procedimiento de ensayo para determinar el Índice de
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LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA DETERMINAR EL ÍNDICE DE ENCALADO EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 06
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PROCEDIMIENTO DE ENSAYO PARA
DETERMINAR EL ÍNDICE DE ENCALADO EN
SUELOS
NTC-ISO-IEC 17025/2005
Requisitos generales de competencia de laboratorios de ensayo y calibración
Vigencia: Ruta de acceso:
Elabora: ___________________
Revisa: ____________________
Aprueba: _____________________
Fecha: ___________________
Fecha: _____________________
Fecha: _____________________
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA DETERMINAR EL ÍNDICE DE ENCALADO EN SUELOS
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1. OBJETO 3
2. ALCANCE 3
3. DEFINICIONES 3
3.1 ABREVIATURAS EMPLEADAS 3
4. CONTENIDO 4
4.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO 4
4.2 PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA 4
4.3 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 4
4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES 5
5. PROCEDIMINETO 7
5.1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS 7
5.2 REGISTRO DE DATOS 8
5.3 CÁLCULOS Y RESULTADOS 8
5.4 REPORTE DE RESULTADOS 10
6. RESPONSABLES 10
7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA 10
ANEXOS 11
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PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA DETERMINAR EL ÍNDICE DE ENCALADO EN SUELOS
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1. OBJETO
Establecer el procedimiento para la determinación del índice de encalado en
suelos, en el Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la
Universidad Tecnológica de Pereira.
2. ALCANCE
Esta metodología analítica se aplica a todas las muestras de suelo sometidas a la
determinación del índice de encalado, en el Laboratorio de Análisis Químico de
Suelos y Foliares de la Universidad Tecnológica de Pereira.
3. DEFINICIONES
Encalado de suelos: Es la operación por la cual se aplica al suelo compuestos de
calcio o calcio y magnesio que son capaces de reducir la acidez al neutralizar los
iones Al+3 y H+ que se producen en suelos ácidos, incrementando de esta manera
el pH.
3.1. ABREVIATURAS EMPLEADAS
CaCO3: carbonato de calcio
Ca(OH)2: hidróxido de calcio
mL: mililitros
g: gramos
N: normalidad
ppm: partes por millón
ha: hectárea
da: densidad aparente
A.A.: absorción atómica
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4. CONTENIDO
4.1. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Los mecanismos de reacción de los materiales encalantes en el suelo permiten la
neutralización de los iones H+ en la solución del suelo por medio de iones OH-
producidos al entrar en contacto la cal con el agua del suelo. Es por esta razón
que la cal es efectiva solamente cuando existe humedad en el suelo. Las
reacciones básicas de la cal en el suelo pueden ser ilustradas con el caso del
carbonato de calcio o calcita. Estas reacciones se presentan a continuación:
CaCO 3 + CO3-2-2
CO32- + OH2 HCO 3
- + OH -
HCO 3- + OH2 H2CO3 + OH -
H2CO3 CO2 + H2O
H2O+H+-OH(solución de suelo)
Ca2+
Las tasas de reacciones indicadas y por lo tanto la disociación del CaCO3 está
directamente relacionada con la tasa a la cual los iones OH- son removidos de la
solución del suelo a través de la neutralización del H+ y la formación de H2O.
Mientras exista H+ en la solución del suelo el Ca2+, CO32-, HCO3
- y H2CO3
continuarán apareciendo en la solución. En esta forma el pH aumenta debido a
que se disminuye la concentración de H+ en el suelo. El incremento de pH permite
la precipitación del Al3+ como Al(OH)3, que es un compuesto insoluble, eliminado
de esta forma el efecto tóxico del Al3+ en las plantas y la principal fuente de iones
H+.
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4.2. PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Las muestras deben ser etiquetadas debidamente en la bolsa en la cual el usuario
debe traerla y registradas en el formato LAS-TMM-F03 (ver anexo 1). Se llevan al
horno de secado a 60ºC por 2 días, luego se pasa por un tamiz “mesh 10”, y se
envasa en un frasco identificado con el número interno de laboratorio para esa
muestra.
4.3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.
4.3.1. Materiales
� Vasos plásticos taparrosca de 125mL
� Limpión
� Botellón con agua destilada
� Dispensador de 25 ó 50mL
� Embudos
� Papel filtro
� Matraces aforados de 50 y 100mL
� Pipetas de 10 y 20mL
4.3.2. Reactivos
� Solución buffer de 4.0 y 7.0
� Patrones de calcio para A.A.
� Hidróxido de calcio Ca(OH)2
4.3.3. Equipos
� Agitador magnético y mecánico
� Espectrofotómetro de Absorción Atómica
� Balanza Analítica
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� pH-metro (Fisher Accumet Basic AB15)
4.4. NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES
4.4.1. Seguridad. Esta prueba no tiene mayores riesgos de accidente químico,
pero como la solución titulante es básica (de baja concentración) se debe usar
guantes y gafas, además de una mascara con filtros especiales para partículas
3M, ya que al momento de procesar y pesar la muestra se podrían aspirar
partículas de suelo.
4.4.2. Calibración del pH-metro. Primero debe revisarse que el electrodo se
encuentre en óptimas condiciones. Luego se debe lavar para eliminar residuos de
la solución de KCl en la que se almacena, sumergir en el buffer de pH 7.0 mínimo
durante 30 minutos, lavar y sumergir en buffer de pH 4.0 otros 30 minutos.
4.4.3. Manejo del espectrofotómetro de absorción atómica.
I. Accionar el interruptor de encendido del aparato.
II. Colocar la lámpara del elemento a analizar (para cada elemento metálico
existe una lámpara y unas condiciones especificas).
III. Ajustar la intensidad de la corriente de la lámpara (mA) recomendada por el
fabricante.
IV. Elegir la longitud de onda teórica de trabajo, según el elemento a trabajar.
V. Se abre el paso de los gases y se enciende la llama (primero se abre el aire
y luego el acetileno y para apagarla, primero se cierra el acetileno y luego el
aire).
VI. Ajustar la ganancia para seleccionar la longitud de máxima absorción en
condiciones experimentales, mientras se aspira el patrón de máxima
concentración.
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VII. Verificar la calibración del aparato y la orientación correcta de la llama con
un patrón de referencia.
VIII. Ajustar el cero de absorbancia en un blanco (agua destilada).
IX. Calibrar las condiciones ópticas y de llama con el patrón de mayor
concentración.
X. Introducir los estándares de concentraciones conocidas del elemento en
cuestión en la llama anotando las lecturas del aparato.
XI. Introducir la muestra problema en la llama.
XII. Hacer curva de concentración vs. lectura con la curva patrón y por
interpolación se obtiene la concentración de la muestra problema en ppm.
4.4.4. Todo el material de trabajo debe estar limpio y seco.
4.4.5. Como muestra patrón se usa “Serie Catalina”.
5. PROCEDIMIENTO
Se pesan 25g de suelo, se depositan en un vaso plástico taparrosca de 125mL y
se agregan 25mL de agua destilada, se agita mecánicamente la solución suelo
agua durante 1h a 200rpm, se lee el pH inicial y se reporta en la tabla de datos
para índice de encalado, se adicionan 10mL de la solución titulante de Ca(OH)2 de
concentración conocida y se llevan a agitación de nuevo durante 1h a 200rpm,
luego se lee el pH y se reporta en la respectiva tabla de datos. Se repite el mismo
procedimiento de adiciones de base hasta que el pH de la solución suelo agua sea
mayor o igual a 7. (Ver anexo 2).
