experto en genética médica y genómica · 2021. 2. 10. · pcr reacción de cadena de la...
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Experto en Genética Médica y Genómica
Sesión 2.1 Técnicas de diagnóstico molecular
¿Como hacemos hoy un Diagnóstico Genético?
Historia Genética
Estudio Genético
ConsejoGenético
El Diagnóstico Genético es un PROCESO
Planificación del Estudio Genético
Historia Genética
Estudio Genético
ConsejoGenético
Interpretación basada en la experiencia
Historia Genética
Estudio Genético
ConsejoGenético
Planificación del Estudio Genético
Historia Genética
Estudio Genético
ConsejoGenético
Utilización de la tecnología adecuada
Historia Genética
Estudio Genético
ConsejoGenético
PCRReacción de Cadena de la Polimerasa
9
PCRReacción de Cadena de la Polimerasa
Es una técnica de amplificación enzimática “in vitro”. Permite amplificar unfragmento específico de ADN situado entre dos regiones de secuenciaconocida.
PCRReacción de Cadena de la Polimerasa
11
PCRReacción de Cadena de la Polimerasa
La visualización del ADN amplificado durante la PCR se realiza mediante electroforesis
PCRReacción de Cadena de la Polimerasa
...AGTCCTGGCCTGAACACCACCAC...CACCACCACTCCTTAACTGGT...
...TCAGGACCGGACTTGTGGTGGTG...GTGGTGGTGAGGAATTGACCA...
REGIÓN MICROSATELITE
( CAC)n
➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, ctt,... )
➢ No están asociados a ninguna patología
➢Mediante marcadores polimórficos “etiquetamos” cada uno de los genes
➢ Hacemos haplotipos, árboles familiares
➢Estudios indirectos
Microsatélites (SSR)
I:1 I:2
II:1 II:2II:3
III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6
II:4
III:7 III:8III:9
IV :1 IV :2 IV :3 IV :4 IV :5 IV :6
III:10
IV :7 IV :8
III:11
IV :9
III:12
IV :10
7q32.2
I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875D7S530
D7S2544
I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153
?
II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
ADN-2089
IMEGEN-198
ADN-2081
IMEGEN-197
ADN-2080
IMEGEN-196
ADN-2094
IMEGEN-195
Distrofia muscular de cinturas
Autosómica dominante
ligada a la región 7q32.2
I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875D7S530
D7S2544
I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153
?
II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
ADN-2089
IMEGEN-198
ADN-2081
IMEGEN-197
ADN-2080
IMEGEN-196
ADN-2094
IMEGEN-195
Análisis de ligamiento
I:1246 242193 197146 146130 126
D15S646D15S128D15S122D15S210
I:2242 244195 199142 148130 128
?
II:1242 244195 199142 148130 128
D15S646D15S128D15S122D15S210
Síndrome del Prader-Willi (15q11_13)
➢ Deleción en el cromosoma de origen paterno
➢ Disomia uniparental materna
➢ Defectos en el imprinting del cromosoma 15 paterno
D15S646
D15S128
D15S122
D15S210
REGIÓN PW/ ANG
Análisis de ligamiento
Cariotipo
➢ Alteraciones cromosómicas
➢ Cultivo celular 2-3 semanas
QF-PCREstudio prenatal
➢ Alteraciones numéricas
➢ Técnica rápida para la detección de:
➢ Cromosoma 21: Síndrome de Down (trisomía)
➢ Cromosoma 18: Síndrome de Edwards (trisomía)
➢ Cromosoma 13: Síndrome de Patau (trisomía)
➢ Cromosomas sexuales X e Y:
➢ Síndrome de Turner: X0 (monosomía)
➢ Síndrome de Klinefelter: XXY
➢ Otras aneuploidías: XXX; XY
QF-PCREstudio prenatal
QF-PCREstudio prenatal
✓ Detecta el 70-80% de las aberraciones cromosómicas causantes de defectos congénitos
✓ Detecta el 99.9% de las aneuploidías en embarazos de bajo riesgo
QF-PCREstudio prenatal
(CAG)nHD, SCA
5’UTR 3’UTRExón Intrón
(CGG)nFRAXA
(CTG)nDM
(GAA)nAF
(GCG)nOPMD
Exón
➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, gata,... )
➢ No están asociados a ninguna patologíaMicrosatelites (SSRs)
➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( tripletes CGG, CAG... )
➢ Están asociados a una patología
Mutaciones dinámicas
Mutaciones dinámicas
Inestabilidad de repeticiones de tripletes en tándem
❑ Número de repeticiones es polimórfico en población❑ Adquieren un tamaño patológico❑ Inestabilidad Intergeneracional ❑ Fenómeno de anticipación❑ Enfermedades neurológicas
ACTATATGCTAGCTAGCTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGACTGATCTAGCTGATCGT
ACGATCAGCTAGATCAGTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTAGCTAGCTAGCATATAGT
Núm. repeticiones = A - (B + C)
3
AB C
Mutaciones dinámicas
(CAG)nHD
5’UTR 3’UTRExón Intrón ExónEnfermedad de Huntington
➢ Alelos normales. 6-26 repeticiones➢ Alelos intermedios: 27-35 repeticiones➢ Alelos asociados al HD: > 36 repeticiones. ➢ Forma juvenil 60 rep
118 pb 17 rep197 pb 43 rep
127 pb 20 rep191 pb 41 rep
124 pb 19 rep
146 pb 26 rep
Mutaciones dinámicas
5’UTR 3’UTRExón Intrón
(CTG)nDM
ExónDistrofia Miotónica
➢Alelos normales. 5-34 repeticiones➢ Alelos pre-mutados : 35-49 repeticiones➢Alelos asociados a DM1 mínima : 50-150 repeticiones➢Alelos asociados a DM1 clásica: ~100- ~1000 repeticiones➢Alelos asociados a DM1 congénita: > 2000 repeticiones
91 pb 12 rep ¿ ?
