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DETECCIÓN DE Legionella EN AGUA POR
PCR A TIEMPO REAL : DESARROLLO Y VALIDACIÓN
UnidadUnidadUnidadUnidad VirologVirologVirologVirologííííaaaa y y y y MicrobiologMicrobiologMicrobiologMicrobiologííííaaaa Molecular.Molecular.Molecular.Molecular.
Dra. Blanca Bermejo, Andrés Antón, Ivonne Avalos.
FINALIDAD DEL ESTUDIO
Desarrollo de una técnica de PCR a tiempo real para la detección, identificación y cuantificación
simultánea de Legionella spp y Legionella pneumophila en
muestras de agua de circuitos de refrigeración y/o potables.
ETAPAS DEL ESTUDIO
1. Determinación de las dianas genéticas para la amplificación de Legionella
2. Diseño y puesta a punto de la PCR a tiempo real
3. Optimización del proceso analítico
4. Validación del proceso
5. Validación de la PCR frente al método de referencia
1. Determinación de las dianas genéticas para la amplificación de Legionella
• Legionella spp: Gen 16S rRNA
• Legionella pneumophila: Gen Macrophage Inhibitor Potentiator (mip)
•J. Clin. Microbiol. 2003, 41(9): 4016-4021.
•Appl. Environ. Microb. 2001, 67(9): 3985-3993.
•J. Clin Microbiol. 2002, 40: 3814-3817
2. Diseño y puesta a punto de la PCR a tiempo real
PCR dúplex
5´TxRed/3´BHQmipLegionella pneumophila
5´FAM/3´BHQ16S rRNALegionella spp
Detección sonda TaqMan
Amplificaciónprimer específico
Curvas estándar externasL. pneumophila
ATCC 33152DNA
dil seriadas
107 a 101 genomas/L
3. Optimización del proceso analítico
FILTRACIÓN
EXTRACCIÓN ADN
PCR A TIEMPO REAL
ANÁLISIS DE DATOS
Muestra de agua
3. Optimización del proceso analítico
FILTRACIÓN
EXTRACCIÓN ADN
PCR A TIEMPO REAL
ANÁLISIS DE DATOS
Muestra de agua 1 mL cepaATCC 33152
ADN
+ 1 L H2O
ADN
FILTRACIÓN
3. Optimización del proceso analítico
FILTRACIÓN
EXTRACCIÓN ADN
PCR A TIEMPO REAL
ANÁLISIS DE DATOS
Muestra de agua
RESULTADO
MUESTRA ADN CLONADO
ADN
PCR ADN CLONADO
PCR Legionella
PO
INHIBIDORES PCRNO
4. Validación del proceso
-++++++
+++++++
+++++++
+++++++
+
+
+
+
3
+
-
+
+
2
-
-
+
-
14567
++++
++++
++++
++++
1. Límite de cuantificación
Log genomas/L
Exp
erim
ento
s
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
012345678
Log Conc
Det
ecci
ón (
%)
102 genomas/L
87.5%
4. Validación del proceso
2. Reproducibilidad
y = 0.0046x + 0.9566
y = -0.0145x + 0.9228
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Experimentos
Efic
ienc
ia P
CR
Eficiencia mip 97% ± 1.9
Eficiencia spp 88% ± 2.6
Eficiencia PCR = 10 (1/-pend) -1
0
2
4
6
8
5 10 15 20 25 30 35
Ciclo
Log
Con
c
5. Validación de la PCR frente al método de referencia
En la PCR se detectan genomas de Legionella mientras que en el método de referencia se valoran unidades formadoras de colonia (ufc).
OBJETIVO: Estudiar la equivalencia en los resultados de PCR frente a los
del método de referencia.
METODOLOGÍA:1. Valoración paralela de 80 muestras de agua de diferente
orígen.2. Determinación de un valor de PCR que refleje el riesgo de
legionelosis de acuerdo con los resultados del método de referencia.
3. Interpretación de los resultados.
1. Valoración paralela de 80 muestras de agua de di ferente orígen.
60% resultados coincidentes con el cultivo microbiológico
10% detectable por PCR y negativo en cultivo
12% detectable por PCR y no valorable por cultivo
3% no valorable por PCR (inhibición)
15% no detectable por PCR con valores en cultivo de 10-102 ufc/L
5. Validación de la PCR frente al método de referencia
1.E-01
1.E+00
1.E+01
1.E+02
1.E+03
1.E+04
1.E+05
1.E+06
1.E-01 1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06
MICRO
PCR
1,E-01
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E-01 1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06
MICRO
PC
R
1,E-01
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E-01 1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06
MICRO
PC
R
1,E-01
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E-01 1,E+00 1,E+01 1,E+02 1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06
MICRO
PC
R
2. Determinación de un valor de PCR que refleje el riesgo de legionelosis de acuerdo con los resultados del método de referencia.
88.41%Spec
76.92%Sens
100Cut off
100%Spec
66.67%Sens
10000Cut off
97.33%Spec
85.71%Sens
1300Cut off
5. Validación de la PCR frente al método de referencia
3. Interpretación de los resultados.
En la determinación de Legionella por PCR a tiempo real, un valor superior a 1300 genomas/L permite identificar muestras que contengan >103 ufc/L con sensibilidad y especificidad cercanas al 100%.
5. Validación de la PCR frente al método de referencia
La PCR a tiempo real es una
herramienta de diagnóstico rápido
para la detección de Legionella en
situaciones de brote o emergencia.
GRACIAS