5.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
5.1.1. Solución titulante de Ca(OH)2 0,1N. Pesar 1.927g de Ca(OH)2 al 96%,
llevar a 500mL con agua destilada, agitar magnéticamente durante 1h, y como no
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hay disolución completa del hidróxido de calcio es necesario filtrar la solución lo
cual altera la concentración inicial de 0.1N, por eso se hace necesario determinar
la concentración de calcio en la solución filtrada por medio del espectrofotómetro
de Absorción Atómica. La solución filtrada debe ser almacenar en botellas bien
cerradas para ser protegida del CO2. (Ver anexo 3).
5.1.2. Procedimiento para determinar la concentración de calcio en la
solución titulante de Ca(OH)2 por A.A. Tomar 1mL de la solución titulante
filtrada, llevar a un matraz de 100mL, adicionar 4mL de oxido de lantano al 1% y
aforar con agua destilada. Determinar la concentración en ppm de calcio según la
curva de calibración con patrones de calcio. (Ver anexo 4).
5.1.2.1. Oxido de lantano al 10%. (Realizar en frío) 100g La2O3 en 500 mL de
agua destilada. Agregar poco a poco 250mL de HCl agitando permanentemente.
Realizar en cabina. Enfriar y aforar a 1L. (Ver anexo 5).
5.1.2.2. Óxido de lantano al 1%. Tomar 10mL de la solución de oxido de
lantano al 10% y aforar a 100mL con agua destilada (ver anexo 6).
5.1.3. Patrones de calcio. Se parte de titrisoles de 1000ppm de Ca o de una sal,
para preparar un patrón de 1000ppm. De este se hace la respectiva dilución para
obtener un patrón de 100ppm, luego preparar patrones de 2, 5, 10, 20 y 50ppm,
aforados a 50mL con previa adición de 4mL de oxido de lantano 1% (ver anexo 7).
Se usa la siguiente formula para realizar el cálculo de las diluciones:
)(
)()()(
)()()()(
oconcentradC
diluidoCdiluidoVoconcentradV
diluidoCdiluidoVoconcentradCoconcentradV
×=
×=×
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5.1.4. Curva de calibración. Hacer curva de calibración en el equipo de
Absorción Atómica con los patrones de calcio preparados y determinar la
concentración de calcio en la solución titulante.
5.2. REGISTRO DE DATOS
Utilizar el formato LAS-TRE-F04 para registrar los datos del ensayo de la
determinación del índice de encalado de un suelo. (Ver anexo 8).
5.3. CALCULOS Y RESULTADOS
El equipo de A.A. arroja la concentración de Ca en solución titulante como Xppm
calcio. Se convierte la concentración Xppm de calcio a Xg de calcio / Lsol.
Lsol
XgCa
mgCa
gCa
Lsol
XmgCa
11000
1
1=×
El volumen de solución titulante que se adicionó fue de 10mL a cada muestra de
suelo.
YgCaLsolLsol
XgCa=× 010,0
1
El valor de Yg calcio, indica entonces la cantidad de Ca que se está adicionando
a la solución de suelo con cada alícuota.
El peso de cada muestra de suelo fue de 25g. Entonces:
Kgsuelo
ZKgCa
Kgsuelo
YKgCa
gsuelo
YgCa==
2525
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El peso promedio de una hectárea (ha) de suelo con densidad aparente de 1, es
de 2´000.000Kg.
hasuelo
FKgCa
hasuelo
Kgsuelo
Kgsuelo
ZKgCa=×
1
000.0002́
Si se conoce la densidad aparente (da) del suelo, entonces se reemplaza el valor
J (2´000.000 Kg de suelo) por el valor que de la multiplicación de J*da.
El valor F arrojado por la ecuación anterior se convierte a Kg de CaCO3 / ha de
suelo, de la siguiente manera:
hasuelo
MKgCaCO
KgCa
KgCaCO
hasuelo
FKgCa 3
40
3100=×
El valor de M indica la cantidad de cal que se debe aplicar al suelo analizado por
cada hectárea.
5.4. REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados se expresan como Kg de CaCO3 / ha de suelo y se entregan al
usuario en el formato LAS-TRE-F05. (Ver anexo 9).
6. RESPONSABLES
La responsabilidad recae sobre el analista el cual debe seguir la metodología
establecida para el análisis.
7. DOCUMENTO DE REFERENCIA
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El formato para diligenciar este documento es el establecido por la norma cero del
Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la Universidad
Tecnológica de Pereira, llamada: Requisitos generales de competencia de
laboratorios de ensayo y calibración, Norma Técnica Colombiana NTC-ISO-IEC
17025.
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ANEXOS
Anex
o 1. F
orm
ato para la recepción de muestras particu
lares.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍM
ICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO DE RECEPCIÓN PARA M
UESTRAS PARTICULARES
Versión 02
Página 1 de 1
Código: LAS - TMM - F03
Vigencia: Abril 2009
# LAB
SOLICITANTE
FINCA
LOTE
MUNICIPIO
VEREDA
CULTIVO
EDAD
DENSIDAD
ANALISIS
R
evi
só:
___
___
__
__
__
___
__
__
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Anexo 2. Flujograma para el procedimiento de encalado.
Repetir proceso de adiciones de solución titulante hasta que el pH de la solución de suelo sea ≥ 7,0
Fin
Registrar en formato LAS-
TRE-F05
Graficar datos reportados en TRE-F05
Registrar en formato LAS-
TRE-F04
Adicionar 10mL de solución titulante de Ca(OH)2 (ver anexo 2)
Agitar mecánicamente 1h a 200rpm
Leer pH
Registrar pH en formato LAS- TRE-F04
Agregar 25mL de H2O destilada
Agitar mecánicamente 1h a 200rpm
Leer pH
Pesar 25g de suelo
Inicio
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Anexo 3. Flujograma para la preparación de la solución titulante de Ca(OH)2
0.1N .
Agitar magnéticamente 1h
Filtrar la solución y almacenar en frascos taparrosca para proteger del
CO2
Determinar la concentración real de calcio en la solución por absorción atómica
(ver anexo 3)
Fin
Pesar 1.927g de Ca(OH)2 al 96% y aforar a 500mL con H2O
destilada
Inicio
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Anexo 4. Flujograma para el procedimiento de determinación de la
concentración de calcio en la solución titulante por A.A.
Aforar a 100mL con agua destilada, con previa adición de 4mL de oxido de lantano al 1%
Determinar concentración de calcio según curva de calibración con patrones
de calcio (ver anexo 6)
Fin
Tomar 1mL de la solución titulante filtrada
Inicio
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Anexo 5. Flujograma para preparación de solución de óxido de lantano al
10%.
Anexo 6. Flujograma para preparación de solución de oxido de lantano al
1%.
Agregar poco a poco 250mL de HCl con agitación permanente (realizar en cabina)
Enfriar y aforar a 1L con agua destilada
Fin
Pesar 100g de La2O3 y aforar a 500mL (realizar en frío)
Inicio
Aforar a 100mLcon agua destilada
Fin
Inicio
Tomar 10mL de oxido de lantano al 10%
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Anexo 7. Flujograma para preparación de patrones de calcio.