66 pb 5 rep ¿ ?
66 pb 5 rep 94 pb 13 rep
88 pb 11 rep ~253 pb 66 rep
Mutaciones dinámicas
TP-PCR (Triplet repeat primed PCR)
…ACTACGTAGCTGACTGCTGCTGCTGCTGCTG…CTGCTGCTGCTGCTGCACTGATGCTACGTG…
…TGATGCATCGACTGACGACGACGACGACGAC…GACGACGACGACGACGTGACTACGATGCAC…
Mutaciones dinámicas
Distrofia Miotónica
Mutaciones dinámicas
X Frágil (FMR1; Xq27.3) Interrupción de las repeticiones
Mutaciones dinámicas
Detección de deleciones/ duplicaciones
MLPA
dPCR
CGH array
NGS
A pequeña escala A gran escala
1 experimento permite la cuantificación relativa de hasta 48 secuencias distintas de ADN.
Es rápido, sencillo y.... barato
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
3-PCR con los primers universales X e Y
2-Ligación
1-Hibridación
4-Electroforesis capilar
Control
Paciente
Interpretación de los resultados
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
➢ Detección de aneuploidías
➢Análisis de las regiones subteloméricas
➢ Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen o región cromosómica (MLPA diseñado para más de 300 genes)
➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20 síndromes distintos de microdeleción)
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
➢ Detección de aneuploidías
Diagnóstico prenatal de aneuploidías (P095)
Reordenamientos subtelomericos submicroscopicos
Chr 8
Chr 16
Traslocación 8:16
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Control
Paciente con del 6q
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
ControlControl
Deleción 18q
Aborto espontaneo: 46, XY, (18) (18:20) (q21:p13) mat
Madre: 46, XX, t(18:20) (q21:p13)
Duplicación 20p
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Reordenamientos subtelomericos submicroscopicos
64
65 66 67
Control
Paciente con DMD
Gen DMD
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Diagnóstico de CNV
Control
Paciente con DMD; dup2-7
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
PMP22
Duplicación= CMT1A
Deleción= HNPP
Multiplex-A Multiplex-B
CONTROL NEGATIVO
CHMT- 1A
HNPP
D17S1356D17S1357
D17S261
D17S955D17S261
D17S261 D17S1358D17S921
D17S1356 D17S261
D17S955 D17S1357
D17S1356D17S261 D17S955
D17S1357
D17S1358D17S921D17S261D17S261
D17S261 D17S261D17S921
D17S1358
Limitaciones: Marcadores no informativos. A veces difícil interpretación
Duplicación / Deleciónde la región 17p11
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Salsa Mix P033
Control
HNPP
CMT1A
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
1p36 deletion syndrome*2p16 microdeletion 3q29 microdeletion9q22.3 microdeletion15q24 deletion syndrome*17q21 microdeletion*22q13 / Phelan-McDermid*Cri du Chat syndrome, 5p15*DiGeorge syndrome 22q11*DiGeorge region 2, 10p15Langer-Giedion syndrome, 8qMiller-Dieker syndrome, 17p*NF1 microdeletion syndromePrader-Willi / Angelman*MECP2 / Xq28 duplication*Rubinstein-Taybi syndromeSmith-Magenis syndrome*Sotos syndrome 5q35.3*Wagr syndromeWilliams syndrome*Wolf-Hirschhorn 4p16.3*
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Síndromes de microdeleción
dup 7q11 no por FISH pero… si por MLPA
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
3-PCR
2-Ligación
1-Hibridación
Falso positivo: Presencia de una mutación puntual en una zona de unión de la sonda
MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
45
PCR a tiempo real
46
Nº de ciclos
Log [ADN]
Detección
en agarosa
1. Exponencial: En cada ciclo se duplica la cantidad inicial del ADN diana
(asumiendo un 100% de eficiencia).
