degradación aeróbica de tolueno: el plásmido tol
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Degradación aeróbica de tolueno:el plásmido TOL
Representative hydrocarbons in petroleum
Alkanes
Ciclics
n-alkane
Ramified alkane
Ciclopentane Ciclooctane Biciclooctan Ciclohexane Bicicloheptane
Aromatics
Benzene Naphtalene Fenantrene Benzo () pirene
Hidrocarburos aromático:
Representativos de contaminación (petróleo e industria)Estructuras muy estables
Contaminantes antropogénicos
Estructuras diseñadas para ser muy estables (Diseñadas para ser tóxicas)
DIFÍCILES DE DEGRADAR
COMPUESTOS CONTAMINANTES DE ORIGEN INDUSTRIAL
Orgánicos
Pesticidas (concentraciones traza pero MUY tóxicos)Compuestos aromáticos policíclicosHidrocarburos policlorados, solventes orgánicos y carburantes (BTEX)Solventes orgánicos NO cloradosTintes, detergentes, ...
Inorgánicos
Fosfatos y nitratos (agricultura intensiva)Metales tóxicos (Zn, Cd, Ni, Cu, Pb, Cr, Hg, Mo, As, Se)
ORGANISMOS IMPLICADOS EN LA RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS
MICROORGANISMOSBacterias
Muy versátilesBuen nivel de conocimientoFáciles de manipular
HongosVersátilesBajo nivel de conocimiento de cepas silvestresDifíciles de manipular
PLANTAS Gran tamaño (visibles)Manipulables
INVERTEBRADOSComo reactores (futuro?)
Manipulación requiere CONOCIMIENTO PREVIO
• Organismos y sus posibilidades
• Rutas disponibles
• Regulación de la rutas
• Mecanismos disponibles para su manipulación
¿Qué conocimiento tenemos?
¿Cómo llegamos esta información?
CH3
tolueno
Compuesto naturalconstituyente del petróleo
(BTX)
Origen antropogénico
Clasificado como contaminante prioritario por la EPA
Ejemplo mejor estudiado
Compuesto modelo
Conocimiento profundo a nivel bioquímico, genético, fisiológico, manipulación de rutas, circuitos reguladores, evolución, etc...
Bioquímica de la degradación aeróbica de tolueno
Plásmido TOL
Pseudomonas putida mt-2
CH3
toluenoAislada en los años 60
Microbiología
1900
1930
Microorganismos capaces de crecer a expensas de compuestos aromáticos "Ecología microbiana"
1960 1as evidencias de una nueva ruta: rotura en meta
Bioquímica
1940
1950Oxidación de la cadena lateral del tolueno
Oxidación del benceno vía catecol
Estudios exhaustivos de degradación de alquilaromáticos
Aislamiento e identificación de intermediarios
Pseudomonas putida mt-2
Dos rutas diferentes para la degradación de benzoato:
Rotura en orto (puede degradar BENZOATO)
Rotura en meta (puede degradar METIL-
BENZOATOS)
COOH
COOH
CH3
Aparecen mutantes espontáneos que parecen cambiar su metabolismo de tipo meta a tipo orto.
ben+, m-ben-
Han perdido TODAS las enzimas de la ruta meta.
Son MUY estables (no hay revertientes).
