a la digestión con pepsina.

2. Alérgenos digeridos rápidamente con pepsina pero con fragmentos estables.

3. Alérgenos lábiles a la digestión con pepsina. [“Alérgenos incompletos”].

Ejemplos prácticos:

� No todas las proteínas estables a digestión son alérgenos.� No todos los alérgenos son (aparentemente) estables a la digestión.

Sin embargo:

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Resistentes a las condiciones del tracto gastrointestinal

7S globulina (soja)

2S albúmina (mostaza)

2S albúmina (cacahuete)

ββββ-lactoglobulina (leche)

Astwood y col., Nature Biotechnology 14, 1269, 1996

1.- Alérgenos estables a digestión con pepsina

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Resistentes a las condiciones del tracto gastrointestinal

2.- Alérgenos rápidamente digeridos con pepsina pero con fragmentos estables

Seroalbúmina (leche) αααα-lactoalbúmina (leche)

Thomas y col., Regulatory Toxicologyand Pharmacology 39, 87, 2004

Moreno y col., Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 9810, 2005

� Fragmentos generados durante la digestión gastrointestinal podrían tener capacidad de unión a IgE.

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Resistentes a las condiciones del tracto gastrointestinal

3.- Alérgenos lábiles a pepsina: “Alérgenos incompletos”

� “Alérgenos completos”.Capacidad de sensibilizar a través del aparato digestivo y de provocar la reacción alérgica.

� “Alérgenos incompletos”.Capacidad de provocar la reacción alérgica pero no de sensibilizar a través del aparato digestivo. Síntomas en pacientes sensibilizados previamente

por vía respiratoria, cutánea, etc.

Lábiles a enzimas proteolíticas

Aalberse, Environmental Toxicology and Pharmacology 4, 55, 1997

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Resistentes a las condiciones del tracto gastrointestinal3.- Alérgenos lábiles a pepsina: “Alérgenos incompletos”

Moreno, Biomedicine & Pharmacotherapy 61, 50, 2007

� Reactividad cruzada con otros alérgenos no alimentarios. Responsables del “síndrome de la alergia oral” [síntomas zona bucofaríngea].

� Alergia Látex-Frutas: plátano, piña, kiwi, patatas, aguacate.

� Alergia Polen-Vegetales: manzana, pera, zanahoria, apio, melocotón

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Resistentes a las condiciones del tracto gastrointestinal

� Necesidad desarrollo test de digestión in vitro que consideren factores fisiológicos:

1.- Relación adecuada enzima : alérgeno.2.- Evaluación del efecto matriz del alimento.3.- Adición de surfactantes (fosfolípidos).4.- Digestión con otras enzimas proteolíticas intestinales.5.- Combinar con inmunoensayos para elucidar la inmunorreactividad de los fragmentos de considerable peso molecular originados tras la digestión gastrointestinal.

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos?

� Tamaño y estructura de la proteína

� Carácter multivalente de alérgenos. Multiplicidad de epítopos: un alérgeno debe contener como mínimo dos epítopos, cada uno con al menos 15 aminoácidos, para hacer posible la interacción antígeno (alérgeno) – anticuerpo. [Huby y col., Toxicological Sciences

55, 235, 2000].

� Peso molecular mayoría alérgenos entre 10-70 kDa.

� No existe ningún plegamiento estructural determinado que estéasociado per se a la alergenicidad de proteínas.

Proteínas alimentarias: ¿Qué las convierte en alérgenos? � Tamaño y estructura de la proteína

Aalberse, Journal of Allergy and Clinical Immunology 106, 228, 2000

Esquema de la presentacióni. Alimentos con un mayor índice de alergenicidad.

ii. Principales alérgenos de origen animal y vegetal.

iii. Propiedades implicadas en la alergenicidad de proteínas alimentarias.

iv. Empleo del procesado de alimentos en la reducción de la alergenicidad.

v. Líneas de evolución.

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

� Durante el procesado:

1.- Cambios físicos (temperatura, presión etc.).

2.- Cambios químicos-bioquímicos (pH extremos, enzimas).

3.- Fermentación.

� ¿Cómo afectan estos procesos a las proteínas (alérgenos)?:1.- Desnaturalización (desplegamiento) y posterior agregación.

2.- Interacción con otros ingredientes (adsorción a lípidos).

3.- Modificaciones covalentes (glicación, prod. oxidación lípidos).

