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DETECCIÓN DE Legionella EN AGUA POR

PCR A TIEMPO REAL : DESARROLLO Y VALIDACIÓN

UnidadUnidadUnidadUnidad VirologVirologVirologVirologííííaaaa y y y y MicrobiologMicrobiologMicrobiologMicrobiologííííaaaa Molecular.Molecular.Molecular.Molecular.

Dra. Blanca Bermejo, Andrés Antón, Ivonne Avalos.

FINALIDAD DEL ESTUDIO

Desarrollo de una técnica de PCR a tiempo real para la detección, identificación y cuantificación

simultánea de Legionella spp y Legionella pneumophila en

muestras de agua de circuitos de refrigeración y/o potables.

ETAPAS DEL ESTUDIO

1. Determinación de las dianas genéticas para la amplificación de Legionella

2. Diseño y puesta a punto de la PCR a tiempo real

3. Optimización del proceso analítico

4. Validación del proceso

5. Validación de la PCR frente al método de referencia

1. Determinación de las dianas genéticas para la amplificación de Legionella

• Legionella spp: Gen 16S rRNA

• Legionella pneumophila: Gen Macrophage Inhibitor Potentiator (mip)

•J. Clin. Microbiol. 2003, 41(9): 4016-4021.

•Appl. Environ. Microb. 2001, 67(9): 3985-3993.

•J. Clin Microbiol. 2002, 40: 3814-3817

2. Diseño y puesta a punto de la PCR a tiempo real

PCR dúplex

5´TxRed/3´BHQmipLegionella pneumophila

5´FAM/3´BHQ16S rRNALegionella spp

Detección sonda TaqMan

Amplificaciónprimer específico

Curvas estándar externasL. pneumophila

ATCC 33152DNA

dil seriadas

107 a 101 genomas/L

3. Optimización del proceso analítico

FILTRACIÓN

EXTRACCIÓN ADN

PCR A TIEMPO REAL

ANÁLISIS DE DATOS

Muestra de agua

3. Optimización del proceso analítico

FILTRACIÓN

EXTRACCIÓN ADN

PCR A TIEMPO REAL

ANÁLISIS DE DATOS

Muestra de agua 1 mL cepaATCC 33152

ADN

+ 1 L H2O

ADN

FILTRACIÓN

3. Optimización del proceso analítico

FILTRACIÓN

EXTRACCIÓN ADN

PCR A TIEMPO REAL

ANÁLISIS DE DATOS

Muestra de agua

RESULTADO

MUESTRA ADN CLONADO

ADN

PCR ADN CLONADO

PCR Legionella

PO

INHIBIDORES PCRNO

4. Validación del proceso

-++++++

+++++++

+++++++

+++++++

+

+

+

+

3

+

-

+

+

2

-

-

+

-

14567

++++

++++

++++

++++

1. Límite de cuantificación

Log genomas/L

Exp

erim

ento

s

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

012345678

Log Conc

Det

ecci

ón (

%)

102 genomas/L

87.5%

4. Validación del proceso

2. Reproducibilidad

y = 0.0046x + 0.9566

y = -0.0145x + 0.9228

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Experimentos

Efic

ienc

ia P

CR

Eficiencia mip 97% ± 1.9

Eficiencia spp 88% ± 2.6

Eficiencia PCR = 10 (1/-pend) -1

0

2

4

6

8

5 10 15 20 25 30 35

Ciclo

Log

Con

c

5. Validación de la PCR frente al método de referencia

En la PCR se detectan genomas de Legionella mientras que en el método de referencia se valoran unidades formadoras de colonia (ufc).

OBJETIVO: Estudiar la equivalencia en los resultados de PCR frente a los

del método de referencia.

METODOLOGÍA:1. Valoración paralela de 80 muestras de agua de diferente

orígen.2. Determinación de un valor de PCR que refleje el riesgo de

legionelosis de acuerdo con los resultados del método de referencia.

3. Interpretación de los resultados.

1. Valoración paralela de 80 muestras de agua de di ferente orígen.

60% resultados coincidentes con el cultivo microbiológico

10% detectable por PCR y negativo en cultivo

12% detectable por PCR y no valorable por cultivo

3% no valorable por PCR (inhibición)

15% no detectable por PCR con valores en cultivo de 10-102 ufc/L

5. Validación de la PCR frente al método de referencia

1.E-01

1.E+00

1.E+01

1.E+02

1.E+03

1.E+04

1.E+05

1.E+06

1.E-01 1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06

MICRO

PCR

1,E-01

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E-01 1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06

MICRO

PC

R

1,E-01

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E-01 1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06

MICRO

PC

R

1,E-01

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E-01 1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06

MICRO

PC

R

2. Determinación de un valor de PCR que refleje el riesgo de legionelosis de acuerdo con los resultados del método de referencia.

88.41%Spec

76.92%Sens

100Cut off

100%Spec

66.67%Sens

10000Cut off

97.33%Spec

85.71%Sens

1300Cut off

5. Validación de la PCR frente al método de referencia

3. Interpretación de los resultados.

En la determinación de Legionella por PCR a tiempo real, un valor superior a 1300 genomas/L permite identificar muestras que contengan >103 ufc/L con sensibilidad y especificidad cercanas al 100%.

5. Validación de la PCR frente al método de referencia

La PCR a tiempo real es una

herramienta de diagnóstico rápido

para la detección de Legionella en

situaciones de brote o emergencia.

GRACIAS