Mismo fenotipo se obtiene curando con Mitomicina C
El carácter el TRANSMISIBLE
Los genes de la ruta meta presentes en un plásmido: TOL (pWW0)
Métodos para el estudio de rutas
• Detección e identificación de compuestos intermediarios
(resting cells)
• Estudios isotópicos
• Estudios de adaptación simultánea
• Obtención y análisis de mutantes
CH3 CH3OH
CH3
OH
OH
o-cresoltolueno 3-metilcatecol
H3C
OH
OH
H
H
CH2OH CHO COOH
H
HOOC OHOH
CH3
OH
CH2OH
OH
CHO
OH OH
COOH
CH3
OH
OHOH
COOH
OH
OH
ORTO
(ORTO)
cis-toluenodihidrodiol
m-cresol
META
alcoholbencílico
benzaldehído benzoato cis-benzoatodihidrodiol
catecol
p-cresol alcoholp-hidroxibencílico
p-hidroxi-benzaldehído
p-hidroxi-benzoato
protocatecuato
META
P. putida mt-2
P. putida F1
B. cepacia G4
R. pickettii PK01
P. mendocina KR1
TOL
TOD
TOM
TBU
T4MO
OXIDACIÓN del anilloRUPTURA OXIGENOLÍTICA
AEROBIOSIS
OH
OH
COOH
OHOH
protocatecuato
COOH
OH
HO
gentisato
Intermediarios centrales
catecol
CH3
OH
OH
COOHCOOH
O2
O2
Activación del anillo
Apertura del anillo Oxidación
Reacciones periféticas
OHCOOH
NH2
OH
CATECOLOH
OH
COOHNH2
CH CH
COOH
CHO
CH
COOH
CH2OH
CH3
CO COOH
NH
CH2CHNH2
COOH
CH2 CHNH2
CO CH2 CHNH2
NH2COOH
NHCHO
CO
anilina
antraceno
salicilato
antranilato
fenantreno
naftaleno
benceno
fenol
benzoato
benzaldehído
L-mandelato
cinamato
alcohol bencílico
tolueno
benzoilformiato
L-triptófano
formilquinurenina
quinurenina
HO COOH
COOH
Rotura en posición meta
P. putida mt-2
Ruta TOL
CH3
tolueno
CH2OH
Alcohol bencílico
CHO
benzaldehído
COOH
benzoato
XO DH DH
T1,2DO
HOOC
H
OHOH
Cis-benzoato dihidrodiol
OH
OH
catecol
DHDH
CH3
CH3
xyleno
X F C1 C2B A TSIGED H
CH3
ISPTOL
ISPTOL
(todC1C2)FerredoxinTOL
FerredoxinTOL
(todB)ReductaseTOL
ReductaseTOL
(todA)NAD+
NADH+H+
O2
CH3
OHOH
H
H
toluene
cis-toluene dihydrodiolNAD+
(todD)NADH+H+
CH3
OHOH
3-MethylcatecholO2 (todE)
Ring fission
Meta
Orto OH
OH
catecol
OH
OH
3-metilcatecol
CH3
OH
OH
4-metilcatecol
H3C
No todos los sustituyentes están permitidos
COOHCHO
OH
COOHCOOH
CATECOL
orto meta
OH
OH
Rotura del anillo: DIOXIGENASAS
cis,cis-muconato Semiladhido hidroximucónico
1,2 Dioxigenasa 2,3 Dioxigenasa
O2
HCOOH
COOH
OHO
4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa
O2
CH3COOH
4-hidroxi-2-oxovalerato
2-hidroxi, 6-oxo 2,4-heptadienoato hidrolasa
acetaldehído deshidrogenasa
CCH3
OSCoA
acetilCoA
OH
CHOCOOH
OH
OH
CH3 CO COOH
OH
COOHCOOH
O
COOHCOOH
CO2
O
COOH
OH
CCOOH
CH3
O
CH3
OH
OH
catecol
semialdehído 2-hidroximucónico
2-oxo 4-pentenoato
Catecol 2,3 Dioxiganasa
2-hidroxi-2,4-pentadienoato hidratasa
3-metilcatecol
2-hidroxi, 6-oxo
2,4-heptadienoato
4-oxalcrotonatoisomerasa
+
piruvato
CH3CHO
acetaldehído
META
4-oxalcrotonato (enol)
4-oxalcrotonato (ceto)
semialdehido2-hidroximuconatodeshidrogenasa
semialdehido2-hidroximuconatohidrolasa
4-oxalcrotonatodescarboxilasa
O2
-carboximuconatolactonasa
CHOOC
OSCoA CH3C
OSCoA
acetilCoAsuccinilCoA
O2
OH
OHHOOC
COOHCOOH
HOOC
COOHO
O
HOOC
ORTO
COOHO
O
COOHCO
OSCoA
COOHCOOH
O
OH
OH
COOHCOOH
COOHO
O
-cetoadipato enol lactona
muconolactonaisomerasa
-carboximuconolactonadescarboxilasa
-cetoadipato
-cetoadipato enol lactona hidrolasa
-cetoadipato succinilCoA transferasa
-cetoadipilCoA tiolasa
catecol
cis,cis-muconato
muconolactona
catecol 1,2-dioxigenasa
protocatecuato
-carboxi-cis,cis-muconato
-carboximuconolactona
protocatecuato3,4-dioxigenasa
muconato lactonasa
-cetoadipilCoA
OXIGENASASDioxigenasas
del anillo
abren el anillo