Aforar a 100mL con agua destilada para obtener una solución de 100ppm de Ca
Llevar a 5 matraces de 50mL las siguientes cantidades: 1 - 2.5 - 5.0 – 10 – 25mL de la solución de 100ppm de Ca, para obtener patrones de 2, 5, 10, 20,
50ppm de Ca respectivamente
Adicionar a cada matraz 4mL de oxido de lantano al 1% y aforar con agua destilada
Fin
Inicio
Tomar 10mL de una solución estándar de 1000ppm de Ca
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18
Anex
o 8. F
orm
ato para reg
istro in
terno de datos y en
sayo
s.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO INTERNO PARA REGISTRO DE DATOS DE ENCALADO
Versión 01
Página 1 de 1
Código: LAS – TRE- F04
Vigencia: Abril 2009
Valor de pH con las adiciones de 10mL de Ca(O
H) 2
# LAB
pH inicial
1
2
3
4 5
6
7 8
9
10
Re
visó
:
__
___
__
__
___
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___
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Jefe
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-01
Códi
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19
Anex
o 9. F
orm
ato para entreg
a de resu
ltad
os.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍM
ICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
INFORME DE ENSAYO
Versión: 01
Página 1 de 1
Código:
LAS-TRE-F05
Vigencia: Abril 2009
Solicitante___________
________
______
Finca ______
________
Tipo de m
uestra _______________
Fecha ejecución del ensa
yo ___
__________
Dpto ______________
Tipo de análisis _______
____
____
Fecha de impresión _____________
Municipio ____________
__
# de muestras ___________
____
Fecha de registro ________
_____
Vereda _______
_______
Cultivo _______________
# de registro _____________
Teléfono ______________
Densidad _______________
Método:
Po
ten
cio
mé
tric
o,
con
ad
icio
nes
de
hid
róxi
do
de
calc
io.
INDICE DE ENCALADO "ROSARIO"
y =
0,0
003x +
4,4
417
R2 =
0,9
983
4,2
4,4
4,6
4,85
5,2
5,4
5,6
5,86
6,2
6,4
6,6
6,87
05
00
10
00
15
00
20
00
250
03
000
35
00
400
04
50
05
000
55
00
600
06
50
07
000
750
08
00
0
KgCaCO3/hasuelo
pH
Coordinador
La
bora
tori
o d
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CELULOLÍTICOS EN SUELOS
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PROCEDIMIENTO DE ENSAYO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
CELULOLÍTICOS EN SUELOS
NTC-ISO-IEC 17025/2005
Requisitos generales de competencia de laboratorios de ensayo y calibración
Vigencia: Ruta de acceso:
Elabora: _____________________
Revisa: _____________________
Aprueba: _____________________
Fecha: _____________________
Fecha: _____________________
Fecha: _____________________
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Página
1. OBJETO 3
2. ALCANCE 3
3. DEFINICIONES 3
3.1 ABREVIATURAS EMPLEADAS 3
4. CONTENIDO 4
4.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO 4
4.2 PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA 6
4.3 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 6
4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES 7
5. PROCEDIMINETO 8
5.1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS 9
5.2 REGISTRO DE DATOS 9
5.3 CÁLCULOS Y RESULTADOS 10
5.4 REPORTE DE RESULTADOS 10
6. RESPONSABLES 10
7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA 11
ANEXOS 12
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1. OBJETO
Establecer el procedimiento microbiológico para la identificación de
microorganismos celulolíticos en suelos, en el Laboratorio de Análisis Químico de
Suelos y Foliares de la Universidad Tecnológica de Pereira.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica a todas las muestras de suelos sometidas al
procedimiento de identificación de microorganismos celulolíticos, en el Laboratorio
de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la Universidad Tecnológica de
Pereira.
3. DEFINICIONES
Los microorganismos celulolíticos se encargan de degradar la celulosa que es un
constituyente de los restos vegetales que se incorporan al suelo. Estos
organismos poseen enzimas hidrolíticas: endo beta- 1,4 glucanasa, exo beta-1,4
glucanasa y beta 1,4 glucosidasa que son inducidas por la presencia de celulosa.
3.1. ABREVIATURAS EMPLEADAS
G.A.: Grado Analítico
U.F.C.: Unidades Formadoras de Colonia
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4. CONTENIDO
4.1. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
La celulosa es un polímero cuya molécula tiene más de dos mil unidades de D-(+)-
Glucosa, que poseen un enlace glucosídico (1,4) de tipo beta. Las moléculas de
celulosa se unen mediante puentes de hidrógeno de dos tipos diferentes, dando
lugar a una estructura polimórfica. Se han reconocido, al menos, cuatro formas
cristalinas, además de la celulosa amorfa. De la hidrólisis se obtienen
celodextrinas, celobiosa y, finalmente, glucosa.
Aunque romper el enlace glucosídico β (1-4) es relativamente sencillo, los puentes
de hidrógeno en las formas cristalinas de la celulosa configuran cristales con una
disposición tan comprimida que ni el agua ni las enzimas pueden penetrar en ellos
(formas insolubles). La estructura cristalina sólo puede ser atacada por un tipo de
celulasas, las exoglucanasas, que son capaces de hidrolizar los enlaces
glucosídicos terminales, rompiendo dicha estructura cristalina y transformándose
en celulosa amorfa. En esas condiciones puede intervenir otro grupo de enzimas
del complejo enzimático, las endoglucanasas, continuando ya el proceso hasta la
degradación total de la molécula. La hidrólisis completa de la celulosa transcurre
en distintos episodios, en los que intervienen diferentes enzimas del sistema
enzimático celulolítico (sensu lato). Se distinguen tres fases en la degradación de
la celulosa:
1. Transformación de la celulosa insoluble (cristalina) en celulosa soluble
(amorfa).
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2. Transformación de celulosa soluble en oligosacáridos y celobiosa (dímero
de la glucosa).
3. Transformación de la celobiosa en glucosa.
En las dos primeras fases intervienen diversas enzimas que podemos incluir
dentro del grupo de las celulasas (sensu stricto), mientras que en la tercera está
presente una enzima que cataliza la ruptura del enlace beta del disacárido,
denominada (-Glucosidasa. El proceso se puede resumir según el siguiente
esquema:
Exoglucanasa Endoglucanasa ββββ-Glucosidasa CELULOSA (Cristalina) → CELULOSA (Amorfa) → CELOBIOSA → GLUCOSA
La intervención de la β-Glucosidasa resulta decisiva para que se produzca la
degradación completa de la celulosa, puesto que en caso contrario se produciría
un aumento de la concentración de celobiosa, que inhibe precisamente la acción
de exocelulasas y endocelulasas.
Para poner en evidencia la actividad de las Beta –D- Glucanasas se usa un
sustrato soluble agarizado (carboximetilcelulosa). La cajas de Petri se lavan con
una solución de cloruro de sodio 1M durante 5 minutos, luego por el agregado del
Rojo Congo al medio, este adquiere el color propio del colorante visualizándose
las zonas de hidrólisis como zonas decoloradas (claras) alrededor de la colonia y
rodeando a las hifas las cuales quedaron teñidas de rojo.
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4.2. PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS.
Las submuestras deben ser recolectadas en recipientes limpios y con
instrumentos previamente esterilizados con alcohol, la muestra compuesta
obtenida después del cuarteo debe ser recolectada en una bolsa plástica de cierre
hermético y esterilizada, esta se debe conservar a aproximadamente a 4ºC para
evitar un incremento de la microbiota original. Una vez llegue al LAS-UTP debe ser
debidamente etiquetada en la bolsa en la cual el usuario la trae y registrada en el
formato LAS-TMM-F04 (ver anexo 1), en un ambiente aséptico debe ser
homogenizada en un tamiz mesh 10 (estéril) y de nuevo guardada en una bolsa
plástica hermética y estéril, se debe almacenar a 4ºC hasta su análisis que deberá
hacerse en el menor tiempo.
4.3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.
