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Universidad de La Habana
Facultad de Biología
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas
Autora: M. C. Tays Hernández García
Tutores: Dr. C. Cristina María Mateo de Acosta del Río
Dr. C. Rolando Pérez Rodríguez
Centro de Inmunología Molecular
La Habana
2011
Estudio a nivel molecular de la polirreactividad idiotípica y el reconocimiento de linfocitos B por el
anticuerpo B7Y33
A mi mamá
Abreviaturas
ABREVIATURAS MÁS FRECUENTES
AcM: Anticuerpo monoclonal
ADN: ácido desoxirribonucleico
ADNc: ADN complementario
AcQ: Anticuerpo quimérico
CDR: Región determinante de la complementariedad
CDR H: CDR de la cadena pesada
Fc: Fragmento cristalizable del anticuerpo
FcγR: Receptor del Fc de las IgG
FR: Región marco
HMS: Hipermutación somática
IVIg: Inmunoglobulinas intravenosas
J : Segmento génico de unión de la cadena ligera kappa
JH: Segmento génico de unión de la cadena pesada
KLH: Keyhole Lympet Haemocyanin
MHC: Complejo principal de histocompatibilidad
RCB: Receptor de antígeno de células B
SSTF: Solución salina tamponada con fosfatos
V : Segmento génico variable de la cadena ligera kappa
V : Región variable de la cadena ligera kappa
VH: Segmento génico variable de la cadena pesada
VH: Región variable de la cadena pesada
VL: Región variable de la cadena ligera
Síntesis
SÍNTESIS
En el presente trabajo se hace un estudio de las bases moleculares que sustentan la
polirreactividad idiotípica y el reconocimiento de linfocitos B por el anticuerpo anti-
idiotipo α B7. El análisis inmunogenético de este, y otro anti-idiotipo α, el 34B7, con
similar multiespecificidad antigénica y reactividad con otras inmunoglobulinas,
demostró que no comparten las mismas restricciones genéticas descritas para los
anticuerpos naturales. Se obtienen variantes quiméricas del anticuerpo B7, con
mutaciones en los CDRs de la cadena pesada y el Fc, así como anticuerpos
quiméricos híbridos que contienen la región variable de la cadena pesada de una
variante del B7, y de cadenas ligeras irrelevantes. La región variable de la cadena
pesada es determinante en la amplia reactividad idiotípica de la variante mutada
B7Y33, aunque la región variable de la cadena ligera la modula. Se demuestra la
existencia de más de un sitio de unión a los diferentes anticuerpos dentro de la propia
región variable del B7Y33, los cuales no coinciden con los responsables de su unión a
los linfocitos B. A esta última interacción contribuyen las regiones variables y
constante del anticuerpo, así como el Fc RIIb sobre los linfocitos B. Se evidencia la
capacidad del B7Y33 de potenciar la inmunogenicidad de IgMs autólogas
reconocidas por él, para lo cual es importante la formación de inmunocomplejos entre
el B7Y33 y estos anticuerpos. El reconocimiento de linfocitos de pacientes con
desórdenes linfoproliferativos B por el B7Y33 sugiere las potencialidades
terapéuticas de este anticuerpo en ese tipo de patologías.
Índice
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 7
2.1 Inmunogenética ....................................................................................................... 7
2.1.1 Estructura de las inmunoglobulinas ................................................................. 7
2.1.2 Genes empleados en el ensamblaje de las regiones variables .......................... 9
2.1.3 Genes de línea germinal ................................................................................. 11
2.1.4 Hipermutaciones somáticas ............................................................................ 12
2.2 Actividad de reconocimiento de los anticuerpos ................................................ 14
2.2.1 Reconocimiento por la región variable........................................................... 14
2.2.1.1 Contribución de los aminoácidos al sitio de unión ..................................... 14
2.2.1.2 Unión a múltiples ligandos ......................................................................... 16
2.2.1.2.1 Autorreconocimiento ............................................................................ 20
2.2.1.3 La teoría de la red idiotípica ....................................................................... 21
2.2.1.4 Anticuerpos naturales .................................................................................. 22
2.2.2 Reconocimiento de la región constante de las IgG por receptores Fcγ .......... 24
2.2.2.1 Interacciones anticuerpo-FcγR .................................................................... 26
2.2.2.2 Glicosilación del anticuerpo y unión al FcγR ............................................. 27
2.2.2.3 FcγRs e inmunidad adaptativa .................................................................... 28
2.3 El FcγRIIb y la biología de la célula B ................................................................ 29
2.3.1 El FcγRIIb ....................................................................................................... 29
2.3.2 Estrategias terapéuticas relacionadas con el FcγRIIb ................................... 32
2.3.2.1 El FcγRIIb y las enfermedades malignas de células B................................ 33
2.4 Ingeniería de anticuerpos ..................................................................................... 34
3. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 39
3.1 Medios de cultivo ................................................................................................... 39
3.2 Microorganismos ................................................................................................... 39
3.3 Hibridomas y líneas celulares .............................................................................. 39
3.4 Animales................................................................................................................. 40
3.5 Vectores plasmídicos ............................................................................................. 40
3.6 Oligonucleótidos .................................................................................................... 41
3.6.1 Oligonucleótidos para la síntesis del ADN complementario y la amplificación
de las regiones variables por reacción en cadena de la polimerasa .............................. 41
3.6.2 Construcción de las variantes mutadas de la VHB7 ....................................... 42
3.7 Genes sintéticos ..................................................................................................... 43
3.8 Anticuerpos monoclonales .................................................................................... 43
3.9 Fragmentos de anticuerpos .................................................................................. 44
3.10 Técnicas de uso corriente en Biología Molecular ............................................... 44
Índice
3.11 Análisis inmunogenético ....................................................................................... 45
3.11.1 Identificación de los segmentos génicos V, D y J empleados en las regiones
variables....... ................................................................................................................... 45
3.11.1.1 Análisis de las secuencias en las regiones de recombinación V-(D)-J .... 45
3.11.2 Agrupamiento de genes de la familia VHJ558 ................................................. 46
3.12 Modelación de la estructura tridimensional de la región variable del B7Y33 . 46
3.13 Construcción y expresión de los anticuerpos quiméricos B7, sus mutantes e
híbridos............................................................................................................................... 46
3.14 Acoplamiento de anticuerpos a biotina ............................................................... 48
3.15 Ensayos de interacción entre anticuerpos ........................................................... 48
3.16 Ensayos de interacción del B7Y33 con antígenos de naturaleza no
inmunoglobulínica ............................................................................................................. 49
3.17 Inoculación de ratones con las IgMs anti-gangliósidos y los AcQs ................... 49
3.18 Ensayo de medición de anticuerpos específicos en el suero de los ratones ....... 49
3.19 Citometría de flujo ................................................................................................ 50
3.19.1 Aislamiento de linfocitos de bazo de ratones BALB/c no inmunizados ........... 50
3.19.2 Aislamiento de células mononucleares humanas ............................................ 50
3.19.3 Reconocimiento de linfocitos B y líneas celulares .......................................... 51
3.19.4 Expresión del FcγRII en líneas celulares de ratón .......................................... 51
3.19.5 Ensayos de inhibición ...................................................................................... 52
3.19.6 Experimento de unión por complementariedad molecular ............................. 53
3.20 Análisis estadístico................................................................................................. 53
4. RESULTADOS ................................................................................................... 55
4.1 Análisis inmunogenético de los AcMs B7 y 34B7 ............................................... 55
4.1.1 Origen de los genes VK y VH de los AcMs B7 y 34B7 ...................................... 55
4.1.2 Análisis del CDR3 y el FR4 ............................................................................. 59
4.1.3 Agrupamiento de genes de la VH J558 ............................................................ 60
4.2 Diseño de variantes mutadas de la VHB7 ........................................................... 62
4.3 Obtención de los AcQs B7 y las variantes mutadas B7Y33 y B7STK .............. 63
4.4 Influencia de las cadenas pesada y ligera del B7Y33 en su polirreactividad
idiotípica ............................................................................................................................. 65
4.4.1 Reactividad de los AcQs híbridos .......................................................................... 65
4.4.2 Participación de los CDRs H del B7Y33 en su polirreactividad idiotípica .... 66
4.4.2.1Diseño de mutaciones en la VHB7Y33 basado en análisis bioinformático ..... 66
4.4.2.2 Reactividad del B7Y33 y sus variantes mutadas frente a las IgMs anti-
gangliósidos ................................................................................................................. 67
4.4.2.3 Propiedad de autounión del B7Y33 y sus variantes mutadas ...................... 68
4.5 Reactividad del B7Y33 frente a variantes mutadas del AcQ P3 ....................... 69
Índice
4.6 Efecto inmunopotenciador del B7Y33 ................................................................. 70
4.6.1 Respuesta de anticuerpos en ratones BALB/c inoculados con IgMs anti-
gangliósidos y B7Y33 ...................................................................................................... 70
4.6.2 Importancia de la coinyección IgM/AcQ para la función inmunopotenciadora
del B7Y33 ........................................................................................................................ 72
4.6.3 Importancia de la interacción IgM/AcQ para el efecto de
inmunopotenciación.. ...................................................................................................... 74
4.6.4 Importancia de las células B-1 para el efecto de inmunopotenciación .......... 74
4.6.5 Determinación de efecto “priming” en la capacidad inmunopotenciadora del
B7Y33......... ..................................................................................................................... 75
4.7 Reconocimiento de linfocitos B ............................................................................ 75
4.7.1 Reconocimiento del RCB por el B7Y33 .......................................................... 75
4.7.2 Reconocimiento del FcγRII por el B7Y33 ....................................................... 77
4.7.3 Participación de las regiones variable y constante del B7Y33 en su
interacción con los linfocitos B ....................................................................................... 81
4.7.4 Reconocimiento de linfocitos de pacientes con desórdenes proliferativos de las
células B por el B7Y33 .................................................................................................... 86
5. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 87
5.1 La necesidad de un modelo recombinante para el estudio de las propiedades
inmunoquímicas del AcM anti-idiotipo B7 ..................................................................... 87
5.2 AcMs B7 y 34B7:¿anticuerpos naturales? .......................................................... 87
5.3 La cadena pesada del AcM B7 en la interacción con otras inmunoglobulinas 91
5.4 Efecto inmunopotenciador del B7Y33 ................................................................. 93
5.5 Interacción B7Y33-célula B .................................................................................. 96
5.6 Potencial terapéutico del B7Y33 a partir de la interacción con el FcγRIIb..... 98
6. CONCLUSIONES ........................................................................................... 101
7. RECOMENDACIONES ................................................................................. 103
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 105
9. ANEXOS ........................................................................................................... 119
Introducción
1
1. INTRODUCCIÓN
La postulación de la teoría de la red idiotípica por Jerne (Jerne, 1974), introdujo el
concepto de que la función de los anticuerpos sobrepasa la interacción con sus
antígenos, e incluye las relaciones complejas que estos pueden establecer entre sí, de
potencial relevancia para la regulación del sistema inmune (Winkler y cols., 1979;
Shoenfeld, 2004). La existencia de anticuerpos anti-idiotipo β, con la habilidad de
inhibir la unión del anticuerpo que le dio origen al antígeno nominal, y de
mimetizarlo, se ha explotado ampliamente para el diseño de vacunas (Poskitt y cols.,
1991; Betakova y cols., 1998). Sin embargo, los anticuerpos anti-idiotipo α, los
cuales no afectan esta unión antígeno-anticuerpo, no se han estudiado a profundidad.
Los gangliósidos, glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico, son componentes
normales de la membrana plasmática de la mayoría de las células de mamíferos y se
han asociado también con la transformación maligna (Marquina y cols., 1996;
Malykh y cols., 2001; Kannagi y cols., 2008).
Diversas estrategias se han desarrollado para inducir anticuerpos específicos por estas
moléculas poco inmunogénicas (Helling y cols., 1994; Helling y cols., 1995;
Livingston y Ragupathi, 1997). En el Centro de Inmunología Molecular (CIM) se han
obtenido diversos anticuerpos específicos por los gangliósidos, entre los que figuran
los anticuerpos monoclonales (AcMs) P3 (Vázquez y cols., 1995), E1, A3, F6
(Alfonso y cols., 1995) y 14F7 (Carr y cols., 2000). Algunos de estos, en diferentes
formulaciones, han sido capaces de inducir fuertes respuestas anti-idiotípicas en
ratones (Vázquez y cols., 1998). De esta manera, se han aislado AcMs que se han
comportado como β, o como γ (aquellos capaces de inhibir la interacción del
anticuerpo que lo originó, con el antígeno nominal, pero no lo mimetizan), en
dependencia de las especies en las cuales se han usado como inmunógenos para la
obtención de anticuerpos anti-anti-idiotipo. El carácter de imagen interna o mímica
antigénica solo se expresó en aquellas especies en las que los gangliósidos N-
glicolilados no son antígenos propios (Vázquez y cols., 1998; Hernandez y cols.,
2005).
Introducción
2
Además, se han generado mediante la inmunización de animales con los anticuerpos
anti-gangliósidos antes mencionados, AcMs anti-idiotipo α, no específicos por el
paratopo. Dos de ellos son los AcMs polirreactivos B7 y 34B7, de isotipo IgG2a e
IgG1, respectivamente (Macías y cols., 1999). Estos se obtuvieron a partir de la
inmunización de ratones BALB/c con el AcM E1, específico por el gangliósido N-
acetil-GM2 (NeuAcGM2) (Alfonso y cols., 1995).
Desde el punto de vista inmunoquímico, ambos anticuerpos se clasifican como anti-
idiotipos α, pues no interfieren en la unión del AcM E1 al gangliósido referido.
Una propiedad sorprendente que distingue a los AcMs B7 y 34B7 es su
polirreactividad idiotípica, al reconocer no solo al AcM E1 sino, además, a otros
anticuerpos murinos específicos por gangliósidos, y sus anti-idiotipos (Portuondo,
1996; Macías y cols., 1999). Se comprobó que el AcM B7 se autorreconoce (Macías
A., comunicación personal) y es capaz de interactuar con anticuerpos neonatales,
descritos como altamente polirreactivos en la red idiotípica (Holmberg y cols.,
1984a). No se conoce si los inmunocomplejos que estas interacciones puedan generar
tienen algún papel biológico, aunque algunos autores han reseñado que los
inmunocomplejos, en general, pueden activar células dendríticas y estimular la
presentación antigénica a células T (Regnault y cols., 1999).
El empleo de proteínas de mieloma humano, así como fragmentos F(ab´)2 obtenidos a
partir de inmunoglobulinas del suero de donantes humanos sanos, demostró que las
interacciones idiotípicas del AcM B7 cruzan la barrera de la especie. Por otro lado,
estudios de citometría de flujo evidenciaron que ambos anti-idiotipos son capaces de
reconocer linfocitos humanos de sangre periférica al igual que líneas tumorales B
humanas y murinas (Portuondo, 1996; Macías y cols., 1999).
Macías y colaboradores, en 1999, demostraron que los AcMs B7 y 34B7 manifiestan,
in vitro, propiedades similares a las de la preparación de inmunoglobulinas
intravenosas (IVIg, siglas del inglés intravenous immunoglobulins), purificado
policlonal de inmunoglobulinas IgG humanas procedente de miles de donantes sanos.
Entre dichas propiedades figura la inhibición de la proliferación de líneas celulares B
humanas.
Introducción
3
Tales hallazgos sugieren que estos anti-idiotipos pueden desempeñar un papel
inmunorregulador como el propuesto para las IVIg, las cuales se han usado
exitosamente en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunes y
desórdenes linfoproliferativos (Kazatchkine y Kaveri, 2001; Krause y Shoenfeld,
2005). La presencia de anticuerpos naturales poliespecíficos por antígenos propios es
esencial en el efecto terapéutico de esta preparación policlonal, para la cual se han
propuesto diferentes mecanismos de acción. Estos recaen tanto en la región variable
como la constante de las IgGs que la componen. La región variable es responsable del
reconocimiento de moléculas solubles y asociadas a membrana, así como idiotipos de
inmunoglobulinas y el receptor de antígeno de células B (RCB). Por otro lado, el
fragmento cristalizable (Fc) contribuye a los efectos de las IVIg, a través de las
interacciones con receptores de dicho fragmento para las IgG (FcγRs), la modulación
de la expresión de FcγRIIb, y la expresión y saturación de receptores Fc neonatales
(FcRn) (Negi y cols., 2007).
Los FcγRs constituyen una pieza clave en la regulación de la respuesta inmune innata
y adaptativa mediada por los anticuerpos, además de ser críticos en algunas funciones
efectoras de estos (Nimmerjahn y Ravetch, 2008). Entre ellos destaca el FcγRIIb,
único FcγR expresado en las células B, como un importante modulador de las señales
activadoras trasmitidas por el RCB. El FcγRIIb, punto de control en el desarrollo
periférico de los linfocitos B, influye, incluso, en la sobrevida de las células
plasmáticas (Xiang y cols., 2007). Su papel regulador de la inmunidad adaptativa
comprende, adicionalmente, el efecto inhibitorio sobre la internalización dependiente
de FcγRs, la presentación de antígeno y la consiguiente activación de las células
dendríticas (Kalergis y Ravetch, 2002; Nimmerjahn y Ravetch, 2008). Diferentes
técnicas, entre ellas la inmunohistoquímica, han permitido identificar el FcγRIIb en
muestras provenientes de pacientes con desórdenes proliferativos de las células B
(Cassard y cols., 2006; Rankin y cols., 2006). Todo lo anteriormente expuesto
convierte a este receptor en un atractivo blanco para el tratamiento de esas patologías,
así como infecciones microbianas y enfermedades autoinmunes, que incluiría el uso
de AcMs como una de las herramientas más poderosas.
Introducción
4
La capacidad de uno de los anti-idiotipos α mencionados anteriormente, el AcM B7,
de reproducir algunas de las propiedades de las IVIg sugiere su potencial
aplicabilidad clínica. Para garantizar un resultado satisfactorio en la terapia es
necesario disponer, al menos, de una versión quimérica de este con la cual reducir el
desarrollo de una probable respuesta HAMA (siglas del inglés human anti-mouse
antibodies) que pueda dificultar el éxito del tratamiento (LoBuglio y cols., 1989), y
asegurar la eficacia de las funciones efectoras del anticuerpo. Otro motivo que
justifica la obtención de una molécula recombinante es la inestabilidad del hibridoma
secretor del AcM B7 (Macías A., comunicación personal), la cual limita, además, la
producción de cantidades de molécula necesarias para la experimentación en modelos
animales. Por lo tanto, una variante quimérica del AcM B7 se convierte en una
herramienta útil para el uso clínico de este anticuerpo y el estudio de la naturaleza de
sus interacciones con diferentes células del sistema inmune.
Teniendo en cuenta los antecedentes presentados se planteó la siguiente hipótesis de
trabajo:
La multiespecificidad idiotípica de una versión quimérica del AcM anti-idiotipo α B7
es determinante para su unión a los linfocitos B, y contribuye a potenciar la
inmunogenicidad de las inmunoglobulinas a las cuales se une, aunque en su
interacción con los linfocitos B el FcγRIIb también participa.
Para demostrar la hipótesis se plantearon los siguientes objetivos:
Objetivo general
Caracterizar a nivel molecular la polirreactividad idiotípica y el
reconocimiento de linfocitos B por una versión quimérica del anticuerpo anti-
idiotipo α B7.
Objetivos específicos
1. Caracterizar a nivel molecular los sitios responsables de la polirreactividad
idiotípica de una versión quimérica del anticuerpo anti-idiotipo α B7.
2. Caracterizar a nivel molecular el sitio de unión a los linfocitos B, de una
versión quimérica del anticuerpo anti-idiotipo α B7, evaluando la contribución
Introducción
5
del FcγRIIb a dicho reconocimiento.
3. Definir si una versión quimérica del anticuerpo anti-idiotipo α B7 puede
modular la inmunogenicidad de anticuerpos anti-gangliósidos en el modelo
singénico.
El presente trabajo se inserta en los estudios realizados en el CIM de caracterización
de anticuerpos anti-idiotipo generados contra anticuerpos anti-gangliósidos, en
particular, los encaminados a conocer las posibles propiedades inmunorreguladoras
de algunos de ellos. A través del análisis inmunogenético de dos anticuerpos anti-
idiotipo α con similar comportamiento inmunoquímico y actividad biológica, se
demostró que no comparten los mismas restricciones genéticas de los anticuerpos
naturales, a pesar de exhibir, al igual que estos, una alta polirreactividad idiotípica.
Constituye un aporte al conocimiento, la demostración de que el proceso de
hipermutación somática (HMS) no es incompatible con la polirreactividad de los
anticuerpos, contrario a la asunción general de que la HMS contribuye
mayoritariamente a un refinamiento de la especificidad de un anticuerpo (Manivel y
cols., 2000; Jimenez y cols., 2003; Jimenez y cols., 2004). Mediante estudios de
mutagénesis se demostró la existencia en la región variable del anticuerpo B7Y33,
versión quimérica del AcM B7, de más de un sitio de unión para diferentes IgM anti-
gangliósidos. Los experimentos realizados in vivo evidenciaron la capacidad de dicho
anticuerpo de potenciar la inmunogenicidad de algunos de estos últimos. Se pudiera
entonces hipotetizar una función reguladora de los anticuerpos anti-idiotipo α en el
sistema inmune, tema poco comprendido y apenas abordado en la literatura.
Tributan a la novedad científica de este trabajo, el hallazgo y caracterización de una
inesperada e inusual interacción de un anticuerpo anti-idiotipo α con linfocitos B
murinos y humanos, que involucra tanto la región variable como la constante del
anticuerpo, y el receptor FcγRIIb expresado en la superficie de los linfocitos B. El
reconocimiento del receptor FcγRIIb no está asociado a la polirreactividad idiotípica
del B7Y33. Este trabajo brinda evidencias experimentales de cómo un anticuerpo
anti-idiotipo α incrementa la inmunogenicidad de una inmunoglobulina autóloga, lo
que teóricamente contribuiría a sustentar la posible existencia de una red idiotípica
Introducción
6
“natural”. Los resultados presentados sugieren que la interacción con los linfocitos B,
pudiera ser importante para la actividad potenciadora que tiene este anticuerpo anti-
idiotipo α, de la inmunogenicidad de otros anticuerpos en el modelo singénico. Por
otro lado, el reconocimiento por parte del B7Y33 de células tumorales provenientes
de pacientes de leucemia linfocítica crónica B y leucemia linfoblástica aguda de
estirpe B, sugiere su posible aplicación terapéutica; de ahí la importancia práctica de
estos resultados.
Los mismos han sido presentados en varios eventos nacionales e internacionales. Se
encuentran publicados en dos artículos de las revistas internacionales “Hybridoma” y
“Molecular Immunology” y forman parte de un manuscrito en preparación. Han
tributado, además, a una tesis de maestría.
Revisión Bibliográfica
7
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
El sistema inmune adaptativo tiene como base la existencia de múltiples genes que se
han fijado durante millones de años de evolución. La recombinación de estos genes,
junto a otros mecanismos de diversificación, ha dado origen a moléculas como los
anticuerpos, capaces de reconocer un amplio repertorio antigénico. La versatilidad y
especificidad de unión, así como su actividad biológica, caracterizan la comunicación
de estos con otros componentes del sistema inmune, su papel en la articulación de una
respuesta eficiente frente a un antígeno, y su regulación. El conocimiento de estos
temas es de gran utilidad para el desarrollo de anticuerpos cada vez más eficaces en la
clínica y el diseño de procedimientos de intervención en la biología de la célula B,
también con fines terapéuticos.
2.1 Inmunogenética
2.1.1 Estructura de las inmunoglobulinas
La estructura de las inmunoglobulinas se ha estudiado ampliamente (Padlan, 1994).
Las inmunoglobulinas monoméricas como la IgG están formadas por cuatro cadenas
polipeptídicas, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, idénticas entre sí, unidas
por puentes disulfuro. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas están organizadas
en dominios de aproximadamente 110 aminoácidos cada uno, agrupados en número
diferente: dos en las primeras y cuatro o cinco en las segundas (Padlan, 1994) (Fig.
1).
Los dominios constantes de la cadena pesada, ubicados hacia el extremo C-terminal,
son los responsables de las funciones efectoras de la inmunoglobulina, tales como la
fijación de complemento, la transferencia placentaria, la unión a receptores celulares,
etc. Por su parte, los dominios variables se encuentran en la porción N-terminal de
ambas cadenas y se asocian al reconocimiento antigénico. Datos cristalográficos de la
estructura tridimensional de estos dominios inmunoglobulínicos han demostrado la
formación de estructuras globulares compactas (Poljak y cols., 1973). Cada dominio
está formado por reordenamientos estables de puentes de hidrógeno y hojas -
plegadas, antiparalelas, que forman una estructura en bicapa estabilizada por puentes
Revisión Bibliográfica
8
disulfuro. Las dos capas se componen de plegamientos de diferentes tamaños y
conformaciones, con zonas de hélices encontradas en algunos de los plegamientos.
Un análisis detallado de los aminoácidos de la región variable demuestra la presencia
de segmentos de elevada variabilidad. Dichas posiciones se denominan regiones
hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDRs, siglas del inglés
complementarity determining regions) con el antígeno, de las cuales se identifican
tres en cada cadena. Los restantes aminoácidos conforman los llamados marcos (FRs,
del inglés frameworks), que de un anticuerpo a otro conservan una secuencia de
aminoácidos y de estructura tridimensional similares. Algunos aminoácidos de las
regiones FRs también contribuyen a la adecuada proyección espacial de los CDRs.
Los anticuerpos son moléculas glicosiladas, con los carbohidratos añadidos al
segundo dominio de la región constante de la cadena pesada (CH2) (Fig. 1). Esta
unión se establece frecuentemente entre el grupo NH2 de la Asn y la
N-acetilglucosamina. La glicosilación parece desempeñar un papel en la secreción de
las inmunoglobulinas y en el control de su catabolismo. Los dominios CH3 forman
un glóbulo compacto debido a que están muy asociados, mientras los CH2 están
apartados debido a la unión de carbohidratos al residuo Asn297. Ambos dominios
están formados por muchos residuos hidrofóbicos.
Figura 1: Representación esquemática de la estructura de una inmunoglobulina IgG.
Revisión Bibliográfica
9
Estudios realizados con secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN)
complementario (ADNc) arrojaron que aproximadamente el 9% de los anticuerpos
presenta sitios de N-glicosilación en la región variable (Zhu y cols., 2002), mientras
los sitios de O-glicosilación son menos frecuentes. La glicosilación de la región
variable también influye en la biodistribución in vivo del anticuerpo (Morrison,
2005), así como en su inmunogenicidad (Wright y cols., 1991).
La región bisagra es una zona de flexibilidad que permite a los fragmentos de los
anticuerpos rotar o moverse (Padlan, 1994). Presenta tres partes: una región flexible
superior, que determina la separación entre los dos brazos; un fragmento intermedio
que actúa como espaciador entre el fragmento de unión al antígeno (Fab, acrónimo en
inglés) y el Fc, de conformación más bien rígida; y una región inferior flexible que
permite el movimiento del Fc. La región bisagra modula las funciones efectoras a
través de la exposición de los sitios de unión del CH2 en la interfase CH2-CH3
(Harris y cols., 1997).
2.1.2 Genes empleados en el ensamblaje de las regiones variables
Una gran parte de la diversidad en el repertorio de anticuerpos se crea por
recombinación de los segmentos génicos que codifican las regiones variables de las
cadenas pesada y ligera. Estos segmentos génicos se agrupan en loci, que se
encuentran adyacentes a los genes que codifican las regiones constantes
correspondientes (Mak y Simard, 1998).
