gaussia luciferasa como marcador biológico

GAUSSIA LUCIFERASA COMO

MARCADOR BIOLÓGICO PARA

MONITOREO DE LA PROGRESIÓN

DEL TUMOR Y RESPUESTA AL

TRATAMIENTO DE LAS METÁSTASIS

A DISTANCIAIntegrantes:

• Cárdenas Ramírez, Vanessa

• Córdova Espinoza, Leidy

• Guardia Herrero, David

• Pérez Paucar, Pedro

• Sallo Valenzuela, Patty

• Robles , Paola

• Yaranga Rojas, Kathya

BIOLUMINISCEN

CIA

luciferaseLUZ=

Es la luz producida por una reacción química dentro de un organismo.Al menos 2 elementos se requieren. El que produce la luz "luciferina" y otro que cataliza la reacción "luciferasa.

la energía de una fuente de luz es absorbida y remitida como otro fotón.

es una radiación de vida media más prolongada y está asociada con la intensidad de la luz absorbida.

Algunas especies con actividad bioluminiscente

•Bacterias, Hongos, dinoflagelados,radiolarios, Cnidarios, Hydrozoa,Anthozoa, Ctenóforos, Nemertinos, udibranquios,pulpos, anélidos,picnogónidos, Quetognatos, crustáceos (Copépodos, Ostrácodos,Anfípodos, Eufásidos), Equinodermos, Tunicados, Larváceos, Peces•Ciempiés, Milpiés, Insectos

❶Gaussia, mide unos 27mm.Producen la luz cuando hacen ungiro al escaparse.

❷HidromedusaAequorea victoria

❸Dinoflagelado Pyrocystis fusiformis. ❹Japetella sp. la hembra usa subioluminiscencia alrededor de su boca, solocuando busca pareja.

❺Poliqueto Tomopteris sp.“Luminiscencia amarilla”. Cuando esperturbado muestra la ioluminiscenciaen sus parapodios.

❻Ctenóforo batipelágico Bathyctena sp.(2000 m). La bioluminiscencia amarillaaparece cuando el animal es perturbado.

CoelenteracinaEs una luciferina, molécula responsable de la emisión de luzen algunas bacterias , algas, hongos y animales.Es el sustrato de muchas luciferasas y fotoproteinasincluyendo luciferasa de Renilla reniformis (Rluc), Gaussialuciferase (Gluc), aequorina y obelina.

Gaussia luciferaseEs una proteína luminiscente con rendimientos cuánticos más altas que las luciferasas de Renilla sp. y luciérnaga. Es independiente de ATP, lo que requiere sólo coelenteracina y O 2 como sustratos.

Luciferasa de luciérnaga

Cáncer metastásico

•Cáncer que se ha diseminadode su lugar de origen a otrolugar en el cuerpo.•Los lugares más comunes demetástasis del cáncer son lospulmones, los huesos y elhígado.•El tratamiento del cáncermetastático depende,usualmente, del tipo de cáncer ydel tamaño, ubicación y númerode tumores metastáticos.

Glosario

◘Ortotópico: Que está situado en su lugar normal. Se usa confrecuencia para describir un tejido u órgano que se trasplanta a sulugar normal en el cuerpo

◘MDA-MB-231: una sublínea de la línea celular deadenocarcinoma de mama humano; es decir, células secultivaron con el fin de estudiar el papel de la acetilación yextra-celular ubicación de 90alpha proteína de choquetérmico en la invasión de células tumorales.

Marcador biológico: molécula biológica que se encuentra enla sangre, otros líquidos o tejidos corporales, es un signo deun proceso normal o anormal, o de una afección oenfermedad

Glosario◘Inoculación: introducción de una sustancia en elcuerpo para producir o aumentar su inmunidadante una enfermedad o proceso asociado a dichasustancia.

◘Luminómetro: excelente para monitoreo delimpieza en planta, equipo portátil, su avanzadosistema permite leer la cantidad de ATP , cuentacon un software para realizar análisis estadísticos yllevar un control

◘ RLU( unidad relativa de luz) : la luz emitida desdelos híbridos ARN:ADN marcados se mide comoseñales de fotones en un luminómetro y se incluyeen el informe como unidades de luz relativa.

◘ Valor umbral: separa los objetos de una imagenque nos interesan del resto

HER2Receptor del factor de Crecimiento

epidérmico

Es el nombre de una proteína producida

por un gen específico cuya alteración

puede producir cáncer

Las proteínas HER2 son receptores en las

células mamarias

Ayudan a controlar la manera en que una

célula mamaria sana crece, se divide y se

repara así misma

EGF

RReceptor del factor de Crecimiento

epidérmico

Es el receptor celular de la Superficie

de la célula de los Miembros de la

Familia del factor de crecimiento

epidérmico (familia EGF) de los ligandos

de las Proteínas extracelulares.