Monoxigenasas
del anillo
de la cadena lateral
Tolueno dioxigenasa
Benzoato dioxigenasa
(Metil)benzoato dioxigenasa (“toluate dioxygenase”)
Catecol 1,2-dioxigenasa
Catecol 2,3-dioxigenasa
Protocatecuato 3,4-dioxigenasa
Tolueno 2-monooxigenasa
Tolueno 3-monooxigenasa
Tolueno 4-monooxigenasa
Xileno monooxigenasa
Fenol hidroxilasa
4-hidroxibenzoato 3-hidroxilasa
COOH CH3
CH3
CH3
Flavoproteína reductasa sulfoférrica
Dioxigenasas del anillo
FAD o FMN
Flavoproteínareductasa
[2Fe-2S]
Ferredoxina
Rieske[2Fe-2S]
Fe++
OxigenasaNADH+H+
NAD+
Derivado dihidroxilado
Compuesto aromático
CH3
COOHCH3
OHOH
H
H
HOOC
OHH
OH
O2 + 2 H+
IA
IB
IIA
IIB
III
4-sulfobenzoato3,4-dioxigenasa
4-clorofenilacetato3,4-dioxigenasa
ftalato4,5-dioxigenasa
2-oxo-1,2-dihidroquinolina8-monoxigenasa
benzoato1,2-dioxigenasa
dibenzofurano4,4a-dioxigenasa
benceno1,2 dioxigenasa
naftaleno1,2 dioxigenasa
FMN
FMN
FMN
FAD
FAD
FAD
FAD
FAD
R
R
[2Fe-2S]
[2Fe-2S]
[2Fe-2S]
[2Fe-2S]
[2Fe-2S]
[2Fe-2S]
Transporte de electronesClase Oxigenasa Ejemplo
Reductasa Ferredoxina ISP ISP[2Fe-2S
(mononuclear]
Dioxigenasas del anillo
Generalmente varias subunidades
Cadena más o menos compleja de transporte de electrones.
La reacción que llevan a cabo es similar.
Especificidad de sustratoSustratos metabolizados por la ruta TOL: tolueno, m-xyleno, p-xyleno, 3-etiltolueno, 1,2,4 trimetilbenzeno, ...
Es una limitación, pero es manipulable.
“Rasgos” que identifican una ruta:Modo de activación del anilloModo de rotura del anillo
A resaltar:
Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (Fe3+)12
P. putida
HOOC
OH
OHCOOHCOOH
HOOC
O2
protocatecuato -carboxi-cis,cis-muconato
Ohlendorf et al., 1988
Orville et al., 1997
C5
C4
C3 C2
C1
C6
O1
O2
4O
3O
Fe3+
Y408
H460
H462
O
O
OO
O
O
+ O2
+ H2O
- H2O
+ H+
O2
OFe3+
Y408
H460
H462
H
Fe3+
Y408
H460
H462
O
O
O
O
- H+
O
O
O
O
Fe3+
Y408
H460
H462
OO
O2Fe2+
Y408
H460
H462
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Fe3+
Y408
H460
H462
O
O
O
O
Y447 OH
Y447 OH
OFe3+
Y408
H460
Y447
H462
H
COOH
COOHHOOC
Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (Fe3+)12
P. putida
Catecol 2,3-dioxigenasa (Fe++)4
P. putida mt-2
Kita et al., 1999
O2
OH
OH OH
CHOCOOH
catecol semialdehído 2-hidroximucónico
Catecol 1,2-dioxigenasa (Fe3+)2
Acinetobacter sp. ADP1
Vetting & Ohlendorf, 1999
- catecol 4-metilcatecol
Degradación anaeróbica de tolueno
Introducción
Catabolismo de hidrocarburos aromáticos se consideraba EXTRICTAMENTE dependiente de O2.
En las rutas descritas, el ataque inicial del anillo requiere SIEMPRE O2 molecular (Mono- y Dioxigenasas).
Últimos 10 años: algunos organismos TAMBIÉN puede degradar Hidrocarburos en ANAEROBIOSIS.
Procesos anaerobios están empezando a mostrar un gran POTENCIAL para la solución de problemas de contaminación ambiental.
Historia
Observación: aromáticos NO se acumulan en la naturaleza en zonas anaerobias.
1985-86 El tolueno es degradado en sedimentos contaminados con hidrocarburos.
1990 Se consiguen los primeros cultivos puros.
Tanto de zonas contaminadas como pristinas
Están taxonómicamente relacionados
Aerobio vs anaerobio
Aerobios: Oxígeno cumple dos funciones:
- Aceptor de electrones (RESPIRACIÓN)
- Sustrato de las dioxigenasas
Anaerobios: - Oxígeno puede sustituirse por OTROS ACEPTORES
- La reactividad del O2 en Oxigenasas es INSUSTITUIBLE
Estos organismos deben de haber desarrollado rutas diferentes, novedosas, independientes del oxígeno.
