cromatografía plana

Cromatografía Plana• Tipos:

– En capa fina

– En papel

Cromatografía en Capa Fina

Se realiza en placas horizontales de vidrio o plástico que se recubren con una capa delgada y adherente de partículas finamente divididas

Placas: Tamaño de 5 x 20 cm, 10 x 20 cm o 20 x 20 cm

Características Convencionales Alta resolución

Grosor 200 – 250 m 100 m

Tamaño de partícula > 20 m < 5 m

Nro de platos 2000 en 12 cm 4000 en 3 cm

Tiempo elución 25 mín 10 min

• Pasos de la cromatografía en capa fina1. Aplicación de la muestra

2. Desarrollo de la placa3. Localización de los analitos

en la placa (visualización o revelado)

Parámetros característicos• Factor de retraso

RF = dR / dM

• Factor de capacidad

k’ = (dM – dR) / dR

k’ = (1 – RF) / RF

• Altura de plato y Número de platos

N = 16 (dR/W)2

H = dR / N

• Variables que afectan a RF

• Grosor de la fase estacionaria• Humedad de las fases móvil y estacionaria• Temperatura• Grado de saturación de la cámara de desarrollo con los

vapores de la fase móvil• Tamaño de la muestra

Como no es posible controlar absolutamente estas variables, se aplica un factor de retención relativo

Rx = (Distancia recorrida por el analito)

(Distancia recorrida por la referencia)

Aplicaciones de la cromatografía en capa fina• Cualitativas

• Cuantitativas

Electroforesis

• Electroforesis convencionalSe realiza sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros.

Es la técnica de separación más ampliamente empleada por biólogos y bioquímicos. No es una técnica instrumental

• Electroforesis capilar

EN LA ELECTROFORESIS LA SEPARACIÓN OCURRE EN UNA SOLA FASE

Electrofóresis Capilar

Es un proceso en el cual las especies cargadas se separan en función de su distinta velocidad de migración, en el seno de una solución amortiguadora a través de la cual se aplica un campo eléctrico.

Instrumentación

• La velocidad de una especie dada depende de su carga y de su tamaño, es decir la separación se basa en las diferencias en la relación carga-tamaño entre las especies presentes en la muestra. Cuanto mayor es esta relación más rápido migra el ión en el seno del campo eléctrico

v = µo E

E: campo eléctrico

• La movilidad electroforética ( µo) es directamente proporcional a la carga eléctrica del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento

• Instrumentación• Longitud del capilar: 40 - 100 cm• Diámetro interno: 10 – 100 m• Material : sílice fundida• Capacidad del capilar 4 a 5 µL• Volumen de muestra: pocos l

Flujo de fase móvil = flujo electroosmótico

Se caracteriza por tener un perfil casi plano

Esta característica del flujo electroosmótico hace que no contribuya de manera significativa al ensanchamiento de banda

La velocidad del flujo electroosmótico es mayor a la velocidad de migración electroforética de los iones individuales

• Existen variaciones de la electroforesis capilar como la cromatografía micelar electrocinética capilar que se aplica a analitos neutros