el estudio de la estructura, química, bioquímica y función biológica de los carbohidratos...

El estudio de la estructura, química, bioquímica y función biológica de los carbohidratos

complejos (glicanos).

Glicobiologia

• mas del 50% de todas las proteínas conocidas así como mas del 80% de las proteínas de membrana están glicosiladas.

• El contenido de carbohidrato de una glicoproteina varia entre el 1 y el 80% del peso de la misma.

•Los glicanos o glicoconjugados son el biopolímero mas abundante en la naturaleza.

•Mas del 1.5% de todo el genoma humano codifica enzimas involucradas en la biosíntesis y modificación de glicoconjugados, en ciertos protozoos este porcentaje se eleva a casi el 12%.

•La enzima Hidroxilasa del CMP-acido sialico es el único gene identificado que no se encuentra en humanos pero si en chimpance.

•La O-acetilglucosaminilacion es una modificación regulatoria mas abundante que la Fosforilación

GlicobiologíaGlicobiología

GlicobiologíaGlicobiología

Proteoglicanos

Glicoproteinas

Glicolipidos

Glicosilfosfatidil-inositol anclajes

MonosacaridoProteinaLipido

Etanolamina fosfatoInositol fosfato

GLICOCONJUGADOSGLICOCONJUGADOS

Glicobio(pato)logia

El estudio de la estructura, química, bioquímica y función biológica de los carbohidratos

complejos (glicanos) y su implicación causal en el desarrollo de patologías,

diagnosis y terapia.

Diferencias en la composición de isomeros

entre oligopeptidos y oligosacaridos

Hexasacarido HexapeptidoNº Isomeros > 1012 64 106

(librería 6 hexopiranosas) (20 aminoácidos)

Cantidad > 100 nmol < 100pmol

Síntesis 20 semanas 3 h (robot)

Esto implica que no hay método analítico que permita un análisis estructural completo (determinación de secuencia) en cantidades de 100 nmol como se puede hacer con 100 pmol de proteínas u oligonucleotidos.No hay método analítico que permita distinguir entre 1012 estructuras con la misma masa.

Composición de monosacáridos Al menos 7 monosacáridos distintos son comunes de todos los glicanos, aunque hay mas de 30 que pueden formar parte de glicanos en la naturaleza.

NeuAcGalGlcManFucGalNAcGlcNAc

Enlace glicosidico (secuencia)

Anomericidad

Ramificación: numero y posición

Entre el carbono aldehido/ceto y cualquier grupo hidroxilo del otro monosacarido

Configuracion o del carbono que contiene el grupo aldehido/ceto

Tamaño del anillo: furanosa o piranosa

Origen de la Diversidad Estructural y Regulación de Afinidad

“Cluster” con cadenas vecinas en la misma glicoproteina (mucinas) o en la superficie celular (“rafts”).

HOCH2 O

HONH

COH3C

OH

O

O

OH

OH

OH

CH2

3

6HOCH2 O

OHHO

HOO

1

HOCH2 O

OHHO

HO

O1

O

OH

OH

OH

CH2

3

OH

Complejidad del Glicoma

DNA RNA Proteína

Célula

Organismo

Enzimas

Carbohidratos

Glycoconjugados

GENOMA PROTEOMA

TRANSCRIPTOMA

GLICOMA

DinámicoVariaciones espaciales y temporales

Respuesta al ambiente

CáncerDesarrolloInflamaciónDiferenciaciónActivaciónRespuesta infecciones

Desarrollo secuencial y cambios de importancia

de las funciones de los glicanos

Procariotes Eucariotes

Unicelular Multicelular

Estructural

Plegamientode

proteínas

“Tagging”Extracelula

r

Modulación del

plegamiento

Funciones Biológicas de los Glicanos

Físicas/Estructurales

P

P = Patogeno

Reconocimiento Intrínseco= Propio

INTRINSIC RECEPTOR

SELF

Reconocimiento Extrínseco

= No Propio

EXTRINSIC RECEPTOR

OLIGOSACCHARIDE =

SELF

Mimetismo molecular

Los Glicanos actúan como señales vía Lectinas

ANIMAL AND PLANT GLYCOPROTEINS SHOW VARIOUS SUGAR CONTENTS

GLYCOPROTEIN Present in Mr % sugar content

ENZYMESAlkaline phosphatase Murin liver 130 000 18Carboxypeptidase Y Yeast 51 000 17