Reacciones estequiométricas de oxidación anaeróbica de tolueno acopladas a la reducción de diferentes aceptores de electrones.
• Bacterias desnitrificantes :
C7H8 + 7.2 NO3- + 0.2 H+ 7 HCO3
- + 3.6 N2 + 0.6 H2O Gº’ = - 3554 kJ (mol tolueno)-1
• Bacterias sulfatoreductoras :
C7H8 + 4.5 SO4= + 3 H2O 7 HCO-
3 + 2.5 H+ +4.5 HS-
Gº’ = -205 kJ (mol tolueno)-1
• Bacterias reductoras de hierro (III) :
C7H8 + 94 Fe(OH)3 7 FeCO3 + 29 Fe3O4 + 145 H2O Gº’ = -3398 kJ (mol tolueno)-1
• Thauera aromatica K172• Thauera aromatica T1• Azoarcus sp. Cepa T.• Azoarcus tolulyticus Tol4• Azoarcus tolulyticus Td15
Bacterias reductoras de hierro (subclase de proteobacterias)
• Geobacter metallireducens GS15
Bacterias sulfatoreductoras (subclase de proteobacterias)
• Desulfobacula toluolica Tol2• Desulfobacterium cetonicum
Cepas bacterianas disponibles en cultivo puro e identificadas
Bacterias desnitrificantes (subclase de proteobacterias)
Elucidación de la ruta
La activación del sustrato (tolueno) y la rotura en ausencia de O2 es similar en todas las cepas anerobias, independientemente del aceptor de electrones que utilice.
¿Cómo se activa el anillo?
¿Cómo es la apertura del anillo?
Microbiología/ecología de anaerobios.
Métodos
Estudios isotópicos (compuestos marcados con 13C o 14C).Detección e identificación de intermediarios
Inhibodores metabólicosAnálogos del toluenoBajas temperaturas Limitación en aceptores de electrones
Adaptación simultáneaAnálisis de mutantes
En muchos cultivos, se observa acumulación transitoria de BENZOATO y/o BENZOIL-CoA
COOH SCoAO
CONFIRMACIÓN: aparece benzoil-CoA en
Estudios in vitro con extractos crudos libres de células.
Estudios in vivo con sustratos marcados
Se identifica BENCIL-SUCCINATOCOOH
COOHbencilsuccinato
Este compuesto se había considerado inicialmente un producto terminal no metabolizable (dead-end)
Se propone el primer paso de la reacción: ADICIÓN DE FUMARATO
CH3
toluenoHOOC
COOH
COOH
COOHbencilsuccinato
fumarato
Estudios cinéticos in vivo/in vitro apoyan la propuesta
Se identifica la bencilsuccinato sintetasa
Thauera aromatica K172
CH3
CSCoAO
benzoilCoA
tolueno
COOH
COOH
HOOCCOOH
OCOSCoA
COOH
2[H]HSCoA
2[H]
H2O
COSCoA
COOH
COSCoA
COOH
COSCoA
COOH
OH
bencilsuccinato
fumarato
bencilsuccinilCoA
E-fenilitaconilCoA
2-carboximetil 3-hidroxi fenilpropionilCoA
benzoilsuccinilCoA
Bencilsuccinato sintetasa SuccinilCoA:bencilsuccinatoCoA-transferasa
BencilsuccinilCoAdeshidrogenasa
E-fenilitaconilCoAhidratasa
succinilCoAsuccinato
succinilCoA
3-hidroxiacilCoA deshidrogenasa3-oxoacilCoA tiolasa
Se detecta E-fenilitaconilCoA
No requiere ATP
Velocidad aumenta en presencia de succinilCoA como fuente de CoA
Se detecta actividad SuccinilCoA:bencilsuccinato CoA-transferasa
No se han detectado ni todos los intermediarios ni todas las reacciones. Pero cada vez hay más datos que apoyan esta ruta.
Comprobado en detalle en Thauera y Azoarcus (desnitrificantes)
Algunas de las reacciones se han identificados en bacterias sulforreductoras (muy distintas filogenéticamente).
Mecanismo común a todas las cepas (?)
