criobiologia del semen
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Criobiología del semen
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Criobiología del semen
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Criobiología del semen
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Criobiología del semen
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© CRIOBIOLOGIA DEL SEMEN (EN ANIMALES DOMESTICOS Y AVANCES EN ALPACAS)
Autores:
Ing. Brian J. Ordoñez Mulato
briansiempre@hotmail.com
Obra compilada, editada y publicada en la Universidad Nacional de Huancavelica –
E.A.P. de Zootecnia.
1ra Edición, Julio 2009
Impreso en Perú – Hvca
Criobiología del semen
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PREÁMBULO
La presente publicación nace con toda la intención de
hacer una difusión e incentivar tanto a estudiantes, docentes
universitarios u otros investigadores, interesados en
sumergirse al campo de la criopreservación de gametos de
alpaca.
La mayor parte del contenido del presente posee
fundamentos teóricos compilados sobre criobiología,
explicaciones y efectos en las células reproductivas
masculinas. En la segunda parte se mencionan los materiales,
métodos y procedimientos que se tomaron en cuenta para
realizar un estudio en alpacas, así también se muestran
resultados, que dan luces para poder concretar esta
biotecnología, desde luego sabemos que su importancia radica
para emplearse en las comunidades alpaqueras, mediante la
inseminación artificial u otra biotecnología similar; Así para
muchos que desconocíamos, podemos entender que la razón
por la cual no se efectúa la inseminación artificial en esta
especie es no poseer semen criopreservado, de ahí nace la
investigación y la presente publicación.
Criobiología del semen
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Criobiología del semen
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AGRADECIMIENTOS
Es necesario agradecer a personas que por sus
diversos aportes muy importantes fue posible concluir
este estudio: Álvaro López, Teodosio Huanca M. y
Mario L. Gonzáles C, INCAGRO – Wilfredo Huanca.
Criobiología del semen
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Criobiología del semen
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CONTENIDO
ÍNDICE
PREAMBULO
INTRODUCCIÓN
1.1 ASPECTOS GENERALES. 12
1.2 Criobiología del semen. 12
1.3 Factores que afectan la viabilidad espermática durante el proceso de
criopreservación. 13
1.3.1 Cambios de volumen. 13
1.3.2 Shock de frío. 13
1.3.3 El crioprotector y el estrés celular. 14
1.3.4 Estrés osmótico. 14
1.4 Alteraciones a los espermatozoides durante el proceso de
Criopreservación. 15
1.5 Efecto de la criopreservación sobre el espermatozoide. 16
1.5.1 Crio daño sobre la bicapa lipídica. 16
1.5.2 Crio daño sobre la integridad mitocondrial. 17
1.6 Procesamiento para el congelado del semen. 18
1.6.1 Los diluyentes o dilutores. 18
1.6.2 Refrigeración. 19
1.6.3 Adición del crioprotector. 19
1.6.4 Envasado o empacado del semen. 20
1.6.5 Congelamiento de semen. 20
1.6.6 Descongelamiento de semen y evaluación post
congelación. 21
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Del lugar. 23
2.2 Materiales y equipos. 23
2.2.1 Materiales. 23
2.2.2 Reactivos o material químico. 24
2.2.3 Equipos. 24
2.4 Metodología. 25
2.4.1 Preparación seminal pre congelamiento 25
2.4.1.1 Obtención de la muestra de semen. 25
2.4.1.2 Evaluación macroscópica y microscópica del semen. 26
2.4.1.3 Preparación del dilutor. 26
2.4.2 Preparación y proceso del congelamiento seminal. 27
2.4.2.1 Proceso de refrigeración y agregado del
crioprotector. 27
2.4.2.2 Proceso de congelamiento. 28
2.4.3 Evaluación post congelamiento. 30
2.4.4 Análisis estadístico. 30
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Criobiología del semen
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3.1 Evaluación seminal post congelamiento. 31
3.1.1 Resultado de motilidad del espermatozoide post congelamiento. 31
3.1.2 Resultado de mortalidad del espermatozoide post congelamiento. 31
3.1.3 Prueba de contrastes ortogonales para motilidad y mortalidad
espermática post congelamiento. 33
CONCLUSIONES 37
RECOMENDACIONES 37
COMENTARIO 37
REFERENCIAS 39
Criobiología del semen
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INTRODUCCIÓN
Para mejorar la calidad de fibra de las alpacas (Vicugna pacos), en este momento se
cuenta con un moderno medio de mejoramiento genético que actualmente nos brinda el uso
de la biotecnología reproductiva como es la inseminación artificial con semen fresco
diluido (INIA, 2004), el cual tiene la ventaja de efectuar con un solo eyaculado la
posibilidad de inseminar un gran número de hembras pero, sin embargo se tiene el limitante
de que el donador de semen tiene que estar en el lugar de obtención; De lograr un protocolo
de congelamiento seminal ideal en alpacas mediante un conservador o crioprotector viable,
el semen congelado de esta especie podría ser considerado al presente una alternativa seria
para fines de mejoramiento genético, pues brindaría una mayor rapidez al progreso genético
a nivel de los rebaños de nuestro país, así mismo ayudaría a obtener ejemplares de alto
valor genético; Pero las investigaciones realizadas concernientes a este tema son muy pocas
por lo que hasta ahora no se cuenta con protocolo definido.
