ensayos ensayos de potencia potencia para para vacunas ... ibarz inhrr.pdf · ensayos de potencia ....

EnsayosEnsayos de de PotenciaPotencia parapara VacunasVacunasempleandoempleando

CultivosCultivos CelularesCelulares

MSc.MARIAMSc.MARIA TERESA IBARZ M.TERESA IBARZ M.Jefe DivisiJefe Divisióón Control Nacional n Control Nacional

Productos BiolProductos Biolóógicosgicos

Se desarrollSe desarrollóó a finales del siglo XIX como una a finales del siglo XIX como una continuacicontinuacióón de las tn de las téécnicas de Embriologcnicas de Embriologííaa

Wilhem Roux mantuvo en el aWilhem Roux mantuvo en el añño 1885, o 1885, ccéélulas de embrilulas de embrióón de pollo en solucin de pollo en solucióón salina n salina durante unos ddurante unos dííasas

CultivosCultivos CelularesCelulares

El zoEl zoóólogo Americano logo Americano R.GR.G. Harrison (1907) es . Harrison (1907) es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animalesanimales

EEstablecimientostablecimiento de las primeras lde las primeras lííneas celulares neas celulares ((HeLaHeLa y cy céélulaslulas--L de ratL de ratóón)n)

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

Uno de los mayores problemas para el Uno de los mayores problemas para el establecimiento de los cultivos celulares es la establecimiento de los cultivos celulares es la

apariciaparicióón de mn de múúltiples contaminacionesltiples contaminaciones

Rous y Jones, 1916 emplearon por vez primera vez Rous y Jones, 1916 emplearon por vez primera vez tripsina para disociar las ctripsina para disociar las céélulas de embriones de lulas de embriones de

pollo, estableciendo el primer cultivo celular.pollo, estableciendo el primer cultivo celular.

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

Aplicaciones:- Diagnóstico- Virología y producción de vacunas virales- Investigación del cáncer- Producción de proteínas

- Estudios de toxicidad- Producción tejidos, piel para transplantes- Aplicaciones industriales y agrícolas

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

VIROLOGVIROLOGÍÍA A

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

Virus VIH

ProducciProduccióón Vacunas n Vacunas ViralesVirales

Fiebre AmarillaFiebre AmarillaSarampiSarampióónn

Animal completo O Cultivo Primario

SUSPENSION VIRALSUSPENSION VIRAL

ProducciProduccióón n Vacunas ViralesVacunas Virales

Línea Celular

SUSPENSION SUSPENSION VIRALVIRAL

PURIFICACIONPURIFICACION

FORMULACIONFORMULACION

AtenuadaInactivada/Inactivada/FraccionadaFraccionada

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

DIAGNOSTICODIAGNOSTICO

Cuantificación de virus

1) Microscopía Electrónica

2) Efecto sobre la célula hospedadora (Unidad vírica infectiva)

• Formación de placas de lisis

• Efecto Citopático

• Efecto no Visible:

• Hemaglutinación

• Inmunoflorescencia

• Tinción

Cuantificación de virus

POTENCIA VACUNA POTENCIA VACUNA VIRAL ATENUADAVIRAL ATENUADA

Cuantificación de Virus

POTENCIA VACUNA POTENCIA VACUNA VIRAL ATENUADAVIRAL ATENUADA

LINEA CELULAR LINEA CELULAR SUCEPTIBLESUCEPTIBLELIBRE DE AGENTESLIBRE DE AGENTESADVENTICIOSADVENTICIOS

Determinación del Efecto Citopático

Dosis Infectiva Cultivo Celular 50(DICC50)

Ventajas• Control del medio ambiente

• Homogeneidad. Morfología y Composición uniforme.

• Se pueden hacer réplicas idénticas, superando la heterogeneidad de animales de experimentación.

PRUEBAS EN CULTIVOS PRUEBAS EN CULTIVOS CELULARESCELULARES

• Economía en el uso de reactivos o Vacunas a estudiar. Emplea volúmenes reducidos

• Motivaciones Eticas

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

•• TTéécnica sensiblecnica sensible

•• Crecimiento cCrecimiento céélulas animales mucho mlulas animales mucho máás s lento que los contaminantes mlento que los contaminantes máás habituales s habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...)

•• OrganimosOrganimos pluricelulares requieren compleja pluricelulares requieren compleja mezcla de nutrientes, que simula el plasma o el mezcla de nutrientes, que simula el plasma o el fluido intersticial. fluido intersticial.

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

Desventajas

•• Condiciones de asepsia en todo Condiciones de asepsia en todo momentomomento

•• Instrumental y personal calificado para Instrumental y personal calificado para su manipulacisu manipulacióónn

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

• Cantidad y costo: 1 g Cultivo Celular es 10 veces más costoso que el animal.

• Inestabilidad.

Dotación cromosómica aneuploide

Diferencias significativas entre generaciones

Se emplean por determinado número de generaciones

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

Patron Regional de Vacuna Antiamarilica. Lote: 003Comportamiento año 2004

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Nº Determinaciones

Log

10D

L 50 /

0,5

ml

Log 10DL50 / 0,5ml

PATRPATRÓÓN VACUNA ANTIAMARILICAN VACUNA ANTIAMARILICA

MEDIAARITMETICA

LIMITE SUPERIOR

LIMITE INFERIOR

GRAFICAS DE CONTROL

CONTROL ESTADCONTROL ESTADÍÍSTICO DE PROCESOSSTICO DE PROCESOS

Patrón Regional de Vacuna Antipoliomielitica Oral. Lote: SVI/OPV 001 III/96.Comportamiento "Polio Total" año 2004

4,0

4,4

4,8

5,2

5,6

6,0

6,4

6,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Nº Determinaciones

log 1

0 DIC

C 50/ 0

,1m

l

DICC50 /0,1 mL LSC= 6,35 LIC=5,15 LC=5,75

CONTROL ESTADCONTROL ESTADÍÍSTICO DE PROCESOSSTICO DE PROCESOS

GRAFICAS DE CONTROL

Calificación de Analistas:

Guías emitidas por la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) documentos Q2A5 y Q2B6

RESULTADOS CALIFICACION ANALISTAS PRUEBA POTENCIA VAC. SARAMPION

• El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo'

CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES

RESPUESTARESPUESTAINMUNEINMUNE

PROTECCIPROTECCIÓÓNN

DESAFDESAFÍÍO /O /

POTENCIAPOTENCIA

VACUNA ATENUADA VACUNA ATENUADA VACUNA INACTIVADAVACUNA INACTIVADA

VIRUS VIRUS ANIMALES CUANTIFICACION ANIMALES CUANTIFICACION DEL ANTDEL ANTÍÍGENOGENO

CULTIVO ANIMALES CULTIVO ANIMALES ELISA OTROSELISA OTROSCELULARCELULAR

DICC50 DL50 DICC50 DL50 DE50 mcgDE50 mcgUFPUFP UI UI UIUI

UNIDADES INTERNACIONALES UNIDADES INTERNACIONALESUNIDADES INTERNACIONALES UNIDADES INTERNACIONALES

RESUMEN PRUEBAS POTENCIA Y/O CUANTIFICACIRESUMEN PRUEBAS POTENCIA Y/O CUANTIFICACIÓÓN N AgAgEN VACUNASEN VACUNAS