laboratorio de calidad nutricional validaciÓn de...
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• Es un consorcio de instituciones que aspira reducir la desnutrición y mejorar la seguridad alimentaria nutricional en América Latina y el Caribe.
• AgroSalud trabaja en la investigación de cultivos biofortificados (Maíz, Fríjol, Arróz y Camote).
• En este momento AgroSalud esta en el lanzamiento del primer laboratorio en Sur América, especializado en medir la absorción de hierro, zinc, proteína, y vitamina A, a través de métodos in vitro en alimentos mejorados genéticamente.
• OBJETIVOS
• TÉCNICA ANALÍTICA
• VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
• ANÁLISIS Y RESULTADOS
• CONCLUSIONES
OBJETIVOSValidar un método analítico para determinar el
contenido de proteína soluble, el cual es un
indicador del grado de biodisponibilidad.
Cuantificar la cantidad de proteína soluble que se
encuentra en muestras de fríjol y maíz.
Alcanzar uno de las primeras metas necesarias
para poder cumplir con las BPL.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALITICO
VALIDAREs verificar documentalmente que un método cumple con los requisitos establecidos.
PARÁMETROS DE VALIDACIÓN* Linealidad * Selectividad
* Precisión * Robustez
* Exactitud * Sensibilidad
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
LINEALIDADEs la capacidad del método analítico de obtener resultados directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de un rango definido.
PRECISIÓNExpresa el grado de dispersión entre una serie de mediciones múltiples de una muestra homogénea bajo condiciones establecidas.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
PRECISIÓNPRECISIÓN
Precisión IntermediaPrecisión IntermediaRepetitblidadRepetitblidad
RepetibilidadInstrumentalRepetibilidadInstrumental
Repetibilidaddel Método
Repetibilidaddel Método
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
EXACTITUDExpresa la cercanía entre el valor aceptado convencionalmente como valor verdadero y el valor experimental encontrado.
SENSIBILIDADLa sensibilidad de un método corresponde a la
mínima cantidad de analito que puede producir un
resultado significativo.
ANALISIS Y RESULTADOSLINEALIDAD
y = 0.0061x + 0.0573R2 = 0.9976
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 20 40 60 80 100 120
Concentración de proteína (mg/L)
Abs
orba
ncia
Se realizó la curva
de calibración en el
intervalo de
20 a 100 mg/L de
proteína. Cada
punto de la curva se
realizó por
triplicado.
LINEALIDADTest de Cochran, homogeneidad de varianzas
Gcalculado =0.5414 ; Gtablas (P = 0.05; K=5; n=3)= 0.6838
Gcalculado< Gtablas , las variancias de las concentraciones son homogéneas, el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.
Se observa que la distribución de los residuales, es completamente aleatoria
Normalidad de los residuales
-0.02
-0.01
0.00
0.01
0.02
0 30 60 90 120
Concentración (mg/L)
Res
idua
les
No se observa ninguna tendencia
ANÁLISIS DE VARIANCIA, ANOVAANOVA
gl SS MS F Significance FRegresión 1 0.146490678 0.146490678 1229.60 5.09983E-05Residual 3 0.000357411 0.000119137Total 4 0.146848089
Ho = “El cuadrado medio de la regresion fue igual al cuadradomedio residual”
Ha = “El cuadrado medio de la regresion fue diferente al cuadradomedio residual”Fcalculado = 1229.90 ; Ftablas (P = 0.05) = 5.1E-05
Fcalculado > Ftablas
Existe correlación muy significativa entre x e y
TEST DE VERIFICACIÓN DE LA PENDIENTE
Ho = “La pendiente no es significativamente diferente de cero”.
Ha = “La pendiente es significativamente diferente de cero”.
tcalculado = 36.22; ttablas (P = 0.05; n = 5) 3.182 tcalculado> ttablas
Existe diferencia significativa entre la pendiente y cero.Intervalo de confianza de la pendiente
0.00623 ± 0.00055 (0.00568; 0.00678) y se observa que este intervalo no incluye el cero.
TEST DE VERIFICACIÓN DE LA VARIABLE INDEPENDIENTE O DE PROPORCIONALIDAD
Ho = “No existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.
Ha = “Existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.
tcalculado = 0.199 ttablas (P = 0.05; n = 5) 3.182 tcaculado < ttablas
La ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero
Intervalo de confianza del intercepto 0.018 ± 0.036 (-0.018, 0.054) y se observa que este intervalo
incluye el cero
PRECISIÓNMétodos establecidos por la AOAC (Association ofOfficial Analytical Chemist) para comparar coeficientes de variación.
))log(5.01(2(%) CCV −=% Analito Relación Unidades CV (%)
10 10E-1 10% 2.81 10E-2 1% 2.7
0.1 10E-3 0.10% 3.70.01 10E-4 100 ppm 5.30.001 10E-5 10 ppm 7.3
0.0001 10E-6 1 ppm 110.00001 10E-7 100 ppb 15
0.000001 10E-8 10 ppb 210.0000001 10E-9 1 ppb 30
Método 1 Método 2
Concentración (ppm) CV (%)20 7.240 6.4960 6.10
PRECISIÓN
Muestra1 2 3 4 5
CV (%) 1.08 0.39 0.59 0.22 0.40
REPETIBILIDAD DEL SISTEMA
CONCENTRACIÓN ( ppm)20 40 60
CV (%) DIA 1 8.03 7.89 3.96CV (%) DIA 2 8.36 5.78 2.80
REPETIBILIDAD DEL MÉTODO
Se observa que los coeficientes de variación
son inferiores de 8.4
Se calculó los coeficientes de variación para cada uno de los parámetros evaluados: Repetibilidad(sistema y método), Precisión Intermedia (método).