HORMONES AND CYTOKINESChorionic gonadotropin Hum. urine 38 000 31Erythropoietin Hum. Urine 34 000 29Interferon g Hum. WBC 26 000 20

LECTINSSoybean lectin 50 000 50Potato lectin 120 000 6

EXAMPLES OF GLYCOPROTEINS IN ANIMALS AND PLANTS

Cell-surface and viral coat glycoproteins

Serum glycoproteins

Structural glycoproteins

Oligosaccharides of the cell surface are attached to membrane embedded proteins and certain lipid

oligosaccharide

glycolipid hydrophobic helix

integral protein

phospholipid

cholesterol

integral protein

Molecular model, based on the crystal structures

of IgG Fab and IgG Fc.

Fab glycosylation sites are in the hyper-variable region and occupied approx. 40% of the

time. (Dweck, 1995)

X-ray structure of murine antibody against canine lymphoma

Textbook presentation 1998

New methods revolutionised the study of glycoconjugate structures

Many proteins bear a sugar attachment such as13.6 kDa T Lymphocyte Adhesion Domain of Human CD2

Successful fertilisation depends on binding of

spermal lectins to glycoproteins of egg

membrane

Specific glycoprotein - lectin recognition defines many physiological processes

• Fertilisation• Development and differentiation• Activity regulation of hormones• Immune response and inflammation• Memory consolidation

– and many more

Cel-cell recognition relies on the specific glycoprotein-lectin interaction capable to decode information

carried in the presented oligosaccharide motive.

Glycoproteins are found responsible for

• Xenografts rejection• Cancer progression and metastasis• Storage diseases• Immune response towards recombinant

therapeutics

- and many more

STUDYING GLYCOCONJUGATES

ST R U C T U R EProtein, G lycan

Glycotypes, G lycoform sConform ation

B IO SYN T H ESISLocation, Core,

Enzym es, Sorting,E laborations, Regulation

FU N C T IO NConform ational, Protective

Functional EffectsT argeting

E xperim eta l s tra tegiesSam ples, T echniques

Equipm entAnalysis

EVOLUTION DIAGNOSIS THERAPY

PHARMACEUTICAL INDUSTRY

ANALYTICAL TOOLS

ALDOSE: CH2(OH)(CHOH)n-2HCOKETOSE: CH2(OH)(CHOH)n-3COCH2OH

Cyclic hemiacetal forms

D-Glucose

Glycosidic link

Enzyme catalyzed reaction seals the anomeric configuration.

Sugar1-OH + Sugar2-OH Sugar1-O- Sugar2 + H2O

UDP GDP CMP

GalNAc Fucose Sialic a.

GlcNAc Mannose

Galactose

Glucose

Glucuronic a.

Xylose

16 kJ

ENZYME

Laine (1988)Pentasacarido lineal, monosacaridos no repetidos.

n! x 2na x 2nr x 4n-1 n=numero de monosacaridosa=anomericidadr=tamaño del anillo4n-1= enlaces

Con cinco monosacáridos distintos el total es: 31 457 280 estructuras posibles

Con seis monosacáridos distintos el total es: 819 200 000

Para Proteínas el total es 20n. Si n=5 3 200 000

Para oligonucleotidos el total es 4n . Si n=5 1024

Si incluimos posibles ramificaciones el total para un n=6 llega a: 2 633 600 000 = 2.6 x109

sin considerar las formas D o L.

El total de formas posible para un hexasacarido (el tamaño medio involucrado en reconocimiento) es de 1.05 x 1012.