4.3.1. Materiales
� Cajas de Petri
� Asas microbiológicas y de Hockey
� Tubos de ensayo y gradilla
� Erlenmeyer, beaker
� Frascos taparrosca autoclavables
� Pipetas graduadas de 1, 5, y 10mL
� Micropipeta de 10-100µL y puntas
� Mecheros Bunsen
� Probeta de 50, 100 y 1000mL
4.3.2. Reactivos
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� Agua destilada
� Agar agar
� Carboximetil celulosa
� Extracto de suelo
� NO3NH4
� NaCl 1M
� Rojo congo 0,1%
� Solución de NaCl 0.85%
4.3.3. Equipos
� Balanza analítica
� Agitador magnético con calentamiento
� Autoclave
� Incubadora
� Nevera
4.4. NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES.
4.4.1. Seguridad. En un laboratorio de microbiología se trabaja con
microorganismos que pueden ser patógenos, por tanto, hay que seguir unas
normas estrictas de higiene y seguridad. Este trabajo requiere una técnica
aséptica y por tanto ambiente limpio y ordenado.
4.4.2. Recomendaciones. Todo el material a emplearse debe estar exento de
impurezas y estéril. Usar siempre guantes y tapabocas que deberán desecharse
una vez terminado el trabajo. Al manejar una muestra debemos evitar que
microorganismos ajenos a los cultivos, la contaminen, o que los microorganismos
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e la muestra nos contaminen a nosotros. Los microorganismos deben manejarse
siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios
por el laboratorio, ya que se pueden crear corrientes que originen contaminaciones
o producir accidentes. No se debe pipetear nunca con la boca. Usar siempre
pipeteadores manuales. Dentro del laboratorio se utilizará una bata blanca (para
proteger la ropa) que habrá que quitarse al abandonar la sala de trabajo. Durante
las prácticas no se puede comer, fumar ni beber. Los cabellos largos deberán
estar recogidos. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse
las manos a la boca, nariz, ojos. Evitar hábitos como llevarse a la boca
instrumentos, lápices, etc. todo ello para evitar riesgos de contaminación. Las
mesas de trabajo se desinfectan diariamente al iniciar y terminar el trabajo y cada
vez que sea necesario (derrame de productos contaminados). Seguidamente se
lavarán las manos cuidadosamente con agua y jabón. El cultivo con que se trabaja
puede no ser patógeno, manéjelo como si lo fuera.
5. PROCEDIMIENTO
Pesar 2,5g de carboximetil celulosa, 0,5g de NO3NH4, 25 mL de solución de NaCl
0,85%, 7,5g de agar, 475mL de extracto de suelo. Llevar a ebullición hasta
disolución completa, ajustar el pH a 7,0. Esterilizar en autoclave a 115ºC durante
20 minutos. Servir en cajas de Petri. Una vez hayan solidificado llevar a la nevera.
Para sembrar, tomar 0.1mL de la dilución 10-1, adicionar sobre la caja de Petri que
debe estar a temperatura ambiente sembrar por superficie con el asa de Hockey;
repetir el procedimiento de igual manera con las otras diluciones. Incubar a 28ºC
durante 48h. Para revelar se adiciona NaCl 1M a la superficie de la caja durante 5
minutos, luego se desecha y se agrega el rojo congo 0,1% durante 30 minutos, y
se lava con agua destilada hasta que los halos de las colonias puedan ser
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observados. Contar UFC que presenten reacción positiva en el agar (colonias con
halo). Se hacen tres repeticiones por cada dilución. (Ver anexo 2).
5.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
5.1.1. Preparación de diluciones: La dilución 10-1, se prepara adicionando 10g
de la muestra de suelo a analizar en un frasco que contiene 90mL de NaCl 0.85%.
La dilución 10-2 se prepara tomando 1mL de la dilución 10-1 y agregándolo a un
tubo de ensayo con 9mL de NaCl 0.85%. La dilución 10-3 se prepara tomando 1mL
de la dilución 10-2 y adicionándolo a un tubo de ensayo con 9mL de NaCl 0.85%.
Las otras dos diluciones se preparan de igual manera. (Ver anexo 3).
5.1.1.1. Solución salina (NaCl 0.85%). Pesar 8.5g de NaCl y aforar a 1000mL
con agua destilada. (Ver anexo 4).
5.1.2. Preparación de extracto de suelo. Pesar 100g de un suelo cualquiera,
pasarlo por un tamiz Nº 10, mezclarlo con 900mL de agua destilada, agitar y dejar
reposar por 3 días, filtrar la solución y esterilizarla. (Ver anexo 5).
5.1.3. Preparación de solución de NaCl 1M. Pesar 58.44g de NaCl y aforar a 1L
con agua destilada. (Ver anexo 6).
5.1.4. Preparación de solución de rojo conga 0.1%. Pesar 0.1g de rojo congo y
aforar a 100mL. (Ver anexo 7).
5.2. REGISTRO DE DATOS
Utilizar el formato LAS-TRE-F07 para registrar los datos del ensayo de la
identificación de microorganismos celulolíticos. (Ver anexo 9).
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5.3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
Seleccionar las cajas que presenten entre 20 y 200 UFC con halo de degradación.
Contar todas las colonias seleccionada de cada caja. Si corresponden a la misma
dilución hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicar por el factor de
dilución. Si cajas de dos diluciones consecutivas se encuentren en el rango 20 y
200 colonias, se hace el recuento para cada una de las diluciones, y se reporta la
media aritmética de las dos diluciones, a menos que el recuento mayor contenga
dos veces al menor, en este caso se reporta el recuento menor.
Si no hay presencia de colonias en las cajas correspondientes a la dilución mas
concentrada se informa como menor de 1 multiplicado por el valor de la dilución.
InoculadoVolumenDiluciónInversoColoniasN
gsuelo
CFU ..º.
.. ××=
5.4. REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonia por gramo de
suelo (U.F.C. / g de suelo) y se le entregan los resultados al usuario en el formato
LAS-TRE-F07 (ver anexo 9).
6. RESPONSABLES
La responsabilidad recae sobre el analista el cual debe seguir la metodología
establecida para el análisis.
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7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
El formato para diligenciar este documento es el establecido por la norma cero del
Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la Universidad
Tecnológica de Pereira, llamada: Requisitos generales de competencia de
laboratorios de ensayo y calibración, Norma Técnica Colombiana NTC-ISO-IEC
17025.
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO DE RECEPCIÓN DE M
UESTRAS PARA ANALISIS M
ICROBIOLÓGICO
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Código: LAS - TMM - F04
Vigencia: Abril 2009
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PROFUNDIDAD DE
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Anexo 2. Flujograma de procedimiento para siembra de microorganismos
celulolíticos.
Agregar 950mL de extracto de suelo y 50mL de NaCl 0.85% (ver anexos 3 y 4)
Llevar a ebullición para disolución completa
Ajustar pH a 7.0
Esterilizar en autoclave a 115ºC por 20 minutos
A
Enfriar, servir en cajas de Petri y dejar
solidificar
Inocular cada caja con 0,1mL de cada una de las diluciones decimales
consecutivas (ver anexo 2)
Pesar 5.0g de carboximetil celulosa, 1.0g de NO3NH4, 15g de agar
Inicio
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Sembrar por superficie con asa de Hockey, invertir las cajas e incubar a
28ºC durante 48 horas
Revelar los halos de celulólisis adicionando NaCl 1M a la superficie de
la caja por 5 minutos (ver anexo 5)
A
Desechar el NaCl y adicionar rojo congo al 0.1% por 30 minutos (ver anexo 6)
Contar UFC que presenten halo de celulólisis
Lavar con agua destilada hasta que se observen los halos
Registrar el número de colonias en el formato
LAS-TRE-F06
Fin
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Anexo 3. Flujograma para la preparación de diluciones.
