métodos de secuenciación - genética...
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Meacutetodos de
secuenciacioacuten
Patricia V Agostino
Meacutetodos de secuenciacioacuten
Sanger dideoxy (primer extensionchain-
termination) method
Protocolo maacutes conocido de secuenciacioacuten adaptable a
proyectos de secuenciacioacuten a gran escala
Maxam-Gilbert chemical cleavage method
Marcacioacuten y clivaje del DNA de forma secuencia-
especiacutefica Protocolo no faacutecilmente escalable y tedioso
Meacutetodos maacutes modernos
Secuenciacioacuten por siacutentesis
Secuenciacioacuten por ligamiento
Pirosecuenciacioacuten
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger(1977 F Sanger y W Gilbert - DNA Sequencing)
iquestQueacute se necesita
1) Templado de DNA simple cadena (ssDNA antes con
fagoM13 en la actualidad por PCR)
2) ldquoPrimerrdquo complementario al extremo del DNA
3) DNA polimerasa (carente de actividad exonucleasa)
4) Deoxinucleoacutetidos trifosfato (dNTPs) y
dideoxinucleoacutetidos trifosfato (ddNTPs)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
DNA simple cadena 5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
a) Annealing del primer
Pasos
b) Extensioacuten del
primer por la DNA
polimerasa en
presencia de los 4
dNTPs con una
cantidad limitada
de un dideoxi NTP
(ddNTP)
5rsquo
3rsquo
Direccioacuten
de avance
de la
polimerasa
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Cuando un ddNTP se incorpora a la cadena de DNA
en crecimiento esta cadena no puede continuar
elongaacutendose (ya que la DNA pol necesita un extremo 3rsquo OH para
antildeadir el siguiente nucleoacutetido)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
T T TT
ddA
ddA
ddA
ddA
Ejemplo ddATP
Cuando haya una T
en el templado
ocasionalmente se
agregaraacute un ddA a
la cadena en
crecimiento
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodos de secuenciacioacuten
Sanger dideoxy (primer extensionchain-
termination) method
Protocolo maacutes conocido de secuenciacioacuten adaptable a
proyectos de secuenciacioacuten a gran escala
Maxam-Gilbert chemical cleavage method
Marcacioacuten y clivaje del DNA de forma secuencia-
especiacutefica Protocolo no faacutecilmente escalable y tedioso
Meacutetodos maacutes modernos
Secuenciacioacuten por siacutentesis
Secuenciacioacuten por ligamiento
Pirosecuenciacioacuten
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger(1977 F Sanger y W Gilbert - DNA Sequencing)
iquestQueacute se necesita
1) Templado de DNA simple cadena (ssDNA antes con
fagoM13 en la actualidad por PCR)
2) ldquoPrimerrdquo complementario al extremo del DNA
3) DNA polimerasa (carente de actividad exonucleasa)
4) Deoxinucleoacutetidos trifosfato (dNTPs) y
dideoxinucleoacutetidos trifosfato (ddNTPs)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
DNA simple cadena 5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
a) Annealing del primer
Pasos
b) Extensioacuten del
primer por la DNA
polimerasa en
presencia de los 4
dNTPs con una
cantidad limitada
de un dideoxi NTP
(ddNTP)
5rsquo
3rsquo
Direccioacuten
de avance
de la
polimerasa
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Cuando un ddNTP se incorpora a la cadena de DNA
en crecimiento esta cadena no puede continuar
elongaacutendose (ya que la DNA pol necesita un extremo 3rsquo OH para
antildeadir el siguiente nucleoacutetido)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
T T TT
ddA
ddA
ddA
ddA
Ejemplo ddATP
Cuando haya una T
en el templado
ocasionalmente se
agregaraacute un ddA a
la cadena en
crecimiento
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger(1977 F Sanger y W Gilbert - DNA Sequencing)
iquestQueacute se necesita
1) Templado de DNA simple cadena (ssDNA antes con
fagoM13 en la actualidad por PCR)
2) ldquoPrimerrdquo complementario al extremo del DNA
3) DNA polimerasa (carente de actividad exonucleasa)
4) Deoxinucleoacutetidos trifosfato (dNTPs) y
dideoxinucleoacutetidos trifosfato (ddNTPs)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
DNA simple cadena 5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
a) Annealing del primer
Pasos
b) Extensioacuten del
primer por la DNA
polimerasa en
presencia de los 4
dNTPs con una
cantidad limitada
de un dideoxi NTP
(ddNTP)
5rsquo
3rsquo
Direccioacuten