Esto implica que no hay metodo analitico que permita un análisis estructural completo (determinacion de secuencia) en cantidades de 100 nmol como se puede hacer con 100 pmol de proteinas u oligonucleotidos.No hay metodo analitico que permita distinguir entre 1012 estructuras con la misma masa.

Oligomer Number of isomers composition Oligosaccharide Oligopeptide

Dimer AADimer AB

1120

12

Trimer AAATrimer ABCTetramer AAAATetramer ABCDPentamer AAAAAPentamer ABCDE

120720

14243456017872

2144640

161

241

120

R.R. Schmidt, Angew. Chem. 1986, 212-235

Comparable sequences of oligopeptide and oligosaccharide differ drammatically in isomeric

possibilities

Diversidad de enlaces sacárido-proteína en las glicoproteínas

Oligosaccharides are linked to proteins by O- or N-Oligosaccharides are linked to proteins by O- or N-glycosidic bondsglycosidic bonds

In N-linked oligosaccharides N-acetylglucosamine at the C1 position of reducing end of sugar binds to Asn within Asn-X-Ser/Thr sequence.

O-glycosidic bonds are formed between C1 position of reducing terminus of monosaccharide or oligosaccharide and hydroxyamino acid, Ser or Thr.(N-acetylgalactosamine is often at the non-reducing end.)

BIOSYNTHESIS OF GLYCOPROTEINS STARTS IN ER

In ER oligosaccharide is preassembled on a lipid carrier and transferred “en block” to the nascent protein.

Glycan processing and tagging occurs in Golgi.

Glycosylated product is packed and exported to final destination.

EndoH sensitive

EndoH resistant

Biosintesis compleja pero conservada evolutivamente

…en principio no diana terapeutica

Calnexin and calreticulin bind misfolded or unfolded monoglucosylated glycoproteins to prevent final deglucosylation by -glucosidase II, which signalises the export to ER, in case of impaired protein folding.

Lectin-like chaperons mediate and controlproper protein folding

Levaduras

Insectos Plantas

Vertebrados

Hongos

Evolucion de complejidad

Oligosaccharide transfer

Branching enzymes

Processing enzymes

Terminal transferases

GlycoformsTerminal transferases

Branching enzymes

Initialmonosaccharide

O-linked peptideSer/Thr

N-linked peptideA-X-S/T

Origin of Glycoheterogeneity

Glycosaminoglycans attached to proteoglycans are formed

from repeating disaccharide units

Secreted or extracellular

Cartilage proteoglycan *Mr 220 952Versican*Mr 264 048Decorin* Mr 38 000Intracellular granule

Serglycin*Mr 10 190Membrane intercalatedSyndecan* Mr 38 868

*Protein Mr

PROTEOGLYCAN STRUCTURES are predominantly glycosaminoglycans O-linked to Ser

O-linked saccharides extend functional protein domains above membrane surface

PROTEOGLYCAN STRUCTURE

OF BOVINE CARTILAGE

Hyaluronate (up to 4 m), coated with proteo-glycans, forms the backbone of a complex polyanionic structure (Mr>2x106) which is highly hydrated and enmeshed in a network of collagen fibers. Link protein assists the noncovalent attachment of proteoglycan core proteins.

EVOLVING FUNCTIONS OF OLIGOSACCHARIDESADVENTITIOUS

General propertiesand structural roleN-linked cores are added earlyin the life of glycoproteins.

INTERMEDIATESorting role

Transient glucose signals for sorting. Oligomeric proteins assemble before entering Golgi.

COLLATERAL and RECENTSubstitutional roles for amino acids

Extensions and O-linked sugars

Recognition markersPotential for adaptation Terminal elaborations

Supporting facts for the Hypothesis of sequential

evolution of glycosylation:

Two strategies : “En bloc” vs.., stepwise

ER-Golgi shuttling protein ERGIC-53, similar to L-type lectins, recognizes the same structures as calnexin/calreticulin

Core sugar bound to a proximal Asn in the vicinity of a hydrophobic region of trypanosomes coating protein makes redundant the protective -helix segment.

