extracciÓn de adn y diferenciaciÓn de especies de...

1. C. yuhsienensis

4. C. grijsii

5. C. caudata

Marcadores RAPDS

Conclusiones

pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 C

500

1000

2. C. longicarpa

Este trabajo ha sido financiado por la Xunta de Galicia (proyecto XUGA PGIDIT03RAG60301PR)

6. C. sasanqua

7. C. salicifolia

8. C. sinensis

5. C.lutchuensis

EXTRACCIÓN DE ADN Y DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DEMEDIANTE MARCADORES RAPD-PCRCAMELLIA

Vela P. , Aguín O. , C. Salinero , M. J. Sainz1 1 1 2

Estación Fitopatológica do Areeiro. Diputación Provincial de Pontevedra. Subida a la Robleda s/n. 36153 Pontevedra. España. www.efa-dip.orgDpto. de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela. Campus Universitario, 27002 Lugo, España.

1

2mjsainz@lugo.usc.es

C. transnokoensis

C. oleifera

C. polyodonta

C. taliensis

9416

pbM C2 3 4 51 M6 7 8

pb

2313023130

655794166557

43614361

Extracción del ADN genómico de 8 especies de mediante el Kit

Puregene: calles 1-8; C: control negativo; M: marcador Lambda Hind III.

Camellia

Se utilizaron 24 primers, de los que sólo 4 ( generaron bandas polimórficas, reproducibles y claras. La reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en un termociclador PCR- Express - ThermoHybaid siguiendo el ciclo propuesto por Parks (2000). La reacción estándar

para un volumen final de 20 µl contenía: 2ng/µl de ADN, 0.4 µM de primer, 100 µM de cada dNTP, 2 mM de MgCl y 0.06 u/µl de Taq-polimerasa. La electroforesis

se llevó a cabo a 100 voltios durante 90 minutos en gel de agarosa al 2% en tampón TBE 1X. La tinción se realizó con bromuro de etidio durante 30 minutos y las

bandas se visualizaron con un transiluminador y se fotografiaron.

OPAA-01, OPAA-03, OPAA-04 y OPAG-15)

et al

2

Bandas generadas con el primer OPAA - 01 (5’ - AGACGGCTCC- 3’) en gel

de agarosa (2%), donde M: marcador de 100 bp (MWM XIV); calles 1-8:

especies de ; C: control negativo.Camellia

Los primers OPAA-01, OPAA-03, OPAA-04 y OPAG-15 sirven para diferenciar 8 especies de estudiadas, ya que generan patrones de bandas diferentes para

cada una de ellas, pero es necesario ampliar los estudios para conseguir desarrollar marcadores que permitan la identificación de cultivares.

Camellia

2 ciclos:60 s a 92 ºC7 s a 42 ºC70 s a 72 ºC

38 ciclos:1 s a 92 ºC7 s a 42 ºC70 s a 72 ºC

4 min a 72 ºC

Ciclos de PCR:

Material vegetal Estado Protocolos de extracción de ADN

Yema

Brote

Hoja

Capullo

Fresco

Congelado

Liofilizado

SDS:Isopropanol

EZNA plant DNA Miniprep kit (Omega-Biotek)

Puregene DNA Isolation kit (Gentra System)

V Congreso Ibérico de Ciencias Hortícolas, Porto (Portugal) del 22 al 27 de mayo de 2005