Tomar 1mL de esta dilución y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL de NaCl
0.85% estéril (dilución 10-2)
Tomar 1mL de la dilución 10-2 y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL de
NaCl 0.85% estéril (dilución 10-3)
Tomar 1mL de la dilución 10-3 y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL de
NaCl 0.85% estéril (dilución 10-4)
Tomar 1mL de la dilución 10-4 y agregar 9mL de NaCl 0.85% estéril (dilución 10-5)
Fin
Pesar 10g de suelo y mezclar con 90mL de NaCl 0.85% (dilución 10-1)
Inicio
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Anexo 4. Flujograma para la preparación de solución salina 0.85%.
Anexo 5. Flujograma para la preparación de extracto de suelo.
Llevar a 1L con agua destilada
Fin
Pesar 8.5g de NaCl
Inicio
Mezclar con 900mL de agua destilada y dejar en reposos tres días
Filtrar y esterilizar
Fin
Pesar 100g de suelo
Inicio
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Anexo 6. Flujograma para la preparación de NaCl 1M.
Anexo 7. Flujograma para la preparación de rojo congo 0.1%.
Aforar a 1L con agua destilada
Fin
Pesar 58.44g de NaCl
Inicio
Aforar a 1L con agua destilada
Fin
Pesar 1.0g de rojo congo
Inicio
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LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍM
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO INTERNO PARA REGISTRO DE DATOS M
ICROBIOLÓGICOS
Versión 01
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Código: LAS – TRE- F06
Vigencia: Abril 2009
Conteo de UFC
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Dilución 10-1
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LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍM
ICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
INFORME DE ENSAYO
Versión: 01
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Código:
LAS-TRE-F07
Vigencia: Abril 2009
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LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CELULOLÍTICOS EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 09
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Anexo 10. Desechos. Los residuos de medios, muestras, microorganismos,
guantes, tapabocas y demás, deben depositarse en bolsas especiales marcadas
como “Residuos biológicos” y no se deben mezclar con las demás basuras. Se
deberá contar con una empresa especializada en la recolección y manejo de este
tipo de residuos.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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PROCEDIMIENTO DE ENSAYO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
NTC-ISO-IEC 17025/2005
Requisitos generales de competencia de laboratorios de ensayo y calibración
Vigencia: Ruta de acceso:
Elabora: _____________________
Revisa: _____________________
Aprueba: _____________________
Fecha: _____________________
Fecha: _____________________
Fecha: _____________________
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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Página
1. OBJETO 3
2. ALCANCE 3
3. DEFINICIONES 3
3.1 ABREVIATURAS EMPLEADAS 3
4. CONTENIDO 4
4.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO 4
4.2 PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA 4
4.3 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 5
4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES 6
5. PROCEDIMINETO 7
5.1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS 7
5.2 REGISTRO DE DATOS 8
5.3 CÁLCULOS Y RESULTADOS 8
5.4 REPORTE DE RESULTADOS 9
6. RESPONSABLES 9
7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA 9
ANEXOS 10
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
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Código: LAS-PDE- 07
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1. OBJETO
Establecer el procedimiento microbiológico para la identificación de
microorganismos degradadores de urea en suelos, en el Laboratorio de Análisis
Químico de Suelos y Foliares de la Universidad Tecnológica de Pereira.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica a todas las muestras de suelos sometidas al
procedimiento de identificación de microorganismos degradadores de urea, en el
Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la Universidad
Tecnológica de Pereira.
3. DEFINICIÓN
La urea es la forma más conveniente para la fijación del nitrógeno en el suelo y al
aplicarla esta se hidroliza y para su solubilización necesita la presencia de la
enzima Ureasa que es producida por bacterias, actinomicetos y hongos. Con la
reacción de la enzima, la urea se transforma en amonio el cual luego es nitrificado
por otros microorganismos, donde al final del proceso se obtiene NO3-.
3.1. ABREVIATURAS EMPLEADAS
U.F.C.: Unidades Formadoras de Colonia
G.A.: Grado Analítico
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Código: LAS-PDE- 07
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4. CONTENIDO
4.1. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
La ureasa es una enzima del ciclo del nitrógeno; cataliza la reacción de hidrólisis
de la urea en amonio y dióxido de carbono, y se encuentra presente en plantas
superiores y en microorganismos (particularmente bacterias). Durante largo tiempo
ha sido estudiada en los suelos puesto que afecta a reacciones de pérdida de
fertilizantes nitrogenados en forma de urea, muy utilizados en agricultura; tiene por
tanto importancia en el campo agrotecnológico. Su presencia en los suelos tiene
un origen microbiano.
En medios de cultivo de agar Urea es necesario que haya en el medio, una fuente
de carbono, nitrógeno, vitaminas, y aporte de nutrientes esenciales para el
desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato constituyen el sistema buffer, el rojo de
fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.
Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno
proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoniaco y dióxido de carbono.
Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el rojo-fucsia
fenol del amarillo al rojo-fucsia.
4.2. PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Las submuestras deben ser recolectadas en recipientes limpios y con
instrumentos previamente esterilizados con alcohol, la muestra compuesta
obtenida después del cuarteo debe ser recolectada en una bolsa plástica de cierre
hermético y esterilizada, esta se debe conservar a aproximadamente a 4ºC para
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evitar un incremento de la microbiota original. Una vez llegue al debe ser
debidamente etiquetada en la bolsa en la cual el usuario la trae y registrada en el
formato LAS-TMM-F04 (ver anexo 1), en un ambiente aséptico debe ser
homogenizada en un tamiz mesh 10 (estéril) y de nuevo guardada en una bolsa
plástica hermética y estéril, se debe almacenar a 4ºC hasta su análisis que deberá
hacerse en el menor tiempo.
4.3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO
4.3.1. Materiales
� Cajas de Petri
� Asas microbiológicas y de Hockey
� Tubos de ensayo y gradilla
� Erlenmeyer, beaker, frascos taparrosca autoclavables
� Pipetas graduadas de 1, 5, y 10mL
� Micropipeta de 10-100µL y puntas
� Mecheros Bunsen
� Probeta de 50, 100 y 1000mL
4.3.2. Reactivos
� Agua destilada
� Agar base Urea
� Solución de urea al 40% estéril
� Solución de NaCl 0.85%
� Diluciones 10-1 hasta 10-5
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4.3.3. Equipos
� Balanza analítica
� Agitador magnético con calentamiento
� Autoclave
� Incubadora
� Nevera
4.4. NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES
4.4.1. Seguridad. En un laboratorio de microbiología se trabaja con
microorganismos que pueden ser patógenos, por tanto, hay que seguir unas
normas estrictas de higiene y seguridad. Este trabajo requiere una técnica
aséptica y por tanto ambiente limpio y ordenado.
4.4.2. Recomendaciones. Todo el material a emplearse debe estar exento de
impurezas y estéril. Usar siempre guantes y tapabocas que deberán desecharse
una vez terminado el trabajo. Al manejar una muestra debemos evitar que
microorganismos ajenos a los cultivos, la contaminen, o que los microorganismos
de la muestra nos contaminen a nosotros. Los microorganismos deben manejarse
siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios
por el laboratorio, ya que se pueden crear corrientes que originen contaminaciones
o producir accidentes. No se debe pipetear nunca con la boca. Usar siempre
pipeteadores manuales. Dentro del laboratorio se utilizará una bata blanca (para
proteger la ropa) que habrá que quitarse al abandonar la sala de trabajo. Durante
las prácticas no se puede comer, fumar ni beber. Los cabellos largos deberán
estar recogidos. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse
las manos a la boca, nariz, ojos. Evitar hábitos como llevarse a la boca
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instrumentos, lápices, etc. todo ello para evitar riesgos de contaminación. Las
mesas de trabajo se desinfectan diariamente al iniciar y terminar el trabajo y cada
vez que sea necesario (derrame de productos contaminados). Seguidamente se
lavarán las manos cuidadosamente con agua y jabón. El cultivo con que se trabaja
puede no ser patógeno, manéjelo como si lo fuera.
