isoelectroenfoque

ISOELECTROENFOQUE

EQUIPO 3

COQUIMATLÁN,COL; 12 DE FEBRERO DE 2014

Introducción

Una proteína tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un punto isoeléctrico (pI) que corresponde al valor de pH al cuál la molécula posee carga neta (z) igual a cero (zwitterion), y por lo tanto es inmóvil en un campo eléctrico.

Isoelctroenfoque

 FUNDAMENTO

se basa  en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH.

Esta técnica separa proteínas de acuerdo a sus puntos isoeléctricos.

Procedimiento

Se establece un gradiente de pH el gel de poliacrilamida.

Se adiciona una mezcla de ácidos y bases orgánicos de baja masa molecular (anfolitos); se deja que se distribuyan en el campo eléctrico generado a través del gel.

El gel suele tener urea, de concentración cercana a 6M, no posee carga y no puede afectar en forma directa la carga neta de las proteínas

Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH.

La región del ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH  tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango.

Se coloca una mezcla de proteínas en un pocillo de gel. Con la aplicación de un campo eléctrico, las proteínas entran el gel y se desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su pI.

Al aplicar la diferencia de potencial las proteínas que se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente, y migraran hacia el cátodo; mientras que aquellas que se encuentran en regiones de pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo.

Electroforesis bidimensional

Una vez enfocadas las proteínas de acuerdo a su pI, se

separan por tamaño en un gel de SDS-PAGE.

La electroforesis bidimensional separa proteínas con valores de PI similares pero con diferentes masas moleculares.

Se tiñen los geles

se adquieren las imágenes de los geles con un escáner de alta resolución se analizan con un software especializado.

Así se pueden comparar geles y observar cambios en el patrón de manchas:

Ventajas

Un anfolito siempre se detiene en la zona en la que el pH coincide con su punto isoeléctrico.

útil como herramienta analítica y preparativa.

Gran repetitividad: los resultados no están sujetos a variaciones debidas a las condiciones experimentales, tales como la diferencia de potencial eléctrico aplicada.

Gran poder de resolución.

La muestra se puede colocar en cualquier zona del medio de soporte, en la zona cercana al cátodo, al ánodo o en el centro del mismo.

Bibliografía

http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Electroforesis%202D%20(IEF+SDS-PAGE).pdf

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.html

Lehninger, principios de Bioquimica 5° edicion pag. 90

Stryer, L., Berg, J.M., Tymoczko, J.L. (2008). (6ª edición). Bioquímica. Ed.: Reverté. Pag 73