Los segmentos génicos que contribuyen a la formación de la región variable de la
cadena pesada (VH) están agrupados en tres regiones localizadas hacia el extremo 5’
de los loci que contienen los segmentos que codifican las regiones constantes de cada
isotipo. Estos son los genes variables (VH), de diversidad (D) y de unión (JH, del
inglés joining) que, al recombinar, codifican los primeros 100-130 aminoácidos de la
cadena pesada. Los genes VH contienen las secuencias que codifican la mayoría de
los aminoácidos del dominio VH (los primeros residuos hasta la posición 94, según
Kabat (Kabat y cols., 1991). Durante el proceso de recombinación que tiene lugar en
la ontogenia B, uno de los segmentos génicos D recombina con uno de los JH (Sakano
y cols., 1980). Los segmentos D y J reordenados (D-J) lo hacen seguidamente con
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uno de los genes VH, para dar lugar a la secuencia V-D-J que codifica el dominio VH.
Los conocimientos acumulados durante años muestran que la información requerida
para este proceso está comprendida en secuencias que resultan desplazadas durante la
recombinación. Estas secuencias, denominadas secuencias señal de recombinación o
RSS (del inglés recombination signal sequences), se encuentran localizadas hacia el
extremo 5’ de los genes JH, en el 3’ de los genes VH y hacia los extremos 5’ y 3’ de
los segmentos génicos D. Las secuencias RSS consisten en dos motivos conservados,
un heptámero palindrómico y un nonámero rico en A-T, separados por un espaciador
de 12 o 23 pares de bases.
Por su parte, la región variable de la cadena ligera (VL) se origina de la
recombinación de los segmentos génicos Vк y Jк o los segmentos Vλ y JλCλ. Estos
genes están flanqueados por RSS similares a las que anteceden o preceden los
segmentos génicos que tributan a la región VH, con espaciadores de 12 o 23 pares de
bases. La región Vλ es el resultado de un solo evento de recombinación de los
segmentos Vλ y JλCλ, mientras la Vк proviene del ensamblaje del segmento génico Vк
con uno de los cinco del locus Jк, que preceden el gen Cк.
El proceso de recombinación incluye el corte de la doble hebra de ADN en las
secuencias RSS y, finalmente, la unión de los segmentos codificadores. En este
participan enzimas responsables de la sustracción y adición de nucleótidos, lo que
contribuye a la diversidad en el sitio de unión (Kuby, 1998). Aunque no todos los
elementos involucrados en la recombinación han sido descritos, sí se conoce la
importancia de algunos de ellos, como las recombinasas RAG-1 y RAG-2 y la enzima
TdT (transferasa terminal de desoxinucleótidos) (Mak y Simard, 1998; Fugmann y
cols., 2000).
La enzima TdT es la única polimerasa independiente de molde conocida y cataliza la
adición al azar de desoxinucleótidos 5’ trifosfato al extremo 3’ OH de las cadenas de
ADN (Tonegawa y cols., 1981). La TdT muestra una mayor preferencia por los
nucleótidos CTP y GTP, y este rasgo es empleado con frecuencia en la identificación
de las secuencias originadas por esta enzima. Además, se ha visto que la TdT es más
activa durante la recombinación de la cadena pesada que en la recombinación de la
Revisión Bibliográfica
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cadena ligera (Mak y Simard, 1998). Para identificarlos por su origen, los nucleótidos
adicionados por esta enzima se denominan nucleótidos N (de inserción no cebada de
nucleótidos), y las secuencias de nucleótidos N, secuencias o regiones N. Se ha visto
que las secuencias N aparecen en el 83% de las células B esplénicas de ratones
adultos, al menos en uno de los extremos 5’ o 3’ colindantes con las regiones D,
aunque con una mayor frecuencia hacia el extremo 5’. Es importante señalar que la
enzima TdT no es expresada durante el período fetal, lo que explica la rara aparición
de los nucleótidos N en los recombinantes VH-D-JH generados durante esta etapa
(Bangs y cols., 1991). Las recombinaciones que tienen lugar durante este período
también sugieren una disminución de la actividad exonucleasa, lo cual trae como
consecuencia la aparición en los puntos de recombinación de nucleótidos colindantes
con los segmentos génicos reordenados y que normalmente, producto de la actividad
exonucleasa, no llegan a formar parte del producto final (Bangs y cols., 1991; Kuby,
1998). Estos son los llamados nucleótidos P (Lafaille y cols., 1989).
2.1.3 Genes de línea germinal
En humanos y ratones existe un número elevado de genes V, D y J de línea germinal,
los cuales manifiestan un elevado polimorfismo. Debido a su complejidad y elevado
número, los genes V se han agrupados en diversas familias de acuerdo a su identidad
nucleotídica. Los genes pertenecientes a una misma familia poseen más de un 80% de
similaridad en sus secuencias de nucleótidos, mientras que se consideran de
diferentes familias aquellos genes con niveles de similaridad inferiores al 70%
(Kofler y cols., 1992).
Se han creado diferentes bases de datos para recopilar los genes de línea germinal
descritos. Entre ellas se encuentran la del IMGT, sistema internacional de
información sobre inmunogenética, de acceso en Internet: http://www.imgt.org; la
VBASE2, base integrativa de genes variables de línea germinal de los loci de
inmunoglobulinas humanas y de ratón, con secuencias extraídas de EMBL-Bank
(Retter y cols., 2005); y la base de genes de línea germinal del programa IgBlast, de
acceso en Internet: www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast. Esta última se caracteriza por una
interfase cómoda para el usuario, y se nutre, además, de datos aportados por la base
Revisión Bibliográfica
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de IMGT. Recopila genes de línea germinal funcionales, así como genes con marco
abierto de lectura y pseudogenes. Contiene 349 secuencias de genes funcionales VH
de línea germinal que se agrupan en 16 familias en el caso de los ratones: J558, Q52,
36-60, X24, 7183, J606, S107, 3609, VGAM3.8, VH10, VH11, VH12, 3609N, SM7,
VH15 y VH16. También recopila 98 genes de línea germinal V , tres V , 23 D,
cuatro JH, cinco J y tres J .
2.1.4 Hipermutaciones somáticas
Las células B que se movilizan durante la respuesta inmune migran a los folículos
linfoides donde, junto a los linfocitos T específicos y las células dendríticas
foliculares, forman los centros germinales y se replican. Durante esta fase se
introducen mutaciones en los genes de las regiones variables de las inmunoglobulinas
con una frecuencia 105-10
6 veces mayor que la frecuencia de las mutaciones
espontáneas. Este proceso programado de cambios se denomina hipermutación
somática (HMS), y se expresa fundamentalmente en forma de sustituciones de una
sola base, siendo menos comunes las deleciones y las inserciones.
Las variantes resultantes se seleccionan según su afinidad por el antígeno. Las células
que sobreviven a este proceso son reclutadas para el compartimiento de memoria y
tienen, en general, mayor afinidad por el antígeno. Como resultado, esta se eleva
desde los valores típicos de las respuestas primarias (Kd=10-7
M) hasta los valores
alcanzados en las respuestas maduras (Kd=10-9
M) (Mak y Simard, 1998). De esta
manera, la HMS diversifica los receptores usados por el sistema inmune para el
reconocimiento de los antígenos y le permite adaptar su respuesta a nuevas amenazas
durante el tiempo de vida de un organismo (Janeway, 2005).
Los FRs tienen fundamentalmente un papel estructural, mientras que los CDRs son
responsables, en su mayoría, de las interacciones antígeno-anticuerpo. Por esa razón,
las mutaciones que originan reemplazo de aminoácidos en los FRs tienen una mayor
probabilidad de generar anticuerpos no funcionales, con la afectación de la
estabilidad estructural y/o ensamblaje de los polipéptidos. A pesar de esto, se piensa
que los dominios variables han evolucionado con la capacidad de acomodar cierto
nivel de mutaciones en su estructura, sin afectarla (Andersson y cols., 1998). Tanaka
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y Nei (1989) demostraron que la tasa de sustituciones de reemplazo en los CDRs es
mayor que la de mutaciones silentes, lo que favorece la existencia de organismos con
CDRs diferentes.
En general, se ha observado un uso diferencial de codones entre los FRs y los CDRs
de los genes de anticuerpos. Considerando que la funcionalidad de la molécula de
anticuerpo está determinada por su secuencia aminoacídica, el uso sesgado de
codones en los FRs minimiza la probabilidad de mutaciones de reemplazo en el
proceso de HMS, contrario a lo que ocurre en los CDRs (Wagner y cols., 1995).
Aunque inicialmente se pensó que las interacciones antígeno-anticuerpo requerían de
una perfecta complementariedad química y física, ahora se conoce que estas
interacciones pueden producirse mediante encaje inducido (Padlan, 1994), y que en
algunos casos pueden aparecer moléculas de agua retenidas entre las superficies de
interacción luego de la formación del complejo (Bhat y cols., 1994; Fields y cols.,
1995). La visión menos restringida del proceso de unión al antígeno que se desprende
de estos hallazgos, podría explicar la capacidad observada en ciertos anticuerpos de
acomodar mutaciones somáticas sin mayores efectos en la unión al antígeno (Tulip y
cols., 1992).
Se ha demostrado que, en humanos, la diversidad en los CDRs codificada por los
genes de línea germinal es mayor que la diversidad aportada por las mutaciones
somáticas (Tomlinson y cols., 1996). De esta forma, las mutaciones somáticas
podrían constituir un medio para complementar la diversidad codificada en los genes
V de línea germinal (Andersson y cols., 1998). Esta observación es sustentada por
datos que muestran que, como promedio, las mutaciones somáticas en los anticuerpos
tienden a aparecer en la periferia del sitio de combinación, mientras que el centro de
este sitio no resulta afectado (Tomlinson y cols., 1996; Wedemayer y cols., 1997).
Generalmente se plantea que durante el proceso de HMS la acumulación gradual de
mutaciones resulta en un aumento de la rigidez del centro de combinación con el
antígeno, y por ende, un estrechamiento del espectro de antígenos reconocidos
(Manivel y cols., 2000; Jimenez y cols., 2003; Jimenez y cols., 2004). Sin embargo,
se ha observado para determinados anticuerpos la adquisición de un patrón de unión
Revisión Bibliográfica
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multiespecífica durante el proceso de maduración de la afinidad (James y Tawfik,
2003b).
La identificación de las mutaciones somáticas en los dominios VH y VL de los
anticuerpos requiere del conocimiento de las secuencias de los genes de línea
germinal de origen. La vía más rigurosa para acceder a estas secuencias consiste en la
clonación y la secuenciación de los segmentos génicos V de mayor identidad a partir
de una colección de ADN embrionario (Sakano y cols., 1980). Una alternativa
frecuentemente empleada es la identificación de los segmentos V de línea germinal
de mayor similaridad descritos con anterioridad y colectados en bases de datos.
Cuando no es posible encontrar entre los genes descritos secuencias que muestren un
nivel de identidad suficiente, se hace necesaria la comparación con todas las
secuencias V de anticuerpos informadas, con vistas a la determinación de la secuencia
prototipo (consenso). Al analizar numerosas secuencias similares, se considera que
los nucleótidos conservados provienen de la línea germinal, mientras que los
nucleótidos específicos de una secuencia particular constituyen mutaciones.
2.2 Actividad de reconocimiento de los anticuerpos
2.2.1 Reconocimiento por la región variable
2.2.1.1 Contribución de los aminoácidos al sitio de unión
Como se describe en el epígrafe 2.1, los dominios variables de los anticuerpos median
el reconocimiento antigénico. Se ha demostrado que en los CDRs se encuentra la
mayoría de los aminoácidos que interactúan con el antígeno, mediante
complementariedad físico-química (Chothia y cols., 1986), ya sean puentes de
hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, enlaces electrostáticos, fuerzas de van der
Waals, etc.
Una vista superior de la molécula revela que la alta variabilidad de los CDRs se
localiza en el centro del sitio de unión, donde se concentran los lazos de las regiones
VH y VL, a pesar de la ubicación discontinua de estos segmentos en la secuencia
lineal de la molécula. La proyección de los CDRs es una superficie caracterizada por
depresiones y protuberancias (Padlan y cols., 1989; Garcia y cols., 1992), ubicada en
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15
la estructura sobre el plegamiento de los residuos más conservados de la propia
región variable, y constituye entre el 15-20% de esta (Chothia y cols., 1986). En el
plegamiento espacial de los CDRs se observa una disposición conservada del
esqueleto polipeptídico, denominada estructura canónica (Chothia y cols., 1986).
Cada CDR es capaz de adoptar solamente un mínimo de dichas estructuras. En la
disposición del sitio de unión al antígeno, estas imponen grosso modo la geometría
del sitio de reconocimiento, mientras que las cadenas laterales de los aminoácidos
determinan la especificidad antigénica (Chothia y Lesk, 1986; Chothia y cols., 1989;
Tramontano y cols., 1990).
La variabilidad en secuencia y longitud del CDR 3 de la cadena pesada (CDR H3)
impide generalmente la imposición de una estructura canónica, por lo que se deduce
su elevada contribución a la interacción con el antígeno. Especialmente, la
participación de la cadena pesada es vital para el correcto plegamiento del sitio de
unión, lo que no excluye la importancia de las CDRs de la cadena ligera en la
estabilización de los enlaces débiles.
Dentro de los mismos CDRs hay posiciones más hipervariables que otras. Análisis
topográficos de las estructuras tridimensionales de los anticuerpos indican que los
contactos con el antígeno generalmente ocurren con los residuos centrales del sitio de
unión (MacCallum y cols., 1996). Los residuos más conservados en los CDRs pueden
desempeñar una función más estructural y servir para estabilizar la estructura del sitio
de combinación con el antígeno (Padlan, 1994). Hay residuos característicos que
pueden estar más o menos expuestos si están en los CDRs o en los FRs, como el Trp
y la Tyr, que están más enterrados cuando están en los FRs y más expuestos cuando
están en los CDRs. Los residuos Trp, Tyr y Phe de los FRs se encuentran
normalmente en los interdominios (Padlan, 1994). Los aminoácidos con cadenas
laterales aromáticas pueden contribuir significativamente a la unión con el antígeno,
debido a sus características de hidrofobicidad y gran contribución a la formación de
las fuerzas de van der Waals, su capacidad para formar puentes de hidrógenos (Levitt
y Perutz, 1988), y además por su relativa rigidez, lo que les permite tener ciertos
grados de libertad. Las Val, Ile y Leu son incapaces de formar interacciones iónicas,
por lo que estos residuos pueden contribuir a la unión con el antígeno a través de
Revisión Bibliográfica
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interacciones de van der Waals (Padlan, 1994). Las Asn están más enterradas cuando
están en los CDRs que cuando están en los FRs, y pueden influir en la estabilización
de los lazos de los CDRs (Padlan, 1994). Incluso, se conoce que residuos de los FRs
pueden interactuar directamente con el antígeno (Chothia y cols., 1986). Cambios en
la carga superficial de residuos de los FRs pueden ser determinantes no solo en la
solubilidad y estabilidad del anticuerpo, sino también en su reconocimiento
antigénico.
2.2.1.2 Unión a múltiples ligandos
Muchos han sido los términos usados para definir la capacidad de una proteína de
unirse a más de un ligando o ejercer más de una función. Algunos de estos términos
no son necesariamente excluyentes y pueden superponerse, por lo que suelen, en
ocasiones, utilizarse indistintamente. En un esfuerzo por homogeneizar la
terminología, James y Tawfik (2003a) han propuesto algunas definiciones
relacionadas con dicha capacidad (Tabla 1).
Tabla 1: Definición de distintos tipos de unión múltiple a ligandos (James y Tawfik, 2003a).
Diversidad conformacional Existencia de una proteína en más de una conformación
(conformaciones pre-existentes o plasticidad)
Reactividad cruzada Desempeño de actividades de una proteína que se superponen
con la actividad original, sobre ligandos o sustratos similares al
blanco original de la proteína
Moonlighting Desempeño de diferentes funciones usando partes de la
proteína generalmente diferentes del sitio activo original (papel
in vivo)
Multiespecificidad Realización de una función similar (ej. unión) sobre ligandos
diferentes, mediante el uso de diferentes residuos del sitio
activo
Promiscuidad (polirreactividad) Realización de diferentes funciones usando el mismo sitio que
es responsable de la actividad original
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Aunque ha existido siempre una tendencia a pensar que los anticuerpos tienen una
única estructura tridimensional, existen evidencias físicas y bioquímicas de su
multiespecificidad o reactividad cruzada (Richards y cols., 1975).
La extensión de la complementariedad molecular y la naturaleza de los residuos
aminoacídicos en el sitio de combinación determinan el grado de especificidad del
anticuerpo. El papel de los residuos en la definición de la estructura del sitio de unión
puede ser estimado como una función de las propiedades estructurales de cada
aminoácido individualmente (Mian y cols., 1991). Por ejemplo, los residuos Tyr y
Trp, de gran tamaño y con dos ángulos de torsión, pueden conferir plasticidad al sitio
de unión, lo que permite el acomodo de una variedad de antígenos de formas
ligeramente diferentes (Mian y cols., 1991). Se ha sugerido que estos residuos
confieren a los anticuerpos la propiedad de “adherencia hidrofóbica”, que permite a
antígenos diferentes unirse a través de interacciones hidrofóbicas no específicas
(Padlan, 1994). En este sentido, se ha demostrado que algunos anticuerpos se unen a
varios ligandos con afinidades directamente proporcionales a la hidrofobicidad de
dichas moléculas (Barbas y cols., 1997). Sin embargo, James y Tawfik (2003b)
probaron que la afinidad de un anticuerpo con reactividad cruzada con diferentes
ligandos no tiene que depender necesariamente del grado de hidrofobicidad de estos.
El tipo de reactividad múltiple donde el blanco y el ligando adicional están
relacionados e interactúan de manera similar con el sitio de unión, se denomina
mímica antigénica o molecular. La mímica molecular, también reactividad cruzada,
constituye el tipo de reactividad múltiple que más se describe en la literatura
(Oldstone, 1998). Diversos estudios han referido casos de unión de un anticuerpo a
diferentes ligandos, basada en la química compartida entre estos, y el uso de pequeñas
adaptaciones del sitio de unión (Arevalo y cols., 1994; Kramer y cols., 1997; Trinh y
cols., 1997; James y cols., 2003). Otros autores han demostrado que los ligandos
adicionales similares al antígeno original no tienen necesariamente que mimetizarlo
estructural o químicamente para unirse al anticuerpo, sino que también pueden usar
diferentes contactos específicos con su sitio de unión (James y Tawfik, 2003b). Estos
trabajos han evidenciado, además, que la afinidad y especificidad de unión por varios
ligandos similares entre sí está controlada por el número y la naturaleza de las
Revisión Bibliográfica
18
interacciones por puente de hidrógeno específicas entre el ligando y el anticuerpo
(James y Tawfik, 2003b).
Mientras la reactividad cruzada implica la unión a ligandos que son similares o se
superponen con el antígeno original (Arevalo y cols., 1994; Trinh y cols., 1997), la
multiespecificidad se refiere a la unión a ligandos verdaderamente diferentes.
Algunos modelos teóricos plantean que el número de moléculas complementarias
para un sitio de unión dado es una función del tamaño de la biblioteca de proteínas
con que se explora y el límite de afinidad con que esta se selecciona (Inman y 1978;
Perelson y Oster, 1979). La multiespecificidad se ha podido explicar de diversas
maneras. Una de ellas es la pre-existencia de un equilibro de varias formas isoméricas
del anticuerpo (Foote, 2003), al comprobarse que una misma inmunoglobulina puede
adoptar diferentes conformaciones del sitio de combinación y unir, por lo tanto,
antígenos no relacionados (James y cols., 2003). Una explicación alternativa para la
multiespecificidad es el uso de diferentes grupos de residuos del sitio de combinación
(Kramer y cols., 1997).
Algunos autores, retomando aspectos del antiguo modelo “instructivo” de la
formación de anticuerpos y la explicación del “encaje inducido”, plantean que la
plasticidad del sitio de unión y los cambios conformacionales que puede adoptar un
sitio de unión después de la interacción con el antígeno son la explicación más
plausible para justificar la multiespecificidad. Sin embargo, se desconoce aún lo que
en la secuencia o en la estructura de un anticuerpo polirreactivo le confiere a este más
flexibilidad que un anticuerpo monorreactivo (Notkins, 2004). No obstante, se han
hallado anticuerpos monorreactivos que han evidenciado ser más flexibles y dúctiles
que lo que se pensaba anteriormente (Keitel y cols., 1997; Kramer y cols., 1997). Se
han identificado, incluso, cambios conformacionales por encaje inducido en muchos
anticuerpos maduros, aun cuando las estructuras sugieren que el anticuerpo libre y el
acomplejado no difieren entre sí (Lindner y cols., 1999).
Un dogma central de la inmunología es que la especificidad del anticuerpo es
solamente el resultado de las interacciones de la región variable con el antígeno. Sin
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19
embargo, se ha demostrado que los dominios de la región constante pueden afectar la
afinidad de unión y la especificidad (Torres y Casadevall, 2008).
La unión de glucanos al fragmento variable (Fv) puede modular la interacción con el
antígeno. En este sentido, Fernández y cols. (1997), probaron que la capacidad de
unión de los anticuerpos polirreactivos a sus ligandos depende más del contenido de
carbohidratos en la región variable que en el caso de los monoespecíficos.
Desde el punto de vista biológico, la unión a un número de antígenos diferentes puede
aumentar la talla efectiva del repertorio de anticuerpos, y con ello, la posibilidad de
interceptar un patógeno invasor. El isomerismo conformacional de anticuerpos puede
conferir ventajas, sobre todo, cuando la segunda conformación reconoce un epítopo
en la misma molécula de antígeno, particularmente, si este es monomérico. Esto
permitiría un posible entrecruzamiento: dos conformaciones del anticuerpo sobre dos
epítopos de la misma molécula. En la literatura se ha establecido bien la importancia
del entrecruzamiento y la agregación de complejos inmunes en la eliminación de
antígenos, la activación del complemento, la endocitosis y la transducción de señales
(Metzger, 1992). A pesar de las ventajas evolutivas de la reactividad cruzada y la
diversidad conformacional, estos fenómenos pueden también conducir a alergia y
autoinmunidad (James y cols., 2003). (Fernandez y cols., 1997)
Otro ejemplo de unión a múltiples ligandos lo aportan los llamados superanticuerpos.
Este término surgió para designar aquellas inmunoglobulinas capaces de interactuar
con diferentes ligandos por sitios distintos a los de unión clásica al antígeno (Kohler y
Paul, 1998). Estos anticuerpos combinan la función de unión convencional al
antígeno con una función biológica no clásica, cualitativamente diferente. Sitios
discretos de unión al ligando en el dominio variable de estos anticuerpos son los
responsables de funciones tales como la catálisis química (Paul, 1998), la unión a
nucleótidos (Rajagopalan y cols., 1996), la unión a sí mismos (Kang y Kohler, 1986)
y la unión a superantígenos (Sasso y cols., 1989). A estos sitios contribuyen,
fundamentalmente, residuos conservados de los dominios variables localizados tanto
en los CDRs como en los FRs (Kohler y Paul, 1998).
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20
El estudio de esta propiedad que poseen naturalmente algunos anticuerpos ha
permitido el establecimiento de la tecnología de superanticuerpos, la cual representa
una vía para aumentar la potencia y utilidad de los AcMs. Esta se basa en el
acoplamiento químico de determinados péptidos a los anticuerpos, con el objetivo de
conferir funciones biológicas no detectadas en la mayoría de las inmunoglobulinas.
De esta manera, se han ingenierizado tres tipos de anticuerpos: anticuerpos
dimerizantes con potencial efector incrementado, superanticuerpos con la capacidad
de penetrar células vivas y superanticuerpos como vacunas con propiedades
adyuvantes. En conjunto, estos resultados demuestran que la tecnología de
superanticuerpos genera una nueva clase de moléculas con mayor eficacia terapéutica
(Zhao y cols., 2005).
2.2.1.2.1 Autorreconocimiento
La descripción de un AcM murino específico por la fosfatidilcolina (Rajagopalan y
cols., 1996), perteneciente a la familia inmunogenética T15/S107, con la capacidad de
autorreconocimiento, llevó a nombrar estas moléculas como autocuerpos o
anticuerpos autofílicos.
Al sintetizarse un péptido de la región 50-74 de la VH y comprobar su efecto
inhibitorio sobre la autounión, se pudo deducir que dicha zona, que involucra al CDR
H2 y al FR H3, pudiera ser la responsable de este fenómeno (Kang y Kohler, 1986).
A propósito, uno de los modelos del complejo de autounión propuestos predice la
interacción entre los residuos 50-60 del CDR H2 de una molécula de anticuerpo y los
residuos 63-74 en el FR H3 de la otra (Kohler y Paul, 1998). Experimentos realizados
con otro anticuerpo con capacidad de autounión mostraron que el residuo Ser52a
(numeración de Kabat) es importante en la formación del complejo (Yan y cols.,
1996), lo que confirma la participación del CDR H2 en este fenómeno.
Por mutagénesis dirigida y posteriores estudios de especificidad y autounión, se
concluyó que las actividades de unión al antígeno e interacción homofílica son
funciones independientes que involucran diferentes residuos de contacto en los
dominios variables (Kaveri y cols., 1991).
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21
La capacidad de los autocuerpos de agregarse en la superficie de células blanco como
bacterias o células tumorales (Yan y cols., 1996) podría resultar en una amplificación
de los efectos biológicos. El incremento de la densidad del anticuerpo puede conducir
a una potenciación de la fijación del complemento y la lisis de la célula blanco.
Además, concentraciones elevadas de los anticuerpos podrían aumentar la afinidad
aparente por el antígeno (avidez) (Schillbach y cols., 1993).
El mecanismo de autounión ha sido explotado para mejorar el uso terapéutico de
anticuerpos ya existentes. Un ejemplo lo constituye un anticuerpo anti-CD20, al cual
se le acopló el péptido responsable del fenómeno de autonión del T15/S107 (Kang y
cols., 1988). Después de esta modificación se verificó su capacidad de
autorreconocimiento, con un consiguiente aumento en la actividad de la molécula
original, dada por el incremento en la tasa de apoptosis inducida e inhibición del
crecimiento de células tumorales in vitro (Zhao y cols., 2002).
Anticuerpos naturales encontrados en humanos y otras especies han mostrado unión
al péptido sintético anterior. Este hallazgo sugiere la existencia de anticuerpos anti-
idiotipos que reconocen este sitio, lo que podría hacer de los autocuerpos,
componentes de circuitos idiotípicos regulatorios (Kohler y Paul, 1998).
2.2.1.3 La teoría de la red idiotípica
En 1974 Niels Jerne enuncia la teoría de la red idiotípica (Jerne, 1974), que plantea
que el sistema inmune es controlado internamente por una red de idiotipos y anti-
idiotipos. El concepto de idiotipo, surgido en los años 60 con los experimentos de
Oudin y Michel (Oudin y Michel, 1963), planteaba que las inmunoglobulinas tenían
no solo determinantes antigénicos comunes, sino también individuales. Mediante
experimentos en los cuales inmunizaron conejos con una inmunoglobulina de
mieloma humano, se demostró que los antisueros mantenían la reactividad hacia esta
inmunoglobulina luego de ser absorbidos con inmunoglobulinas no relacionadas. A la
colección de determinantes epitópicos asociados a la región variable se le denominó
idiotipo. A los determinantes individuales reconocidos en el idiotipo por cada
anticuerpo se les denominó idiotopos. Por otra parte, los anticuerpos portan sitios de
Revisión Bibliográfica
22
combinación con los antígenos convencionales que, a su vez, pueden ser reconocidos
por otras moléculas de inmunoglobulina. Jerne denominó este sitio como paratopo.