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

� El procesado de alimentos puede modificar:1.- El poder de sensibilización del alérgeno debido a la alteración:

- de su digestibilidad en el tracto gastrointestinal.

- de su presentación al sistema inmunológico.

2.- La capacidad de desencadenar la reacción alérgica del alérgeno debido a la alteración:

- de la estructura de sus epítopos IgE [destruir epítopos existentes, modificar o generar nuevos (“formación de neoalérgenos”)] .

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

� Reducción de la alergenicidad a través del procesado

1.- Eliminación física del alérgeno.

2.- Hidrólisis enzimática.

3.- Tratamientos térmicos.

4.- Tratamientos alternativos (modificación genética).

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

1.- Eliminación física del alérgeno.

Brenna y col., Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, 493, 2000

Reducción de la alergenicidad del zumo de melocotón (Pru p 3).

SDS-PAGE INMUNOBLOTTING

Néctares de melocotón comerciales

Tratamiento térmico 121ºC 10 y 30 min

Pelado (químico)

SDS-PAGE INMUNOBLOTTING

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

2.- Hidrólisis enzimática.Reducción de la alergenicidad de las semillas de soja

INMUNOBLOTTING

Gly m

Bd 30k

M=Estándar Pm

C= Control (no proteasa)

1= Newlasa F

2= Proteasa M

3= Proteasa A

4= Proteasa N

5= Proteasa P

6= Proteasa S

7= Pancreatina

8= Proleather

Yamanishi y col., Journal of Nutritional Science Vitaminology 42, 581, 1996

Mayor grado hidrólisis

SDS-PAGE

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

3.- Tratamientos térmicos.Alérgeno del cacahuete 7S globulina (Ara h 1)

Maleki y col., Journal ofImmunology 164, 5844, 2000

FORMACIÓN DE TRIMEROS

EPÍTOPOS CERCA DE LA ZONA DE CONTACTO

MONÓMERO-MONÓMERO

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

3.- Tratamientos térmicos.Alérgeno del cacahuete 7S globulina (Ara h 1)

INMUNOBLOTTING

B=Hervido (Agua 100ºC / 20min)

R=Tostado (170ºC / 20min)

Beyer y col., Journal ofAllergy andClinicalImmunology107, 1077, 2001

� Incidencia alergia a cacahuetes 0.6-1% USA y UE. (Sicherer y col., 2003, J Allergy Clin Immunol 112, 1203).

� Indices muy bajos de episodios alérgicos en China.

� Consumo muy elevado en ambos paises.

� USA: tostados.� China: Hervidos.

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

4.- Tratamientos alternativos (modificación genética).Soja transgénica (alérgeno Gly m Bd 30k)

ControlLínea transgénica

silenciada Gly m Bd 30k

Herman y col., PlantPhysiology 132, 36, 2003

Efecto del procesado sobre la alergenicidad

4.- Tratamientos alternativos (modificación genética).Tomates transgénicos (alérgeno LTP)

Le y col., Plant Biotechnology Journal 4, 231, 2006

Esquema de la presentacióni. Alimentos con un mayor índice de alergenicidad.

ii. Principales alérgenos de origen animal y vegetal.

iii. Propiedades implicadas en la alergenicidad de proteínas alimentarias.

iv. Empleo del procesado de alimentos en la reducción de la alergenicidad.

v. Líneas de evolución.

¿Qué nos depara el futuro?�� AlAléérgenos alimentariosrgenos alimentarios: Pueden provocar una respuesta inmune

en individuos sensibilizados a dosis muy bajas.

Individuo Alérgeno Matriz alimento

Dosis necesaria: Muy variable [incluso cantidades traza]

Alimentos hipoalergénicos: Eliminación completa del alérgeno

¿Qué nos depara el futuro?

Eliminación completa del alérgeno del alimento

Disminución contenido alérgeno materia prima

Selección variedades contenido naturalmente bajo

Desarrollo estrategias de cultivo reduzcan niveles alérgeno

¿Qué nos depara el futuro?Eliminación completa del alérgeno del alimento

Ausencia de datos estructurales de alérgenos y epítopos

Obtención de información a nivel estructural y bioquímico de alérgenos alimentarios

Predicción de alergenicidad

Genómica / Proteómica

PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN

¿Qué nos depara el futuro?

Eliminación completa del alérgeno del alimento

Desarrollo de inmunoensayos eficaces para la detección de alérgenos

Mejor correlación métodos in vitro y manifestación de síntomas (in vivo)

DETECCIÓN

Muchas gracias

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