Lapatinib

Es un agente quimioterapéutico,un inhibidor dual de la tirosinaquinasa de EGFR y HER2

Actúa sobre una enzima específicaque se encuentra en las célulascancerosas y detiene el crecimientode las células.

Se usa en forma de ditosilato delapatinib.

INTRODUCCCI

ON

O Ratones de laboratorio

O Los ratones fueron anestesiados con

ketamina/xilazina(100/10mg/kg),

O Inyección intraperitonial

Línea celular y cultivocelular

Línea celular humana 231 Br y HER2 consobreexpresión de contraparte, dondeambos expresan la proteína verdefluorescente

Las células 231 BR y 231BR Her2 semantuvieron en Dulbecco modificadopor Eagle, complementado con suerofetal bovino al 10%

1% de penicilina – estreptomicina solución

Gluc

Transfeccion

El vector lentiviral lleva un cassette

de expresión que codifica la proteína

Gluc y ceruleo flurescente, separados

por un sitio interno de entrada

ribosomal que se ha generado con

anterioridad. Las células 231BR y

231BR Her2 fueron transducidas con

LV-Gluc-PPC – 231BR-G y 231BR-

HER2-G a una multiplicidad de

infección.

Modelo de almohadilla de grasa mamaria

Se ha diseñado células MDA-MB-231BR(231BR), la cual se administra en un volumende 200 a 300 mm3 en la almohadilla de lagrasa mamaria (MFP)

Ratones femeninos de 5 – 7 semanas de edad

El tamaño del tumor se midió mediante unapinza

Los tumores se resecaron y se utiliza para H &E tinción

● Ratones femeninos de 6 -7 semanas deedad desnudos fueron inyectados con:0.25 x 106 231 BR- HER2-G células en 0,1ml de PBS a través del ventrículoizquierdo.

● Fueron sacrificados los ratones que mostraron síntomas clínicos de dolor prolongado

Modelo de metástasis experimental (modelo de inyección intracardiaca)

o El cerebro, los huesos y los demás

órganos se recogieron y se evalúan de

inmediato para GFP mediante

microscopía de fluorescencia.

Ensayo Gluc De Sangre / Orina

❶Se extrajo sangre de hacer unaligera incisión en al vena de lacola❷La orina se recogedirectamente de las aberturas dela uretra❸10 μL de sangre se recogió yse mezcló con 2μL de 50 mM deEDTA.❹Las muestras de sangre uorina se transfirió luego a unaplaca de 96 pocillos.❺La actividad de la Glu se midióutilizando un luminómetro placa.

Cuantificación de tumor viableSe utilizo la tinciónhematoxilina-eosina (H& E) la cual nos permitecontrastar el núcleo delcitoplasma, tiñendo elnúcleo de color azul y elcitoplasma de un colorrosado.

MATLAB

Matlab esta diseñado para

la computación interactiva y

automatizada mediante las

funciones matemáticas y

graficas incorporadas ,

herramientas donde se

podrá analizar y visualizar

los datos

Exploración y análisis de

datos ,visualización y

procesado de imágenes

Biolumiscencia de Imágenes (BLI)Es una tecnología la cual representa una poderosa herramienta parasu uso con bacterias modificadas para expresar genes reporteroscomo lux (unidad del nivel de iluminación).

BLI se utiliza tradicionalmente como una modalidad 2D que resulta enimágenes que están limitados en su capacidad para localizaranatómicamente las poblaciones de células.

Biolumiscencia de Imágenes

Ratón

anestesiado

Línea celular MDA-

MB-231 BR(231BR)

Inyección de ctz

4mg/kg

El tiempo de adquisición de

la imagen se encontraba

en el intervalo de 15

segundos a 1 minuto

Sistema IVIS acoplado

a un software de

imagen

RESULTADOS

Resultado n 1 Comparación de la actividad Gluc en sangre, plasma y orina

Resultado n 2

Seguimiento de la actividad Gluc en la sangre, la orina e imágenes de bioluminiscencia (BLI) del modelo ortotópico de cáncer de mama.

Resultado n 3

La sangre de ensayo

Gluc refleja la carga

tumoral viable.

Resultado n 4

Monitorización en tiempo real de progresión deltumor metastásico con Gluc sangre y localizaciónde la metástasis, con imágenes deBioluminiscencia

Metástasis de columna vertebral metástasis

cerebrales

Resultado n 5

El ensayo Gluc en sangre Ofrece monitoreo en tiempo real de respuesta al tratamiento de la progresión del metástasis sistémico.

CONCLUSIONES

• La detección del tumor viable primario se puededetectar antes que se desarrolle la proliferacióncelular, por medio del biomarcador Gaussialuciferasa solo se da a través en ensayo desangre.

• La Gaussia luciferasa es el regulador que ayudadetectar la formación y actividad de las célulastumorales, tanto en tratamiento como en elcontrol.

Muchas

gracias