“Structural effects arose adventitiously and were selected for. Direct effects of glycosylation on behavior of

glycoproteins evolved recently.”T. Drickhamer, 1998

Diversidad Evolutiva de las Lectinas

Oncogenic transformations are associated with numerous changes in glycosylation• different cancers are characterized by

different changes– appearance of novel carbohydrate structures– changes in the activity of glycosyltransferases– appearance of novel lectins

• novel carbohydrate structures and lectins are promising targets for cancer vaccines and drug targeting

NON-SPECIFIC ROLES OF GLYCANS BOUND TO PROTEIN

• Folding, assembling Hepatic lipase and secretion Erythropoietin Vascular endothelial growth f. immature GP aggregation

HBV glycoproteins• Conformational effects Yeast acid phospfatase

increased thermal stability t-Plasminogen activator decreased backbone mobility Cell-surface CD2

Mucins (terminal Sia)• Protective effects Fibronectin

proteolytic degradation Ribonuclease BLDL-receptor (ovary cells)

circulatory life time ceruloplasmin• Functional effects and antithrombin

binding Glycoprotein hormones kinetics Ribonuclesase A and B

Glicanos mas

comunes en células

animales

OSer

OSer/Thr

NAsn

Ser-O-

EXTERIOR

INTERIOR

NAsn

S S S

-O-SerS SSS S

EtnP

INOSITOL

P

NH

Ac

P

NS NS

Ac

S

2

P

GlicoproteinaGlicoproteina

ProteoglicanoProteoglicano

ANCLAJE ANCLAJE GLICOFOSFO-GLICOFOSFO-

LIPIDOLIPIDO

N- CHAINSN- CHAINS

O-LINKED O-LINKED CHAINCHAIN

HIALURONANOHIALURONANO

GLICOSAMINO-GLICOSAMINO-GLICANOSGLICANOS HEPARAN SULFATOHEPARAN SULFATO

CONDROITINCONDROITIN SULFATOSULFATO

Acido Acido SialicosSialicos

GLICOESFINGOLIPIDOGLICOESFINGOLIPIDO

O-GlcNAcO-GlcNAc

Eliminacion de los

glicanos mayoritarios permite la viabilidad celular in vitro

OSer

GLYCOPHOSPHO-GLYCOPHOSPHO-LIPIDLIPID

ANCHORANCHOR

OSer/Thr

NAsn

Ser-O-

N-LINKED CHAINSN-LINKED CHAINS

O-LINKED O-LINKED CHAINCHAIN

GLYCOSPHINGOLIPIDGLYCOSPHINGOLIPIDOUTSIDE

INSIDE

NAsn

S S S

-O-SerS SSS S

GLYCOSAMINO-GLYCOSAMINO-GLYCANSGLYCANS

EtnP

INOSITOL

P

NH

Ac

P

NS NS

O-LINKED GlcNAcO-LINKED GlcNAc

Ac

S

2

P

GlycoproteinGlycoprotein

ProteoglycanProteoglycan

HYALURONANHYALURONAN

HEPARAN SULFATEHEPARAN SULFATE

CHONDROITINCHONDROITIN SULFATESULFATE

Sialic AcidsSialic Acids

LETHAL

Eliminación de los

glicanos mayoritarios

causa letalidad

embrionaria

in vivo

OSer

GLYCOPHOSPHO-GLYCOPHOSPHO-LIPIDLIPID

ANCHORANCHOR

OSer/Thr

NAsn

Ser-O-

N-LINKED CHAINSN-LINKED CHAINS

O-LINKED O-LINKED CHAINCHAIN

GLYCOSPHINGOLIPIDGLYCOSPHINGOLIPIDOUTSIDE

INSIDE

NAsn

S S S

-O-SerS SSS S

GLYCOSAMINO-GLYCOSAMINO-GLYCANSGLYCANS

EtnP

INOSITOL

P

NH

Ac

P

NS NS

O-LINKED GlcNAcO-LINKED GlcNAc

Ac

S

2

P

GlycoproteinGlycoprotein

ProteoglycanProteoglycan

HYALURONANHYALURONAN

HEPARAN SULFATEHEPARAN SULFATE

CHONDROITINCHONDROITIN SULFATESULFATE

Sialic AcidsSialic Acids

Species 1 Species 2 Species 3 Species 4 Species 5

= in situ localization of a specific oligosaccharide structure

Glicomica Comparativa: nueva aproximación para el establecimiento de las funciones endógenas de

algunos oligosacaridos

Examples of Parasite Glycans

Examples of Parasite Glycans

Which class of Glycan recognition is more common?

IntrinsicRecognition