Jerne postuló que los idiotipos podían constituir dianas regulatorias del sistema
inmune y que existían parejas de regiones variables complementarias que coexistían
en el repertorio de cada individuo. En una versión posterior (Jerne, 1984), propuso
que la línea germinal codificaba “pares” de autoanticuerpos y anticuerpos anti-
idiotipo dirigidos contra estos, que de esta forma establecían series de anticuerpos
interactuantes. El postulado fundamental de la teoría de la red idiotípica es que
debido a la extraordinaria diversidad de las regiones variables en las
inmunoglobulinas, estas expresan idiotopos que reaccionan cruzadamente con un
gran número de epítopos, si no con todos. Por lo tanto, en la colección de idiotopos
del individuo existe una configuración molecular similar a las encontradas en los
determinantes de los antígenos involucrados en la inmunización natural o
experimental. Los anticuerpos portadores de estos idiotopos miméticos, pueden
interactuar con los anticuerpos antígeno-específicos. Un anticuerpo antígeno-
específico, denominado Ab1, presenta múltiples idiotopos, por lo que la respuesta
anti-idiotípica es muy heterogénea y se clasifica frecuentemente de la siguiente forma
(Bona, 1992): Ab2 , que reconocen idiotopos en el Ab1 que no están relacionados
estructuralmente con el sitio de combinación con el antígeno; Ab2 , que reconocen
el idiotopo que corresponde con el sitio de unión con el antígeno (paratopo) y
mimetizan el epítopo reconocido por el Ab1; Ab2 , que reconocen idiotopos
asociados estructuralmente con el sitio de combinación del Ab1 con el antígeno, pero
no son capaces de mimetizarlo.
Los anticuerpos anti-idiotipo β son los más utilizados en la práctica, como vacunas,
por su capacidad de mimetizar el antígeno. Esto ha sido de gran utilidad en la
inducción de respuesta inmune específica contra antígenos poco inmunogénicos como
los carbohidratos (Betakova y cols., 1998).
2.2.1.4 Anticuerpos naturales
Entre las evidencias posteriores que sustentan la teoría idiotípica, se encuentran los
estudios realizados en animales libres de gérmenes, donde se han detectado
Revisión Bibliográfica
23
anticuerpos en ausencia de estimulación antigénica (Avrameas, 1991; Varela y
Coutinho, 1991). Estos surgen independientemente de cualquier inmunización y se
denominan anticuerpos naturales (Ternynck y Avrameas, 1986). Una fracción
mayoritaria de ellos está constituida por inmunoglobulinas multiespecíficas que
reaccionan con una amplia, pero bien definida, colección de moléculas diferentes,
incluidos otros anticuerpos (Ternynck y Avrameas, 1986) (Araujo y cols., 1987;
Sigounas y cols., 1994; Tchernychev y cols., 1995; Tchernychev y Wilchek, 1996;
Notkins, 2004). Esta multirreactividad forma una red temprana de inmunoglobulinas
en el sistema inmune y su interferencia resulta en distorsiones del repertorio de
células B en el adulto (Vakil y Kearney, 1986). La amplia reactividad de los
anticuerpos naturales incluye antígenos propios como hormonas, ácidos nucleicos,
fosfolípidos, polisacáridos y/o antígenos foráneos como componentes de bacterias,
virus, protozoos y hongos. Igualmente, son capaces de reconocer proteínas autólogas
y heterólogas y haptenos como el dinitrofenol (Martin y Martin, 1975; Geller y cols.,
1993; Hardy y cols., 1994). La afinidad de los anticuerpos polirreactivos por
diferentes antígenos es generalmente más baja (Kd= 10-3
a 10-7
M) que la de un
anticuerpo monorreactivo hipermutado generado durante la respuesta inmune (Kd=
10-7
a 10-11
M); sin embargo, muestran una elevada avidez (Casali y Notkins, 1989;
Adib-Conquy y cols., 1993; Hardy y cols., 1994).
Estas inmunoglobulinas, generalmente de isotipo IgM, aunque también existen como
IgA e IgG, son secretadas por un subconjunto de células B llamadas B-1 y que son
predominantes en el repertorio B temprano (fetal y neonatal), aunque persisten en el
individuo adulto (Kasaian y cols., 1991). Se localizan preferentemente en las
cavidades peritoneal y pleural (Hayakawa y cols., 1986). En humanos constituyen
entre el 10% y el 30% de los linfocitos B periféricos (Kasaian y cols., 1992), y son
también abundantes entre las células de la lámina propia del intestino (Kroese y cols.,
1992).
Los anticuerpos naturales son capaces de reconocerse entre sí y formar una densa red
idiotípica, lo que constituye la base estructural del alto grado de conectividad
idiotípica interclonal presente en el repertorio neonatal (Holmberg y cols., 1984b;
Vakil y Kearney, 1986). En la existencia de tales contactos, según la teoría de Jerne
Revisión Bibliográfica
24
(Jerne, 1974), se basa la regulación del sistema inmune. En enfermedades tales como
la cirrosis hepática, cáncer de mama y enfermedad de Alzheimer, se observan
alteraciones en los niveles normales de anticuerpos naturales (Louzir y cols., 1988;
Ounanian y cols., 1990). Además, en modelos animales sensibles a enfermedades
autoinmunes como los ratones B/W, en los que se establece un estado patológico
similar al lupus eritematoso sistémico, se encuentran niveles anormales de
anticuerpos naturales, fundamentalmente elevadas concentraciones de IgM e IgG
polirreactivas (Dietrich y cols., 1992).
Las células B-1 de la cavidad peritoneal utilizan un repertorio limitado de genes de
región variable de línea germinal, generalmente no mutados, sin adición de
nucleótidos N, y no modificados por hipermutación somática (Lalor y Morahan,
1990; Kantor, 1996; Kantor y cols., 1997; Seidl y cols., 1999). Algunos autores
refieren la existencia de restricciones genéticas en las VHs, las que generalmente
están codificadas a partir de genes que pertenecen a las familias génicas 7183 y Q52
en el ratón (Holmberg, 1987). Otros, sin embargo, defienden el criterio de que los
anticuerpos polirreactivos pueden ser codificados por todas las familias VH (Striebich
y cols., 1990; Chen y cols., 1991). Por otra parte, no se ha descrito un uso
preferencial de familias génicas de segmentos V en el repertorio neonatal (Lawler y
cols., 1989). Las secuencias correspondientes a las VL, al igual que las pesadas,
aparecen en un estado muy próximo al de la línea germinal (Carlsson y cols., 1991).
2.2.2 Reconocimiento de la región constante de las IgG por receptores Fcγ
La región constante de los anticuerpos les permite interactuar con diferentes
poblaciones celulares portadoras de diversos receptores. Entre estos se encuentran los
FcγRs, que a través de las señales positivas o negativas que trasmiten, logran armar
una respuesta inmune balanceada. Se convierten en un ejemplo típico de cómo la
excitación simultánea de vías de señalización activadoras e inhibitorias determina un
umbral para la activación celular (Ravetch y Lanier, 2000).
La mayoría de los FcγRs son activadores e incluyen el receptor de alta afinidad
FcγRI, y una familia de receptores de moderada y baja afinidad que comprenden los
FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa y FcγRIIIb en humanos, y FcγRIII y FcγRIV, en ratones.
Revisión Bibliográfica
25
El FcγRIIb, presente en ambas especies, es el único que tiene una función inhibitoria
(Nimmerjahn y Ravetch, 2008).
Los FcγRs conectan las respuestas inmunes humoral y celular. La interacción entre la
IgG unida al patógeno y los receptores activadores media directamente la eliminación
del patógeno a través de mecanismos de citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos (ADCC, siglas del inglés antibody-dependent
cell-mediated cytotoxicity), la desgranulación de células citotóxicas y fagocitosis, e
indirectamente, la liberación de citocinas y otros mediadores inflamatorios.
Igualmente, los FcγRs son importantes en la neutralización de toxinas patogénicas
unidas a IgG (Perez y cols., 2009; Verma y cols., 2009). Estas funciones son
inhibidas por el FcγRIIb.
A la expresión pareada de moléculas inhibitorias y activadoras en la misma célula se
suma un segundo nivel de complejidad en la familia de los FcγRs: la existencia de
cuatro subclases diferentes de IgG en humanos (IgG1-IgG4) y en ratones (IgG1,
IgG2a, IgG2b e IgG3), las cuales se unen con afinidad y especificidad variables a
dichos receptores. Esto es de gran importancia para las funciones efectoras de los
anticuerpos dependientes de los FcγRs, y el diseño de terapias basadas en anticuerpos
(Nimmerjahn y Ravetch, 2006).
Los Fc Rs se expresan ampliamente en todo el sistema hematopoyético. Se desconoce
aún con certeza la expresión de FcγRs en las células T; aunque estudios iniciales
sugirieron que ciertas subpoblaciones de estos linfocitos los expresaban, evidencias
más recientes lo niegan (Stout y Herzenberg, 1975; Takai, 2002; Ravetch, 2003). Las
células efectoras del sistema inmune innato como monocitos, macrófagos, células
dendríticas, basófilos y mastocitos expresan ambos tipos de receptores, activadores y
el inhibitorio. Solo dos tipos de células no los co-expresan: las células NK (expresan
únicamente el FcγRIII) y los linfocitos B (solo expresan el FcγRIIb) (Nimmerjahn y
Ravetch, 2008).
El tipo de señalización que transducen los FcγRs depende de la presencia de motivos
de Tyr que pueden ser inhibidores (ITIM, siglas del inglés immunoreceptor tyrosine-
based inhibitory motif), o activadores (ITAM, siglas del inglés immunoreceptor
Revisión Bibliográfica
26
tyrosine-based activation motif), y que se encuentran en la región citoplasmática de
estos receptores. El FcγRIIb trasmite sus señales a través del ITIM, mientras el resto
de los receptores, con excepción del FcγRIIIB humano anclado a
glucosilfosfatidilinositol (GPI, siglas del inglés glycosylphosphatidylinositol), lo
hacen a través del ITAM.
El FcγRI es el único receptor de alta afinidad en humanos y en ratones; se une a
IgG2a en ratones, o IgG1 e IgG3 en humanos, con una afinidad de 10-8
-10-9
M. El
resto de los receptores tienen afinidades cien a mil veces más bajas y muestran una
especificidad de subclases IgG más amplia (Ravetch, 2003).
La baja afinidad de la mayoría de los FcγRs impide la unión de moléculas de
anticuerpo monoméricas libres que están presentes siempre a altos niveles en el suero,
y por lo tanto, evita la potencial activación no específica de respuestas pro-
inflamatorias. En contraste, el FcγRI está constantemente saturado con ligando.
2.2.2.1 Interacciones anticuerpo-FcγR
Los FcγRs pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y, con excepción del
FcγRIIIB anclado a GPI, son glicoproteínas transmembrana tipo I. A pesar de la
especificidad variable del ligando, la estructura general de los FcRs está
estrechamente relacionada y puede ser superpuesta con otros miembros de la familia
con mínimas diferencias (Radaev y Sun, 2002).
Los receptores de baja afinidad constan de dos dominios extracelulares (D1 y D2)
separados por un ángulo de 50-55o, y están conectados por una región bisagra. Sin
embargo, el FcγRI contiene un dominio adicional, D3, el cual se ha sugerido es
importante para la unión de alta afinidad (Allen y Seed, 1989). Estructuras resueltas
de anticuerpos libres y acomplejados con otras proteínas, revelan que el Fc (dominios
CH2 y CH3) adquiere una estructura tipo “herradura”, con la porción sacarídica
ligada al residuo Asn 297 del CH2 sobresaliente hacia la cavidad central.
Las variaciones en la composición de azúcares pueden conducir a cambios
conformacionales sutiles en regiones del Fc (Matsumiya y cols., 2007). La estructura
cristalina del complejo FcγRIIIA-Fc de IgG1 humana (Sondermann y cols., 2000;
Revisión Bibliográfica
27
Radaev y cols., 2001), sugiere una estequiometría 1:1 para las interacciones IgG1-
FcγRs (Kato y cols., 2000; Zhang y cols., 2000). Solo un dominio de los FcγRs hace
contacto con las regiones más bajas de la bisagra, y por lo tanto, se intercala en el
surco formado por dos cadenas diferentes del Fc.
El conocimiento acumulado sobre las interacciones FcγRs-IgG ha facilitado la
obtención de variantes de la región Fc con diferentes afinidades por los receptores
antes mencionados, para ser usadas convenientemente en una u otra aplicación
terapéutica de los anticuerpos. Por ejemplo, a partir del mapeo de alta resolución del
sitio de unión de las IgG1 humanas a los FcγRs, se han diseñado variantes mutadas de
dicho isotipo con una unión mejorada a estos receptores (Shields y cols., 2001; Lazar
y cols., 2006). Por el contrario, con el objetivo de obtener moléculas de anticuerpo
que retengan su especificidad, pero que disminuyan su inmunogenicidad y activación
de células T, se han generado variantes mutadas con unión reducida a los FcγRs I y
II. Un ejemplo de este tipo son las diferentes versiones de IgG1 humanizada del AcM
anti-CD3 humano OK-T3, obtenidas a partir de las sustituciones de los residuos de
Leu 234 y 235 del CH2 por Ala. Las variantes retienen la capacidad inmunosupresora
del anticuerpo original y reducen significativamente el indeseado síndrome de
liberación de citocinas, asociado a la activación de las células T (Xu y cols., 2000).
2.2.2.2 Glicosilación del anticuerpo y unión al FcγR
Además de las interacciones con los diferentes aminoácidos, la porción sacarídica
unida a la Asn297 del Fc también participa en la interacción con los FcγRs. Estas
cadenas laterales de azúcares consisten en un núcleo heptasacarídico conservado de
dos antenas, que contiene manosa y N-acetilglucosamina, con adiciones variables de
residuos de fucosa, N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico. Mientras el núcleo
de azúcar es altamente ordenado en la estructura del cristal, los residuos terminales
son más flexibles. Existe un parche hidrofóbico en cada cadena γ del Fc que
interactúa con estos azúcares (Deisenhofer, 1981). Cada glucano interviene en
aproximadamente 70 interacciones no covalentes con la superficie de la proteína, lo
que restringe su movimiento. Estas interacciones estabilizan el Fc y contribuyen a
mantener su estructura (Mimura y cols., 2000; Mimura y cols., 2001). De hecho, la
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28
eliminación completa de la porción sacarídica de la región Fc, cambia su estructura y
conduce a una afectación de la unión a los FcγRs celulares. Cambios más sutiles en la
glicosilación del anticuerpo también tienen impacto en la unión a los FcγRs y su
actividad in vivo. Por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de fucosa modula
la unión al FcγRIIIa (Okazaki y cols., 2004). Cuando no hay fucosa se genera una
interacción de alta avidez debido a que una mayor superficie del Fc está disponible
para interacciones adicionales con el residuo Asn162 del receptor.
Otro residuo sacarídico que afecta la actividad del anticuerpo es la galactosa. La
ausencia de galactosa terminal y ácido siálico se ha observado en los anticuerpos
presentes en pacientes con algunos desórdenes autoinmunes como la artritis (Arnold y
cols., 2007).
2.2.2.3 FcγRs e inmunidad adaptativa
La familia de los FcγRs ha demostrado tener una importancia capital en el
establecimiento de un umbral de activación de las células dendríticas y la modulación
de la respuesta celular adaptativa. En estas células, los FcγRs son determinantes en la
fagocitosis o endocitosis de los inmunocomplejos y la presentación de péptidos
derivados del antígeno en el complejo principal de histocompatibilidad (MHC)
(Woelbing y cols., 2006).
Varios estudios han demostrado que los inmunocomplejos son potentes activadores
de las células dendríticas e inducen respuestas inmunes más fuertes que el antígeno
solo. Su internalización conduce, además de a la presentación por MHC-II, a la
presentación cruzada por MHC-I, con la consiguiente activación de células T CD4+ y
CD8+ (Regnault y cols., 1999). Este proceso es controlado por el FcγRIIb.
Adicionalmente, la deficiencia o bloqueo del FcγRIIb en células dendríticas ha
conducido a su maduración espontánea (Boruchov y cols., 2005; Dhodapkar y
Dhodapkar, 2005). Esto demuestra el papel regulador de dicho receptor sobre este
proceso en condiciones no inflamatorias.
En situaciones en las cuales se desea una respuesta inmune máxima, como la
inmunoterapia de tumores o infecciones microbianas, el bloqueo de la actividad del
Revisión Bibliográfica
29
FcγRIIb puede ser una forma de obtener mejores efectos terapéuticos (Nimmerjahn y
Ravetch, 2007). De acuerdo con esto, se ha demostrado que la eliminación del gen
codificador del FcγRIIb resulta en una mayor estimulación de las células T antígeno-
específicas (Kalergis y Ravetch, 2002).
2.3 El FcγRIIb y la biología de la célula B
2.3.1 El FcγRIIb
Los anticuerpos constituyen las herramientas principales con las cuales los linfocitos
B participan en la respuesta inmune. Sin embargo, estas moléculas tienen un papel
importante en la biología y regulación de la actividad de este tipo de células, más allá
de sus funciones efectoras relacionadas con componentes del sistema inmune innato.
Este papel lo realizan fundamentalmente mediante la interacción específica del Fc
con el FcγRIIb expresado en las células B, lo cual contribuye a un efecto supresor de
la inmunidad humoral (Sidman y Unanue, 1976; Phillips y Parker, 1984).
El FcγRIIb está conservado en ratones y humanos (Nimmerjahn y Ravetch, 2008) y
es el único FcγR expresado en las células B (Amigorena y cols., 1989). La función
principal del FcγRIIb es inhibir señales activadoras, lo cual realiza a través del
cocomprometimiento del RCB por los inmunocomplejos. Esta señal conduce a la
fosforilación del ITIM citoplasmático del FcγRIIb por la cinasa Lyn de la familia Src
(Amigorena y cols., 1992; Muta y cols., 1994). La unión subsiguiente de fosfatasas de
inositol que contienen motivos SH2, en particular la SHP1, resulta en la
desfosforilación de intermediarios del fosfatidilinositol, lo que impide el
reclutamiento de cinasas como la BTK o la fosfolipasa C a la membrana celular, y
disminuye los eventos siguientes de la cascada de señalización activadora (Ono y
cols., 1996; Ono y cols., 1997). De esta manera, el FcγRIIb regula la activación de la
célula B aumentando su umbral y suprimiendo la presentación antigénica a las células
T mediada por el mecanismo inhibitorio dependiente de ITIM antes descrito.
El FcγRIIb puede también interrumpir la formación de la sinapsis inmune, importante
en la activación temprana de la célula B (Sohn y cols., 2008), debido, en parte, a la
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30
alteración de las interacciones RCB-lípidos y a la obstaculización de su
oligomerización inducida por el antígeno (Liu y cols., 2010).
La señalización inhibitoria a través del FcγRIIb se ha demostrado en todas las células
que lo expresan con excepción de las dendríticas foliculares, en las cuales solo se ha
comprobado una función de unión a inmunocomplejos. A diferencia de estas células
presentes en los folículos primarios, las de los centros germinales expresan altos
niveles de FcγRIIb, y de hecho, su expresión puede ser requerida para la activación
(El Shikh y cols., 2006). La ausencia de este receptor en estas células de los centros
germinales afecta el atrapamiento de los inmunocomplejos y, en consecuencia, una
disminución de la respuesta de anticuerpos y la memoria (Qin y cols., 2000;
Barrington y cols., 2002).
Adicionalmente, el entrecruzamiento del RCB y el FcγRIIb en ratones deficientes de
SHIP (Ono y cols., 1996), así como la homo-oligomerización del FcγRIIb, han
resultado en un incremento de los niveles de muerte celular. Esta inducción depende
de la fosforilación de un residuo de Tyr (probablemente el 269) del FcγRIIb por la
proteína cinasa de Tyr ABl (Pearse y cols., 1999; Tzeng y cols., 2005) y la activación
de miembros de la familia Bcl-2 (Carter y Harnett, 2004).
Se ha sugerido que este escenario puede surgir en los centros germinales, en los
cuales las células B están en contacto directo con los inmunocomplejos presentados
en la superficie de las células dendríticas foliculares. Mientras las células B que
generan RCB de mayor afinidad reciben señales del RCB y del FcγRIIb, aquellas que
pierden afinidad por el antígeno solo reciben señales por el FcγRIIb, y son por lo
tanto eliminadas. Esto es un mecanismo que permite la eliminación de células
autorreactivas de baja afinidad del repertorio inmaduro de la medula ósea o que se
generan de novo durante el proceso de maduración de la afinidad.
Otra situación en la cual la célula B virtualmente no expresa RCB y sí altos niveles de
FcγRIIb, es la célula plasmática terminalmente diferenciada. Estas células residen
predominantemente en nichos de la médula ósea, donde reciben señales de
sobrevivencia de las células del estroma (Radbruch y cols., 2006). Las señales pro-
apoptóticas disparadas por el entrecruzamiento exclusivo del FcγRIIb por los
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31
inmunocomplejos sobre las células plasmáticas, pueden explicar un posible
mecanismo de generación de espacio en este órgano linfoide para acomodar la vasta
cantidad de células plasmáticas que son necesarias para proteger al organismo de
todos los tipos de patógenos (Tzeng y cols., 2005). Los inmunocomplejos generados
de novo durante una respuesta inmune podrían unirse a las células plasmáticas en la
médula ósea e inducir apoptosis en una fracción de estas, dando espacio a las nuevas
células plasmáticas generadas. De hecho, las inmunizaciones secundarias con un
nuevo antígeno resultan en la disminución en la médula ósea del número de células
plasmáticas específicas por el antígeno primario (Xiang y cols., 2007). En
concordancia con lo anterior, está la resistencia a la inducción de apoptosis en las
células plasmáticas en cepas de ratones propensos a la autoinmunidad, con ausencia o
niveles bajos de FcγRIIb (Nimmerjahn y Ravetch, 2008). Por lo tanto, el fallo en el
control de la persistencia de células plasmáticas con niveles afectados de FcγRIIb
puede contribuir, en última instancia, al desarrollo de enfermedades autoinmunes.
En conjunto, los hallazgos anteriores prueban que el FcγRIIb es un importante punto
de control tardío en la tolerancia periférica humoral. La corrección de sus niveles de
expresión puede ser una estrategia prometedora para interferir con el proceso de
autoinmunidad patológica y restaurar la tolerancia.
El FcγRIIb se expresa también en las células pre-B y algunos estudios sugieren una
potencial contribución a la tolerancia central (Kato y cols., 2002; Brauweiler y
Cambier, 2004), aunque esto no está aún respaldado por experimentos realizados en
ratones deficientes del receptor (Fukuyama y cols., 2005).
En ratones y humanos se han identificado tres isoformas del FcγRIIb. Dos de estas, el
FcγRIIb1 y FcγRIIb2, codifican proteínas de membrana que tienen un ITIM en el
dominio citoplasmático. La isoforma principal, el FcγRIIb1, se expresa
mayoritariamente en las células B, en bajos niveles en los monocitos (Joshi y cols.,
2006), y tiene capacidad reducida de endocitar inmunocomplejos. Esta variante
contiene una inserción citoplasmática posterior al ITIM, que inhibe la endocitosis al
impedir la acumulación del receptor en vesículas recubiertas de clatrina (Miettinen y
cols., 1992). Por su parte, el FcγRIIb2 es la isoforma más expresada en células de
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32
origen mieloide y puede mediar endocitosis (Miettinen y cols., 1989), proceso
dependiente de un motivo de dileucinas en su dominio citoplasmático (Hunziker y
Fumey, 1994; Matter y cols., 1994). La tercera isoforma, el FcγRIIb3, es soluble, y se
caracteriza por la ausencia del dominio transmembrana y los primeros
citoplasmáticos, y puede inhibir la presentación de los complejos antígeno-anticuerpo
(Esposito-Farese y cols., 1995).
En general, el FcγRIIb inhibe la internalización y presentación de antígenos por la
célula dendrítica (Kalergis y Ravetch, 2002). Sin embargo, se ha probado que el
FcγRIIb expresado por este tipo de células puede entregar el antígeno a un
compartimento no degradativo, lo cual permite su recirculación a la superficie celular,
donde podría interactuar con el RCB y activar la célula B (Bergtold y cols., 2005).
2.3.2 Estrategias terapéuticas relacionadas con el FcγRIIb
Dado el amplio papel del FcγRIIb en la regulación de la respuesta inmune, este se ha
convertido en el centro de diversas estrategias terapéuticas dirigidas contra tumores,
autoinmunidad e inflamación. Entre ellas figura la modulación de la expresión del
FcγRIIb en células efectoras. El aumento in vitro de la expresión del receptor en
monocitos de pacientes con artritis reumatoide, y la consiguiente disminución de la
producción de factor de necrosis tumoral α (TNFα, siglas del inglés tumor necrosis
factor) por estas células, propone la modificación de la presencia del FcγRIIb como
una opción para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Adicionalmente,
algunas evidencias sugieren que la eficiencia de agentes terapéuticos como la IVIg y
el infliximab (AcM anti-TNFα), usados con éxito en estos padecimientos, es debida a
su efecto en la expresión del FcγRIIb (Bruhns y cols., 2003; Belostocki y cols., 2008).
Otro enfoque terapéutico basado en este receptor se concentra en la modulación de su
unión a la molécula de IgG. Este se funda en el mejoramiento de la eficacia de
anticuerpos terapéuticos a partir de la disminución de su unión al FcγRIIb o el
aumento de su unión a los FcγR activadores (Shields y cols., 2001; Lazar y cols.,
2006). Una forma de lograr lo anterior consiste en la modulación de los niveles de
glicosilación de dichos AcMs (Kalergis y Ravetch, 2002; Dhodapkar y cols., 2005;
Ferrara y cols., 2006).
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33
Una tercera aproximación considera directamente el FcγRIIb como un blanco
terapéutico. Su implementación implica el uso de AcMs dirigidos contra el receptor
que permitan su entrecruzamiento y, con ello, la inducción de apoptosis de células B
y plasmáticas en enfermedades como linfoma, mieloma y las autoinmunes (Rankin y
cols., 2006; Xiang y cols., 2007; Zhou y cols., 2008). Igualmente se está
considerando el uso clínico de anticuerpos biespecíficos que se unan simultáneamente
al RCB y el FcγRIIb, lo cual inhibiría las células B autorreactivas (Smith y
Clatworthy, 2010). Otra alternativa, que de hecho ha demostrado su eficacia en un
modelo murino de lupus eritematoso sistémico (Werwitzke y cols., 2008), comprende
la administración de FcγRIIb soluble, lo que podría inhibir la activación mediada por
los inmunocomplejos.
2.3.2.1 El FcγRIIb y las enfermedades malignas de células B
Las patologías malignas de las células B comprenden más del 85% de los linfomas
diagnosticados, con el linfoma B de células grandes difusas y el linfoma folicular,
como los más comunes de todos los linfomas no Hodgkin diagnosticados (Armitage y
Weisenburger, 1998).
El FcγRIIb se expresa en altos niveles en linfomas de origen B. Se ha observado una
sobreexpresión de la isoforma FcγRIIb2 en algunos foliculares (Callanan y cols.,
2000), como resultado de una translocación del cromosoma 1q21 (Chen y cols.,
2001). Por su parte, la sobreexpresión de la isoforma FcγRIIb1 ha demostrado
aumentar el potencial tumorigénico in vivo en experimentos de xenotrasplante
(Zusman y cols., 1996). Estudios inmunohistoquímicos han revelado que el 54% de
todos los linfomas no Hodgkin son positivos al receptor (Camilleri-Broet y cols.,
2004). En este estudio todos los linfomas de zona marginal de bazo y linfocíticos
pequeños, y solo la mitad de los foliculares, fueron positivos al receptor.
El 2B6 es un AcM de alta afinidad específico por el FcγRIIb humano. Sus versiones
quimérica y humanizada han demostrado la capacidad, in vitro, de dirigir la
citotoxicidad de células mononucleares de sangre periférica y macrófagos derivados
de monocitos a líneas de linfoma B (Rankin y cols., 2006). En un modelo de
xenotrasplante de linfoma B humano en ratón, la administración del anticuerpo redujo
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la tasa de crecimiento tumoral y la aumentó la supervivencia. Estas evidencias avalan
al FcγRIIb como un blanco viable para el tratamiento de desórdenes
linfoproliferativos.