Anillo activado (benzoilCoA)
Rotura: en todos los casos, reacción hidrolítica.Es necesaria una reducción previa del anillo: BenzoilCoA Reductasa(requiere ATP; es MUY específica)
Sigue -oxidaciónLas reacciones hasta la rotura del anillo están DEMOSTRADAS en Thauera y en Rhodopseudomonas
CSCoAO
COOH
CSCoAO
O
benzoilCoA
CSCoAO
CSCoAO
CSCoAO
O
COOH
CSCoAO
HO
2 ATP 2[ADP+Pi] H2O NAD+ NADH+H+
2[H]
2H2O
COOH
SCoAOC
COOH
SCoAOC
SCoAOC
OH
SCoAOC
O
SCoAOC
CH3
SCoAOC
CO2 CH3
SCoAOC
2[H]2[H] H2O
2[H]
1,5-ciclohexadieno1-carboxilCoA
6-hidroxi 1-ciclohexeno1-carboxilCoA
6-ceto 1-ciclohexeno 1-carboxilCoA
3-hidroxipimelilCoA
1,5-ciclohexadieno1-carboxilCoA hidratasa
6-hidroxi 1-ciclohexeno1-carboxilCoA
deshidrogenasa
6-ceto 1-ciclohexeno1-carboxilCoAhidrolasa
BenzoilCoA reductasa
3-hidroxipimelilCoAdeshidrogenasa
2 acetilCoA
COOH
CSCoAO
Rhodopseudomonaspalustris
PimelilCoA
Bencilsuccinato sintetasa222
CH3 CH2
H2CCH
COO-
CCOO-
H
H2CCH
COO-
CCOO-
HH
EnzimaHOOC
COOH
Enzima-H
tolueno
fumarato
bencilsuccinato
Activador(¿ORF?)
’22
Muy sensible a O2
(V = 20 s)
BenzoilCoA reductasa
Fe/SFAD
Benzoil CoAreductasa
2[4Fe-4S]
FerredoxinaDonador de electrones?
CSCoAO
benzoilCoA
CSCoAO
2 ATP2[H]
2[ADP+Pi]
1,5-ciclohexadieno1-carboxilCoA
Especificida de sustrato
CO SCoA
COOH
OH
OH
OH
OHHO
OH
OH
COOH
OHOH
COOH
OH
HO
2 [H]2 ATP
OH
OH
Co-sustratos anaerobios: 2 [H], CO2, ATP, CoA, H2O
Co-sustratos aerobios: O2, H2O
REDUCCIÓN del anilloRUPTURA HIDROLÍTICA
OXIDACIÓN del anilloRUPTURA OXIGENOLÍTICA
benzoil-CoA
resorcinol
fluoroglucinol
catecol
protocatecuato
gentisato
CoASH
SCoAO
O2
O2
COOHCOOH
2O
Intermedioscentrales(aerobios)
Intermedioscentrales(anaerobios)
ANAEROBIOSIS
AEROBIOSIS
SCoAO
H
OHCOOH
NH2
OH
CATECOLOH
OH
COOHNH2
CH CH
COOH
CHO
CH
COOH
CH2OH
CH3
CO COOH
NH
CH2CHNH2
COOH
CH2 CHNH2
CO CH2 CHNH2
NH2COOH
NHCHO
CO
anilina
antraceno
salicilato
antranilato
fenantreno
naftaleno
benceno
fenol
benzoato
benzaldehído
L-mandelato
cinamato
alcohol bencílico
tolueno
benzoilformiato
L-triptófano
formilquinurenina
quinurenina
HO COOH
COOH
OHfenol
OHp-cresol
CH3
Oalcohol
p-metoxibencílico
CH2OH
CH3
OHp-hidroxibenzoato
COOH
tirosina
H2N CHCH2
COOH
p-hidroxibenzoilCoA
C
OH
SCoAO
OH
OH
COOH
OH
protocatecuatoOH
COOH
OCH3
vainillato
OH
CHCHCOOH
cumarato
COOH
Cl3-clorobenzoato
COOH
benzoato
CH2OH
a lcoholbencílico
BENZOILCoA
CSCoAO
fenilalanina
H2N CHCH2
COOH
fenil-oxoacetato
COOH
C O
NH2anilina
CSCoAO
NH2
o-aminobenzoilCoA
CSCoAO
NH2
triptófano
N
CH2
H
CHNH2
COOH
COOHNH2
2-amino benzoato
tolueno
CH3
Características generales de cepas anaerobias que degradan tolueno
Tanto estrictas como facultativas.
Espectro de hidrocarburos aromáticos que son capaces de degradar es MUY REDUCIDO.
tg generalmente mayor que en aerobios.(desnitrificantes son las que tienen velocidad de crecimiento mayor)
Muchas formas de respiración.
