obtención de extractos proteicos 1) separación de la biomasa

Obtención de extractos proteicos1) Separación de la biomasa

Centrifugación

2) Ruptura o permeabilización celularMecánicos y no mecánicos

• Métodos no mecánicos– Agentes químicos

• Solventes orgánicos• Detergentes• Álcalis

– Enzimáticos• Lizozima, glucanasas,

etc

Métodos mecánicos- French Press y Sonicación– Ventajas

No se agregan compuestos adicionalesEconómicos a gran escala

– DesventajasDebe controlarse la temperatura y la

formación de espuma que pueden llevar a la desnaturalización de proteínas

French press (pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio)

Sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido)

French press

La gran diferencia de presión (del orden de 20000 a 40000 psi) genera el flujo celular través de un orificio pequeño generándose grandes esfuerzos de corte que rompe las células.

Se puede utilizar un volumen grande de sedimento bacteriano (> 10 ml) de manera rápida y eficiente.

El pistón debe ser enfriado antes de su uso debido a la acumulación de temperatura

Sonicación

Un sistema mecánico produce vibraciones de alta intensidad que generan ondas de ultrasonido (aprox 20 kHz). La trasmisión de estas vibraciones en el medio líquido rompe las células

Tras la ruptura celular o bien, si se requiere, durante el proceso de ruptura,se utiliza un buffer de extracción para solubilizar las proteínas. Puedenutilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones específicos paraproteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se pretendepurificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay quecuidar que la enzima no se desnaturalice.

Ejemplo de buffer de extracción:

-Tris 50 mM pH8

- NaCl 100 mM

- DTT 1 mM (agente reductor)

- PMSF 0.1 mM (inhibidor de serín-proteasas)

Mantener la temperatura a: 4 °C

Centrifugación para clarificar sobrenadante con el extracto de proteínas solubles (10.000–15.000 rpm)

Extractos de proteinas: como los estudiamos????

Cuanta proteína tengo?? Está pura? Tiene subunidades? Qué peso molecular tiene? Está activa?

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

1) Geles desnaturalizantes (SDS-PAGE)

2) Geles nativos

3) Geles en dos dimensiones (2D)

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE):técnica que permite separar moléculas cargadas por aplicación de un campo eléctrico.

SDS-PAGE: condiciones desnaturalizantes (porque se agrega un detergente iónico con carga(-) que es el dodecilsulfato de sodio=SDS 0.1 %) que desnaturaliza las prot. (pierden estruct.2daria y terciaria) y se une a las proteínas cargándolas negativamente a igual densidad decarga. Y condiciones reductoras (se agrega 2- mercaptoetanol o DTT) para reducir puentesdisulfuro y disociar las subunidades de las proteínas. Al aplicar una corriente eléctrica lasmoléculas migran hacia el ánodo, los complejos proteína-SDS migrarán según su PesoMolecular

+ CALOR a 90º-100ºC 5 min

Proteínas desnaturalizadas

SISTEMA DE LAEMMLI (DISCONTINUO: GEL DE CONCENTRACIÓN Y GEL DE SEPARACIÓN)

Acrilamida + bisacrilamida (30:0.8): forman un polímero que con el agregado de APS (persulfato de amonio, agente polimerizante y TEMED (catalizador de la polimerización) generan un gel en presencia de Tris-ClH (buffer), glicina y en el caso de geles desnaturalizantes, SDS.

Gel de concentración

glicina

Gel de concentración: concentra las muestras (menor concentración de poliacrilamida 5%, mayor tamaño del poro, pH 6.8)

Gel de separación: separa las muestras (mayor concentración de poliacrilamida 10-15%, pH 8.8, favorece la movilidad)

Las muestras se calientan o hierven en presencia de un buffer, SDS, β-mercaptoetanol, glicerol (importante porque le dá peso a la muestra para que caiga adentro del pocillo) y colorante azul de bromo fenol para monitorear el frente de la corrida, y se siembran en el gel

Gel: Teñido con azul de Coomassie: proteínas separadas de acuerdo a su PM

Corrida electroforética

Tinción

Un polipéptido individual se puede aislar por electroelución y determinar su secuencia de aminoácidos

Las glicoproteínas pueden tener una migración anómala. El PM se determina por otros métodos como filtración en gel.