Por otro lado, la leucemia crónica de células B es la más común en el mundo
occidental (Parker, 1997), y los individuos que la padecen desarrollan frecuentemente
enfermedades autoinmunes, lo cual sugiere una desregulación inmune (Kipps, 1997).
Se ha observado un incremento en los niveles de ácido ribonucleico mensajero
(ARNm) de FcγRIIb en células de pacientes con leucemia linfocítica crónica B
(Zheng y cols., 2002), lo que lo convierte en una diana potencial para el tratamiento
de esta patología. El hallazgo de la expresión del FcγRIIb en células tumorales de
tejido no hematopoyético abre una posibilidad al uso de anticuerpos contra este
receptor más allá de las enfermedades malignas del tipo B (Cassard y cols., 2002).
2.4 Ingeniería de anticuerpos
De principios de la década del 80 datan los primeros trabajos referentes a la clonación
de secuencias génicas de anticuerpos a partir de ADN obtenido de linfocitos,
hibridomas y linfomas, y la manipulación de los genes de las regiones variables de las
inmunoglobulinas para la creación de moléculas con nuevas propiedades (Morrison y
cols., 1984; Morrison, 1985). No es hasta finales de esta década que se produce el
desarrollo impetuoso de la ingeniería genética de anticuerpos, impulsado
fundamentalmente por tres factores: a) la necesidad de mejorar la eficacia terapéutica
de los AcMs murinos, b) las limitaciones tecnológicas para obtener AcMs humanos
(Wright y cols., 1992) y c) el desarrollo de la Biología Molecular.
De la experiencia terapéutica de cientos de pacientes, se ha podido definir que una
alta proporción de los individuos sometidos a altas dosis y esquemas repetidos con
AcMs desarrollan una respuesta HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón), que puede
limitar la efectividad del tratamiento (LoBuglio y cols., 1989; Blanco y cols., 1997).
Esta respuesta está dirigida fundamentalmente a la región constante del anticuerpo,
aunque se ha detectado también una cierta respuesta anti-idiotípica (contra la región
variable). Este fenómeno puede disminuir la eficiencia del tratamiento al eliminar los
AcMs circulantes, lo cual altera sus propiedades farmacocinéticas, y/o causar
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hipersensibilidad a los inmunocomplejos o reacciones alérgicas que son dañinas a los
pacientes. A ello se suma que los anticuerpos murinos pueden ser poco eficientes en
la promoción de funciones efectoras por las células humanas, y que su patrón de
glicosilación es diferente al de los anticuerpos humanos, hecho este que parece
afectar su biodistribución y transporte (Nose y Wigzell, 1983). Los factores que
probablemente influyen en la inmunogenicidad de los AcMs terapéuticos son: las
regiones constantes y variables murinas; los alotipos de las inmunoglobulinas
humanas y la glicosilación inusual; el método, frecuencia y dosis de administración;
el estado inmunitario y de la enfermedad del paciente, así como su haplotipo MHC; la
especificidad del anticuerpo, la naturaleza del antígeno (soluble o de superficie
celular) y la formación de los inmunocomplejos; la activación del complemento y la
unión al receptor del Fc del anticuerpo, y la inflamación con liberación de citocinas
(Clark, 2000).
Las primeras modificaciones hechas a los AcMs de ratón mediante la ingeniería
genética se dirigieron principalmente a la creación de inmunoglobulinas quiméricas,
donde las regiones variables de anticuerpos murinos con potencial terapéutico se
asociaron a regiones constantes humanas, en el afán de eliminar la respuesta HAMA
y mejorar sus funciones efectoras, conservando la especificidad original (Morrison y
cols., 1984; Wright y cols., 1992).
Otros autores han logrado disminuir aún más la inmunogenicidad, insertando los
CDRs de los anticuerpos xenogénicos sobre los FRs de inmunoglobulinas humanas
(Riechmann y cols., 1988). Este procedimiento trae muchas veces una pérdida de la
afinidad por el antígeno. Para resolver este problema un número mínimo de residuos
murinos en la región de los FRs son restituidos dentro de los correspondientes FRs
humanos (Jones y cols., 1986b; Riechmann y cols., 1988; Kettleborough y cols.,
1991; Tempest y cols., 1991; Mateo y cols., 1997).
Las características del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo dependen de su
estructura primaria y la relativa disposición de los CDRs, aunque algunos
aminoácidos de la región de los FRs intervienen en la unión al antígeno (Davies y
cols., 1990; Foote y Winter, 1992; Mateo y cols., 1997). Un grupo de residuos en los
Revisión Bibliográfica
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FRs ha sido definido como zona "Vernier", la cual puede ajustar la estructura de los
CDRs y ayuda en la fijación al antígeno de una forma fina (Foote y Winter, 1992).
Sustituciones de estos residuos pueden ser importantes en la recuperación de la
afinidad en los anticuerpos humanizados a los que se les ha injertado CDRs murinos,
por lo que esta zona de "Vernier" tiene una consecuencia obvia en el diseño de los
anticuerpos humanizados.
Además de las células B, las células T juegan un papel importante en la respuesta
inmune. En el 2001, Mateo y colaboradores describieron una nueva metodología para
reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos quiméricos (AcQs) sin afectar su
afinidad. Los epítopos inmunogénicos hipotéticos de la región variable,
frecuentemente presentes en regiones anfipáticas, son identificados mediante análisis
in silico. Posteriormente, son sujetos a mutagénesis dirigida para sustituir los residuos
murinos involucrados por los correspondientes humanos y/o romper los motivos
anfipáticos. Una búsqueda de posibles epitopos anfipáticos en la base de datos de
Kabat (http://immuno.bme.nwu.edu/), reveló la presencia de patrones conservados en
las diferentes familias de las secuencias de las regiones variables, lo cual sugiere que
el método propuesto podría ser de aplicabilidad general (Roque-Navarro y cols.,
2003; Fernandez-Marrero y cols., 2011).
Otras estrategias han creado anticuerpos completamente humanos mediante la
selección de regiones variables humanas en bibliotecas de fagos (Kretzschmar y von
Ruden, 2002). Por otra parte, el reemplazo de los genes inmunoglobulínicos murinos
por su contraparte humana en animales transgénicos, ha permitido que estos
produzcan anticuerpos humanos luego de la inmunización (Green, 1999; Tomizuka y
cols., 2000). Sin embargo, a pesar de todos los esfuerzos realizados para reducir la
inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos, se ha observado en muchos casos
una respuesta HAHA (siglas del inglés human anti-human antibodies) que persiste
luego de la humanización, dirigida fundamentalmente contra la porción idiotípica
(Iwahashi y cols., 1999; Ritter, 2000). Incluso, se ha evidenciado que las
modificaciones genéticas pueden generar nuevos idiotopos en la variante
humanizada. Solo los ensayos clínicos son concluyentes sobre la inmunogenicidad en
Revisión Bibliográfica
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pacientes, y esclarecer cuál de estos métodos es el más ventajoso para su aplicación
terapéutica.
Materiales y Métodos
39
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Medios de cultivo
Para el cultivo de las bacterias se empleó el medio Luria-Bertani (LB) (Sigma, St.
Louis, EUA), con o sin antibióticos. Para la selección de colonias recombinantes
mediante la actividad de la enzima -galactosidasa, se añadió a las placas con agar X-
gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- -D-galactopiranósido) e IPTG (isopropil- -
Dtiogalactopiranósido) (Sigma).
El medio Eagles Modificado de Dulbecco (D’MEM-F12) (Gibco-BRL, Gaithersburg,
MD), suplementado con 10% de suero fetal de ternera (SFT) inactivado por calor,
penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 g/mL), y L-glutamina 2 mM, se utilizó
para el cultivo de las líneas celulares NS0, K562, Daudi, MB16F0, F3II, los
hibridomas y los transfectomas. Para la selección de las células NS0 transfectadas se
añadió al medio histidinol 10 mM (Sigma).
3.2 Microorganismos
Para la clonación y purificación de los vectores plasmídicos se empleó la cepa de
Escherichia coli TG1 supE hsd 5 thi (lac-proAB) F´ [traD36 proAB+ lacI
q
lacZ M15] que se obtuvo de la ATCC (American Type Culture Collection,
Rockville, EUA).
3.3 Hibridomas y líneas celulares
Los hibridomas productores de los AcMs B7 y 34B7 (Macías y cols., 1999) se
obtuvieron en el laboratorio de Hibridomas del CIM. Los hibridomas productores de
los AcMs 2.4G2 y M5/114.15.2 fueron gentilmente donados por el Dr Vincenzo
Bronte, Istituto Oncologico Veneto, Italia.
Se utilizó la línea celular NS0 (mieloma murino no secretor de inmunoglobulinas;
Galfrè y Milstein, 1981), y los transfectomas NS0 productores de las cadenas ligeras
quiméricas de los AcMs P3 y 1E10 (López-Requena y cols., 2003), para la expresión
estable de los anticuerpos recombinantes.
Se utilizaron además las líneas celulares K562 (eritroleucemia humana; Koeffler y
Materiales y Métodos
40
cols., 1980), Raji (Linfoma de Burkitt; Pulvertaft, 1964), Daudi (Linfoma de Burkitt;
Klein y cols., 1968), MB16F0 (melanoma no metastásico de ratón C57/Bl6; Voulot y
cols., 1985) y F3II (tumor mamario murino; Alonso y cols., 1996). Las cuatro
primeras se obtuvieron de la ATCC, mientras la F3II fue donada gentilmente por el
Doctor Daniel Alonso, Instituto de Oncología Ángel H. Roffo, Argentina.
La línea celular A20 (linfoma B murino) y su mutante natural A20IIAI.6 (Jones y
cols., 1986a) fueron donadas gentilmente por el Dr. Oscar Burrone (International
Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Italia). La línea transfectada
A20IIA1.6 huIIB1 (Siberil y cols., 2006) fue donada por el Dr. Srini Kaveri
(INSERM, Francia).
3.4 Animales
Los ratones hembras BALB/c y BALB/c xid, de seis a ocho semanas de edad, se
obtuvieron del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio
(CENPALAB, La Habana). Los animales se mantuvieron y alimentaron en
condiciones de aislamiento de acuerdo con las directivas estipuladas por el Comité de
Animales de Laboratorio del CIM bajo estricto control veterinario. Los estudios se
llevaron a cabo con la aprobación del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de
los Animales de Laboratorio.
3.5 Vectores plasmídicos
Para la secuenciación de las VHs y VLs de los AcMs se empleó el vector pMOS-Blue
(Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido), el cual codifica la -lactamasa
(resistencia a ampicillina). El sitio de inserción se encuentra dentro de la secuencia
del gen que codifica la enzima -galactosidasa, lo cual permite la selección de
transformantes con el inserto deseado por discriminación de colonias blancas y
azules, mediante la inducción del gen por IPTG y el desarrollo del color azul con el
sustrato cromogénico X-Gal.
Se utilizaron como vectores de expresión el pAG4622, que contiene el segmento
génico de la región constante kappa de la cadena ligera humana y confiere resistencia
al ácido micofenólico, y el pAH4604, el cual contiene el segmento génico de la
Materiales y Métodos
41
región constante 1 de la cadena pesada humana, y confiere resistencia al histidinol
(Coloma y cols., 1992), gentilmente donados por la Dra. Sherrie L. Morrison de la
Universidad de California, Los Angeles (UCLA). Se empleó, además, el pAH4604
(Ala/Ala), versión mutada del pAH4604, donde los residuos de leucina de las
posiciones 234 y 235 se sustituyeron por alaninas (Hinojosa y cols., 2010). Estos
vectores contienen un promotor de inmunoglobulinas, y para la inserción de los
segmentos génicos variables, presentan los sitios EcoRV-SalI (pAG4622) y EcoRV-
NheI (pAH4604). Contienen un sitio único de restricción PvuI para su linealización y
codifican la -lactamasa.
3.6 Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos se sintetizaron en un equipo Applied Biosystems 381 DNA
synthesizer (Amersham Pharmacia, Reino Unido) en el Centro de Ingeniería Genética
y Biotecnología, y se purificaron por PAGE (del inglés polyacrylamide gel
electrophoresis), en condiciones desnaturalizantes (urea 6 M). Los nucleótidos entre
paréntesis indican que existe una mezcla con uno o el otro en esa posición del
oligonucleótido..(Tanaka y Nei, 1989)
3.6.1 Oligonucleótidos para la síntesis del ADN complementario y la
amplificación de las regiones variables por reacción en cadena de la
polimerasa
Para la síntesis del ADNc de las regiones variables de los AcMs B7 y 34B7 se
emplearon los siguientes oligonucleótidos:
VL: 5’-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’
VH: 5’-AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC-3’
Para la amplificación de las regiones variables de los AcMs B7 y 34B7 se emplearon
los siguientes oligonucleótidos (hibridan en la región 5´ de la secuencia codificadora
del péptido señal y en el extremo 3´, al final del FR4, de ambas cadenas):
Materiales y Métodos
42
CACC: Sitio de unión del ribosoma GATATC: Sitio de restricción EcoRV
GTCGAC: Sitio de restricción SalI GCTAGC: Sitio de restricción NheI
GTTAAC: Sitio de restricción HincII
3.6.2 Construcción de las variantes mutadas de la VHB7
VHB7Y33: Residuo Thr33 Tyr (CDR H1)
VHB7STK: Residuos Gly56 Ser, Ala57 Thr, Ser58 Lys (CDR H2)
RCP: Reacción en cadena de la polimerasa
RCPs: RCP con los productos mezclados de la RCP 1 y la RCP 2.
Los codones mutados se encuentran subrayados.
Materiales y Métodos
43
3.7 Genes sintéticos
Los genes mutados de la VHB7Y33 se sintetizaron químicamente (Geneart GmbH,
Regensburg, Alemania). Las variantes H1, H2, H3 y H4 contienen cambios en los
CDRs H1, H2, H3, y el FR H3, respectivamente. El diseño de las modificaciones
contenidas en cada uno se detallan en la sección Resultados.
3.8 Anticuerpos monoclonales
Los AcMs (IgM, κ) E1 (Alfonso y cols., 1995), P3 (anti-gangliósidos N-glicolilados;
Vázquez y cols., 1995), y F6 (anti-gangliósido NeuAcGM1; Alfonso y cols., 1995) se
purificaron a partir de fluido ascítico por cromatografía de exclusión molecular
empleando una columna Sephacryl S-300 de alta resolución (XK-26/1000)
(Pharmacia, Uppsala, Suecia), equilibrada con solución salina tamponada con
fosfatos (SSTF) con NaCl 0,5 M pH 7,4, previa precipitación con sulfato de amonio.
El AcQ C5 (IgG1, ) (Roque-Navarro y cols., 2003), se generó en el grupo de
Biología Molecular a partir de la región variable del AcM ior-C5, el cual reconoce a
una glicoproteína de PM 145-190 kDa en células de tumores colorrectales (Vázquez y
Giscombe R. , 1995). Los AcQs (IgG1, humanas) 14F7 (anti-gangliósido NeuGc
GM3, Roque-Navarro y cols., 2008), 1E10 (López-Requena y cols., 2003), P3
(López-Requena y cols., 2003) y sus mutantes P3S31 y P3S98; 100a (López-Requena
y cols., 2007c), así como B7Y33, sus mutantes y el AcQ C5, se obtuvieron de los
sobrenadantes de cultivo de los transfectomas correspondientes y se purificaron por
cromatografía de afinidad con proteína A (Pharmacia). El anticuerpo Rituximab se
adquirió de la firma Roche (Basilea, Suiza).
Los AcMs 2.4G2 (rata, IgG2a; específico por Fc RII/III murino) y M5/114.15.2 (rata,
IgG2b; específico por MHC-II murino), se obtuvieron a partir de los sobrenadantes de
cultivo de los hibridomas correspondientes y se purificaron por cromatografía de
afinidad con proteína G.
Las IgGs purificadas se analizaron por SDS (del inglés sodium dodecyl sulfate)-
PAGE bajo condiciones reductoras.
Materiales y Métodos
44
La especificidad de los anticuerpos purificados se confirmó mediante ensayos
inmunoenzimáticos en fase sólida (ELISA), y la concentración proteica se estimó por
absorbancia a 280 nm y se confirmó por ELISA (Mateo y cols., 2000).
3.9 Fragmentos de anticuerpos
Los fragmentos F(ab´)2 de las proteínas PM2 y PM5 de mieloma IgG humano se
obtuvieron por digestión de los anticuerpos con pepsina, según Lamoyi y Nisonoff,
1983. Los fragmentos Fc y las inmunoglobulinas no digeridas se removieron por
adsorción a proteína A acoplada a sefarosa (Pharmacia). La fracción no adsorbida,
que contiene los F(ab´)2, se dializó extensivamente contra solución salina tamponada
con fosfatos (SSTF). (Lamoyi y Nisonoff, 1983).lamoLo yi
3.10 Técnicas de uso corriente en Biología Molecular
La preparación de las células competentes, la transformación de estas, la purificación
del ADN plasmídico en pequeña y gran escala, las reacciones de ligamiento, las
electroforesis de ADN en geles de agarosa y poliacrilamida, y las digestiones con
enzimas de restricción se hicieron según Sambrook y cols., 1989. Se emplearon
juegos de reactivos para la purificación de ADN plasmídico y extracción de
fragmentos de ADN de geles de agarosa de la firma Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden,
Alemania). Las enzimas de restricción, la T4 ADN ligasa y el juego de reactivos para
la RCP con la Vent ADN polimerasa, se obtuvieron de la firma New England Biolabs
(EUA). Las reacciones de RCP se realizaron en un termociclador PTC-150 (MJ
Research Inc., Watertown, EUA).
La extracción del ARN total a partir de los hibridomas productores de los AcMs se
realizó utilizando el reactivo TRIzol (Gibco BRL). Las reacciones de transcripción
inversa-RCP se realizaron empleando el juego de reactivos Access RT-PCR
(Promega, Madison, EUA). (Sambrook y cols., 1989)
Las regiones VL y VH amplificadas se insertaron en el vector pMOSBlue para su
secuenciación. Esta se realizó por el método de los didesoxinucleótidos (Sanger y
cols., 1979), usando el juego de reactivos T7 ADN polimerasa (USB, Cleveland,
EUA) de acuerdo con el protocolo descrito por los fabricantes, o utilizando el servicio
comercial de Macrogen Inc. (Seúl, Corea del Sur).
Materiales y Métodos
45
3.11 Análisis inmunogenético
3.11.1 Identificación de los segmentos génicos V, D y J empleados en las regiones
variables
Las secuencias de nucleótidos individuales de las regiones variables se analizaron
mediante su alineación con secuencias V, D y J de línea germinal contenidas en la
base de datos de genes de línea germinal del IgBlast, NCBI (siglas del inglés National
Center for Biotechnology Information), de acceso en Internet
(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast). Para determinar si las secuencias habían sufrido el
proceso de HMS, se calculó la relación mutaciones de reemplazo aminoacídico sobre
mutaciones silentes (R/S) [valor igual o mayor a 2,9 ante una selección positiva de
cambios nucleotídicos que afectan la secuencia aminoacídica (Shlomchik y cols.,
1987)]. Las secuencias obtenidas se analizaron también empleando el programa
BLAST del NCBI, de acceso en Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), con
el objetivo de identificar las secuencias de mayor similaridad. Las secuencias de
nucleótidos o aminoácidos enviadas a BLAST se compararon con secuencias
contenidas en bases de datos en NCBI (GenBank). Los aminoácidos se numeraron de
acuerdo al esquema de Kabat, empleando el servicio de acceso en Internet
(http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html) del grupo de Bioinformática de Andrew
C. R. Martin, del University College of London (UCL).
3.11.1.1 Análisis de las secuencias en las regiones de recombinación V-(D)-J
El origen de los nucleótidos en los CDR H3 se analizó según Bangs y cols. (1991). El
segmento génico VH codifica hasta el codón 94 en la región variable de la cadena
pesada. La región codificada por los segmentos génicos D se identificó mediante el
análisis por alineación con todos los genes D de línea germinal. Los nucleótidos en
las uniones VH-D o D-JH que pudieron haber sido originados tanto en el gen D como
en los genes VH o JH adyacentes, se asignaron a VH o JH. Las regiones N se definieron
como los segmentos de nucleótidos colindantes con la región D en sus extremos 5’ o
3’, y que no pudieron ser explicados por ninguno de los segmentos génicos descritos
(Alt y Baltimore, 1982). Los genes de línea germinal JH y D se tomaron de la base de
datos IgBlast accesible en el sitio del NCBI en Internet (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Materiales y Métodos
46
En las secuencias de las regiones variables de las cadenas ligeras, los segmentos V
donantes generalmente explican las secuencias de estas regiones variables hasta el
codón 95 en el CDR L3. Asimismo, la identificación del gen J donante permite
identificar el extremo 3’ del CDR L3, que termina en el codón 97.
3.11.2 Agrupamiento de genes de la familia VHJ558
El análisis filogenético de las secuencias génicas de la familia VH J558 (156 genes)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline) se realizó con el programa
CLUSTALW7 y se visualizó con el programa Tree View (V 1.6.6). La búsqueda de
anticuerpos que usan los genes VH agrupados se hizo con el nucleotide-nucleotide
BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
3.12 Modelación de la estructura tridimensional de la región variable del B7Y33
El modelo computacional de la región variable del AcQ B7Y33 se construyó a partir
de las secuencias aminoacídicas, empleando el servidor web de modelación de
anticuerpos WAM, del inglés Web Antibody Modelling ((Whitelegg y Rees, 2000);
http://antibody.bath.ac.uk). El modelo se analizó empleando el programa Swiss PDB
Viewer (Guex y Peitsch, 1997).
3.13 Construcción y expresión de los anticuerpos quiméricos B7, sus mutantes e
híbridos
Los segmentos génicos VLB7 y VHB7, clonados en el vector pMOS-Blue, se
digirieron EcoRV/SalI (el primero) y HincII/NheI (el segundo). Posteriormente, se
transfirieron a los vectores de expresión pAG4622 (cadena ligera, digerido
EcoRV/SalI) y pAH4604 (cadena pesada, digerido EcoRV/NheI), respectivamente.
La introducción de las mutaciones en las posiciones 33 (B7Y33) y 56-58 (B7STK) de
la cadena pesada del AcQ B7 se realizó mediante la técnica de sobrelapamiento de los
productos de la RCP (Kammann y cols., 1989), con el uso del juego de reactivos de la
Vent ADN polimerasa. Las bandas clonadas en pMOSBlue se digirieron con las
enzimas HincII/NheI, y se transfirieron a los vectores de expresión pAH4604 o
pAH4604 (Ala/Ala) (cadenas pesadas), previamente digeridos EcoRV/NheI.
Materiales y Métodos
47
Los derivados sintéticos de VHB7Y33, clonados en el vector pGA4 (Geneart), se
digirieron HincII/NheI y se transfirieron al vector de expresión pAH4604 digerido
EcoRV/NheI.
Las células NS0 se electroporaron, con un pulso de 200 V y 960 F (electroporador
GeneZapper; Kodak, New Haven, EUA), con 20 g de los vectores de expresión que
contienen las cadenas ligera y pesada, linealizados con la enzima PvuI, como ha sido
previamente descrito (Mateo y cols., 2000). Para la obtención del AcQ B7 y las
variantes mutadas de su región VH se cotransfectaron las construcciones
VкB7pAG4622 y aquellas obtenidas a partir del vector pAH4604, mientras para el
B7Y33LALA se usó la misma cadena ligera quimérica y la construcción VHB7Y33
pAH4604 (Ala/Ala). La producción de inmunoglobulinas quiméricas se cuantificó
por ELISA, partiendo de los sobrenadantes de los clones resistentes (Mateo y cols.,
2000). Brevemente: las placas se recubrieron con un antisuero de chivo anti-cadena
humana (Sigma), durante toda la noche, a 4°C. Después de lavadas con SSTF-T
(SSTF con 0,5% Tween 20, pH 7,5), se añadieron las muestras diluidas en SSTF-T-
suero fetal de ternera 5% (SSTF-T-SFT). Como segundo anticuerpo se empleó un
antisuero de chivo anti-cadena humana conjugado a peroxidasa (Jackson
Immunoresearch, WestGrove, EUA). Todas las incubaciones se hicieron durante 1 h,
a 37 °C. Tras otro lavado con SSTF-T se desarrolló la reacción con la adición de la
solución sustrato (o-fenilendiamina en tampón de citrato-fosfato, pH 4,2, con H2O2
0,06%), y se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico. La absorbancia del
producto de la reacción se midió a 492 nm en un lector de ELISA (Organon Teknika,
Salzburg, Austria). Para la cuantificación, se empleó un patrón de inmunoglobulinas
humanas con un rango de concentraciones de 7 a 500 ng/ml. Los clones de mayor
productividad de anticuerpos se subclonaron dos veces por dilución limitante.
Para la construcción de los AcQs híbridos, los transfectomas productores de las
cadenas ligeras quiméricas de los anticuerpos P3 y 1E10 (López-Requena y cols.,
2003) se transfectaron, como ha sido descrito, con el vector para la expresión de la
cadena pesada quimérica del anticuerpo B7Y33 para obtener los anticuerpos híbridos
VHB7Y33/V P3 y VHB7Y33/V 1E10, respectivamente.
Materiales y Métodos
48
3.14 Acoplamiento de anticuerpos a biotina
El acoplamiento de los anticuerpos a biotina se realizó según un procedimiento
previamente descrito (Bayer y Wilchek, 1980). El anticuerpo (1 mg/ml) se incubó con
100 μg/ml de biotina N-hidroxisuccinimida (Sigma) en tampón borato (0,1 M; pH
8,8) por 4 h a 25oC, en la oscuridad. La reacción se detuvo con la adición de 20 μl de
NH4Cl 1 M por cada 250 μg de biotina empleada. A continuación las soluciones se
dializaron durante 48 h contra SSTF.
3.15 Ensayos de interacción entre anticuerpos
La reactividad de los AcQs generados, frente a las IgMs anti-gangliósidos, se
determinó través de un ensayo de ELISA descrito previamente (López-Requena y
cols., 2007c). Las placas (Microlon® 600, high binding, Greiner Bio One, Alemania)
se recubrieron durante toda la noche, a 4°C, con los correspondientes AcMs murinos
a 10 µg/ml, y se bloquearon por 1 h con SSTF-T-seroalbúmina bovina 1% (SSTF-T-
SAB). Después de la incubación con los AcQs durante 2 h, a 37°C, las placas se
lavaron y se añadió un antisuero de chivo anti-cadena humana conjugado a fosfatasa
alcalina (Sigma). La solución sustrato consistió en 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato en
tampón dietanolamina, pH 9.8. La absorbancia del producto de la reacción se midió a
405 nm en un lector de ELISA (Organon Teknika).
Un experimento similar al descrito anteriormente se utilizó para evaluar la unión del
B7Y33 o la muteína B7Y33LALA a otros AcQs, con los cuales se recubrieron las
placas. Después de bloqueadas, se añadió el B7Y33 o el B7Y33LALA biotinilados, y
la reactividad se detectó con estreptavidina conjugada a fosfatasa alcalina (Jackson
Immunoresearch). De manera semejante se midió la capacidad de autounión de los
diferentes AcQs. En este caso, diferentes concentraciones de anticuerpos biotinilados
se añadieron a placas recubiertas con las mismas moléculas no biotiniladas. La
reactividad se midió con estreptavidina conjugada a fosfatasa alcalina (Jackson
Immunoresearch).
Todos los experimentos de interacción entre anticuerpos se hicieron por triplicado.