Identificación de GENES
Mutagénesis al azar- química- transposones SELECCIÓN de clones inactivos
secuenciación (cromosoma)
Análisis de secuencia
Confirmación - producto génico- Comparación con proteína conocida
Genoteca- Complementación- Búsqueda de actividades
Gran potencial para la solución de problemas de contaminación medioambiental.
Zonas contaminadas con frecuencia son ANAEROBIAS.
OXIGENACIÓN $$
TRANSPORTE no es considerable en áreas grandes.
Considerar recuperación in situ basada en organismos ANAEROBIOS.Adición de otros aceptores de electrones, más solubles (fácil y barato).Degradación lentaAplicable cuando la contaminación sólo afecta al suelo (no hay acuífero amenazado).
Aplicaciones
Oxígeno disuelto en agua saturada: 8,6 mg/lEsto permitiría oxidar
2,8 mg tolueno/l
Concentración saturante de sulfato en agua: 2 g/lEsto permitiría oxidar (anaeróbicamente)
300 mg tolueno/l
Estimaciones energéticas potenciales
Pero
Procesos aerobios son mucho más RÁPIDOS.Organismos aerobios son más versátiles.
Acuíferos
aeróbico
Zona no saturada
contaminante
NRMnR
O2
TiempoFeRSR
Accidente! O2
contaminante
O2NRMnR
contaminante
contaminante
NR O2
FeR
SR
M
O2
NO3-
SO4=
CO2
CH4
CO2
Fe(III) Fe(II)
CO2
SO4= S=
CO2
O2 H2O
CO2
NO3- N2
O2
Zona no saturada
Organización genética y regulación
Regulación
Proteínas
ARN-Polimerasa
ADNGen
Ausencia de sustrato
ADNGen
Presencia de sustrato
Regulador
ARN-Polimerasa
ARNRegulador
+
GenesADN
Gen
Ribosomas
ARN
Proteínas
ARN-Polimerasa
Reguladores
Operón
Proteínas
Reprimido
C
Regulador XylR
Deleción
ConstitutivoActivado por el efector
(desreprimido)
O‘Neill & al., 1998
ADP + Pi
ATP
A
C
ADP + Pi
ATP
C
A
Activación de un regulador
pWW0
P. putida mt-2
• Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca)
• Mutagénesis al azar• Mapeo y localización de los mutantes
(secuenciación)• Análisis bioquímico: identificación de gen-función
CH3 COOH
Krebs
tolueno benzoato
U W C M A B Nxyl
Operón upper
X Y Z L T E FG J Q K HI S R
Operón meta
Organización genética
K
F
B
T
O
Tn4653
IN
X K
Tn4651
B H
FVD
xylR
xylS
D
A
E
E
JC
P
meta
A
D
GQ
F upper
I
E
H
A
G
S
G
CJ
C
MR
JL B
H
pWW0
XhoI
EcoRI
HindIII
Tra/Rep
tnpT
res
tnpS
tnpA
tnpA(Tn4653 )
117 kb
Operón
Operón(Tn4561 )
Regulación de la expresión
Determinar actividades en células creciendo en distintos medios:No-sustrato de la ruta (acetato)Sustratos de la ruta upperSustratos de la ruta meta
Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD
Acetato - - - -Tolueno + + + +Bencilalcohol + + + +Benzoato - - + +3-metilbenzoato - - + + Acetato + Tolueno + + + +
TODAS las actividades son inducibles
Sustratos de la ruta meta sólo inducen a la ruta metaSustratos de la ruta upper inducen tanto a la ruta upper
como a la ruta meta
Mutante PaW210:
Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD
Acetato - - - -Tolueno - - - -Bencilalcohol - - - -Benzoato - - + +3-metilbenzoato - - + +
Ruta upper NO es inducibleRuta meta SÓLO es inducible por sustratos de meta
xylRxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu Pm
upper meta
tolueno
+Reguladores
XylR
+
benzoatos
xylS
XylSEsquema de regulación
?