5. PROCEDIMIENTO
Pesar 2,4g de agar base Urea, adicionar 95mL de agua destilada. Llevar a
ebullición hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 115ºC durante 20
minutos. Enfriar a 50ºC y añadir 5mL de solución de urea al 40%. Mezclar bien y
distribuir en cajas de Petri. Una vez hayan solidificado llevar a la nevera durante
toda la noche para una buena solidificación del medio. Tomar 0.1mL de la dilución
10-1, adicionar sobre la caja de Petri que debe estar a temperatura ambiente
(sacar de la nevera y dejar al lado del mechero, no se puede calentar porque las
altas temperaturas degradan la urea), sembrar por superficie con el asa de
Hockey; repetir el procedimiento de igual manera con las otras diluciones. Incubar
a 35ºC durante 24h. Se hacen tres repeticiones por cada dilución. Contar UFC que
presenten reacción positiva en el agar (colonias con coloración fucsia-rojo). (Ver
anexo 2).
5.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
5.1.1. Preparación de diluciones. La dilución 10-1, se prepara adicionando 10g
de la muestra de suelo a analizar en un frasco que contiene 90mL de NaCl 0.85%.
La dilución 10-2 se prepara tomando 1mL de la dilución 10-1 y agregándolo a un
tubo de ensayo con 9mL de NaCl 0.85%. La dilución 10-3 se prepara tomando 1mL
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
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de la dilución 10-2 y adicionándolo a un tubo de ensayo con 9mL de NaCl 0.85%.
Las otras dos diluciones se preparan de igual manera. (Ver anexo 3).
5.1.1.1. Solución salina (NaCl 0.85%). Pesar 8.5g de NaCl y aforar a 1000mL
con agua destilada. (Ver anexo 4).
5.1.2. Solución de urea al 40%. Pesar 40g de urea (G.A.) aforar a 100mL con
agua destilada, como la urea se degrada a temperaturas altas no se puede
autoclavar esta solución, entonces se debe hacer una filtración por membrana
para su esterilización. (Ver anexo 5).
5.2. REGISTRO DE DATOS
Utilizar el formato LAS-TRE-F06 para registrar los datos del ensayo de la
determinación del índice de encalado de un suelo. (Ver anexo 6).
5.3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
Seleccionar las cajas que presenten entre 20 y 200 UFC con halo de degradación.
Contar todas las colonias seleccionada de cada caja. Si corresponden a la misma
dilución hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicar por el factor de
dilución. Si cajas de dos diluciones consecutivas se encuentren en el rango 20 y
200 colonias, se hace el recuento para cada una de las diluciones, y se reporta la
media aritmética de las dos diluciones, a menos que el recuento mayor contenga
dos veces al menor, en este caso se reporta el recuento menor.
Si no hay presencia de colonias en las cajas correspondientes a la dilución mas
concentrada se informa como menor de 1 multiplicado por el valor de la dilución.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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InoculadoVolumenDiluciónInversoColoniasN
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CFU ..º.
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5.4. REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonia por gramo de
suelo (U.F.C. / g de suelo) y se le entregan al usuario en el formato LAS-TRE-F07
(ver anexo 7).
6. RESPONSABLES
La responsabilidad recae sobre el analista el cual debe seguir la metodología
establecida para el análisis.
7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
El formato para diligenciar este documento es el establecido por la norma cero del
Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la Universidad
Tecnológica de Pereira, llamada: Requisitos generales de competencia de
laboratorios de ensayo y calibración, Norma Técnica Colombiana NTC-ISO-IEC
17025.
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ANEXOS
Anexo 1. Formato de recepción de muestras para análisis microbiológico.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS PARA ANALISIS MICROBIOLÓGICO
Versión 01
Página 1 de 1
Código: LAS - TMM - F04
Vigencia: Abril 2009
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LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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Anexo 2. Flujograma de procedimiento para la identificación de
microorganismos degradadores de urea.
Guardar en la nevera a 4ºC durante una noche, para mejor solidificación
A
Agregar 95mL de H2O destilada
Llevar a ebullición para disolución completa
Esterilizar en autoclave a 115ºC por 20 minutos
Llevar a 50ºC ± 3
Adicionar 5mL de solución de urea al 40% (estéril) y mezclar (ver anexo 4)
Servir en cajas de Petri, entre 20 y 25mL, dejar solidificar
Pesar 2,4g de Agar Base Urea
Inicio
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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Llevar las cajas a temperatura ambiente con calentamiento suave
Inocular cada caja con 0,1mL de cada una de las diluciones decimales
consecutivas (ver anexo 2)
Sembrar por superficie con asa de Hockey, invertir las cajas e incubar a 35ºC
durante 24 horas
Registrar el número total de colonias en el formato
LAS-TRE-F06
Contar UFC que presenten coloración rojo-fucsia
Fin
A
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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Anexo 3. Flujograma para la preparación de diluciones.
Tomar 1mL de la dilución 10-4 y agregar 9mL de NaCl 0.85% estéril (dilución 10-5)
Fin
Tomar 1mL de esta dilución y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL de
NaCl 0.85% estéril (dilución 10-2)
Tomar 1mL de la dilución 10-2 y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL
de NaCl 0.85% estéril (dilución 10-3)
Tomar 1mL de la dilución 10-3 y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL
de NaCl 0.85% estéril (dilución 10-4)
Inicio
Pesar 10g de suelo y mezclar con 90mL de NaCl 0.85% (dilución 10-1)
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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Anexo 4. Flujograma para la preparación de solución salina 0.85%.
Anexo 5. Flujograma para la preparación de solución de urea al 40%.
Aforar a 100mL con H2O
Acondicionar el sistema de filtración dentro de la cabina de flujo laminar
Adicionar la muestra a filtrar
Aplicar vacío parcial mediante la bomba conectada al sistema de filtración.
Llevar a 1L con agua destilada
Fin
Pesar 8,5g de NaCl
Inicio
Inicio
Pesar 40g de urea (G.A.)
Fin
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Anexo 6. Formato interno para registro de datos y ensayos.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO INTERNO PARA REGISTRO DE DATOS MICROBIOLÓGICOS
Versión 01
Página 1 de 1
Código: LAS – TRE- F06
Vigencia: Abril 2009
Conteo de UFC
# LAB
Dilución 10-1
Dilución 10-2
Dilución 10-3
Dilución 10-4
Reporte UFC/g suelo
Re
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Anexo 7. Formato para entrega de resultados de análisis microbiológicos.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
INFORME DE ENSAYO
Versión: 01
Página 1 de 1
Código:
LAS-TRE-F07
Vigencia: Abril 2009
Solicitante_________________________
Finca ______________
Tipo de muestra _______________
Fecha ejecución del ensayo _____________
Dpto ______________
Tipo de análisis _______________
Fecha de impresión _____________
Municipio ______________
# de muestras _______________
Fecha de registro _____________
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Universidad Tecnológica de Pereira – Escuela de Tecnología Química – Vereda la Julita – Teléfono (6) 3213295
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE UREA EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 07
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Anexo 8. Desechos. Los residuos de medios, muestras, microorganismos,
guantes, tapabocas y demás, deben depositarse en bolsas especiales marcadas
como “Residuos biológicos” y no se deben mezclar con las demás basuras. Se
deberá contar con una empresa especializada en la recolección y manejo de este
tipo de residuos.