Materiales y Métodos
49
3.16 Ensayos de interacción del B7Y33 con antígenos de naturaleza no
inmunoglobulínica
Las placas de microtitulación antes mencionadas se recubrieron con los antígenos
P64K (proteína de Neisseria meningitidis, Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología, CIGB, La Habana), toxoide tetánico (TT) (Instituto Finlay, La
Habana), factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGFhr, siglas del
inglés human epidermal growth factor) (CIGB), insulina humana (Novo Nordisk A/S,
Dinamarca), insulina bovina (Gibco BRL) y transferrina bovina (Gibco BRL), a 10
g/ml en tampón de recubrimiento, durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron
con SSTF-T, y se bloquearon con SSTF-T-SAB. Se añadieron los AcQs purificados y
después del lavado con SSTF-T, se utilizó como segundo anticuerpo un antisuero de
chivo anti-cadena humana conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma). Como criterio de
reconocimiento positivo se estableció el valor de absorbancia superior al doble del
correspondiente al anticuerpo irrelevante, y mayor a 0.2 unidades de absorbancia.
3.17 Inoculación de ratones con las IgMs anti-gangliósidos y los AcQs
Con el objetivo de caracterizar la respuesta de anticuerpos inducida por la
coadministración de IgMs anti-gangliósidos (AcMs P3, E1 y F6), y el B7Y33 o una
de sus variantes (VHB7Y33/V P3), se inocularon ratones BALB/c o BALB/c xid por
vía subcutánea, a intervalos de 14 días, con dos dosis de 80 g de los AcQs y 50 g
de las IgMs, en SSTF. Los anticuerpos murinos y quiméricos se administraron en una
mezcla única, o de manera independiente por diferentes flancos del animal. En uno de
los experimentos se inyectó la mezcla solo en una de las dosis, mientras la restante
consistió exclusivamente en la IgM murina. Las extracciones de los sueros se
realizaron antes del inicio del protocolo y siete días después de cada dosis. Como
control se empleó el AcQ C5.
3.18 Ensayo de medición de anticuerpos específicos en el suero de los ratones
Se determinó por ELISA la presencia en el suero de los ratones de anticuerpos IgG
específicos por las IgMs inoculadas. Las placas se recubrieron durante toda la noche,
a 4°C, con la IgM correspondiente, a 10 g/ml. Después de lavadas con SSTF y
bloqueadas con SSTF-T-SAB, se añadieron los sueros diluidos 1:50 en SSTF-T-SAB,
Materiales y Métodos
50
los cuales se incubaron 2 h a 37°C. Como segundo anticuerpo se empleó un antisuero
de chivo anti-cadena murina conjugado a fosfatasa alcalina (Jackson
Immunoresearch). Se asumió como respuesta positiva el valor de absorbancia
superior al doble del correspondiente al suero preinmune. Las mediciones se hicieron
por triplicado.
3.19 Citometría de flujo
En todos los ensayos de citometría de flujo los conjugados se usaron a las
concentraciones sugeridas por los fabricantes. Los análisis se llevaron a cabo
empleando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson, Mountain View,
EUA). Las muestras se caracterizaron en cuanto a la intensidad de fluorescencia
emitida por los fluoróforos con los que se marcaron, y en cuanto a la granulosidad y
al tamaño de las células. Estos dos últimos parámetros están dados por la dispersión
del láser hacia los lados (SSC, siglas del inglés side scatter) y hacia delante (FSC,
siglas del inglés forward scatter), respectivamente. Los datos obtenidos se analizaron
empleando el programa WinMDI 2.8. En cada medición se adquirieron 104 células.
Los experimentos se repitieron, al menos, dos veces.
3.19.1 Aislamiento de linfocitos de bazo de ratones BALB/c no inmunizados
Para la obtención de los linfocitos de bazo de ratones BALB/c no inmunizados, se
perfundió este órgano con SSTF. La suspensión celular se centrifugó, se desechó el
sobrenadante y las células se resuspendieron en 2 ml de solución de lisis (NH4Cl 0,15
M, KHCO3 10 mM, EDTANa2 0,1 mM, pH 7.2), en la que se incubaron a 25oC
durante 5 min. Después se centrifugaron y se resuspendieron en una solución de SAB
al 2% en SSTF (SSTF-SAB), a una densidad de 106
células/ml.
3.19.2 Aislamiento de células mononucleares humanas
La sangre humana utilizada se obtuvo del Banco de Sangre del Centro de
Investigaciones Médico Quirúrgicas (CIMEQ, La Habana) (donante sano) o de
pacientes diagnosticados con desórdenes proliferativos de células B (leucemia
linfocítica crónica B y leucemia linfoblástica aguda B), del Instituto de Hematología e
Inmunología, La Habana. Para el aislamiento de las células mononucleares del
Materiales y Métodos
51
donante sano o de los pacientes con leucemia linfocítica crónica B se procesaron
muestras de sangre periférica, mientras que para el paciente de leucemia linfoblástica
aguda B, aspirado de médula ósea.
Se colectaron 10 ml de sangre o aspirado de médula ósea en tubos BD VacutainerTM
(Becton Dickinson, NJ, EUA) que contienen heparina, y se diluyeron en igual
volumen de SSTF. La sangre diluida se añadió a 1/3 del volumen de Ficoll-PaqueTM
PLUS (Amersham Pharmacia Biotech), y se centrifugó 20 min a 2000 rpm, a 25oC.
Las células contenidas en la interfase se lavaron con SSTF y se centrifugaron durante
5 min a 1200 rpm. Finalmente, se resuspendieron en SSTF-SAB a una densidad de
106células/ml.
3.19.3 Reconocimiento de linfocitos B y líneas celulares
Los esplenocitos de ratón BALB/c, y las líneas NS0, Raji, Daudi, MB16F0 y F3II
(106) se incubaron con los AcQs a 4
oC durante 30 min y se lavaron con SSTF-SAB.
Posteriormente, se mantuvieron en iguales condiciones con una preparación
policlonal de F(ab´)2 de conejo anti-IgG humana conjugado a isotiocianato de
fluoresceína (FITC, acrónimo del inglés fluorescein isothiocyanate) (Dako,
Dinamarca), para detectar la unión de los AcQs, y un anticuerpo anti-B220 de ratón,
conjugado a ficoeritrina (PE, acrónimo del inglés phycoerythrin) (BD Biosciences
Pharmingen, NJ, EUA), para la identificación de las células B.
Las células mononucleares humanas y las células K562 (106) se incubaron durante 30
min a 4oC con los AcQs biotinilados. Después de lavadas con SSTF-SAB se
mantuvieron a 4oC durante 20 min con estreptavidina conjugada a PE (BD
Biosciences Pharmingen) y, en el caso de las células mononucleares humanas, un
anticuerpo anti-CD19 humano conjugado a FITC (AbD Serotec, Raleigh, EUA). Los
AcQs C5, 1E10 y P3 se usaron como controles de isotipo.
3.19.4 Expresión del FcγRII en líneas celulares de ratón
Para evaluar la expresión del FcγRII en tres líneas celulares murinas (NS0, MB16F0
y F3II), se incubaron 106
células con el AcM 2.4G2. Después de lavadas con SSTF-
SAB se les añadió un anticuerpo de chivo anti-inmunoglobulinas de rata, biotinilado
Materiales y Métodos
52
(BD Biosciences Pharmingen) y, después de un lavado intermedio, estreptavidina
conjugada a FITC (BD Biosciences Pharmingen). En todos los pasos las incubaciones
se realizaron a 4oC durante 30 min.
3.19.5 Ensayos de inhibición
Un millón de células de bazo de ratón BALB/c se incubaron con concentraciones
crecientes de un antisuero de burro específico por IgM (anti-cadena µ de ratón;
Jackson Immunoresearch) durante 30 min a 4oC. Después de un lavado con SSTF-
SAB, las células se incubaron con 2,5 µg/ml de B7Y33 biotinilado durante 30 min, a
la misma temperatura. La reactividad se midió con estreptavidina conjugada a FITC
(BD Biosciences Pharmingen). Un anticuerpo anti-B220 (BD Biosciences
Pharmingen) conjugado a PE se utilizó para identificar la población de células B.
El ensayo de inhibición con un anticuerpo específico por el FcγRII de ratón se realizó
incubando esplenocitos de ratón BALB/c o células NS0 con el anticuerpo 2.4G2, por
30 min a 4oC. A continuación, las células se incubaron con 2,5 µg/ml de B7Y33
biotinilado en iguales condiciones. La reactividad se midió con estreptavidina
conjugada a PE (BD Biosciences Pharmingen). El porcentaje de inhibición se calculó
como sigue:
% inhibición= [(% unión sin inhibidor-% unión con inhibidor)/% unión sin
inhibidor]*100. En el experimento con células de bazo se usó un anticuerpo anti
MHC-II como control negativo de inhibición. En el caso de las células NS0, el AcQ
14F7 biotinilado, específico por el gangliósido NeuGcGM3, se usó como control
negativo.
Las células humanas K562 y Raji se incubaron primeramente con el B7Y33 a 15
μg/ml (K562) o 5 μg/ml (Raji), y posteriormente con el anticuerpo comercial AT10
conjugado a PE (AbD Serotec), específico por el FcγRII humano, siempre durante 30
min a 4oC. La unión del AT10 se evaluó también en ausencia del B7Y33. El AcQ
Rituximab se utilizó como control negativo.
Materiales y Métodos
53
3.19.6 Experimento de unión por complementariedad molecular
Las muteínas H3 o H4 se mezclaron con el AcQ B7Y33LALA en diferentes
proporciones (1:10, 10:1 y 1:1, donde 1: 2,5 μg/ml; 10: 25 μg/ml) y se incubaron
durante 30 min a 37oC. Las mezclas se añadieron a esplenocitos de ratón BALB/c y
mantuvieron a 4oC por 30 min. La reactividad se midió con una preparación
policlonal de F(ab´)2 de conejo anti-IgG humana conjugado a FITC (Dako). Un
anticuerpo anti-B220 conjugado a PE (BD Biosciences Pharmingen) se usó para
marcar los linfocitos B.
3.20 Análisis estadístico
Para la comparación entre los diferentes grupos experimentales, se determinó
previamente la normalidad de la distribución de los datos, mediante la prueba de
Kolmogorov-Smirnov, y la homogeneidad de varianza, mediante la prueba de
Bartlett. Como en los casos analizados no existe distribución normal ni
homogeneidad de varianza, aun después de diferentes transformaciones, se aplicó el
método no paramétrico Kruskal-Wallis y la post-prueba de Dunn. Todas estas
técnicas están contenidas en el programa GraphPad Prism versión 5.03 de 2010, para
Windows.
Resultados
55
4. RESULTADOS
4.1 Análisis inmunogenético de los AcMs B7 y 34B7
4.1.1 Origen de los genes VK y VH de los AcMs B7 y 34B7
Los AcMs anti-idiotipos α B7 y 34B7 comparten un alto grado de multiespecifidad y
de conectividad idiotípica, propiedades similares a los anticuerpos que forman parte
del repertorio neonatal natural (Holmberg y cols., 1984b; Avrameas, 1991). Por lo
tanto, algunas analogías inmunogenéticas podrían esperarse entre estos y aquellos.
Los genes de la VH y VL de los AcMs B7 y 34B7 se aislaron, amplificaron y
clonaron en el vector pMOSBlue para su secuenciación.
Las secuencias correspondientes a los genes VL (Vк) del B7 y el 34B7 (Fig. 2)
exhiben sustituciones nucleotídicas cuando son comparadas con los genes de línea
germinal de los cuales presumiblemente se originaron (Tabla 2).
Tabla 2: Origen potencial de los genes V de los AcMs B7 y 34B7, según comparaciones con genes de
línea germinal de la base de datos IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast /).
El gen VкB7 (del codón 1 al 95) deriva del gen de línea germinal 21-7 (Heinrich y
cols., 1984) con el que comparte un 98% de identidad. Los cambios con respecto a
dicho gen ocurren en los FRs y en los CDRs. En estos últimos solo existen
reemplazos, a diferencia de los FRs, donde no hay prevalencia de un tipo particular
de mutación (Fig. 2 y Tabla 3).
Por otra parte, el gen Vк34B7 proviene probablemente del gen de línea germinal 19-
13 (Hawley y cols., 1982; Hawley y cols., 1984) (Tabla 2). Las mutaciones que lo
originaron conducen a ocho cambios aminoacídicos que se distribuyen en FRs y
CDRs. En ambas regiones los reemplazos superan las mutaciones silentes, aunque en
Base de datos IgBlast (genes V de línea germinal)
Genes V Nombre del gen de
origen
Número de acceso en la base
de datos GenBank
% identidad
VHB7 J558.5 AF303836 96,2
VкB7 21-7 K02158 98
VH34B7 J558.7 AF3838 94
Vк34B7 19-13 J00569 95,4
Resultados
56
los FRs los cambios conservativos son mayoría. La relación R/S en estas zonas
supera el valor de 2,9 (FRs: 5 y CDRs: 2/0), que se asume como criterio para indicar
la selección positiva de cambios nucleotídicos que afectan la secuencia aminoacídica
(Shlomchik y cols., 1987).
Tabla 3: Distribución y clasificación de las mutaciones en las regiones VH y Vκ de los AcMs B7 y
34B7, al compararse con los potenciales genes de línea germinal de origen.
M: total de mutaciones; R: reemplazos; S: mutaciones silentes; C: cambios conservativos;
NC: cambios no conservativos
Las VHs B7 y 34B7 usan genes de la familia J558. El gen VHB7 muestra un 96,2%
de identidad con el gen de línea germinal J558.5 y se diferencia de este en siete
residuos aminoacídicos (Fig. 3). El análisis cuantitativo y cualitativo de las
mutaciones indica un patrón característico de anticuerpos hipermutados. Hay una
Gen Región M S R R/S
C NC
VHB7 FR FR1 2 1 0 1 4/3
FR2 1 0 1 0
FR3 4 2 1 1
CDR CDR1 0 0 0 0 3
CDR2 4 1 1 2
VκB7 FR FR1 1 1 0 0 1
FR2 0 0 0 0
FR3 1 0 0 1
CDR CDR1 1 0 1 0 2/0
CDR2 1 0 1 0
VH34B7 FR FR1 6 2 2 2 5
FR2 1 0 1 0
FR3 5 0 2 3
CDR CDR1 1 0 0 1 3
CDR2 3 1 1 1
Vκ34B7 FR FR1 3 0 2 1 5
FR2 0 0 0 0
FR3 3 1 2 0
CDR CDR1 1 0 1 0 2/0
CDR2 1 0 0 1
Resultados
57
prevalencia de reemplazos, sobre todo no conservativos, en los CDRs, con un R/S de
3. En las regiones FRs esta relación es inferior a dicho valor (Tabla 3).
Figura 2: Secuencias nucleotídica y aminoacídica deducida de las regiones Vκ de los AcMs B7 y
34B7, comparadas con las secuencias génicas de línea germinal más similares, según la base de datos
IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Los puntos representan identidad. Los CDRs están
señalados con líneas continuas y la numeración se hizo según Kabat, 1991 ...
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
VKB7 GAC ATT GTG CTG ACA CAG TCT CCT GCT TCC TTA GCT GTA TCT CTG GGG CAG AGG GCC ACC
21.7 ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
VKB7 D I V L T Q S P A S L A V S L G Q R A T
21.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
CDR1
21 22 23 24 25 26 27 27a 27b 27c 27d 28 29 30 31 32 33 34 35 36
VkB7 ATC TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TCT ACC TAT AGT TAT ATG CAC TGG TAC
21.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ...
VKB7 I S C R A S Q S V S T S T Y S Y M H W Y
21.7 . . . . . . . . . . . . S . . . . . . .
CDR2
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
VKB7 CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC AAG AAT GCA TCC AAC CTA GAA TCT
21.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ...
VKB7 Q Q K P G Q P P K L L I K N A S N L E S
21.7 . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . .
57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
VKB7 GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GAC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT
21.7 ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
VKB7 G V P A R F S D S G S G T D F T L N I H
21.7 . . . . . . . G . . . . . . . . . . . .
77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
VKB7 CCT GTG GAG GAG GAG GAT ACT GCA ACA TAT TAC TGT CAG CAC AGT TGG GAG GTT CCG
21.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ..T
VKB7 P V E E E D T A T Y Y C Q H S W E V P
21.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . I .
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
VK34B7 GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAA GAA TTC TTG TCC ACA TCA TTA GGA GAC AGG GTC AGC
19.13 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... A.. ... ... ... G.. ... ... ... ... ...
VK34B7 D I V M T Q S Q E F L S T S L G D R V S
19.13 . . . . . . . . K . M . . . V . . . . .
CDR1
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
VK34B7 ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT AGT GCT GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA
19.13 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ...
VK34B7 I T C K A S Q N V G S A V A W Y Q Q K P
19.13 . . . . . . . . . . T . . . . . . . . .
CDR2
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
VK34B7 GGA CAA TCT CCT AAA CTA CTG ATT TAC TCG GCA TCC AAT CGG TAC ATT GGA GTC CCT GAT
19.13 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ...
VK34B7 G Q S P K L L I Y S A S N R Y I G V P D
19.13 . . . . . . . . . . . . . . . T . . . .
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
VK34B7 CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACC ATC ACC AAT ATG CAG TCT
19.13 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ...
VK34B7 R F T G S G S G T E F T L T I T N M Q S
19.13 . . . . . . . . . D . . . . . S . . . .
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94
VK34B7 GAA GAC CTG GCA GAC TAT TTC TGC CAG CAA TAT AGC AGC T-- -CG
19.13 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... .AT C.T
VK34B7 E D L A D Y F C Q Q Y S S S
19.13 . . . . . . . . . . . . . Y
Resultados
58
Figura 3: Secuencias nucleotídica y aminoacídica deducida de las regiones VH de los AcMs B7 y
34B7, comparadas con las secuencias génicas de línea germinal más similares, según la base de datos
IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Los puntos representan identidad. Los CDRs están
señalados con líneas continuas y la numeración se hizo según Kabat, 1991.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
VHB7 GAG GTC CAG CTG CAA CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG ACT TCA GTC AAG ATA
J558.5 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ..G ... ...
VHB7 E V Q L Q Q S G P E L V K P G T S V K I
J558.5 . . . . . . . . . . . . . . . A . . . .
CDR1
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
VHB7 TCC TGC AAG ACT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAA TAC ACC ATG CAC TGG ATG AAG CAG AGC
J558.5 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ...
VHB7 S C K T S G Y T F T E Y T M H W M K Q S
J558.5 . . . . . . . . . . . . . . . . V . . .
CDR2
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 52a 53 54 55 56 57 58 59
VHB7 CAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GGT GTT AGT CCT AAC AAT GGT GGT GCT AGT TAC
J558.5 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. .A. ... ... ... ... ... A.. ..C ...
VHB7 H G K S L E W I G G V S P N N G G A S Y
J558.5 . . . . . . . . . . I N . . . . . T . .
60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79
VHB7 AAC CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAG TCC TCC AAC ACA GCC TAC
J558.5 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ...
VHB7 N Q K F K G K A T L T V D K S S N T A Y
J558.5 . . . . . . . . . . . . . . . . S . . .
80 81 82 82a 82b 82c 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94
VHB7 ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAC GAT TCT GCC GTC TAT TAC TGT GCA AGG
J558.5 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ..A ... ... ... ... ... ..A
VHB7 M E L R S L T S D D S A V Y Y C A R
J558.5 . . . . . . . . E . . . . . . . . .
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
VH34B7 GAG GTC CAG CTA CAA CAG TCT GGA CCT GAA CTG GTG AAG CGT GGG GCT TCA GTG AAG ATG
J558.7 ... ... ... ..G ... ... .T. ... ... ..G ... C.. .G. .C. ... ... ... ... ... ...
VHB34B7 E V Q L Q Q S G P E L V K R G A S V K M
J558.7 . . . . . . F . . . . L R P . . . . . .
CDR1
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
VH34B7 TCC TGT AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAC TAC TCC ATG GAC TGG GTG AGG CAG AGC
J558.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... .A. ... ...
VH34B7 S C K A S G Y T F T D Y S M D W V R Q S
J558.7 . . . . . . . . . . . . Y . . . . K . .
CDR2
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 52a 53 54 55 56 57 58 59
VH34B7 CAT GGA GAA AGC TTT GAG TGG ATT GGA CGT GTT AAT CCT TTC AAT GGT GTT ACT AGT TAC
J558.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... .G. ... ..C ...
VH34B7 H G E S F E W I G R V N P F N G V T S Y
J558.7 . . . . . . . . . . . . . Y . . G . . .
60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79
VH34B7 AAC CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC CAG TCC TCC AGC ACA GCC TTC
J558.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... A.. ... ... ... ... ... .A.
VH34B7 N Q K F K G K A T L T V D Q S S S T A F
J558.7 . . . . . . . . . . . A . K . . . . . Y
80 81 82 82a 82b 82c 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94
VH34B7 ATG GAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAT GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT ACA AGA
J558.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... G.. ..
VH34B7 M E L N S L T S D D S A V Y Y C T R
J558.7 . . . . . . . . E . . . . . . . A .
Resultados
59
Similar comportamiento tiene el gen VH34B7, que muestra un 94,5% de identidad
con su posible gen de origen, el J558.7 (Haines y cols., 2001). Difiere de este en 13
residuos (Fig. 3), y tanto en FRs como en CDRs exhibe un R/S superior a 2,9.
Mientras en los FRs predominan los cambios conservativos y silentes, en los CDRs
son mayoría las sustituciones no conservativas (Tabla 3).
Resalta el hecho de que el número de mutaciones en la VH de ambos anticuerpos es
mayor al de ambas VL, lo que se ha descrito en la literatura (Chen y cols., 1992;
David y Zouali, 1995), aunque no sea la generalidad (Milstein, 1993). En su conjunto,
estos resultados apuntan a que ambos anticuerpos son hipermutados.
4.1.2 Análisis del CDR3 y el FR4
Parte del CDR3 y el FR4 de las cadenas ligeras del B7 y el 34B7 usan los segmentos
génicos Jк2 y Jк5, respectivamente (Fig. 4). Las mutaciones en el FR4 de VкB7 no
dan lugar a reemplazos. Por su parte, el cambio en el CDR3 de Vк34B7 origina una
sustitución, a diferencia del ocurrido en FR4, donde la mutación no significó una
variación en la secuencia aminoacídica.
La secuencia nucleotídica codificante de las posiciones 95 a 113 de la región VHB7
revela que el CDR H3 y FR 4 se originaron del rearreglo de los segmentos DSP2.3,
DSP2.4 o DSP2.6 con el segmento génico JH3, y la adición de nucleótidos N.
En el caso del AcM 34B7, para esta zona se usan los segmentos génicos DFL16.1 y
JH2, al igual que los nucleótidos N. Dos de los cambios nucleotídicos en el CDR3 del
gen VHB7 y uno en el CDR3 del VH34B7 condujeron a reemplazos, mientras uno
adicional, en FR4 del VH34B7, fue silente. En conjunto, estas evidencias refuerzan la
ocurrencia de mutaciones somáticas en la generación de estos anticuerpos.
Con un origen genético diferente¸ los CDRs H3 de ambos anticuerpos no muestran
una regularidad en la naturaleza química de los residuos que los componen.
Resultados
60
Figura 4: Posible origen de los CDRs 3 y FRs 4 de las cadenas ligera y pesada de los AcMs B7 y
34B7. Los nucleótidos N se representan con asteriscos (*). Las líneas discontinuas indican homología
con los genes J y D correspondientes. Las secuencias de línea germinal J y D provienen de la base de
datos de Kabat, 1991.
4.1.3 Agrupamiento de genes de la VH J558
Los genes de la familia J558 se agruparon de acuerdo a la similaridad de sus
secuencias. Como evidencia el dendrograma evolutivo (Fig. 5), existe un subgrupo
formado por genes VH expresados por los AcMs B7 y 34B7 y sus potenciales genes
de línea germinal de origen. En este grupo también se encuentran los genes VH108A
(Givol y cols., 1981), J558.6 (Haines y cols., 2001), J558.34.124, J558.16.106,
J558.26.116, J558.22.112, J558.18.108, J558.36.126 (Johnston y cols., 2006),
45.21.2, J558.5A, J558.3A y VH108B (Chang y Mohan, 2005). El análisis de
anticuerpos cuyas secuencias génicas de VH son altamente similares a estos genes
(hasta un 94%) no mostró prevalencia de inmunoglobulinas conectadas
idiotípicamente, lo cual no permite asociar la polirreactividad idiotípica a un
subconjunto particular de la familia VH J558 (Tabla 4).
VKB7
CDR388 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 106a 107
C Q H S W E V P Y T F G G G T K L E I K R
TGT CAG CAC AGT TGG GAG GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- --T
JK2
VK34B7
CDR3
88 89 90 91 92 93 94 96 97 98 99 100 101 102
C Q Q Y S S S V T F G A G T
TGC CAG CAA TAT AGC AGC TCG GTC ACG TTC GGT GCT GGG ACA
C-------------------------C
L JK5VHB7
CDR3
94 95 96 97 98 99 100 100a 100b100c101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111R R G A E A T T W L A Y W G Q G T L V T V
AGG AGA GGG GCA GAG GCT ACG ACC TGG CTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC N** *** *** ** -- --- T-- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
- -T- --- -- JH3
V F DSP2.3,2.4,2.6
VH34B7
CDR3
94 95 96 97 98 99 100 100a 100b 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116
R E N H Y G S L F D Y W G Q G T T L T V S S A S P
AGA GAG AAT CAC TAC GGT AGC CTC TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCT AGC CCC
N** * N **- --- --- --- --- --- --A --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
JH2
-- T-- --- --- --
Y
DFL16.1
Resultados
61
Figura 5: Dendrograma evolutivo que muestra el análisis de las secuencias VH de genes de línea
germinal de la familia J558 (156 secuencias). El árbol evolutivo se obtuvo con el programa
CLUSTALW7 y se visualizó con el Tree View (V1.6.6). El subgrupo en el cual se incluyen los genes
VHB7 y 34B7 se encierra en un cuadrado de líneas discontinuas.
Tabla 4: Frecuencia de anticuerpos anti-idiotipo codificados por genes del subgrupo de la familia VH
J558 o sus derivados más similares (mayor de un 94% de identidad de sus secuencias nucleotídicas).
Gen Número de secuencias (>94% homología) Anticuerpos anti-idiotipos VH 108A 32 0
J558.34.124 30 0
J558.16.106 31 0
J558.34.124 31 2
J558.6 36 0
J558.26.116 42 3
45.21.2 46 4
J558.22.112 33 1
J558.5A 39 0
J558.18.108 31 0
J558.3A 44 0
J558.36.126 38 0
VH 108B 37 0
Resultados
62
4.2 Diseño de variantes mutadas de la VHB7
Datos publicados por Macías y colaboradores mostraron que los AcM B7 y 34B7 son
altamente multiespecíficos (Macías y cols., 1999). A diferencia de sus genes VH, que
derivan de genes de línea germinal pertenecientes a la familia J558, los que les dan
origen a sus respectivas VL comparten un bajo porcentaje de identidad (65%).
Teniendo en cuenta lo anterior, y el papel determinante de las cadenas pesadas en la
especificidad de algunos anticuerpos anti-idiotipo generados por nuestro grupo
(López-Requena y cols., 2007b), se decidió evaluar la contribución de la región VH a
la reactividad de inmunoglobulinas de este tipo. Para realizar este estudio se escogió
el AcM B7.
Con el propósito de hacer un mapeo preliminar del sitio de unión de dicho anticuerpo
se diseñaron mutaciones para investigar, en particular, la posible participación de los
CDRs H1 y H2. Se propuso una sola mutación en el CDR H1, para la cual se
seleccionó la posición H33, que ocupa una posición central en el sitio de unión del
anticuerpo. Se sustituyó el residuo de Thr por otro de Tyr, ya que es un cambio no
conservativo, e introduce una alteración significativa en la topografía local del sitio
de unión. Además, la Tyr es frecuente en esa posición. Este cambio caracterizaría a la
variante mutada B7Y33.