CH3 COOH
Krebs
tolueno benzoato
Fusiones transcripcionalesHuésped heterólogo (Escherichia coli)
Examinar regulación en AUSENCIA de las rutas
Promotor Gen marcador desprovisto de promotor propio
xylS xylR Pm:: ‘lacZ
E. coli
E. coli (pKT570, pJLR107)
Inductor Actividad -galactosidasa
Ninguno -3-metilbenzoato + Xyleno +
• Xyleno NO tiene que ser metabolizado para activar la ruta meta
Expresión de XylS en P. putida mt-2
Xyleno (XylR) activa la síntesis de XylS
Altas concentraciones de XylS en la células activan la ruta meta en ausencia de inductor
P. putida (pWW0)
Inductor niveles de mRNA de xylS
Ninguno 103-metilbenzoato 10Xyleno 100
xile
no
xylS
3-m
etilb
enxz
oato
ning
uno
+Pr1Pr2 xylRPs1xylSxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu
+
tolueno
+
benzoatos
Ps2Pm
upper meta Reguladores
XylR
XylS
CH3 COOH
Krebs
tolueno benzoato
BenR
32/38
+Pr1Pr2 xylRxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu
+
- -
-
tolueno
+
54
IHF
Ps2
benzoatos
Pm
upper meta Reguladores
54
+
70
+
IHF
-
XylS
XylR
Ps1xylS
Reguladores
• Activa a los promotores Pu y Ps
• Es dependiente de 54 (familia NtrC)
• Reprime su propia expresión
• IHF activa en Pu y reprime en Ps
• En Ps HU es necesaria
• Requiere activación por un efector
• Represión dependiente de la presencia
de otras fuentes de C
XylR
A
C
A B C D
85Pro Ser
135Asp Asn
172Glu Lys
Perfil de efectores
Mutagénesis química
Regulador - 3-MBA 2NT 3-NT
XylR 180XylR6 1150XylR49 1500XylR7 150XylR49-7 70
105019002600900150
1000290035501050950
90450
30001000450
CH3
NO2
CH3
NO2
CH2OH
CH3
Represión catabólica
Crecimiento
Exp
resi
ón
de
la r
uta
u
pp
er
Inductor
Medio rico
Tasa de dilución (h-1)
Exp
resi
ón
de
la r
uta
u
pp
er
Cultivo contínuo(limitación de C)
0.05 0. 5 0.75
Limitación
Exp
resi
ón
de
la r
uta
u
pp
er
Cultivo contínuo (0.05 h-1)
C O2N PS
Sistema PTSCRC?Otro?
54-polimerasa
xylS xylR
XylR
IHFIHF
70-polimerasa
XylR Activa ReprimeIHF Facilita Impide54 +
Efector +
¿ Represor?
Elementos que participan en la regulación
Reguladores
XylS
• Activa al promotor Pm
• Pertenece a la familia AraC
• Es dependiente de 32 y 38
Extremo N-terminal
Extremo C-terminal
1 2 3 4 765
• Requiere activación por un efector
Crecimiento
Exp
resi
ón
de
la r
uta
m
eta
Inductor
32 38
- 39 2FBz 343
Bz 6369 3FBz 6801
2MBz 2724 4FBz 2886
3MBz 13452 2ClBz 141
4MBz 3377 3ClBz 9034
2,3DMBz 6491 4ClBz 2991
2,4DMBz 1737 2,6DClBz 397
2,5DMBz 4093 3,5DClBz 381
2,6DMBz 383 2BrBz 547
3,4DMBz 4630 3BrBz 5372
3,5DMBz 385 4BrBz 1726
Pm :: ‘lacZ
XylS
COOH
X
Efector Actividad Efector Actividad
XylS
• Mutagénesis química de XylS (NTG)
• Selección de resitencia a Tetraciclina:
- Constitutiva.
- Inducible por distintos efectores.
• Identificación del residuo mutado
Extremo N-terminal
Extremo C-terminal
Motivo HTH-1 Motivo HTH-2
1 2 3 4 765
Unión del efector
Pm :: tet
0 2 4 6 8
0
4000
8000
Time (h)
-g
alac
tosi
das
e (M
iller
U) wt
rpoS
rpoH
rpoSrpoH
XylS/Pm:lacZ
Proteínas desnaturalizadas
estress
Promotores dependientes de 32
32
+
Respuesta HS
DnaKJ
NO estress -
Proteínas desnaturalizadas
estress
DnaKJ
Promotores dependientes de 32
32
+
Respuesta HS
0
5
10
15
20
3-metilbenzoato
-G
ala
cto
sid
as
e (M
ille
r U
)
PrpoDhs-lacZ
Respuesta a choque térmico
HS
FtsH
32
38Faseestacionaria
54
IHF
70
Limitaciónanabólica
-
XylS
XylR
(XylR)
Pm+
Pu+
COOH
benzoato
CH3
tolueno
• Plásmido
Transferible
Incidencia sobre otras poblaciones
Tol tiene además 2 transposones!