2. Lineal: Los componentes de la reacción empiezan a consumirse, la reacción
es mas lenta y algunos de los reactivos o enzimas empiezan a degradarse.
3. Plateau: La amplificación está parada, no se producen nuevos productos.
Algunos productos de PCR se pueden degradar. Esta fase es la que se detecta
en la PCR tradicional.
PCR a tiempo real
47
Plateau
Lineal
Exponencial
Ciclos
Pro
du
cto
PC
R
Análisis a tiempo final en gel de agarosa
o ?
Ct
PCR a tiempo real
48
Análisis en fase exponencial Análisis en tiempo final
◼ Alta concentración/Alta Eficiencia◼ Alta concentración/Baja Eficiencia◼ Baja concentración/Alta Eficiencia
PCR a tiempo real
49
PCR a tiempo real
50
Sondas TaqMan
PCR a tiempo real
Desnaturalización
PCR a tiempo real
Desnaturalización
PCR a tiempo real
Desnaturalización
PCR a tiempo real
Hibridación de primers y sonda
PCR a tiempo real
Hibridación de primers y sonda
PCR a tiempo real
Hibridación de primers y sonda
PCR a tiempo real
Amplificación y degradación de la sonda
PCR a tiempo real
Amplificación y degradación de la sonda
PCR a tiempo real
Amplificación y degradación de la sonda
PCR a tiempo real
Amplificación y degradación de la sonda
PCR a tiempo real
Amplificación y degradación de la sonda
PCR a tiempo real
Amplificación y degradación de la sonda
PCR a tiempo real
Amplificación y degradación de la sonda
PCR a tiempo real
PCR a tiempo real
65
• Detección mediante dos sondas Taqman de los alelos diana.
• Técnica muy rápida e interpretación de los resultados sencilla
-Preparación de la PCR
-Amplificación PCR a tiempo real
-Interpretación de los resultados (máxima precisión y fiabilidad)
Detección de mutaciones
Factores de coagulación
Homocigoto normal Heterocigoto Homocigoto mutante
66
Detección de SARS-CoV-2
67
PCR a tiempo real
Sondas FRET
68
Análisis curvas de melting
Mismatch
Perfect match
Temperatura
baja media alta
PCR a tiempo real
69
Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )
Método semicuantitativo
Tm aa (p.Val617Phe) Genotipo
59ºC - Val / ValHomocigoto
normal
59ºC 63ºC Val / Phe Heterocigoto
- 63ºC Phe / PheHomocigoto
mutante
PCR a tiempo real
70
Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
▪ Dependiendo de la concentración inicial se detectará antes o después la fluorescencia
▪ En el termociclador se detecta, en tiempo real, la cantidad de amplificado existente
2x105 copias
2x104 copias
Nn =No x E n
- Nn es la concentración de una muestra enun número de ciclos dado
- No es la concentración de partida de lamuestra
- E es la eficiencia de la reacción
- n es el número de ciclos
71
Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real
❑ Con una serie de patrones sepuede realizar una recta deregresión, empleando estarecta se puede cuantificar unamuestra
❑ Para cuantificar una muestra debemos obtener el nº de ciclo en el quese detecta la fluorescencia y comparar con un estándar con cantidadesconocidas del analito
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
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Reordenamientos en Oncohematología: BCR-ABL p210
➢ Cuantificación Enfermedad Mínima Residual
➢ Análisis reordenamiento y gen de referencia
➢ Límite de Cuantificación 0,01%
ABLBCR-ABL
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
73
Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
74
Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas
➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos
➢ Análisis InDel y gen de referencia
➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)
➢ Límite de Cuantificación 0,1%
➢ Límite detección 0,01%
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
PCR Digital
76
© 2015 IMEGEN – Información confidencial. Todos los derechos reservados.
PCR Digital
PCR Digital
78
PCR Digital
PCR Digital
80
La PCR a tiempo real basa su resultado en la estimación de un Ct
Mediante PCR digital se obtienen resultados en copias por ml.