PRECISIÓN INTERMEDIA DEL MÉTODO
Dia 1 Dia 1 Dia 2 Dia 2 Dia 3 Dia 312.73 16.29 9.91 10.69 12.00 12.68
Analista # 1 14.11 13.61 10.65 10.88 11.79 12.3913.08 15.70 10.14 10.91 12.71 12.30
CV(%) 5.41 9.28 3.71 1.12 3.98 1.63Dia 1 Dia 1 Dia 2 Dia 2 Dia 3 Dia 310.14 10.21 6.87 8.90 9.57 9.51
Analista #2 9.74 12.27 7.20 8.56 10.04 9.1810.81 12.81 8.72 9.20 9.66 9.81
CV(%) 5.26 11.67 12.97 3.58 2.60 3.30
Muestras de Maíz
PRECISION INTERMEDIA DEL MÉTODO
Día 1 Día 1 Día 2 Día 2 Día 3 Día 316.39 16.54 19.59 18.07 17.31 17.25
Analista # 1 18.29 16.76 19.49 20.56 18.68 18.0316.17 17.08 20.17 20.01 18.00 18.00
CV(%) 6.89 1.58 1.85 6.67 3.81 2.47Día 1 Dia 1 Día 2 Día 2 Día 3 Día 318.94 16.44 14.81 13.41 17.45 14.16
Analista #2 16.84 16.77 14.72 11.38 12.46 15.3916.07 20.51 15.50 11.68 14.82 13.33
CV(%) 8.58 12.61 2.87 9.00 16.72 7.24
Muestras de Fríjol
EXACTITUD
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
15 25 35 45 55 65
Concentración de proteina (mg/L)
Abs
orba
ncia
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Curva Patron
curva patrón muestra 1 muestra 2 muestra 3
pendiente 0.0061 0.0057 0.0059 0.0054
Muestra de Maíz
EXACTITUD
PRUEBA t STUDENT
Ho = “No hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curvapatrón.”
Ha = “Hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curvapatrón.”
tcalculado = -3.39 ; ttablas (P = 0.05;n =3) = 4.303tcalculado < ttablas
Estadísticamenta las pendientes obtenidas de lascurvas de adición de patrón son iguales a las de
la curva patrón.
No hay efectos de matriz en las muestrasanalizadas.
Concentración Teórica (mg/L)x x + 20 x + 40 x + 60
0.104 0.246 0.379 0.462Absorbancia 0.121 0.229 0.358 0.469
0.127 0.248 0.372 0.473Media 0.12 0.24 0.37 0.47CV(%) 10.17 4.33 2.89 1.19
Concentración Interpolación Recuperación(mg/L) (%)
20 0.156 79.1240 0.268 94.050.252
Respuesta exp neta - blanco
0.124
Metodo de adición de patrón
Para confirmar que la recuperación essatisfactoria se aplica un test de t.
Ho = “Que el 88.46 % de recuperación essignificativamente igual al 100 % de recuperación”
Ha = “Que el 88.46 % de recuperación essignificativamente diferente al 100 % de recuperación”
tcalculado = 2.17; ttablas (P = 0.05; n =2) = 4.30tcalculado < ttablas
Se concluye: el 88.46 % de recuperaciónrepresenta el 100 % de recuperación
EXACTITUD
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
15 25 35 45 55 65Concentración de proteina (mg/L)
Abs
orba
ncia
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Curva Patron
curva patrón muestra 1 muestra 2 muestra 3
pendiente 0.0061 0.0051 0.0059 0.0058
PARA FRÍJOL
EXACTITUD
• Prueba t Student
Ho = “No hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestras con adicion de patron y la pendiente de la curvapatron”.
Ha = “ Hay diferencias significativas entre laspendientes de las curvas de las muestra con adicion patron y la pendiente de la nueva curvapatron”.
.
tcalculado = -3.39 ; ttablas (P = 0.05; n = 3) 4.30
tcalculado < t tablas
Estadisticamenta las pendientes obtenidas de lascurvas de adición de patrón son iguales a la de la
curva patrón.
Se concluye que no hay efectos de matriz en lasmuestras analizadas.
Concentración Teórica (mg/L)x x + 20 x + 40 x + 60
0.160 0.310 0.446 0.496Absorbancia 0.158 0.289 0.399 0.507
0.202 0.297 0.404 0.506Media 0.173 0.299 0.416 0.503CV(%) 14.33 3.55 6.20 1.21
Concentración Interpolación Recuperación(mg/L) (%)
20 0.156 80.1940 0.268 90.5760 0.380 86.69
Media 85.81CV% 6.11
0.243
Respuesta exp neta - blanco
0.330
0.125
MÉTODO DE ADICIÓN DE PATRÓN
Para confirmar que la recuperación es satisfactoria se aplica un test de t.
Ho = “Que el 85.81 de recuperacionessignificativamente igual al 100 % de recuperacion”
Ha = “Que el 85.81 de recuperaciones significativamente igual al 100 % de recuperacion”
tcalculado= 4.0225 ttablas (α = 0.05; gl =2) = 4.303
tcalculado < t tablas
Se concluye: el 85.81 % obtenido representael 100 % de recuperación
SENSIBILIDAD
nbsyLD blbl 3+
=
Método de Bajas Concentraciones
Limite de detección = 4.8 mg/LLimite de cuantificación = 6.27 mg/L
nbsyLC blbl 10+
=
CONCLUSIONES
•De acuerdo a los análisis de linealidad, exactitud, precisión y sensibilidad se puede concluir que elmétodo de Lowry puede ser utilizado para la valoración cuantitativa de proteína en muestras de fríjol y maíz.
•Estos son los primeros pasos para lograr que elfuturo laboratorio de Agrosalud alcance la certificación.
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