de avance
de la
polimerasa
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Cuando un ddNTP se incorpora a la cadena de DNA
en crecimiento esta cadena no puede continuar
elongaacutendose (ya que la DNA pol necesita un extremo 3rsquo OH para
antildeadir el siguiente nucleoacutetido)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
T T TT
ddA
ddA
ddA
ddA
Ejemplo ddATP
Cuando haya una T
en el templado
ocasionalmente se
agregaraacute un ddA a
la cadena en
crecimiento
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
DNA simple cadena 5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
a) Annealing del primer
Pasos
b) Extensioacuten del
primer por la DNA
polimerasa en
presencia de los 4
dNTPs con una
cantidad limitada
de un dideoxi NTP
(ddNTP)
5rsquo
3rsquo
Direccioacuten
de avance
de la
polimerasa
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Cuando un ddNTP se incorpora a la cadena de DNA
en crecimiento esta cadena no puede continuar
elongaacutendose (ya que la DNA pol necesita un extremo 3rsquo OH para
antildeadir el siguiente nucleoacutetido)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
T T TT
ddA
ddA
ddA
ddA
Ejemplo ddATP
Cuando haya una T
en el templado
ocasionalmente se
agregaraacute un ddA a
la cadena en
crecimiento
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
b) Extensioacuten del
primer por la DNA
polimerasa en
presencia de los 4
dNTPs con una
cantidad limitada
de un dideoxi NTP
(ddNTP)
5rsquo
3rsquo
Direccioacuten
de avance
de la
polimerasa
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Cuando un ddNTP se incorpora a la cadena de DNA
en crecimiento esta cadena no puede continuar
elongaacutendose (ya que la DNA pol necesita un extremo 3rsquo OH para
antildeadir el siguiente nucleoacutetido)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
T T TT
ddA
ddA
ddA
ddA
Ejemplo ddATP
Cuando haya una T
en el templado
ocasionalmente se
agregaraacute un ddA a
la cadena en
crecimiento
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Cuando un ddNTP se incorpora a la cadena de DNA
en crecimiento esta cadena no puede continuar
elongaacutendose (ya que la DNA pol necesita un extremo 3rsquo OH para
antildeadir el siguiente nucleoacutetido)
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
T T TT
ddA
ddA
ddA
ddA
Ejemplo ddATP
Cuando haya una T
en el templado
ocasionalmente se
agregaraacute un ddA a
la cadena en
crecimiento
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
5rsquo3rsquo
5rsquo 3rsquo
T T TT
ddA
ddA
ddA
ddA
Ejemplo ddATP
Cuando haya una T
en el templado
ocasionalmente se
agregaraacute un ddA a
la cadena en
crecimiento
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
El resultado es una serie de fragmentos
de distinta longitud en cada tubo
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Radioactividad
Primers marcados (kinasa con 32P)
dNTPs marcados (35S o 32P)
bull Fluorescencia
ndash ddNTPs marcados por fluorescencia
ndash Cada uno de los 4 ddNTP fluorece a distinta longitud de onda permitiendo su identificacioacuten
Visualizacioacuten de los fragmentos de DNA
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
Anaacutelisis de los fragmentos
de DNA por SDS-PAGE y
marca radioactiva del
primer o de los dNTPs
ddNTP diferentes usados en
reacciones separadas
Lectura
Con esta teacutecnica en 1977
Sanger secuencioacute el primer
genoma viral de DNA X174
de aprox 5 500 pb
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodo de Maxam-Gilbert (1977)
Se necesita
-DNA marcado en un
extremo
-Una base modificada
(ej metil-guanina) por
cadena de DNA
-Un agente que cliva la
base modificada (ej
piperidina)
Esta reaccioacuten se realiza para
otras bases (A+G C y C+T)
Se muestra ejemplo para G
(Guanina metilada)
Los productos se detectan por
electroforesis de forma similar
que en el meacutetodo de Sanger
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
1-Se desnaturaliza el DNA
2-Se marca el extremo 5rsquo con
radioactividad
3-La muestra se divide en cuatro
aliacutecuotas que son tratadas con
diferentes reactivos quiacutemicos que
cortan al DNA en G (piperidina)
A+G (aacutecido foacutermico) C+T
(hidracina) C (hidracina + NaCl)
4-En cada aliacutecuota queda una
coleccioacuten de fragmentos de DNA de
diferente tamantildeo que termina en