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 08
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PROCEDIMIENTO DE ENSAYO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
NTC-ISO-IEC 17025/2005
Requisitos generales de competencia de laboratorios de ensayo y calibración
Vigencia: Ruta de acceso:
Elabora: _____________________
Revisa: _____________________
Aprueba: _____________________
Fecha: _____________________
Fecha: _____________________
Fecha: _____________________
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
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Código: LAS-PDE- 08
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Página
1. OBJETO 3
2. ALCANCE 3
3. DEFINICIONES 3
3.1 ABREVIATURAS EMPLEADAS 3
4. CONTENIDO 4
4.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO 4
4.2 PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA 4
4.3 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 5
4.4 NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES 6
5. PROCEDIMINETO 7
5.1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS 8
5.2 REGISTRO DE DATOS 8
5.3 CÁLCULOS Y RESULTADOS 8
5.4 REPORTE DE RESULTADOS 9
6. RESPONSABLES 9
7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA 9
ANEXOS 11
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 08
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1. OBJETO
Establecer el procedimiento microbiológico paral a identificación de
microorganismos proteolíticos en suelos, en el Laboratorio de Análisis Químico de
Suelos y Foliares de la Universidad Tecnológica de Pereira.
2. ALCANCE
Este procedimiento se aplica a todas las muestras de suelos sometidas al
procedimiento de identificación de microorganismos proteolíticos, en el Laboratorio
de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la Universidad Tecnológica de
Pereira.
3. DEFINICIÓN
Los microorganismos proteolíticos son los encargados de desintegrar las
moléculas proteicas a polipéptidos y luego a aminoácidos (humificación), después
sufren el proceso de nitrificación pasando por NH3 y NO2- hasta llegar a NO3
- que
es la forma en la cual la mayoría de plantas absorben el nitrógeno.
3.1. ABREVIATURAS EMPLEADAS
U.F.C.: Unidades Formadoras de Colonia
G.A.: Grado Analítico
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
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4. CONTENIDO
4.1. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Las paredes y membranas celulares contienen diferentes e innumerables
proteínas, las cuales juegan diversos roles como catalizadores de reacciones
celulares (enzimas) o como material estructural (en membranas y paredes
celulares).
Los aminoácidos, junto con las proteínas, son usualmente considerados
principalmente como fuentes de nitrógeno, aunque también pueden actuar como
única fuente de carbono para algunos microorganismos. La mayoría de los
microorganismos son capaces de asimilar un gran rango de aminoácidos, aminas
y amidas. Un constituyente común en los medios de cultivo para la detección de
proteasas es la caseína (proteína de la leche), la cual al ser hidrolizada da como
resultado todos los aminoácidos comunes, exceptuando el triptófano que es
destruido durante la hidrólisis. Una vez hidrolizada la caseína se convierte en sus
aminoácidos componentes, los cuales transmiten la luz en vez de reflejarla como
la caseína coloidal. Las colonias de bacterias productoras de proteasas presentan
un halo claro de hidrólisis alrededor, producto de la degradación de la caseína por
parte de las proteasas secretadas al medio.
4.2. PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS.
Las submuestras deben ser recolectadas en recipientes limpios y con
instrumentos previamente esterilizados con alcohol, la muestra compuesta
obtenida después del cuarteo debe ser recolectada en una bolsa plástica de cierre
hermético y esterilizada, esta se debe conservar a aproximadamente a 4ºC para
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evitar un incremento de la microbiota original. Una vez llegue al LAS-UTP debe ser
debidamente etiquetada en la bolsa en la cual el usuario la trae y registrada en el
formato LAS-TMM-F04 (ver anexo 1); en un ambiente aséptico debe ser
homogenizada en un tamiz mesh 10 (estéril) y de nuevo guardada en una bolsa
plástica hermética y estéril, se debe almacenar a 4ºC hasta su análisis que deberá
hacerse en el menor tiempo.
4.3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.
4.3.1. Materiales
� Cajas de Petri
� Asas microbiológicas y de Hockey
� Tubos de ensayo y gradilla
� Erlenmeyer, beaker
� Frascos taparrosca autoclavables
� Pipetas graduadas de 1, 5, y 10mL
� Micropipeta de 10-100µL y puntas
� Mecheros Bunsen
� Probeta de 50, 100 y 1000mL
4.3.2. Reactivos
� Agua destilada
� Agar agar
� KH2PO4
� Extracto de levadura
� MgSO4.7H2O
� Extracto de suelo
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� HCl 0.1N
� Solución de NaCl 0.85%
� Diluciones 10-1 hasta 10-5
4.3.3. Equipos
� Balanza analítica
� Agitador magnético con calentamiento
� Autoclave
� Incubadora
� Nevera
4.4. NORMAS DE SEGURIDAD Y RECOMENDACIONES.
4.4.1. Seguridad. En un laboratorio de microbiología se trabaja con
microorganismos que pueden ser patógenos, por tanto, hay que seguir unas
normas estrictas de higiene y seguridad. Este trabajo requiere una técnica
aséptica y por tanto ambiente limpio y ordenado.
4.4.2. Recomendaciones. Todo el material a emplearse debe estar exento de
impurezas y estéril. Usar siempre guantes y tapabocas que deberán desecharse
una vez terminado el trabajo. Al manejar una muestra debemos evitar que
microorganismos ajenos a los cultivos, la contaminen, o que los microorganismos
de la muestra nos contaminen a nosotros. Los microorganismos deben manejarse
siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios
por el laboratorio, ya que se pueden crear corrientes que originen contaminaciones
o producir accidentes. No se debe pipetear nunca con la boca. Usar siempre
pipeteadores manuales. Dentro del laboratorio se utilizará una bata blanca (para
proteger la ropa) que habrá que quitarse al abandonar la sala de trabajo. Durante
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las prácticas no se puede comer, fumar ni beber. Los cabellos largos deberán
estar recogidos. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse
las manos a la boca, nariz, ojos. Evitar hábitos como llevarse a la boca
instrumentos, lápices, etc. todo ello para evitar riesgos de contaminación. Las
mesas de trabajo se desinfectan diariamente al iniciar y terminar el trabajo y cada
vez que sea necesario (derrame de productos contaminados). Seguidamente se
lavarán las manos cuidadosamente con agua y jabón. El cultivo con que se trabaja
puede no ser patógeno, manéjelo como si lo fuera.
5. PROCEDIMIENTO
Pesar 5g de caseína, 0,05g de extracto de levadura 0,75g de KH2PO4, 0,25g de
MgSO4.7H2O, 25 mL de solución de NaCl 0,85%, 7,5g de agar, 475mL de extracto
de suelo, todo esto se adiciona a un erlenmeyer de 1L. Llevar a ebullición hasta
disolución completa, ajustar el pH a 6,8. Esterilizar en autoclave a115ºC durante
20 minutos. Servir en cajas de Petri. Una vez hayan solidificado llevar a la nevera
durante para una mejor solidificación. Para sembrar, tomar 0.1mL de la dilución
10-1, adicionar sobre la caja de Petri que debe estar a temperatura ambiente
sembrar por superficie con el asa de Hockey; repetir el procedimiento de igual
manera con las otras diluciones. Incubar a 28ºC durante 48h. Para revelar los
halos de proteólisis se adiciona a la superficie HCl 0.1N durante 5 minutos. Contar
UFC que presenten reacción positiva en el agar (colonias con halo). Se hacen tres
repeticiones por cada dilución. (Ver anexo 2).