Resultado Método Variabilidad
La PCR a tiempo real permite realizar cuantificaciones relativas
Mediante PCR digital se pueden obtener resultados absolutos sin necesidad de estándares
La PCR a tiempo real se ve afectada por la eficiencia de la reacción, el equipo empleado, el material de referencia, inhibición en el ADN
PCR Digital
81
dPCR
AVG1.75
SD0.74
AVG3.25
SD0.86
AVG1.75
SD0.1
AVG3.25
SD0.3
dPCR
PCR Digital
Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )
Mismatch
Perfect match
Temperatura
baja media alta
PCR Digital
Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )
Método semicuantitativo
PCR Digital
➢Enfermedad neuromuscular infantil
➢Autosómica recesiva
➢Frecuencia de portadores 1/50
➢Gen SMN1 (5q13)
➢Gen SMN2 Modificador del fenotipo
Atrofia muscular espinal
❑ Estudios de ligamiento
❑ PCR a tiempo real
❑ MLPA
❑ PCR digital
• Gen normalizador
• Cuantificación de SMN1
• Cuantificación de SMN2
Atrofia muscular espinal
❑ Estudios de ligamiento
❑ PCR a tiempo real
❑ MLPA
❑ PCR digital
1 1 2 2
1 x SMN1
2 x SMN2
Atrofia muscular espinal
4 x SMN1
0 x SMN2
1 1 2 2
Atrofia muscular espinal
3 x SMN1
1 x SMN2
1 1 2 2
Atrofia muscular espinal
❑ Estudios de ligamiento
❑ PCR a tiempo real
❑MLPA
❑ PCR digital
Atrofia muscular espinal
90
Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
91
➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos
➢ Análisis InDel y gen de referencia
➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)
➢ Límite de Cuantificación 0,1%
➢ Límite detección 0,01%
Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas
92
Receptor 49,87%Donante 0%Quimera 0,32%Quimera 3,79%
Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas
93
Sample Informative marker FAM/VIC* Het Conversion
XXX-T1 Q116-3i 1.04% 2.07%
XXX-T1 Q116-7i 1.04% 2.08%
XXX-T1 Q116-32i 1.05% 2.10%
XXX-T2 Q116-3i 16.63% 33.26%
XXX-T2 Q116-7i 16.64% 33.28%
XXX-T2 Q116-32i 16.32% 32.63%
XXX-T3 Q116-3i 35.87% 71.75%
XXX-T3 Q116-7i 36.92% 73.83%
XXX-T3 Q116-32i 34.33% 68.66%
XXX-T1
XXX-T2
XXX-T3
Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas
94
A-pre A-post
Q116-10d; 1.37%
Average*2 (Heterozygous correction): 2.60 | STD DEV: 0.14%
Q116-10d, Negative Control
Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas Q116-11i; 1.23%
95
Clinical Chemistry 59:12 (2013)
Detección de DNA libre circulante post-transplante de hígado
Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas
Secuenciación ADN
• Secuenciación automática, 1986Basado en el método Sanger
Marcaje fluorescente
Aplicación de electroforesis capilar
Secuenciación ADN
Método enzimático de terminación de cadena = Método dideoxi de Sanger
~ PCR pero con dNTPs y ddNTPs (terminadores)
Secuenciación ADN
Método enzimático de terminación de cadena = Método dideoxi de Sanger
~ PCR pero con dNTPs y ddNTPs (terminadores)
Secuenciación ADN
Análisis de enfermedades mediante secuenciación
▪ Extracción de ADN▪ Amplificación por PCR de exones y zonas adyacentes▪ Secuenciación automática ▪ Análisis de secuencias▪ Comparación con secuencias de referencia▪ Análisis de los cambios detectados (polimorfismos, mutaciones, …)
Gen APC
c.1581G>A
p.Ala527Ala
Análisis de enfermedades mediante secuenciación
Gen PKD1
c.9616C>T
p.Gln3206*
Análisis de enfermedades mediante secuenciación
Gen PKD1
c.11713-2A>G
Procesado
Análisis de enfermedades mediante secuenciación
Gen PKD1
c.5014delA
p.Arg1672fs50*
Análisis de enfermedades mediante secuenciación
Limitaciones de la técnica de Sanger
- Genes grandes con altos costes
- Heterogeneidad genéticaEnfermedades con muchos genes
dificultad de diagnóstico diferencial
- Enfermedades complejas y multifactorialesDiagnóstico genético todavía no resuelto
- Confirmación de mutaciones detectadas por NGS
Secuenciación NGS
NextSeq S5 NovaSeq
MGIGeneReader MiSeq
PacificBiosciences
Nanopore
107
Muchas gracias
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Digital PCR intro (II)
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