En el caso del CDR H2, se decidió introducir cambios en las posiciones 56-58, que
identificarían la muteína B7STK. Este segmento está comprendido en la región 50-
73, la cual se considera la responsable de las interacciones homofílicas en anticuerpos
de diferentes especificidades de la familia VHS107 (Kaminski y cols., 1999). En este
caso, se sustituyeron los residuos escogidos por otros que cumplían los siguientes
requerimientos:
-diferente naturaleza química (cambio no conservativo),
-alta frecuencia de aparición en la base de datos de Kabat para las posiciones
seleccionadas, para asegurar la viabilidad estructural de la construcción.
De esta manera, para la zona 56-58 de la VHB7 se propusieron los siguientes
cambios: Gly 56 por Ser; Ala 57 por Thr y Ser 58 por Lys.
Resultados
63
Los cambios sugeridos para obtener las dos variantes mutadas se resumen en la tabla
5.
Tabla 5: Mutaciones propuestas en la VH del AcM B7.
Variantes Posiciones
H33 H56 H57 H58
VHB7 Thr Gly Ala Ser
VHB7Y33 Tyr - - -
VHB7STK - Ser Thr Lys
Las regiones variables del AcM B7 salvaje y sus variantes mutadas se expresaron
como AcQs recombinantes, para disponer así de moléculas más eficaces para su uso
potencial en humanos, y acometer un estudio más profundo de caracterización a nivel
molecular de la reactividad de este anticuerpo.
4.3 Obtención de los AcQs B7 y las variantes mutadas B7Y33 y B7STK
Los segmentos génicos de las VH y VL del AcM B7 aislados, se digirieron y
clonaron en los vectores de expresión que contienen las regiones constantes humanas
correspondientes. Se procedió de manera similar con los genes mutados VHB7Y33 y
VHB7STK.
Se obtuvieron transfectomas estables de células NS0 que producen 0,5 g/ml del
AcQ B7 y 12 g/ml de los AcQs B7Y33 y B7STK, en cultivo estacionario.
El estudio de la especificidad antigénica se demostró por ELISA. El B7Y33, al igual
que el AcQ B7, interactúa con los AcMs E1 y P3. Este resultado constituye una
primera evidencia del carácter polirreactivo del B7Y33. Sin embargo, el B7STK
pierde dicho reconocimiento (Fig. 6), lo que apunta a una participación del CDR H2
en esas interacciones.
Resultados
64
Figura 6: Reactividad del AcQ B7 y sus variantes mutadas. Las placas de ELISA se recubrieron con
10 g/ml de los AcMs E1 y P3 y se incubaron con los sobrenadantes de los transfectomas a 2 g/ml de
AcQs. La reactividad se detectó con un antisuero anti-cadena γ humana conjugado a fosfatasa alcalina.
El AcQ C5 se usó como anticuerpo irrelevante.
Otra evidencia de la conectividad idiotípica del B7Y33 es su interacción con los
fragmentos F(ab’)2 de dos proteínas de mieloma IgG humano (Fig. 7). Este
anticuerpo manifiesta, además, la propiedad de multiespecificidad descrita para el
AcM B7 (Macías y cols., 1999), al reconocer disímiles antígenos, sobre todo, el
toxoide tetánico y la proteína P64K de Neisseria meningitidis (Fig. 7).
Figura 7: Multiespecificidad del AcQ B7Y33. Placas recubiertas con 10 µg/ml de toxoide tetánico
(TT), P64K, factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGFhr), insulina bovina (Ins.
bov.), insulina humana (Ins. hum.), transferrina (Transf.) y albúmina humana (Alb. h.) (izquierda), o
los F(ab’)2 de las proteínas de mieloma PM2 y PM5 (derecha), se incubaron con 10 µg/ml de B7Y33.
La reactividad se detectó con un antisuero anti-cadena γ humana conjugado a fosfatasa alcalina. El
AcQ C5 se usó como anticuerpo irrelevante.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5D
O 4
05
nm
AcM E1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
DO
40
5 n
m
AcM P3
AcQ B7 B7Y33 B7STK AcQ C5 AcQ B7 B7Y33 B7STK AcQ C5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
OD
40
5n
m
B7Y33
C5Q
TT P64K rhEGF B.Ins. H. Ins. Transf. H. Alb.
DO
40
5 n
m
TT P64K EGFhr Ins.b. Ins.h. Transf. Alb.h.
B7Y33
AcQ C5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
PM2 PM5
DO
405
nm
Resultados
65
Considerando que el AcQ B7Y33 retiene las propiedades inmunoquímicas descritas
para el AcM B7, y se expresa eficientemente, se decidió continuar el estudio con
dicha variante mutada, en lugar del AcQ B7, cuyo transfectoma resultó altamente
inestable, de manera similar a como se comporta el hibridoma productor del AcM B7
murino (Macías A., comunicación personal).
4.4 Influencia de las cadenas pesada y ligera del B7Y33 en su polirreactividad
idiotípica
4.4.1 Reactividad de los AcQs híbridos
Con el objetivo de profundizar en el estudio de las características de la región
variable que explican la conectividad del B7Y33, se construyeron moléculas híbridas
quiméricas que combinan su cadena pesada con cadenas ligeras no relacionadas. En
este caso se usaron las del AcM P3 y de su anti-idiotipo 1E10. Se obtuvieron
transfectomas estables que expresan los AcQs híbridos VHB7Y33/V 1E10 y
VHB7Y33/V P3, con productividades de 10 g/ml en cultivo estacionario.
Figura 8: Reactividad del B7Y33 y los híbridos VHB7Y33/VкP3 y VHB7Y33/Vк1E10 con
anticuerpos anti-gangliósidos. Las placas de ELISA se recubrieron con 10 µg/ml de los AcMs E1, P3 y
F6. Los AcQs B7Y33 y sus híbridos se usaron a 10 µg/ml. La unión se detectó con un antisuero anti-
cadena γ humana conjugado a fosfatasa alcalina. El AcQ C5 se empleó como control de isotipo. Se
muestra un ELISA representativo. La reactividad de los AcQs frente a cada IgM se midió en
experimentos independientes, aunque se incluyan en un mismo gráfico.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
DO
40
5n
m
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
DO
40
5n
m
E1 P3 F6 E1 P3 F6
B7Y33 vs VHB7Y33/VкP3 B7Y33 vs VHB7Y33/Vк1E10
B7Y33 Híbridos AcQ C5
Resultados
66
La comparación de las reactividades de los AcQs frente a los anticuerpos
antigangliósidos E1, P3, y F6 (IgM, κ; específico por el NeuAcGM1), se hizo a partir
de una compilación de las réplicas provenientes de al menos tres repeticiones de cada
experimento. La no existencia de una distribución normal de los datos (prueba
Kolmogorov-Smirnov) u homogeneidad de varianza (prueba de Bartlett, P<0,05)
precisaron el uso del método no paramétrico Kruskal-Wallis y la post-prueba de
Dunn para la comparación de las reactividades. En resumen, los híbridos
VHB7Y33/V P3 y VHB7Y33/V 1E10 mostraron mayor reactividad (prueba de
Dunn, P<0,05) que el B7Y33 frente a los AcMs E1 y F6, mientras exhibieron un
reconocimiento del AcM P3 que no difiere significativamente del B7Y33 (prueba de
Dunn, P>0,05). En la figura 8 se exhibe un ensayo representativo del total de
determinaciones realizadas. La reactividad de los AcQs frente a cada IgM se midió en
experimentos independientes, aunque se incluyan en un mismo gráfico.
4.4.2 Participación de los CDRs H del B7Y33 en su polirreactividad idiotípica
4.4.2.1Diseño de mutaciones en la VHB7Y33 basado en análisis bioinformático
En la figura 9 se muestra el modelo del Fv del AcQ B7Y33. Se identificaron
diferentes regiones del dominio VH que comprenden los tres CDRs y el llamado
CDR H4, del FR3, y que están expuestas al solvente, lo que las convierte en
potenciales zonas de interacción del AcQ B7Y33 con otras moléculas.
Figura 9: Modelo del Fv del B7Y33. La cinta azul representa el dominio variable de la cadena pesada,
mientras la gris clara, el de la cadena ligera. Con esferas del mismo color se destacan los residuos
cambiados en una misma variante mutada. En el interior de cada esfera se indica la posición
correspondiente del residuo.
2831 53 54
57
73
75
9899
100
Resultados
67
Teniendo en cuenta lo anterior, se diseñaron diferentes variantes mutadas (Tabla 6),
siguiendo como estrategia realizar sustituciones radicales en las cadenas laterales de
los residuos aminoacídicos escogidos, sin afectar la estructura de los lazos
hipervariables. Para ello, se cambiaron residuos por otros que aparecieran en dichas
posiciones en las secuencias génicas VH más similares a la VHB7, correspondientes a
anticuerpos con estructuras resueltas (recopilados en la base de datos PDB (Protein
Data Bank, de acceso en Internet: http://www.ww.pdb.org). La selección de los
residuos a modificar excluyó aquellos que interactúan con otros residuos vecinos.
Tabla 6: Mutaciones propuestas en la VHB7Y33 a partir del análisis bioinformático.
4.4.2.2 Reactividad del B7Y33 y sus variantes mutadas frente a las IgMs anti-
gangliósidos
A partir del diseño descrito en el acápite anterior, se construyeron y expresaron las
variantes mutadas de la VHB7Y33 con sustituciones en cada uno de los tres CDRs de
la cadena pesada, así como en la zona conocida como CDR H4, localizada en el FR
H3. Estas mutantes se denominaron H1, H2, H3 y H4, respectivamente (Tabla 6). Se
obtuvieron transfectomas que expresan establemente 1 g/mL de dichos AcQs.
La comparación de las reactividades de los AcQs frente a cada IgM se hizo a partir de
una recopilación de las réplicas provenientes de al menos tres repeticiones de cada
experimento y se procedió de manera similar al estudio de la reactividad de las
moléculas hibridas. Por la inexistencia de distribución normal de los datos (prueba
Kolmogorov-Smirnov) u homogeneidad de varianza (prueba de Bartlett, P<0,05) se
aplicó la prueba no paramétrica Kruskal Wallis y la post-prueba de Dunn, para la
comparación entre los grupos. Las variantes mutadas H1 y H2 aumentaron
significativamente el reconocimiento por el B7Y33 de los AcMs E1 y F6 (prueba de
Posiciones
Variantes 28 31 53 54 57 73 75 98 99 100
B7Y33 Thr Glu Asn Asn Ala Lys Ser Glu Ala Thr
H1 Arg Arg
H2 Tyr Tyr Thr
H3 Lys Ser Gln
H4 Thr Gln
Resultados
68
Dunn, P<0,05), mientras no tuvieron impacto en la reactividad contra el AcM P3
(prueba de Dunn, P>0,05). Adicionalmente, las mutaciones de H3 afectaron
fuertemente la reactividad contra este anticuerpo (prueba de Dunn, P<0,05), a
diferencia de los AcMs E1 y F6, frente a los cuales no se modificó su reconocimiento
(prueba de Dunn, P>0,5). Las mutaciones en CDR H4 no variaron la interacción del
B7Y33 con ninguna de las IgMs probadas (prueba de Dunn, P>0,05). En la figura 10
se exhibe un ensayo representativo de los experimentos realizados.
Figura 10: Reactividad del B7Y33 y sus variantes mutadas H1 (CDR H1), H2 (CDR H2), H3 (CDR
H3), H4 (FR H3) con anticuerpos anti-gangliósidos. Las placas de ELISA se recubrieron con 10 µg/ml
de los AcMs E1, P3 y F6. Los AcQs B7Y33 y las variantes mutadas se usaron a 10 µg/ml. La unión se
detectó con un antisuero anti-cadena γ humana conjugado a fosfatasa alcalina. El AcQ C5 se empleó
como control de isotipo. Se muestra un ELISA representativo. La reactividad de los AcQs frente a
cada IgM se midió en ensayos independientes, aunque se incluyan en un mismo gráfico.
4.4.2.3 Propiedad de autounión del B7Y33 y sus variantes mutadas
Una propiedad inusual del AcM B7 es su capacidad de autounión (Macías A.,
comunicación personal). Al igual que otras propiedades inmunológicas de este
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
DD
40
5n
m
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
DO
40
5n
m
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
DO
405
nm
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
DO
40
5n
m
B7Y33 vs H1 B7Y33 vs H2
B7Y33 vs H3B7Y33 vs H4
E1 P3 F6E1 P3 F6
E1 P3 F6 E1 P3 F6
B7Y33 Variantes mutadas AcQ C5
Resultados
69
anticuerpo, el B7Y33 mostró la capacidad de reconocimiento homofílico. El resto de
las variantes mutadas evaluadas mantuvieron el reconocimiento a sí mismas (Fig. 11).
Figura 11: Ensayo de autounión del AcQ B7Y33 y sus mutantes. Placas de ELISA se recubrieron con
10 µg/ml de B7Y33 (A), H1 (CDR H1) (B), H2 (CDR H2) (C), H3 (CDR H3) (D) y H4 (FR H3) (E).
Diferentes concentraciones de anticuerpos biotinilados se añadieron a placas recubiertas con las
mismas moléculas no biotiniladas. La reactividad se midió con estreptavidina conjugada a fosfatasa
alcalina. El Rituximab se usó como control de isotipo (F).
4.5 Reactividad del B7Y33 frente a variantes mutadas del AcQ P3
Para estudiar las zonas de la VHP3 que son potencialmente reconocidas por el
B7Y33, se evaluó la reactividad de este anticuerpo frente al AcQ P3 y dos variantes
mutadas que pierden la capacidad de unión al gangliósido (P3S31, CDR H1 y
P3S98;100a, CDR H3) (López-Requena y cols., 2007c). La reactividad del B7Y33
frente a estas variantes mutadas no se afectó en ninguno de los casos (prueba de
Dunn, P>0,05) (Fig. 12). El AcQ 14F7 biotinilado se usó como control negativo y las
densidades ópticas no superaron el valor de 0.2.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
405 n
m
concentración (µg/ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
405 n
m
concentración (µg/ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
405 n
m
concentración (µg/ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
405 n
m
concentración (µg/ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
405 n
m
concentración(µg/ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
405 n
m
concentración (µg/ml)
A B C
FED
Resultados
70
4.6 Efecto inmunopotenciador del B7Y33
4.6.1 Respuesta de anticuerpos en ratones BALB/c inoculados con IgMs anti-
gangliósidos y B7Y33
El AcM P3, a diferencia de otros AcMs anti-gangliósidos de isotipo IgM generados
en el CIM, ha resultado inmunogénico en el modelo singénico (Vázquez y cols.,
1998). Para determinar si el B7Y33 puede modificar la inmunogenicidad de estos
anticuerpos autólogos, se determinaron en los sueros de ratones BALB/c las
respuestas de anticuerpos inducidas por la administración subcutánea de una mezcla
de los AcMs P3, E1 y F6 con el AcQ B7Y33, sin adyuvante. Se asumió como
respuesta positiva aquel valor de absorbancia superior al doble del correspondiente al
suero preinmune. En la tabla 7 se indica la frecuencia de animales respondedores por
grupo después de la primera y segunda dosis.
Posterior a la primera dosis, los cinco ratones que recibieron el AcM P3 y el B7Y33
(solo dos en el grupo control) desarrollaron una respuesta de anticuerpos IgG contra
la IgM inyectada que, aunque satisface el criterio de positividad establecido, fue muy
baja (Anexo I).
DO
405
nm
a
aa
Figura 12: Reconocimiento de
variantes mutadas del AcQ P3 por
el AcQ B7Y33. Se recubrieron
placas de ELISA con 10 µg/ml de
AcQ P3 y sus mutantes P3S31
(CDR H1) y P3S98;100a (CDR
H3). Se añadió B7Y33 biotinilado
a 20 µg/ml y la reactividad se
midió con estreptavidina
conjugada a fosfatasa alcalina.
Letras diferentes indican
diferencias estadísticamente
significativas (prueba de Dunn,
P<0,05).
Resultados
71
Tabla 7: Resumen de la reactividad de los sueros (anticuerpos IgG) de los ratones BALB/ca frente a
las IgMs usadas en cada caso.
a
A los ratones BALB/c se les administró por vía subcutánea la mezcla de una IgM (E1, P3 o F6) y los
AcQs B7Y33 o C5. Los sueros se tomaron a los 7 días de cada dosis.
b Los resultados se presentan como número de ratones con reactividad (al menos el doble de la señal
del suero preinmune) frente a las diferentes IgMs usadas en cada caso, sobre el número total de ratones
inoculados.
Para la siguiente comparación de las reactividades de los sueros entre los grupos se
consideraron todos los valores de absorbancia de cada una de las réplicas, y se aplicó
la prueba estadística no paramétrica Kruskal-Wallis y la post-prueba de Dunn. Como
se aprecia en la figura 13, después de la segunda dosis, la respuesta de anticuerpos
IgG en el grupo que recibió P3/B7Y33 fue estadísticamente superior a la del que se
inoculó con P3/AcQ C5 (prueba de Dunn, P< 0,05), aunque no se evidenciaron
diferencias en el número de animales respondedores (Tabla 7).
Figura 13: Respuesta de anticuerpos IgG contra AcMs anti-gangliósidos. Sueros de ratones BALB/c
inoculados con los AcMs P3, E1 y F6 mezclados con los AcQs B7Y33 o C5 (tomados 7 días después
de la segunda dosis), se enfrentaron a placas recubiertas con 10 µg/ml de los anticuerpos murinos
usados en cada administración. La reactividad de los sueros, diluidos 1:50, se determinó con un
antisuero específico por el fragmento Fcγ de ratón, conjugado a fosfatasa alcalina. Se muestran los
valores de absorbancia de cada una de las réplicas de los ratones por grupo. PI: sueros preinmunes.
Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (Prueba de Dunn, P<0,05).
En el caso de las administraciones de los AcMs E1 y F6, la combinación con B7Y33
indujo después de la primera dosis, respuestas IgG de bajo nivel contra los
anticuerpos anti-gangliósidos usados en cada caso (Anexo I). En los grupos control
P3/B7Y33 P3/AcQ C5 E1/B7Y33 E1/AcQ C5 F6/B7Y33 F6/AcQ C5
Frecuencia de
respondedores b1ra dosis 5/5 2/5 3/5 0/5 3/5 0/5
2da dosis 5/5 5/5 5/5 0/5 4/5 2/5
AcM P3 AcM E1 AcM F6
ab
c
a
b b
a
b
b
Resultados
72
(E1/AcQ C5 o F6/AcQ C5) fue menor la frecuencia de respuestas positivas en dicha
extracción (Tabla 7). La segunda dosis, por su parte, generó anticuerpos IgG
específicos por el AcM E1 solo en aquellos ratones a los que se les administró la
mencionada IgM y, adicionalmente, el B7Y33 (Tabla 7 y Fig. 13). En cuanto a las
inoculaciones con el AcM F6, después de la segunda dosis, cuatro de cinco ratones
que lo recibieron mezclado con el B7Y33, desarrollaron respuesta IgG específica por
dicha IgM, mientras solo lo hicieron dos en el grupo control (Tabla 7). La reactividad
general del primer grupo fue significativamente superior a la del segundo (prueba de
Dunn, P<0,05) (Fig. 13).
Considerando el efecto del B7Y33 sobre la inmunogenicidad del AcM E1, anticuerpo
que dio origen al AcM B7, se decidió profundizar en el estudio de este fenómeno. En
los análisis sucesivos, para la comparación entre grupos se hizo un compendio de los
resultados de dos experimentos independientes, y se consideraron todos los valores de
absorbancia de cada una de las réplicas.
4.6.2 Importancia de la coinyección IgM/AcQ para la función
inmunopotenciadora del B7Y33
Con el objetivo de determinar la relevancia de la coadministración de los anticuerpos
E1 y B7Y33 en la generación de una respuesta IgG contra el primero, se evaluaron
sueros de ratones que recibieron la IgM y el AcQ mezclados, o por lugares diferentes
cada uno, siempre por vía subcutánea. Se muestran en la figura 14A los valores
absolutos de absorbancia, según el ELISA realizado, de todas las réplicas.
Resultados
73
Figura 14: Respuesta de anticuerpos IgG contra el AcM E1 coadministrado con el AcQ B7Y33.
Sueros de ratones inoculados con el AcM E1 y el B7Y33 (tomados 7 días después de la segunda
administración) se enfrentaron a placas de ELISA recubiertas con 10 µg/ml del anticuerpo murino. La
reactividad de los sueros, diluidos 1:50, se determinó con un antisuero específico por el fragmento Fcγ
de ratón conjugado a fosfatasa alcalina. (A) Se administraron dos dosis del AcM E1 y el B7Y33
mezclados, o por diferentes flancos cada uno (DF). (B) Se administraron dos dosis del AcM E1 y los
AcQs B7Y33 o el híbrido mezclados. (C) Se administraron dos dosis del AcM E1 y el B7Y33
mezclados. (D) Se administró una primera dosis del AcM E1 y B7Y33 mezclados, y una segunda de
E1 solamente (1x) o dos dosis de AcM E1 y B7Y33 mezclados (2x). (A), (B) y (D) se hicieron en
ratones BALB/c, (C) en BALBc/xid. El AcQ C5 se usó como control de isotipo. PI: sueros
preinmunes. Letras diferentes indican diferencias significativas (prueba de Dunn, P<0,05).
El análisis individual de cada muestra reveló que siete de diez animales inoculados
con una mezcla de ambos anticuerpos indujo respuesta IgG contra el E1, mientras el
grupo que recibió cada anticuerpo por lugares diferentes, solo tuvo tres respondedores
(Tabla 8). El grupo que recibió la mezcla desarrolló una respuesta significativamente
superior al que se inoculó con los dos anticuerpos en flancos diferentes (prueba de
Dunn, P<0,05) (Fig. 14A).
A
C
B
D
a
bc
b
cd cd
a
c
bd
cd
a
b b
a
b
c
Resultados
74
Tabla 8: Resumen de la reactividad de los sueros de los ratones BALB/c inoculados con el AcM E1 y
los AcQs B7Y33, VHB7Y33/VкP3 o C5.
a
Los resultados se presentan como número de ratones con reactividad (al menos el doble de la señal
del suero preinmune) frente al AcM E1 sobre el número total de ratones.
b A los ratones BALB/c o BALB/c-xid se les administró por vía subcutánea el AcM E1 y los AcQs, sin
adyuvante. Estos se inocularon juntos (coinyección) o separados (flancos diferentes). Los sueros se
tomaron a los 7 días de la segunda dosis.
c En todos los casos se aplicaron dos dosis de IgM/AcQ con excepción del grupo E1/B7Y33 1x, a los
que se les administró la mezcla de anticuerpos en una primera dosis, mientras en la segunda dosis solo
recibieron el AcM E1.
4.6.3 Importancia de la interacción IgM/AcQ para el efecto de
inmunopotenciación
Con el objetivo de valorar la suficiencia de la potencial formación del
inmunocomplejo E1/B7Y33 para la capacidad inmunopotenciadora evaluada, se
analizaron sueros de animales que recibieron la mezcla (vía subcutánea) del AcM E1
con la molécula híbrida VHB7Y33/VкP3, capaz también de unirse a este anticuerpo,
incluso más que el B7Y33 (Fig. 8). Como resultado, en el grupo que recibió el
híbrido mezclado con el AcM E1, solo dos ratones de diez produjeron anticuerpos
IgG específicos por el E1, a diferencia del grupo al que se le administró B7Y33,
donde los respondedores fueron mayoría (ocho de diez) (Tabla 8 y Fig. 14B). La
diferencia en la reactividad de estos dos grupos fue estadísticamente significativa
(prueba de Dunn, P<0,05).
4.6.4 Importancia de las células B-1 para el efecto de inmunopotenciación
Para estimar el papel de determinadas poblaciones en la orquestación de la respuesta
Forma de
administración bCepa Inmunógeno c
E1/B7Y33 E1/AcQ C5 E1/ VHB7Y33/VкP3 E1/B7Y33
1x
Frecuencia de
respondedores aCoinyección BALB/c 7/10 0/10 - -
Flancos diferentes 3/10 0/10 - -
Coinyección BALB/c 8/10 0/10 2/10 -
Coinyección BALB/c-xid 8/10 1/10 - -
Coinyección BALB/c 7/10 - - 2/10
Resultados
75
IgG específica por el AcM E1, se procedió de manera similar a la descrita
anteriormente, en ratones BALB/c xid, deficientes de células B-1. Tal como se
muestra en la figura 14C, la respuesta de anticuerpos IgG específicos por el AcM E1
generada tras la coadministración de esta IgM y el B7Y33 es significativamente
superior a la del grupo control (E1/AcQ C5) (prueba de Dunn, P<0,05), donde no
hubo ratones respondedores. Por lo tanto, se reprodujo el resultado obtenido en
ratones BALB/c normales.
4.6.5 Determinación de efecto “priming” en la capacidad inmunopotenciadora
del B7Y33
Con el objetivo de definir si el B7Y33 es capaz, con una sola dosis, de condicionar un
estado de activación que permita inducir una respuesta IgG específica por el AcM E1
tras inoculaciones posteriores, se evaluaron sueros de ratones que recibieron la
mezcla de los dos anticuerpos en cada dosis, y aquellos que solo la recibieron en la
primera dosis, mientras que en la segunda únicamente recibieron el AcM E1. Solo
dos de estos últimos animales fueron capaces de generar una respuesta IgG específica
por el AcM E1, en contraste con los del otro grupo (dos dosis con E1/B7Y33) que
respondieron mayoritariamente (Tabla 8).
4.7 Reconocimiento de linfocitos B
4.7.1 Reconocimiento del RCB por el B7Y33
Considerando las evidencias previas de la capacidad del B7Y33 de unirse a otros
anticuerpos, y su efecto inmunopotencidor, se determinó si puede reconocer
inmunoglobulinas no solo en forma soluble, sino además, como RCB. Para ello, se
evaluó primeramente su interacción con linfocitos B murinos y humanos por
citometría de flujo.
El B7Y33 reconoció un 74% de las células B de bazo, provenientes de un ratón
BALB/c no inmunizado. Esta interacción probó ser dependiente de la cantidad de
anticuerpo (Fig. 15A y B). Adicionalmente, este anticuerpo se unió a linfocitos B de
Resultados
76
sangre periférica de un donante humano sano (Fig. 15C). El AcQ C5 se empleó como
control de isotipo.
Figura 15: Unión del AcQ B7Y33 a los linfocitos B humanos y murinos. (A) y (B) Esplenocitos de
ratones BALB/c no inmunizados. (C) Células mononucleares periféricas de donante sano humano. Las
células se incubaron con 5 µg/ml de B7Y33 (A), diferentes concentraciones de B7Y33 (B), o 5 µg/ml
de B7Y33 biotinilado (C). La unión se midió con un antisuero anti-IgG humana conjugado a FITC (A
y B) o estreptavidina conjugada a PE (C). El AcQ C5 se usó como control de isotipo.
A continuación se examinó si el B7Y33 interactuaba directamente con el RCB a
través de un ensayo de inhibición. La preincubación de los esplenocitos de ratón
BALB/c con cantidades crecientes de un antisuero anti-IgM no afectó la unión del
B7Y33 a los linfocitos B (Fig. 16A).
Este resultado no es conclusivo, considerando la posibilidad de un bloqueo
incompleto por el antisuero de todos los sitios potenciales de unión sobre el RCB. Por
esa razón, se evaluó el reconocimiento del mieloma murino NS0, que no produce
inmunoglobulinas, por el B7Y33, y se demostró que reconoce también estas células
B7Y33 AcQ C5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25
Po
rce
nta
jed
e c
élu
las
B
mar
cad
as(%
)
concentración (μg/ml)
Anti-IgGh-FITC
B2
20
-PE
CD19-FITC
Estr
ep
tavi
din
a-P
E
B7Y33 AcQ C5
B7Y33 AcQ C5
14,9% 43,1%
2,5%39,5%
56,3% 3,7%
0,8%39,2%
0,2% 0,1%
8,4%91,3%2,7%89,6%
5,2%2,5%
Bazo de ratón
sangre periférica humana
A
C
B
Resultados
77
(Fig. 16B). Esto apunta a la existencia de otra molécula diana del B7Y33, sobre los
linfocitos B, diferente al RCB.