Estimación del PM de proteínas: nº de aminoácidos x 110-120 dalton

Rango de separación de SDS-PAGE% acrilamida Rango de

separación (kDa)

6 50-200

8 30-95

10 20-80

12 12-60

15 10-43

Una vez finalizada la electroforesis podemos teñir el gel para visualizar las proteínas, o transferirlas a una membrana para hacer western blot

Si las proteínas a separar son mayores a 200 kDa se pueden preparar Geles en gradiente que tienen entre 5-25% de acrilamida en el mismo gel.

Visualización del gel: tincionesTinción con el colorante Azul de Coomassie: se une a residuos básicos e hidrofóbicos de las proteínas. Detecta aprox. 0.2 microgramos de proteína .

Tinción con plataLas proteínas reducen la plata soluble generando un precipitado inicial de Ag. Se agregan reductores para intensificar la señal. Es 100 veces más sensible: 0.2 ng

Ag+ solubleReducción

Ago insoluble

PAGE en condiciones nativasLas proteínas se separan en función de su masa, su carga (al PH 8 de corrida tienen cargas negativas la mayoría de las proteínas) y también su forma tridimensional que genera fricción sobre el gel

Mantiene a las proteínas en su conformación nativa y pueden mantenerse activas (podemos hacer una tinción y ver actividad). Se realiza en frío

No se utilizan detergentes ni agentes reductores

No separa las proteínas en subunidades

Nos permite evaluar la pureza de una muestra: Ej

- Dos proteínas del mismo PM van a migrar separadamente.

- Una proteína multimérica migrará como una banda única

ISOELECTROENFOQUE:

Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparación moléculas ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente, y cuando alcanzan una región en la cual el pH es igual al punto isoeléctrico, ésta detiene su avance. Se consigue la separación de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoeléctrico.

IsoelectroenfoqueSe genera y mantiene un gradiente de pH en un gel utilizando anfolitos o inmobilinas con PI que abarcan un rango de PH y se aplica un campo eléctrico para generar el gradiente. Los anfolitos con oligoaminos y oligocarboxilos de 600-900 Da.

Las proteínas migran hasta ubicarse en el pH que corresponda con su pI. Resuelve ΔpI = 0.02

2-D electroforesisPrimera dimensión se separan por su PI en condiciones nativas y la segunda en condiciones desnaturalizantes, se separan de acuerdo al PM. Podemos identificar miles de proteínas. Se usa en los estudios del proteoma, también para distiguir modificaciones post-traduccionales (acetilaciones, glicosilaciones, fosforilaiones), polimorfismos, distintos alelos, estados de activación, etc.

Western Blot o InmunoblottingEl gel no se tiñe, se transfiere a una membrana

Detección por transferencia a membrana y revelado por anticuerpos- Alta resolución de la electroforesis de proteínas- Especificidad de los anticuerpos- Sensibilidad de las reacciones enzimáticas

( Detecta nanogramos de una proteína)

Transferencia de las proteínas del gel a una membrana

• Nitrocelulosa

• Nylon

• PVDF (polifluoruro de vinilideno)

membrana

IMPORTANTE:Utilizar guantes SIEMPRE y pinzas planas para el manejo de la membranaMinimizar el contacto con la membrana

Transferencia a membrana

Frente de corrida (colorante azul de bromo fenol)

Transferencia a membrana

100 V

1-2 horas

Pasos del revelado (1-4)

1) Bloqueo de la membrana

(con exceso de proteínas: leche (caseína), albúmina.

2) Incubación con 1er anticuerpo(específico) que reconozca la proteína desnaturalizada.

3) Incubación con 2do anticuerpoligado a una enzima

Lavado para remover exceso de 1er anticuerpo

Lavado para remover exceso de 2do anticuerpo

4) Incubación con sustrato

C. Fluorescencia: 2do anticuerpo unido a un fluoróforo. Se requiere equipamiento especial

Detección colorimétricaReactivos cromogénicos

Ejemplo: enzima: fosfatasa alcalina, sustrato: NBT/BCIP precipitado insoluble(formazán color azul-violeta)

Fosfatasa alcalina

Purificación de G6PD recombinante

Inoculación de la proteína a un conejo.

Análisis de los sueros por Western blot.

Tinción con Azul de Coomassie de los eluatos obtenidos por purificación en resina de Ni-NTA.

Western blot con Ac anti tag de HistidinaPre-inmune 1/200 1/500

Obtención de anticuerpos policlonales contrala G6PD de E. coli.

Reactivos quimioluminiscentes

Ejemplo: enzima peroxidasa (HRP) con sustratos: luminol + peróxido luz

Detección quimioluminiscente