Inestable%
cél
ulas
TO
L+
100
50
0
tiempo
benzoato
o-xyl
tolueno
Retrotransferencia
Consecuencias
• Represión catabólica: MEZCLAS
• Activación del regulador: INDUCIBILIDADLa inacapacidad de una cepa para degradar un determinado compuesto aromático puede tener dos causas:
- Enzima(s) no reconocen el sustrato- El regulador no reconocen al inductor, no se activa la
ruta
CH3 CH3OH
CH3
OH
OH
o-cresoltolueno 3-metilcatecol
H3C
OH
OH
H
H
CH2OH CHO COOH
H
HOOC OHOH
CH3
OH
CH2OH
OH
CHO
OH OH
COOH
CH3
OH
OHOH
COOH
OH
OH
ORTO
(ORTO)
cis-toluenodihidrodiol
m-cresol
META
alcoholbencílico
benzaldehído benzoato cis-benzoatodihidrodiol
catecol
p-cresol alcoholp-hidroxibencílico
p-hidroxi-benzaldehído
p-hidroxi-benzoato
protocatecuato
META
P. putida mt-2
P. putida F1
B. cepacia G4
R. pickettii PK01
P. mendocina KR1
TOL
TOD
TOM
TBU
T4MO
benABC(DKEF)PbenAbenR PbenR
benzoato XylS
+
pcaK pcaF pcaTB(DC)pcaRPpcaR
-cetoadipato
+-PpcaK PpcaF PpcaT pcaIJPpcaI
++ +
Cromosoma (ruta orto)
P. putida mt-2
catBCAPcatBcatR PcatR
+
-
cis,cis-muconato
COOHO
OCOOHCOOH
O
OH
OH
COOHCOOH COOH
OO
-cetoadipato enol lactona -cetoadipatocatecol cis,cis-muconato muconolactona
ABC1X DR* F E IG HC2tod TS
CH3
Krebs
tolueno
cromosoma
todXFC1C2BADEGIH todSTPtodX PtodS
P-
-P
+
tolueno
Tolueno dioxigenasa +
meta
Reguladores
P. putida F1
TOD
tbm A B C D E F
CH3
tolueno
CH3
o-cresol
OHCH3
OH
OH3-metilcatecol
Tolueno 2-monooxigenasa
tbmABCDEFPtbmAtb4m
tolueno
tbmR
54
++
Regulador Tolueno/benceno 2-monooxigenasa
Tolueno4-monooxigenasa
Burkholderia sp. JS150
TOM
plásmido
B
CH3
tolueno
CH3
m-cresol
CH3OH
OH3-metilcatecol
OHKrebs
Operón meta Tolueno3-monooxigenasa
Fenolhidroxilasa
Proteína demembrana
tbuR tbuS tbuA1UVBVA2CTPtbuA1 tbuX PtbuX
70?54 54
JIKGFEW tbu PtbuW tbuD PtbuD
54ANR?54
tolueno
tolueno
+ +++
meta Tolueno 3-monooxigenasa+
regulador
Fenol hidroxilasa Proteína demembrana
Reguladores
tolueno
Ralstonia pickettii PKO1
TBU
tbu A1U VA2 C T XD R SF E WI K GJ H
cromosoma
tmo A BC
DE FpcuCAB pobA
p-cresol metilhidroxilasa+
p-hidroxibenzaldehídodeshidrogenasa
Tolueno4-monooxigenasa
CH3 CH3
OH
COOH
OH
COOH
OHOH
Krebs
tolueno
p-cresol p-hidroxibenzoato
protocatecuato
p-hidroxibenzoatohidroxilasa
P. mendocina KR1
T4MO
cromosoma
A DB C E GF IHbbs
CO SCoA
CH3
HOOCCOOH
COOH
COOH
benzoilCoA
tolueno
bencilsuccinato
fumarato
acetilCoA + CO2
COOH
CSCoAO
HO
3-hidroxipimelilCoA
fdx
hadoah
dch
bcr
B A DC
benzoilCoA reductasa
Thauera aromatica K172
D C A BS Rtdi bss
reguladores bencilsuccinato sintetasa
?
E C D ?tuttutB
tdiSRPtdiS
P-
-P
bssDCABPbssD
+
tolueno
Bencilsuccinato sintetasaReguladores
Thauera aromatica K172
Características de la regulación
En todos los casos estudiados, las enzimas sólo están presentes cuando las células se cultivan en presencia de tolueno:INDUCIBLES
Sometidos a represión catabólica
Reguladores del tipo de 2 componentes
Expresión reprimida en presencia de O2
AadR (FNR) Activación en respuesta a anaerobiosis
Cuando la cepa puede degradar tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, las rutas y su regulación son distintas.
Anaerobias facultativas
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