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
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5.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
5.1.1. Preparación de diluciones: La dilución 10-1, se prepara adicionando 10g
de la muestra de suelo a analizar en un frasco que contiene 90mL de NaCl 0.85%.
La dilución 10-2 se prepara tomando 1mL de la dilución 10-1 y agregándolo a un
tubo de ensayo con 9mL de NaCl 0.85%. La dilución 10-3 se prepara tomando 1mL
De la dilución 10-2 y adicionándolo a un tubo de ensayo con 9mL de NaCl 0.85%.
Las otras dos diluciones se preparan de igual manera. (Ver anexo 3).
5.1.1.1. Solución salina (NaCl 0.85%). Pesar 8.5g de NaCl y aforar a 1000mL
con agua destilada. (Ver anexo 4).
5.1.2. Preparación de extracto de suelo. Pesar 100g de un suelo cualquiera,
pasarlo por un tamiz Nº 10, mezclarlo con 900mL de agua destilada, agitar y dejar
reposar por 3 días, filtrar la solución y esterilizarla. (Ver anexo 5).
5.1.3. Preparación de HCl 0.1N. Tomar 10mL de HCl 1.0N y aforar a 100mL. (Ver
anexo 6).
5.2. REGISTRO DE DATOS
Utilizar el formato LAS-TRE-F07 para registrar los datos del ensayo de la
identificación de microorganismos proteolíticos. (Ver anexo 8).
5.3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
Seleccionar las cajas que presenten entre 20 y 200 UFC con halo de degradación.
Contar todas las colonias seleccionada de cada caja. Si corresponden a la misma
dilución hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicar por el factor de
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dilución. Si cajas de dos diluciones consecutivas se encuentren en el rango 20 y
200 colonias, se hace el recuento para cada una de las diluciones, y se reporta la
media aritmética de las dos diluciones, a menos que el recuento mayor contenga
dos veces al menor, en este caso se reporta el recuento menor.
Si no hay presencia de colonias en las cajas correspondientes a la dilución mas
concentrada se informa como menor de 1 multiplicado por el valor de la dilución.
InoculadoVolumenDiluciónInversoColoniasN
gsuelo
CFU ..º.
.. ××=
5.4. REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonia por gramo de
suelo (U.F.C. / g de suelo) y se le entregan los resultados al usuario en el formato
LAS-TRE-F07 (ver anexo 8).
6. RESPONSABLES
La responsabilidad recae sobre el analista el cual debe seguir la metodología
establecida para el análisis.
7. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
El formato para diligenciar este documento es el establecido por la norma cero del
Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y Foliares de la Universidad
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IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
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Código: LAS-PDE- 08
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Tecnológica de Pereira, llamada: Requisitos generales de competencia de
laboratorios de ensayo y calibración, Norma Técnica Colombiana NTC-ISO-IEC
17025.
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ANEXOS
Anex
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LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍM
ICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO DE RECEPCIÓN DE M
UESTRAS PARA ANALISIS M
ICROBIOLÓGICO
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Código: LAS - TMM - F04
Vigencia: Abril 2009
# LAB
SOLICITANTE
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MUNICIPIO
VEREDA
CULTIVO
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PROFUNDIDAD DE
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Código: LAS-PDE- 08
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Anexo 2. Flujograma de procedimiento para siembra de microorganismos
proteolíticos.
Agregar 950mL de extracto de suelo y 50mL de NaCl 0.85% (ver anexo 3 y 4)
Llevar a ebullición para disolución completa
Ajustar pH a 6.8
Esterilizar en autoclave a 115ºC por 20 minutos
Enfriar, servir en cajas de Petri y dejar solidificar
Inocular cada caja con 0,1mL de cada una de las diluciones decimales
consecutivas (ver anexo 2)
Pesar 10g de caseína, 0.1g de extracto de levadura, 1.5g de KH2PO4, 0.5g MgSO4, 15g de agar.
Inicio
A
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
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Código: LAS-PDE- 08
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Sembrar por superficie con asa de Hockey, invertir las cajas e incubar a
28ºC durante 48 horas
A
Fin
Revelar los halos de proteólisis adicionando HCl 0.1N a la superficie de
la caja por 5 minutos (ver anexo 5)
Contar UFC que presenten halo de proteólisis
Registrar el número total de colonias en el formato
LAS-TRE-F06
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IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
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Código: LAS-PDE- 08
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Anexo 3. Flujograma para la preparación de diluciones.
Tomar 1mL de esta dilución y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL de NaCl
0.85% estéril (dilución 10-2)
Tomar 1mL de la dilución 10-2 y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL de NaCl
0.85% estéril (dilución 10-3)
Tomar 1mL de la dilución 10-3 y agregar a un tubo de ensayo que contiene 9mL de NaCl
0.85% estéril (dilución 10-4)
Tomar 1mL de la dilución 10-4 y agregar 9mL de NaCl 0.85% estéril (dilución 10-5)
Inicio
Pesar 10g de suelo y mezclar con 90mL de NaCl 0.85% (dilución 10-1)
Fin
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PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 08
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Anexo 4. Flujograma para la preparación de solución salina 0.85%.
Anexo 5. Flujograma para la preparación de extracto de suelo.
Llevar a 1L con agua destilada
Fin
Pesar 8.5g de NaCl
Inicio
Mezclar con 900mL de agua destilada y dejar en reposos tres días
Filtrar y esterilizar
Fin
Inicio
Pesar 100g de suelo
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IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
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Código: LAS-PDE- 08
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Anexo 6. Flujograma para la preparación de HCl 0.1N.
Aforar a 100mL con agua destilada
Inicio
Tomar 10mL de HCl 1.0N
Fin
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Anex
o 7. F
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LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍM
ICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FORMATO INTERNO PARA REGISTRO DE DATOS M
ICROBIOLÓGICOS
Versión 01
Página 17 de 1
Código: LAS – TRE- F06
Vigencia: Abril 2009
Conteo de UFC
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Dilución 10-1
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Cód
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Anex
o 8. F
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icrobiológicos.
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍM
ICO DE SUELOS Y FOLIARES
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
INFORME DE ENSAYO
Versión: 01
Página 1 de 1
Código:
LAS-TRE-F07
Vigencia: Abril 2009
Solicitante_____
_________________
___
Finca ______
________
Tipo de m
uestra _______________
Fecha ejecución del ensa
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________
__
Dpto. ________
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Tipo de análisis _______
____
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Fecha de impresión _____________
Municipio ____________
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# de muestras ___________
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Fecha de registro ________
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Vereda _______
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Cultivo ______________
_
# de registro ___________
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Teléfono ______________
Densidad ______________
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GRUPO FUNCIONAL
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Degradadores de Urea
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GERMAN ANTONIO M
UNERA VELEZ
Universidad Tecnológica de Pereira – Escu
ela de Tec
nología Quím
ica – Vereda la Julita – Teléfono (6) 3213295
LABORATORIO DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUELOS Y FOLIARES DE LA UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL MÉTODO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS EN SUELOS
Versión: 01 Fecha de edición: 2009-04-01
Código: LAS-PDE- 08
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Anexo 9. Desechos. Los residuos de medios, muestras, microorganismos,
guantes, tapabocas y demás, deben depositarse en bolsas especiales marcadas
como “Residuos biológicos” y no se deben mezclar con las demás basuras. Se
deberá contar con una empresa especializada en la recolección y manejo de este
tipo de residuos.
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