Figura 16: El AcQ B7Y33 reconoce un antígeno diferente del RCB en los linfocitos B. (A) Ensayo de
inhibición de la unión del B7Y33 a linfocitos B usando un antisuero específico por IgM de ratón.
Esplenocitos de ratón BALB/c se incubaron primero con diferentes concentraciones del antisuero
inhibidor, y después con 2,5 µg/ml de B7Y33 (concentración no saturante). La reactividad se midió
con estreptavidina conjugada a FITC. (B) Unión de B7Y33 al mieloma no secretor de
inmunoglobulinas NS0. Las células se incubaron con 10 µg/ml del anticuerpo. La unión se detectó con
un antisuero anti-IgG humana conjugado a FITC. El resultado es representativo de dos experimentos.
4.7.2 Reconocimiento del FcγRII por el B7Y33
Seguidamente, se exploró la posible interacción del B7Y33 con otra molécula
expresada en todos los linfocitos B, el FcγRIIb. Este se conserva en ratones y
humanos (Brooks y cols., 1989; Nimmerjahn y Ravetch, 2008), pertenece a una
familia de receptores involucrada en la interacción entre las inmunoglobulinas y las
células, y es el único miembro de la familia expresado en los linfocitos B (Amigorena
y cols., 1989; Nimmerjahn y Ravetch, 2008).
Como se observa en la figura 17, la preincubación de esplenocitos de ratones BALB/c
con el anticuerpo 2.4G2, específico por los receptores FcγRII/III, provocó una
reducción considerable de la unión del B7Y33 a los linfocitos B y a la línea celular
NS0 (FcγRIIb+; Gillet y Stevenson, 2007). Este efecto no se observó con un
Anti-IgGh-FITC
Estreptavidina-FITC
B2
20-
PE
100 µg/ml 25 µg/ml 6,25 µg/ml 1,56 µg/ml 0 µg/mlAnti-IgM
A
B
31,9% 20,5% 25,5% 20,5% 35,1% 19,6% 30,3% 22,4% 25,1% 28,0%
44,8% 2,8% 50,3% 3,8% 42,6% 2,7% 44,7% 2,6% 44,7% 2,2%
A
B
B7Y33
AcQ C5
Even
tos
Anti-IgGh-FITC
Resultados
78
anticuerpo específico por MHC-II (Fig. 17B) ni sobre la unión del AcQ 14F7,
específico por el gangliósido NeuGcGM3, a las células NS0 (Fig. 17C).
Figura 17: Ensayo de inhibición de la unión del AcQ B7Y33 a células B por un anticuerpo anti-
FcγRII. Esplenocitos de ratón BALB/c se preincubaron con diferentes concentraciones del anticuerpo
2.4G2 (específico por FcγRII/III) (A) o un anticuerpo anti-MHC-II (control negativo) (B). Células de
mieloma murino NS0 se preincubaron con 2.4G2 a 2 µg/ml (C). Posteriormente se añadió B7Y33
biotinilado a 2,5 μg/ml. La reactividad se midió con estreptavidina conjugada a PE. En (C) el AcQ
biotinilado anti-NeuGcGM3 14F7 se usó como control negativo. IMF: intensidad media de
fluorescencia.
Otra forma de estimar la importancia del FcγRII como blanco del B7Y33 fue la
evaluación de su interacción con células de ratón, de linaje no linfoide, que no
expresan el FcγRII, como el F3II y el melanoma MB16F0 (Fig. 18A). Para ninguna
de ellas se verificó la unión del anticuerpo (Fig. 18B).
NS0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5
Inhi
bici
ón d
e la
uni
ón d
e B
7Y33
(%
)
[]2.4G2 concentración (μg/ml)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120
Inh
ibic
ión
de
la u
nió
n d
e B
7Y
33
(%
)
anti-MHCII concentración (μg/ml)
A
C
B
[2.4G2] (µg/ml) [anti-MHCII] (µg/ml)
Resultados
79
Figura 18: Evaluación del reconocimiento de líneas celulares que no expresan el FcγRII por el
B7Y33. (A) Expresión del FcγRII en diferentes líneas celulares murinas. Las células (NS0, F3II y
MB16F0) se incubaron con 2 µg/ml de 2.4G2, y posteriormente con un anticuerpo anti-
inmunoglobulinas de rata biotinilado. La expresión se detectó con estreptavidina conjugada a FITC. Se
indica el porcentaje de células positivas en cada caso. (B) Reconocimiento de las células NS0, F3II y
MB16F0 por el AcQ B7Y33. Las células se incubaron con 10 µg/ml de B7Y33 y la unión se reveló
con un antisuero anti-IgG humana conjugado a FITC.
Con el mismo objetivo, se realizó otro experimento que demostró el reconocimiento
por el B7Y33 del linfoma B murino A20 (FcγRIIb+), no así de uno de sus mutantes
MB16F0
4.13%Control de conjugado
4.99%Control de conjugado
F3II
98.6%Control de conjugado
NS0
FcγRII
A
K562 (FcγRII+)
D
Raji (FcγRII+)
E
Daudi (FcγRII+)
F
NS0(FcγRII+)A C F3II(FcγRII-)
Chimeric antibody
MB16F0(FcγRII-)B
antiIgGhFITC
B7Y33 Fluorescencia de fondoAcQ C5
B
Resultados
80
naturales, el A20IIAI.6, que no expresa este receptor (Jones y cols., 1986a) (Fig.
19A). Adicionalmente, se comprobó la unión del B7Y33 a un transfectoma de esta
línea celular que expresa el FcγRIIb1 humano (Siberil y cols., 2006) (Fig. 19B).
Figura 19: El AcQ B7Y33 reconoce el FcγRIIb. (A) Células de linfoma B murino A20 (FcγRIIb+) y
A20IIA1.6 (FcγRIIb-), se incubaron con el AcQ B7Y33 (0,6 µg/ml). La unión se reveló con un
antisuero anti-IgG humano conjugado a FITC. El AcQ 1E10 se usó como control de isotipo. (B) Las
células A20IIA1.6 huIIB1 (FcγRIIb1 humano+) se incubaron con B7Y33 biotinilado a 10 µg/ml y se
detectó su unión con estreptavidina conjugada a PE. El Rituximab (Rx) se usó como control de isotipo.
Posteriormente, se extendió el estudio a células humanas, y se comprobó la unión del
B7Y33 a las líneas celulares Raji y Daudi, que expresan la isoforma B del FcγRII, y
la eritroleucemia K562, que expresa la isoforma A (Fig. 20A). En consonancia con la
evidencia anterior resulta la inhibición de la unión de un anticuerpo comercial anti-
FcγRII humano a las células K562 y Raji por el B7Y33 (Fig. 20B). El Rituximab se
empleó como control de isotipo.
A20 (FcγRIIb+)
A20IIA1.6 (FcγRIIb-)
A20IIA1.6huIIB1 (FcR γIIb1)
An
ti-I
gGh
-FIT
C
FSC
B7Y33 AcQ 1E1042,4% 0,0% 4,3% 0,0%
0,0%95,7%0,0%57,6%
0,4% 0,0%
0,0%99,6% 99,6%
0,4% 42,4%
0,0%
Rx B7Y33
A B
56,9%0,5%
Resultados
81
Figura 20: El AcQ B7Y33 reconoce diferentes isoformas del FcγRII humano. (A) Reconocimiento de
FcγRIIa y FcγRIIb. Las células se incubaron con el AcQ B7Y33 biotinilado (K562, FcγRIIa+) o no
conjugado (Raji y Daudi, FcγRIIb+). La unión se detectó con un antisuero anti-IgG humana conjugado
a FITC (Raji y Daudi) o estreptavidina conjugada a FITC (K562). (B) Inhibición de la unión del
anticuerpo comercial AT10-PE (específico por el FcγRII humano) a células B por el AcQ B7Y33.
Células K562 (panel izquierdo) y Raji (panel derecho) se preincubaron con 15 µg/ml (K562) o 5 µg/ml
(Raji) de B7Y33. Después se marcaron con el anticuerpo AT10-PE. El Rituximab se usó como control
de isotipo. IMF: intensidad media de fluorescencia.
4.7.3 Participación de las regiones variable y constante del B7Y33 en su
interacción con los linfocitos B
A través de dos aproximaciones diferentes se determinó la contribución de la región variable del
B7Y33 a su interacción con las células B. El estudio con las variantes mutadas de la región Fv
demostró que H1 y H2 se unen a linfocitos B de bazo y células NS0, mientras que en las variantes H3
y H4 sí se afecta drásticamente la interacción (Fig. 21).
K562 (FcγRII+)
D
Raji (FcγRII+)
E
Daudi (FcγRII+)
F
NS0(FcγRII+)A C F3II(FcγRII-)
Chimeric antibody
MB16F0(FcγRII-)B
K562Raji
C
c
Anticuerpo Quimérico
(FcγRIIa+) (FcγRIIb+)(FcγRIIb+)
AcQ
A
B
Raji DaudiK562
B7Y33 Fluorescencia de
fondo
AcQ C5
AcQ
Resultados
82
Figura 21: Reconocimiento de células B por las variantes mutadas del AcQ B7Y33. Esplenocitos de
ratón BALB/c (A) o células de mieloma murino NS0 (B) se incubaron con 20 µg/ml de B7Y33 y las
variantes mutadas H1 (CDR H1), H2 (CDR H2), H3 (CDR H3) y H4 (FR H3). Posteriormente, se
marcaron con un antisuero anti-IgG humana acoplado a FITC. El AcQ C5 se usó como control de
isotipo. Para las células NS0 se indica entre paréntesis el porcentaje de células marcadas con los AcQs.
El AcQ C5 se utilizó como control de isotipo.
Por otro lado, el análisis de la unión de las moléculas híbridas evidenció que la
variante VHB7Y33/VκE10 mantuvo el reconocimiento de los linfocitos B y las NS0,
aunque en menor medida que el B7Y33 (Fig. 22), a diferencia del VHB7Y33/VκP3,
que lo perdió completamente.
Para demostrar el papel del Fc del B7Y33 en el reconocimiento de células de linaje B,
se construyó y expresó una variante de la región constante con afectación en la unión
a los FcγRs. La variante seleccionada contiene un doble cambio de leucina por
alanina en las posiciones 234 y 235, conocido por abrogar la interacción con los
FcγRs (Sarmay y cols., 1992; Xu y cols., 2000; Hinojosa y cols., 2010). Se obtuvo un
transfectoma que expresa establemente 1 g/mL de dicho AcQ mutado, denominado
B7Y33LALA. El anticuerpo retuvo el reconocimiento del AcM E1 (Fig. 23A), así
como las propiedades de autounión (Fig. 23B), pero no mostró reconocimiento de
linfocitos B murinos (Fig. 24 A) ni de células de mieloma murino NS0 (Fig. 24 B).
B2
20-
PE
Anti-IgGh-FITC
H2 H3
B7Y33 H1 AcQ C5A i
H4
11,9% 40,3% 32,4% 20,5% 49,1% 1,7%
0,6%48,6%3,1%44,0%2,5%45,3%
5,3%52,5%31,6%20,6%
0,7%41,5%3,6%44,2%
5,5%45,4%
1,7%47,4%
B
Resultados
83
Figura 22: Reconocimiento de células B por los AcQs híbridos VHB7Y33/Vκs no relacionadas.
Esplenocitos de ratón BALB/c (A) y células de mieloma murino NS0 (B) se incubaron con 20 µg/ml
de B7Y33, VHB7Y33/VκP3, VHB7Y33/Vκ1E10. Los AcQs P3, 1E10 y C5 se emplearon como
controles de isotipo. La reactividad se determinó con un antisuero anti-IgG humana conjugado a FITC.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
40
5 n
m
concentración (µg/ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6
DO
405
nm
concentración (µg/ml)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
DO
405
nm
B7Y33
B7Y33 LALA
AcQ C5A
BB7Y33LALA
Rituximab
FSC
An
ti-I
gGh
-FIT
C
AcQ C5 B7Y33 VHB7Y33/VκE10 VHB7Y33/VκP3
Anti-IgGh-FITC
B2
20-
PE
AcQ 1E10 AcQ P3 VHB7Y33/VκP3VHB7Y33/VκE10B7Y33
A
B
10,7% 43,6% 29,7% 24,2% 47,7% 3,9% 47,2% 2,1% 48,3% 7,9%
43,2% 2,5% 44,0% 2,1% 47,1% 1,3% 49,5% 1,3% 42,3% 1,5%
63,0% 0,0% 40,2% 0,2% 0,8% 0,0% 0,2% 0,0%
37,0% 0,0% 59,8% 0,0% 99,2% 0,0% 99,8% 0,0%
Figura 23: Reactividad con el AcM E1 y autounión
de la variante mutada B7Y33LALA. (A) Las placas
de ELISA se recubrieron con 10 µg/ml del AcM
E1. Los AcQs B7Y33 y B7Y33LALA se usaron a
10 µg/ml. La unión se detectó con un antisuero
anti-cadena γ humana conjugado a fosfatasa
alcalina. El AcQ C5 se empleó como control de
isotipo. (B) Placas de ELISA se recubrieron con 10
µg/ml de B7Y33LALA. Diferentes concentraciones
de anticuerpos biotinilados se añadieron a placas
recubiertas con las mismas moléculas no
biotiniladas. La reactividad se midió con
estreptavidina conjugada a fosfatasa alcalina. El
Rituximab se usó como control de isotipo.
Resultados
84
: Figura 24: Reconocimiento de células B por la variante mutada B7Y33LALA. Esplenocitos de ratón
BALB/c (A) o células de mieloma murino NS0 (B) se incubaron con 20 µg/ml de B7Y33 y la variante
mutada B7Y33LALA (CH2). Posteriormente, se marcaron con un antisuero anti-IgG humana acoplado
a FITC. El AcQ C5 se usó como control de isotipo.
A continuación, se trabajó en la demostración de una de las posibles formas de
interacción del B7Y33 con las células B. Esta se basa en contactos directos de ambas
regiones, Fv y Fc, del B7Y33 con el FcγRIIb, y la estabilización de estas
interacciones por las uniones homofílicas y heterofílicas mostradas por este
anticuerpo y sus variantes mutadas H3 y H4 (Fig. 27-II). De dicho modelo de
interacción se podría esperar una “complementariedad molecular” de las variantes
mutadas H3/H4 y el B7Y33LALA, para la unión a estas células: la ausencia de
reconocimiento por las mutantes H3/H4 a través del idiotipo, y la interacción afectada
del B7Y33 a través del Fc, podrían ser compensadas por la interacción con el FcγRIIb
del idiotipo del B7Y33LALA y el Fc de H3/H4, respectivamente. Se demostró
previamente el reconocimiento de las variantes H3/H4 por B7Y33LALA (Fig.25).
Sin embargo, no se detectó la unión de ninguno de los anticuerpos a las células B
cuando se mezcló el AcQ B7Y33LALA y las variantes mutadas H3 o H4 (Fig. 26).
B7Y33LALA0,8%54,2%
0,0%45,0%
B7Y33 AcQ C511,9% 40,3% 49,1% 1,7%
0,6%48,6%2,5%45,3%
B2
20-
PE
Anti-IgGh-FITC
A
B B7Y33 B7Y33LALA AcQ C550,4%
49,6% 0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
0,0%
99,8%
0,2% 0,0%
100%
Ant
i-Ig
Gh
-FIT
C
FSC
Resultados
85
Figura 25: Ensayo de interacción entre el AcQ B7Y33LALA y las variantes mutadas H3 y H4. Placas
de ELISA se recubrieron con 10 µg/ml de las variantes mutadas H3 (CDR H3) y H4 (FR H3). Después
de una incubación con el anticuerpo B7Y33LALA biotinilado (2,5 µg/ml), se midió la reactividad con
estreptavidina conjugada a fosfatasa alcalina.
Figura 26: Las mutaciones del AcQ B7Y33 H3 (CDR H3) y H4 (FR H3) no se complementan con la
mutación Ala/Ala (CH2) para la unión a las células B. Las variantes mutadas H3 o H4 se mezclaron
con la B7Y33LALA a diferentes relaciones (1: 2,5 μg/mL; 10: 25 μg/mL). Las mezclas se añadieron a
esplenocitos de ratón BALB/c. La reactividad se midió con un antisuero anti-IgG humana conjugado a
FITC.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
DO
40
5n
m
H3 H4
B7Y33LALA
Control conjugadoC
élu
las
B m
arc
adas
(%)
B7Y33 + - - - - - -H3:B7Y33LALA
(10:1) - + - - - - -H3:B7Y33LALA
(1:10) - - + - - - -H4:B7Y33LALA
(10:1) - - - + - - -H4:B7Y33LALA
(1:10) - - - - + - -H3:B7Y33LALA
(1:1) - - - - - + -H4:B7Y33LALA
(1:1) - - - - - - +
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Resultados
86
4.7.4 Reconocimiento de linfocitos de pacientes con desórdenes proliferativos de
las células B por el B7Y33
A partir de muestras de médula ósea o sangre periférica, se evaluó el reconocimiento
de linfocitos de pacientes con desórdenes proliferativos de las células B. De seis
pacientes analizados, cinco padecían de leucemia linfocítica crónica B y sus linfocitos
fueron reconocidos por el B7Y33. Asimismo, el anticuerpo se unió a las células B de
un paciente con leucemia linfoblástica aguda de estirpe B (Tabla 9). A diferencia de
los pacientes con leucemia linfocítica crónica B, los linfocitos del paciente con
leucemia linfoblástica aguda no expresaban la molécula CD20, resultado que se
obtuvo al ensayar su reconocimiento por el Rituximab.
Tabla 9: Reconocimiento de células B de pacientes con desórdenes linfoproliferativos por el AcQ
B7Y33.
LLC-B: leucemia linfocítica crónica B; LLA: leucemia linfoblástica aguda B; CMP: células
mononucleares periféricas; MO: médula ósea; NR: no reconocimiento.
a Las células se incubaron con 2,5 μg/ml de B7Y33 o Rituximab biotinilados. La unión se reveló con
estreptavidina conjugada a PE, mediante la técnica de citometría de flujo. La población de linfocitos B
se identificó con un anticuerpo anti-CD19 conjugado a FITC y el Rituximab se utilizó como un control
positivo en el experimento. Los porcentajes de células CD19+B7Y33+ y CD20+B7Y33+ están
referidos al total de linfocitos B.
Paciente Diagnóstico Tipo de muestra CD19+B7Y33+ (%) a CD19CD20+ (%)a
1 LLC-B CMP 74.8 99
2 LLC-B CMP 97. 0 98.5
3 LLC-B CMP 87 99.1
4 LLC-B CMP 64.7 64.5
5 LLC-B CMP 56.9 98
6 LLA MO 52.3 NR
Discusión
87
5. DISCUSIÓN
5.1 La necesidad de un modelo recombinante para el estudio de las propiedades
inmunoquímicas del AcM anti-idiotipo B7
El estudio de las propiedades biológicas del AcM B7 requería de cantidades de
anticuerpo no disponibles, debido a la inestabilidad del hibridoma secretor (Macías
A., comunicación personal). Por lo tanto, se decidió construir una versión quimérica
de la molécula (regiones constantes humanas γ1, κ), teniendo en cuenta, además, que
esta sería muy útil para su posterior uso terapéutico, que se deduce de su
comportamiento similar a las IVIg, in vitro, descrito por Macías y cols. (1999).
Los intentos de obtener un transfectoma con niveles de productividad adecuados no
fueron efectivos. Esta dificultad no se presentó para la expresión de las variantes
mutadas de la cadena pesada, de las que se obtuvieron cepas secretoras estables con
niveles de expresión que clasifican dentro del rango promedio de este parámetro (1-
30 μg/ml), descrito para el sistema de expresión empleado (Yoo y cols., 2002). Una
de ellas es la variante mutada B7Y33, donde un residuo de Thr en la posición H33 se
sustituyó por Tyr. Su reconocimiento de otras IgMs, resultó similar al del AcQ B7,
así como la interacción con proteínas de mieloma humano y disímiles ligandos de
naturaleza no inmunoglobulínica, lo que confirma que esta variante mutada retiene la
polirreactividad idiotípica y la multiespecificidad demostradas por el AcQ B7. Por tal
motivo, se continuó el estudio de las bases moleculares de la reactividad de esta
variante como un modelo del AcM murino B7, considerando que mantenía sus
principales propiedades inmunoquímicas.
5.2 AcMs B7 y 34B7:¿anticuerpos naturales?
Los anticuerpos naturales, cuya existencia es independiente aparentemente de la
estimulación antigénica foránea, se caracterizan por el reconocimiento
multiespecífico de una variedad de autoantígenos. Constituyen una fracción
importante de las inmunoglobulinas del suero, de tal manera que llegan a representar
los anticuerpos autorreactivos hasta el 66% de las IgG séricas de un individuo
(Avrameas y Ternynck, 1993). Se sabe que estos son capaces de reconocerse entre sí,
lo que constituye la base de la red idiotípica que se observa, sobre todo, en el
Discusión
88
repertorio neonatal (Holmberg y cols., 1984b; Vakil y Kearney, 1986). Es conocido el
importante papel que desempeñan en la respuesta primaria a patógenos virales y
bacterianos (Ochsenbein y Zinkernagel, 2000) y su función protectiva contra
endotoxemia (Reid y cols., 1997).
Los AcMs B7 y 34B7 comparten algunas propiedades con los anticuerpos naturales,
como el reconocimiento de otras inmunoglobulinas y la multiespecificidad, dada por
la interacción con moléculas de diferente naturaleza (Macías y cols., 1999). Incluso,
la interacción preferencial del B7Y33 con antígenos de procedencia bacteriana como
el toxoide tetánico y la proteína P64K (procedente de Neisseria meningitidis), sugiere
una aplicación terapéutica potencial de este anticuerpo similar a la reseñada
anteriormente para los anticuerpos naturales. De estas semejanzas inmunoquímicas se
podría especular entonces que estos anticuerpos anti-idiotipo pertenecen al repertorio
natural de inmunoglobulinas.
Poco se conoce sobre la relación entre la estructura y función de los anticuerpos
naturales. No se han detectado diferencias fundamentales en la composición
aminoacídica que distinga a anticuerpos mono y polirreactivos. Algunos estudios han
sugerido que un CDR H3 más largo caracteriza a los anticuerpos naturales
polirreactivos, en comparación con los primeros (Co y cols., 1993; Martin y cols.,
1994), lo cual no ha sido demostrado consistentemente. Sin embargo, determinadas
restricciones genéticas sí tipifican los anticuerpos naturales. Una de ellas son sus
genes VH y VL, que aparecen generalmente en sus formas no mutadas o muy
próximas a la línea germinal (Carlsson y cols., 1991). Algunos autores alegan un uso
favorecido de genes pertenecientes a familias VH proximales a los segmentos D,
sobre todo las 7183 y Q52 (Holmberg, 1987), sin preferencia particular por
determinado grupo del repertorio VL. Otros han adoptado por consenso que los
anticuerpos polirreactivos pueden ser codificados por todas las familias VH (Striebich
y cols., 1990; Chen y cols., 1991). Sin embargo, pese a las coincidencias en su perfil
de reactividad, los AcMs B7 y 34B7 no satisfacen los mismos requerimientos
genéticos de los anticuerpos naturales, descritos por Holmberg, 1987. El análisis
inmunogenético de sus regiones variables evidenció que estos anticuerpos parecen ser
el resultado de un proceso de maduración de la afinidad conducida por el antígeno, y
Discusión
89
la mayoría de las mutaciones se concentran en los segmentos VH y VL.
Adicionalmente, no son codificados por genes de las familias VH 7183 o Q52, y sí por
la familia VH J558.
Los anticuerpos monorreactivos se caracterizan por la presencia de muchas
mutaciones somáticas, a diferencia de los anticuerpos naturales polirreactivos
(Notkins, 2004). La demostración del carácter mutado de dos anticuerpos
multiespecíficos como los AcMs B7 y 34B7 podría ser un ejemplo de cómo el
proceso de HMS puede crear o modificar un patrón de reconocimiento de esta
naturaleza. Sin embargo, al desconocer las características de la reactividad de los
anticuerpos de línea germinal que les dieron origen a estos anti-idiotipos, no es
posible aseverar que su multiespecificidad es una resultante directa del proceso de
HMS. Solo se puede destacar que la existencia de anticuerpos como estos, mutados y
polirreactivos, contrasta con el aumento de la rigidez del sitio de unión y una
restricción de la especificidad antigénica que suelen asumirse como consecuencias
del proceso de maduración de la afinidad y la acumulación gradual de mutaciones
somáticas (Manivel y cols., 2000; Jimenez y cols., 2003; Jimenez y cols., 2004). En la
literatura se describe un anticuerpo, el SPE7, que reconoce al DNP (2,4-dinitrofenil) y
varios derivados, y cuyo patrón de unión multiespecífica parece haber surgido en el
proceso de maduración de la afinidad. Considerando que su precursor potencial es
otro anticuerpo también multiespecífico, se plantea que, tratándose de una unión
promiscua, la maduración podría alterar más el patrón que el número de ligandos que
se unan potencialmente, debido a la modificación del paisaje estereoquímico del sitio
de unión (James y Tawfik, 2003a). En el caso de los AcMs B7 y 34B7, se
seleccionaron en la práctica como anti-idiotipos del AcM E1. Sin embargo, producto
de la HMS pudiera modificarse el reconocimiento por otro antígeno.
En el caso del AcM B7, durante el proceso de maduración de la afinidad, el cambio
de Tyr por Asn en la posición 50 de la región VL crea un sitio potencial de N-
glicosilación. La pérdida o ganancia de sitios de adición de carbohidratos puede
ocurrir durante la HMS (Dunn-Walters y cols., 2001). Este tipo de modificación post-
traduccional puede sin dudas influir en el patrón de reactividad. En algunos
anticuerpos poliespecíficos y anti-carbohidratos, la presencia de glucanos en la región
Discusión
90
variable mejora la afinidad de unión, mientras en otras posiciones puede disminuirla
(Leibiger y cols., 1999). Otros estudios que refuerzan la importancia de la
glicosilación de esta región en la reactividad, son los realizados por Fernández y cols.
(1997), quienes demuestran una dependencia mucho mayor del contenido de
carbohidratos en la región variable para la capacidad de unión en los anticuerpos
polirreactivos que en los monoespecíficos. De esta manera, se puede sugerir un aporte
de la glicosilación de la región variable del AcM B7 a su multiespecificidad, por
demostrar experimentalmente.
Del análisis filogenético de la familia VHJ558 (Fig.5) no se pudo demostrar que la
polirreactividad idiotípica exhibida por los AcMs B7 y 34B7, estuviese restringida a
un subgrupo particular de esta familia. O sea, los genes más similares a los segmentos
génicos VHB7 y VH34B7 no predisponen a una reactividad multiespecífica con otras
inmunoglobulinas. Aparentemente, las mutaciones somáticas que dan origen a los
AcMs B7 y 34B7 no solo pueden ser la causa de su mutiespecificidad, sino también,
de su elevada capacidad de reconocimiento de otras inmunoglobulinas con diferentes
especificidades. Los cambios en el proceso de maduración de la afinidad pueden
haber creado sitios potenciales de unión, al margen del proceso de selección que
ocurre en el órgano linfoide secundario debido al incremento de la afinidad por el
antígeno.