Structural

ExtrinsicRecognition Intrinsic

Recognition

Structural

ExtrinsicRecognition

The two classes of Glycan recognition are under

different types and rates of evolutionary selection

pressures

OR

Glycans have probably been involved in an Ongoing Arms Race during Evolution

OLIGOSACCHARIDE =

M

INTRINSIC RECEPTOR

SELF

EXTRINSIC RECEPTOR

M = Micro-organism Pathogen Toxin Symbiont

How to Evade Microbial Recognition without

loosing Endogenous Function?

Como evadir el reconocimiento microbiano

sin perder la función endógenaCambiar enlace

Anadir modificación

Enmascarar

Añadir ramificación

Sustitución

MSELF

MSELF

MSELF

AcAc

MSELF

MSELF

Glicomica Comparativa

Glycan Arrays

Potencial de uso:1.- Perfil inmunologico anti-glicanos para la identificacion del “target” en distintas condiciones patologicas (infecciones, cancer, autoinmunidad, xenotransplantes, etc).2.- Identificacion de anticuerpos neutralizantes.3.- Identificacion de nuevas familias de proteinas de union a carbohidratos tanto en el hospedador como en el agente infeccioso.

Esto permitira identificar candidatos terapeuticos (Vacunas) y/o diagnosticos, asi como tambien ser critico para el entrendimiento de la relacion hospedador-agente infeccioso y la patogenesis d4e la inefccion.Tambien es posible establecer la firma glicano de los agentes ineecciosos.Es de destacar la capacidad de identificar (en combinacion con MALDI-TOF) antigenos no detctados por medios convencionales como WB.

Glycan Arrays

Glycan Arrays

Chagas Serum

Altamente reproducible en la identificacion de anticuerpos anti-glicanos en sueros

Concluding

• A great majority of proteins and many of membrane lipids are glycosylated. Many of their structures are to be revealed and their distinct function understood.

• Oligosaccharides serve various general and specific purposes, and may have regulatory properties.

• Information embedded in oligosaccharide structures, decoded by specific receptors, mediates many vital biological processes.

• Patterns of glycosylation depend on acting glycozymes. More information are needed about glycozymes.

• Diversity of glycotypes depends on tissue specific glycosylation machinery, yet various glycoforms are a challenging issue of biology.

• The role of glycosylation has been changing during evolution.

Concluding

• Impaired glycosylation may cause diseases and be disease specific.

• Surface oligosaccharides show antigenic properties and are receptor specific.

• Sugar structures change during development and aging, as well as in response to environmental factors.

• Understanding glycobiology will help understanding and treating diseases

• May the lectures on the challenging issues of glycobiology mediate your transformation into genuine glyco fan.

Quo vadis?

Glicobiologia es un área en la que se requiere estudios sistemáticos descriptivos no mecanisticos (al menos por ahora).

Esta claro que la exploración de la diversificación en estructuras de glicanos en patógenos y sus hospedadores puede educarnos acerca de su función.

Beneficios: mejor conocimiento acerca de las susceptibilidades a infecciones y a un mejor diseño terapéutico, identificando glicanos con funciones criticas durante el desarrollo y diversas condiciones patológicas