una base especiacutefica
5-Los fragmentos se separan
electroforeacuteticamente en un gel de
poliacrilamida y se visualizan y
analizan por medio de una
radiografiacutea
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Sanger y Gilbert recibieron el premio
Nobel en 1980
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Nuevo meacutetodo de secuenciacioacuten de Sanger
1982 F Sanger ndash Shotgun Sequencing
(Se agrega un nuevo protocolo)
Se secuencia el genoma del bacteriofago
lambda (48502 nucleoacutetidos primer
genoma secuenciado con este meacutetodo)
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Shotgun Sequencing
Permite
secuenciar
fragmentos
grandes de
DNA
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Secuenciacioacuten automatizada
1987 ndash Primer
secuenciador
ABI 370
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Secuenciacioacuten
automatizada
Durante la electroforesis los
fragmentos migran de acuerdo a su
tamantildeo el fluoroacuteforo con el que
van marcados es detectado por un
laacuteser el cual enviacutea una sentildeal que
es interpretada por el equipo en
forma de un pico en un
ldquoelectroferogramardquo
(electropherogram)
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Secuenciacioacuten automatizada +
amplificacioacuten por PCR
94-95degC desnaturalizacioacuten
45-55degC annealing
68-75degC extensioacuten
25-35 ciclos
Ventajas se requiere
mucha menor cantidad de
DNA molde
Desventajas la DNA pol
termoestable incorpora
ddNTPs de forma poco
eficiente
Ligation mediated PCR (LMPCR)
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
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Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Nueva generacioacuten de meacutetodos de
secuenciacioacuten
Secuenciacioacuten por siacutentesis (SBS)
Secuenciacioacuten por ligamiento (SBL)
Pirosecuenciacioacuten
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Para leer
Nat Rev Genet 2016 May 1717(6)333-51 doi 101038nrg201649
Coming of age ten years of next
generation sequencing technologies
Goodwin S1 McPherson JD2 McCombie WR1
Secuenciacioacuten
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Meacutetodos para estudiar la interaccioacuten
DNA-proteiacutena
Electrophoretic mobility shift assay
(EMSA)
DNA footprinting assay
Yeast one hybrid system
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay
Luciferase reporter assay
Etc
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Interaccioacuten proteiacutena-DNA
Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) Retraso de migracioacuten en gel
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Interaccioacuten proteiacutena-DNA permite identificar la regioacuten de unioacuten de una
proteiacutena al DNA
DNA Footprinting
Meacutetodos maacutes populares DNAse footprinting dimethylsulfate (DMS)
footprinting and hydroxyl radical footprinting
Ejemplo de DNAse
footprinting
Se compara
contra un DNA
control sin el
agregado de la
proteiacutena
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
Doble hiacutebrido
a) Activacioacuten estaacutendar de la
transcripcioacuten El dominio de
unioacuten al DNA (BD) se une al
dominio de activacioacuten (AD)
estimulando la transcripcioacuten
b) Ensayo de doble hiacutebrido Se
fusiona la proteiacutena X a un
dominio BD y la proteiacutena Y a un
dominio AD Se introduce en
levaduras
BD muy usado Gal4
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
DNA-protein interactionsYeast one-hybrid system
Protein-protein interactionsYeast two-hybrid system
RNA-protein interactionsYeast three-hybrid system
Explicado en Brent R Finley RL Jr (1997) Understanding gene and allele
function with two-hybrid methods Annu Rev Genet 31663-704
Interaction of proteins X and Y
upstream of a reporter gene in
yeast leads to transcription
activation
DB = DNA binding domain (ie from Gal4)
AD = activation domain
Meacutetodos de identificacioacuten
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Ejemplo de DNAse
footprinting
Permite identificar
muacuteltiples proteiacutenas
asociadas con una
regioacuten especiacutefica
del genoma
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
Luciferase Reporter Assay
Ejemplo
Goya et al 2016 PNAS 113(48)E7837-E7845
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