Resulta notable que el número total de mutaciones de reemplazo en los FRs es
superior al de los CDRs, en los genes VH de los AcMs B7 y 34B7, sobre todo en FR1
y FR3, hallazgo que se contrapone a la concentración de cambios en los CDRs
durante el proceso de maduración de la afinidad conducida por el antígeno (Wagner y
cols., 1995). Estos cambios pudieran crear sitios de interacción no clásicos, en los que
no se puede excluir la participación de residuos de los CDRs. Tales sitios podrían
constituir la superficie de contacto con regiones no paratópicas de otros anticuerpos,
explicando así el carácter α de estos anti-idiotipos. No obstante, la base estructural de
este fenómeno es aún poco comprendida, debido al reducido número de complejos
idiotipo/anti-idiotipo en que ha sido resuelta la estructura tridimensional por
difracción de rayos X, según los datos publicados en la base Protein Data Bank
(http://www.ww.pdb.org).
Discusión
91
5.3 La cadena pesada del AcM B7 en la interacción con otras inmunoglobulinas
Se conoce que la cadena pesada de los anticuerpos es determinante en su
especificidad. Incluso, se ha descrito la existencia de dominios VH que en ausencia
de regiones VL exhiben per se capacidad de unión (Noel y cols., 1996), o que
manifiestan dicha propiedad cuando se expresan como homodímeros ((Noel y cols.,
1996; Jin y cols., 2003; Sepulveda y cols., 2003). El estudio previo del papel de las
cadenas pesadas en la especificidad de algunos anticuerpos anti-gangliósidos y anti-
idiotipos, ha demostrado que estas regulan la unión a sus ligandos (Krengel y cols.,
2004; Rojas y cols., 2004; López-Requena y cols., 2007b).
Los resultados del presente trabajo son consistentes con tales hallazgos, donde la
reactividad con otros anticuerpos exhibida por las moléculas híbridas
(VHB7Y33/Vк1E10 o VкP3) indica, en primer lugar, que el dominio VH del B7Y33
es decisivo en su patrón de reactividad. De hecho, aporta dicha propiedad al
combinarse con la VL de anticuerpos de los que no se ha informado una interacción
múltiple con diferentes inmunoglobulinas, aun de especificidades muy relacionadas.
No obstante, no se puede descartar la influencia de la VLB7, si se considera el
incremento del reconocimiento de los AcMs E1 y F6, al comparar los anticuerpos
híbridos y el B7Y33. Aunque los residuos de la cadena pesada sean decisivos, la
combinación de ambas cadenas aporta un reajuste de la interacción.
La caracterización de la reactividad de las variantes mutadas H1, H2, H3 y H4 frente
a las IgMs anti-gangliósidos, reveló para las dos primeras, un patrón de
reconocimiento diferente a la del CDR H3. Los cambios en los CDRs H1 y H2
modificaron de manera similar el reconocimiento a los AcMs E1 y F6, sin ningún
impacto en la reactividad frente al AcM P3. Por el contrario, las mutaciones en el
CDR H3 influyeron en la reactividad con este anticuerpo, sin trascendencia alguna
para la interacción con las otras IgMs estudiadas. Estas observaciones sugieren la
existencia de más de un sitio de unión sobre la VHB7Y33 que explicaría su amplia
polirreactividad idiotípica. Existirían, al menos, dos sitios de unión: uno que
comprende los residuos mutados en los CDRs H1 y H2 (variantes H1 y H2), y otro
que contenga los modificados en el CDR H3 (variante H3); no se excluye la
posibilidad de más de dos sitios. La reducción dramática de la reactividad de la
Discusión
92
mutante B7STK frente a los AcMs E1 y P3, es otra evidencia que refuerza la
participación del CDR H2 en las interacciones del B7Y33 con otras
inmunoglobulinas. Aunque los cambios implícitos en la variante mutada H2 no
modificaron el reconocimiento del B7Y33 por el AcM P3, no se puede descartar la
participación de otros residuos del CDR H2 en la unión al AcM P3, como sugiere la
pérdida del reconocimiento de este anticuerpo por la variante B7STK, con cambios en
las posiciones 56-58, correspondientes al CDR H2. Son varios los ejemplos que
ilustran cómo el CDR H2 se involucra en sitios no clásicos de unión anticuerpo-
anticuerpo. Entre estos se incluyen los llamados autocuerpos, quienes se unen a sí
mismos, y cuyo sitio de homofilia comprende dicho CDR (Kaveri y cols., 1991;
Kaminski y cols., 1999). Se debe destacar el hecho de que la variante mutada B7Y33
conservó las propiedades de unión del anticuerpo original a pesar de la gran
diferencia en tamaño de la cadena lateral de la Tyr en comparación con la Thr, y de la
posición central que ocupa el residuo H33 en el CDR H1 y en el sitio de unión en
general. El hecho de que la mutación en esa posición no haya influido en el
reconocimiento de otros anticuerpos, no contradice la posible contribución del CDR
H1 a esta propiedad. De hecho, los experimentos de unión con las variantes mutadas
muestran que, al menos, una de las sustituciones aminoacídicas realizadas en el CDR
H1 y su vecindad (Glu 31 y Thr 28) afecta la reactividad del B7Y33. Aunque del lazo
H4 (región expuesta del FR H3) se ha sugerido su contribución a la interacción entre
regiones variables de inmunoglobulinas, a través de los llamados sitios no
convencionales de unión (Kohler y Paul, 1998), no parece en nuestro caso estar
involucrado en las propiedades de reconocimiento del anticuerpo recombinante
B7Y33.
Teniendo en cuenta que los segmentos génicos VH de los AcMs anti-gangliósidos E1
y F6 pertenecen a la misma familia Q52 (López-Requena y cols., 2007a) y son casi
idénticos (solo un cambio conservativo en FR1), el perfil de reactividad de las
variantes mutadas H1 y H2 podría indicar el reconocimiento por el B7Y33 de una
región que no incluye el CDR H3 de estas IgMs, y, además, la posible existencia de
un idiotopo compartido entre ambos anticuerpos, lo que contribuiría al fenómeno de
la polirreactividad idiotípica. Por otra parte, el reconocimiento de mutantes del AcQ
Discusión
93
P3 que han perdido la capacidad de unión a su antígeno (gangliósidos N-glicolilados)
y/o a sus anti-idiotipos (López-Requena y cols., 2007c) (Fig. 12), demuestra que el
B7Y33 no interactúa con el anticuerpo P3 a través de su sitio clásico de unión al
antígeno nominal (paratopo) o a sus anti-idiotipos.
El gen VHP3 también pertenece a la familia Q52, pero muestra algunas diferencias en
los CDRs H1 y H2 con respecto a los AcMs E1 y F6 (López-Requena y cols., 2007b).
En conjunto, estos resultados ratifican el carácter α del B7Y33, al reconocer regiones
no paratópicas en diferentes anticuerpos. El trabajo de Potter y cols. (1998)
caracteriza la zona reconocida por el anticuerpo anti-idiotipo D12, el cual se une
específicamente a un sitio localizado en la cara externa de la cadena pesada de
anticuerpos codificados por la familia VH3. Este incluye el FR H1, CDR H2 y FR H3,
tres subregiones requeridas igualmente para la unión de la proteína A de
Staphylococcus aureus, superantígeno B (Potter y cols., 1998). Tal hallazgo indica
que algunos anti-idiotipos interactúan con los anticuerpos de una manera similar a los
superantígenos, como pudiera ser el caso del B7Y33.
5.4 Efecto inmunopotenciador del B7Y33
El reconocimiento de diversas IgMs por el B7Y33 permite potencialmente la
formación de inmunocomplejos en una mezcla de ambos tipos de anticuerpos in vivo.
Se conoce que los inmunocomplejos son potentes activadores de las células
dendríticas y capaces de inducir respuestas inmunes más eficientemente que los
antígenos solos (Regnault y cols., 1999; Dhodapkar y cols., 2002). Esto resulta
fundamentalmente de la internalización dependiente de FcγRs en células
presentadoras, y el posterior procesamiento y presentación de antígenos (Nimmerjahn
y Ravetch, 2008). Nos propusimos, por tanto, evaluar si el AcQ B7Y33 tenía la
capacidad de modificar la inmunogenicidad de anticuerpos reconocidos por él,
cuando eran coadministrados en ausencia de adyuvantes.
Los experimentos realizados en ratones BALB/c evidenciaron que la coinoculación
por vía subcutánea de B7Y33 e IgMs propias no inmunogénicas, indujo la producción
de anticuerpos IgG específicos por estas. La pérdida de este tipo de respuesta contra
el AcM E1, al inocularlo separadamente del B7Y33 en el mismo modelo, refuerza la
Discusión
94
importancia potencial de los inmunocomplejos en el efecto inmunopotenciador de
este último. Contradictoriamente, el híbrido VHB7Y33/VкP3, capaz también de
unirse al AcM E1, no reprodujo este resultado cuando fue administrado junto al
anticuerpo anti-gangliósido en las mismas condiciones. Esta evidencia indica que la
formación de inmunocomplejos pudiera ser necesaria, pero no suficiente para la
ocurrencia de este fenómeno. Hay que resaltar que el híbrido VHB7Y33/VкP3 no es
capaz de reconocer los linfocitos B, lo que sugiere que estas células pudieran estar
involucradas en el fenómeno. El resultado obtenido con esta variante híbrida permite
descartar cualquier contribución de la región humana de los AcQs en el efecto
observado en ratones.
De la amplia polirreactividad idiotípica del B7Y33, demostrada con
inmunoglobulinas solubles, se podría inferir una interacción con el RCB expresado en
los linfocitos B. Congruente con esta hipótesis es el reconocimiento extensivo por el
B7Y33 de esta subpoblación linfocitaria en humanos y en ratones. Entonces, se
podría especular que el AcQ en cuestión, dirige el inmunocomplejo a una población
policlonal de células B, y los sucesivos eventos de señalización clásicos a través del
RCB conducirían a un reclutamiento y activación multiplicados de células T CD4+
auxiliadoras, que justificarían una respuesta inmune incrementada. Contrario a esta
suposición, los experimentos de inhibición con el antisuero policlonal anti-IgM, y la
demostración del reconocimiento de células de mieloma que no expresan
inmunoglobulina de superficie, indican que otro antígeno diferente del RCB, es el
crítico en la interacción del B7Y33 con los linfocitos B. Esto no excluye una
interacción de baja afinidad con este receptor. No obstante, esta población celular
pudiera ser importante en el efecto de inmunopotenciación observado, lo que está
respaldado por la imposibilidad de reproducirlo del híbrido VHB7Y33/VкP3,
variante que no es capaz de reconocer las células B. Los experimentos en animales
BALB/c-xid permitieron descartar un papel protagónico de las células B-1 en el
fenómeno descrito, a pesar de la capacidad presentadora de este tipo de células
(Vigna y cols., 2002; Lopes y Mariano, 2009).
Los experimentos de inhibición mostrados indican que el FcγRIIb, el cual se conserva
en humanos y ratones (Brooks y cols., 1989), es el blanco principal del B7Y33 sobre
Discusión
95
los linfocitos B de ambas especies. Aunque este receptor pertenece a una familia de
moléculas cuya función principal se asocia a la unión de los anticuerpos a través de su
Fc, en particular el dominio CH2, los datos presentados sugieren un tipo particular de
interacción. Solo así se puede explicar la elevada avidez por los linfocitos B mediada
por el FcγRIIb, considerando que este el único FcγR que se expresa en estas células, y
que tiene baja afinidad por las IgG monoméricas (Amigorena y cols., 1989;
Nimmerjahn y Ravetch, 2008). Dicha cualidad es única del B7Y33, como lo
demostraron los ensayos que incluyeron anticuerpos con igual isotipo (IgG1
humano).
Aunque los hallazgos de potenciación de la inmunogenicidad de inmunoglobulinas
autólogas de tipo IgM presentados en este trabajo proponen a las células B como
críticas, no se sabe exactamente a qué nivel ocurre su participación en el fenómeno,
ni si se involucran otras poblaciones celulares. Hay que tener en cuenta que el
FcγRIIb está ampliamente distribuido en el sistema hematopoyético. La interacción
del complejo B7Y33/IgM con el FcγRIIb de las células dendríticas podría favorecer
su captura y presentación por la vía no degradativa mediada por dicho receptor en
estas células (Bergtold y cols., 2005), lo cual permitiría su recirculación a la
superficie celular, con la consiguiente interacción con el RCB y activación de las
células B. Se ha observado que la retención y el reciclaje mediado por el FcγRIIb
puede promover el desarrollo de la respuesta inmune humoral de antígenos
dependientes de células T, ya sea por la vía de activación directa mediada por el
RCB, o por permitir la transferencia o entrega del antígeno a la célula B (Batista y
cols., 2001), con la ulterior presentación B-T. La inducción de anticuerpos resultante
del mecanismo explicado anteriormente, le permite a los organismos expuestos a un
antígeno la amplificación del componente celular B específico por antígenos
microbianos o autoantígenos (Bergtold y cols., 2005).
Por otro lado, se plantea que la presencia del FcγRIIb en las células dendríticas, que
es predominante respecto a otros FcγRs en condiciones no inflamatorias, impide la
maduración de estas, inducida por los inmunocomplejos, lo cual se convierte en un
mecanismo para el mantenimiento de la tolerancia periférica (Kalergis y Ravetch,
2002). De lo anterior se podría deducir que un exceso de B7Y33 con capacidad
Discusión
96
bloqueadora del FcγRIIb, permitiría la activación de las células dendríticas con el
inmunocomplejo B7Y33/IgM, y favorecería la respuesta contra esta última. Como el
híbrido VHB7Y33/VкP3 no interactúa probablemente con el FcγRIIb, al no
reconocer los linfocitos B, el inmunocomplejo del híbrido con la IgM no puede
bloquear el receptor inhibitorio y exhibir la capacidad inmunopotenciadora.
Los resultados presentados no son suficientes para dilucidar el mecanismo a través
del cual el B7Y33 ejerce un efecto de potenciación de la respuesta contra anticuerpos
no inmunogénicos en el modelo singénico. Independientemente del papel
determinante que pudiesen desempeñar los linfocitos B u otras poblaciones celulares,
no se pueden descartar otros factores que podrían influir positivamente en este
fenómeno. Uno de ellos es la glicosilación de la región variable del B7Y33. Los
estudios de Wright (1991) mostraron que la adición de carbohidratos al residuo 50 de
la cadena ligera, como podría ocurrir en el B7Y33, aumenta el tiempo de vida media
en sangre de la inmunoglobulina, lo que en este caso daría más oportunidad a la
acción del anticuerpo. Asimismo, se ha demostrado que el tipo de glicosilación en la
cadena ligera puede definir la inmunogenicidad del anticuerpo (Wright y cols., 1991);
se trataría de una inmunogenicidad intrínseca aumentada del B7Y33 que traería
consigo una estimulación de la respuesta inmune. Esta puede ser una explicación
adicional a la ausencia de efecto inmunopotenciador del híbrido VHB7Y33/VкP3, en
el cual no hay sitio de N-glicosilación en la cadena ligera.
5.5 Interacción B7Y33-célula B
La construcción de variantes mutadas de la VH y el Fc del B7Y33 permitió esclarecer
la contribución de estas dos regiones a su unión a las células B. Los resultados
obtenidos evidencian la relevancia del idiotipo, el cual no tiene participación en las
interacciones convencionales Fc-FcγRs.
Del análisis de las evidencias acumuladas, se propusieron y evaluaron cuatro posibles
modelos de interacción del B7Y33 con las células B (Fig. 27). Estos tuvieron en
cuenta que el FcγRIIb murino es capaz de unir IgG humanas (Zhu y cols., 2002; Shi y
cols., 2006).
Discusión
97
Figura 27: Representación esquemática de los modelos de unión del B7Y33 a las células de linaje B.
(I) B7Y33 se une al FcγRIIb a través de su región Fc. La unión B7Y33-FcγRIIb se estabiliza con las
interacciones homofílicas entre las regiones Fv. (II) Dos moléculas de B7Y33 unidas a dos moléculas
de FcγRIIb: una a través de su región Fc y la otra a través de la región variable, interactúan entre sí por
sus regiones Fv. (III) Una misma molécula de B7Y33 se une a una molécula de FcγRIIb a través de su
región Fc y a otra, a través de su región variable. (IV) El B7Y33 se une al FcγRIIb a través de su
región Fc, y a otro antígeno de superficie desconocido a través de su región variable.
La autounión es una de las propiedades que caracterizan a algunos de los llamados
superanticuerpos (Kohler y Paul, 1998; Kohler, 2000). Esta propiedad consiste en
interacciones entre dos moléculas idénticas de anticuerpos a través de un sitio de
unión no convencional y constituye un mecanismo para amplificar la unión de un
anticuerpo a un antígeno sobre la superficie celular. Un ejemplo representativo lo es
el anticuerpo R24, específico por el GD3, que porta en su VH un idiotopo homofílico,
necesario para la unión con alta avidez al gangliósido contenido en la membrana
plasmática de células de melanoma (Yan y cols., 1996). Siguiendo este concepto, se
propuso un primer modelo basado en la unión del B7Y33 al FcγRIIb a través de su
FcγRIIb
Sitio de autounión
Sitio de unión a FcγRIIb en CH2
Sitio de unión al FcγRIIb en Fv
Antígeno de superficie
Sitio de unión a antígeno de superficie en Fv
I II
III IV
Superficie celular
Superficie celular Superficie celular
Superficie celular
Discusión
98
Fc, y la estabilización del complejo por interacciones homofílicas entre las Fv (Fig.
27-I). Este modelo se rechaza debido a que las variantes mutadas de VHB7Y33 que
no se unen a linfocitos B (H3 y H4) exhiben reconocimiento autofílico. El segundo
modelo sugiere que una autounión a través de la región Fv estabiliza las interacciones
directas con el FcγRIIb tanto por el Fc como por el Fv (Fig.27-II). De dicho modelo
de interacción se podría esperar una "complementariedad molecular" de las variantes
mutadas H3/H4 y el B7Y33LALA, para la unión a estas células: la ausencia de
reconocimiento por las mutantes H3/H4 a través del idiotipo, y la interacción afectada
del B7Y33LALA a través del Fc, podría ser compensada por la interacción con el
FcγRIIb del idiotipo del B7Y33LALA y el Fc de H3/H4, respectivamente. Como se
demostró anteriormente, este tipo de interacción no ocurre.
Considerando la naturaleza poliespecífica del AcM B7 (Macías y cols., 1999), una
molécula de anticuerpo podría, en principio, unirse simultáneamente a dos moléculas
de FcγRIIb través de dos sitios diferentes: uno en la región Fv, y otro en la región Fc
(Fig.27-III). Un modelo alternativo consistiría en la unión del anticuerpo a un
antígeno de superficie diferente al FcγRIIb, mientras su Fc está comprometido con
este receptor (Fig.27-IV). Este modelo es consistente con un informe en la literatura
en el cual se describe un anticuerpo que requirió de la estabilización por la
interacción con el FcγRIIb para la unión óptima a su antígeno (CD22) en la superficie
de las células B (Walker y Smith, 2008). Una situación similar se describió para otro
anticuerpo específico por el CD72 (Yamashita y cols., 2006; Walker y Smith, 2008).
Sin embargo, nuestros datos actuales no permiten descartar la tercera posibilidad. Se
requieren más experimentos para determinar cuál modelo de interacción es el
correcto.
5.6 Potencial terapéutico del B7Y33 a partir de la interacción con el FcγRIIb
El FcγRIIb desempeña un importante papel en la homeostasia de las células B y la
regulación de la respuesta inmune (Rahman y cols., 2007; Xiang y cols., 2007; Smith
y Clatworthy, 2010). Se sobreexpresa en linfomas de origen B como el folicular y el
linfocítico pequeño (Callanan y cols., 2000; Camilleri-Broet y cols., 2004; Rankin y
cols., 2006). Estos hallazgos convierten al FcγRIIb en una diana interesante para el
Discusión
99
tratamiento de desórdenes proliferativos de las células B. El reconocimiento de
linfocitos de pacientes con leucemia linfocítica crónica B sugiere la exploración del
uso del B7Y33 en la terapia de tales enfermedades. Esta podría incluir el anticuerpo
acoplado a isótopos radiactivos, en el caso de linfoma. De comprobarse una
capacidad de provocar el entrecruzamiento exclusivo del receptor podría basarse su
uso en la inducción de apoptosis de linfocitos B y células plasmáticas, con lo cual
pudiera utilizarse en la terapia no solo de leucemias y linfomas B, sino también de
enfermedades autoinmunes basadas en la existencia de anticuerpos autorreactivos. El
Rituximab (anti-CD20) se ha usado con resultados clínicos satisfactorios en el
tratamiento de linfomas no-Hodgkin y también en el tratamiento de artritis
reumatoide, trombocitopenia idiopática pura, anemia hemolítica y otras enfermedades
relacionadas con el sistema inmune (Barcellini y Zanella, 2011; Hernandez-Cruz y
cols., 2011). Sin embargo, no es útil en pacientes que no expresan o expresan bajos
niveles de CD20 en sus células B malignas. Se ha visto que durante la terapia con este
anticuerpo algunos individuos devienen refractarios al tratamiento (Davis y cols.,
2000). Por lo tanto, el B7Y33 podría constituir una alternativa al tratamiento con el
Rituximab. Los ensayos citofluorimétricos mostraron el reconocimiento por el AcQ
B7Y33 de células de un paciente con leucemia linfoblástica aguda B, que no
expresaban el CD20. Esto descubre un nicho terapéutico para el B7Y33 si se tiene se
cuenta que las leucemias linfocíticas agudas B surgen, en muchos casos, a partir de la
malignización de células en estadio pre-B temprano, donde el marcador CD20 no se
expresa aún (Lassaletta Atienza, 2004).
Si su capacidad solo se limitara a una función bloqueadora del receptor, podría usarse
como adyuvante para favorecer la potencialidad terapéutica de otros anticuerpos.
El estudio de las bases moleculares de la polirreactividad idiotípica del B7Y33 con
otras inmunoglobulinas sugiere la existencia de un sitio de unión en este anticuerpo
que involucra los CDRs H1 y H2, y otro en que participa el CDR H3. Para la
reactividad con otros anticuerpos no se demostró la contribución del FR H3,
específicamente, el llamado lazo H4. El requerimiento de los CDRs H3 y H4 para el
reconocimiento de los linfocitos B, y en última instancia del FcγRIIb, permite deducir
que esas dos propiedades no están relacionadas. No queda claro si el sitio de unión al
Discusión
100
FcγRIIb es un fenómeno totalmente fortuito, o si de alguna manera está relacionado
con la actividad biológica del anticuerpo murino anti-idiotipo de tipo α, que
coselecciona in vivo esta capacidad de reconocimiento.
El anticuerpo E1, usado para generar el AcM B7, es una IgM de línea germinal
(López-Requena y cols., 2007a), como es frecuente entre los anticuerpos anti-
gangliósidos del repertorio natural (López-Requena y cols., 2007a; López-Requena y
cols., 2007b; Vollmers y Brandlein, 2007). Como se demostró en este trabajo, el
B7Y33 interactúa con el AcM E1 y otros antígenos a través de más de un sitio de
unión en la región variable. Igualmente, se une a los linfocitos B de una manera no
clásica, que involucra tanto la región Fv como la región Fc. Es probable que, usando
como antígeno un anticuerpo con las características del AcM E1, se puedan generar
anticuerpos anti-idiotipo que incluyan especificidades y otras propiedades del
repertorio neonatal, cuyas potencialidades terapéuticas están aún por explorar.
Conclusiones
101
6. CONCLUSIONES
1. La multiespecificidad del AcQ B7Y33 involucra distintos sitios de unión,
donde los responsables de la polirreactividad idiotípica difieren de aquellos
que determinan la unión a los linfocitos B.
2. En la unión del AcQ B7Y33 a las células B participan las regiones variables
(Fv) y constante (Fc) de este anticuerpo, y el receptor FcγRIIb en la superficie
de las células B.
3. El B7Y33 ejerce una función reguladora a través de la potenciación in vivo de
la inmunogenicidad de IgMs autólogas, la cual es dependiente de la formación
de inmunocomplejos entre el B7Y33 y dichos anticuerpos.
Recomendaciones
103
7. RECOMENDACIONES
1. Evaluar la constante de afinidad del B7Y33 por los diferentes anticuerpos y el
FcγRIIb.
2. Determinar si la región Fv del B7Y33 reconoce directamente el FcγRIIb,
mediante la construcción de anticuerpos sin dominio CH2 y la expresión
recombinante del dominio extracelular del FcγRIIb.
3. Ampliar la evaluación del reconocimiento de células B de pacientes con
desórdenes linfoproliferativos B por el B7Y33, y estudiar el efecto biológico
de su unión a estas células.
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9. ANEXOS
Anexo I.
Figura I:. Respuesta de IgG contra AcMs anti-gangliósidos. Sueros de ratones BALB/c inoculados
con los AcMs P3, E1 y F6 mezclados con los AcQs B7Y33 o C5 (tomados 7 días después de la
primera dosis), se enfrentaron a placas recubiertas con 10 µg/ml de los anticuerpos murinos usados en
cada administración. La reactividad de los sueros, diluidos 1:50, se determinó con un antisuero
específico por el fragmento Fcγ de ratón, conjugado a fosfatasa alcalina. Se muestran los promedios de
los valores de absorbancia de cada uno de los ratones y un suero preinmune representativo.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
DO
405
nm
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405
nm
0
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0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
DO
405
nm
AcM P3 AcM E1 AcM F6
P3/B7Y33 P3/AcQ C5 PI E1/B7Y33 E1/AcQ C5 PI F6/B7Y33 F6/AcQ C5 PI
120
AUTOBIBLIOGRAFÍA
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Presentaciones en eventos científicos relacionadas con el tema de la tesis:
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Inmunología. Diciembre 2002, Habana, Cuba.
XI Conferencia Internacional de Anticuerpos Humanos e Hibridomas. Octubre 2004,
Dublín, Irlanda.
Taller Internacional: “Inmunoterapia para el Nuevo Siglo” (IT-2004). Diciembre
2004, Habana, Cuba.
V Congreso Nacional de Hematología, Inmunología y Medicina Transfusional. Mayo
2005, Habana, Cuba.
Congreso: Enfermedades Inmunes, de la teoría a la terapia, Rusia, 2005.
Taller Internacional: “Inmunoterapia para el Nuevo Siglo” (IT-2006). Diciembre
2006, Habana, Cuba.
V Congreso de la Sociedad Cubana de Inmunología. Febrero, 2006, Santiago de
Cuba, Cuba.
XI Conferencia Internacional de Anticuerpos Humanos e Hibridomas. Mayo 2006,
Montego Bay, Jamaica.
VI Congreso de la Sociedad Cubana de Inmunología, Camaguey, Cuba, 2008.
Taller Internacional: “Inmunoterapia para el Nuevo Siglo” (IT-2008). Diciembre
2006, Habana, Cuba.
VII Congreso Intrenacional de Química e Ingeniería Química, Cuba, 2009
XVII Conferencia Internacional de Anticuerpos Humanos e Hibridomas (Porto,
2010).
122
Otras publicaciones del autor:
Herrera A, Galban E, Hernández T, Sandez B, Duarte C. A family of Compact
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LE. Active anti-metastatic immunotherapy in Lewis Lung Carcinoma with self
EGFR extra cellular domain protein in VSSP adjuvant. International Journal of
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López-Requena A, Rodríguez M, de Acosta CM, Moreno E, Puchades Y,
González M, Talavera A, Valle A, Hernández T, Vázquez AM, Pérez R.
Gangliosides, AB1 and AB2 antibodies. II. Light versus heavy chain: an
idiotype- antiidiotype case study. Molecular Immunology. 2007; 44:1015.
Hinojosa LE, Hernández T, de Acosta CM, Montero E, Pérez R, López-
Requena A. Construction of a recombinant non-mitogenic anti-human CD3
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Molina-Pérez M., González A., Sosa K., López-Requena A., Pérez R., Mateo
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