En el Perú la producción de alpacas es la fuente de vida de miles de familias que
directa e indirectamente se benefician económicamente, así mismo contribuye al país
aportando el 2% del PBI, su demanda es importante debido a que actualmente se aprecia en
el extranjero como una fibra exótica y sus características textiles de calidad hacen que tenga
un precio mayor frente a la lana de ovino en el mercado mundial.
Dado el valor económico actual y su demanda en el mercado exterior de la fibra
hace que su producción sea preponderantemente valiosa, es por ello que recién en los
últimos años se esta dando el interés respectivo acerca de la finura de la fibra, pues según
estudios realizados en nuestro país se cuenta con una alta producción de fibra gruesa.
En nuestros días se cuenta con el 87% de la población a nivel mundial, ventaja que
debe ser aprovechada por ahora, no solo el Perú es el único interesado en el desarrollo de
alguna biotecnología reproductiva como la inseminación artificial, congelación de semen,
transferencia de embriones, entre otros, que funcionan muy bien en otras especies, uno de
los más grandes interesados es Australia, que ya para el 2005 contaba con 60,814 alpacas
según (Reyna, 2005) y últimamente está invirtiendo mayores recursos económicos en
investigación de este tipo, además, están EEUU, Gran Bretaña, Nueva Zelanda y Alemania,
y los países hermanos de Sudamérica el caso de Chile principalmente.
En ese sentido la presente investigación tiene como objetivo evaluar el efecto
crioprotector que brindan el glicerol y el etilen glicol sobre la motilidad y mortalidad del
espermatozoide de alpaca al post congelamiento.
Los autores
Criobiología del semen
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.
Criobiología del semen
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1. ASPECTOS GENERALES.
El uso de la inseminación artificial es considerado como un medio para
acelerar el mejoramiento genético de los rebaños, haciendo factible que unos
cuantos machos seleccionados de buena calidad puedan donar semen para inseminar
artificialmente a cientos de hembras dentro de su vida reproductiva y así lograr
mejores generaciones.
La inseminación artificial es la técnica individual más importante creada
para el mejoramiento genético de animales y actualmente se práctica en vacunos,
porcinos, ovinos y otras especies (Hafez, 1993).
En las alpacas la mejora genética es lenta en comparación a otro ganado,
debido a su fisiología reproductiva que limita la aplicación de alguna biotecnología
reproductiva la misma que funciona muy bien en otras especies, una de estas
limitantes es el largo periodo de gestación, otra restricción es que los animales
machos inician la pubertad al primer año de edad y tienen problemas en la
liberación completa del pene que les impide realizar una copula normal y recién a
los 3 años el 100% de animales se encuentran libres de la adherencia pene-
prepucial, por tal razón sugieren trabajar con animales mayores (Reyna, 2005).
También hay otro problema importante pero ya casi superado acerca de la
obtención de semen de buena calidad, pues se ha intentando diversos métodos por
muchos años, el empleo del maniquí y una vagina artificial modificada que en la
actualidad viene a ser el mejor método utilizado, con este procedimiento la copula
es similar a la monta natural durando en promedio 20 minutos según Tibary et al,
(1999), como se sabe la monta natural es prolongada sosteniendo aproximadamente
25 minutos (Bustinza 2001).
Acerca de las características seminales se indica que los eyaculados
colectados de 3 o 4 días tienen un mejor volumen y concentración. El volumen de
semen varía de acuerdo a la técnica de obtención utilizada, a la individualidad y
entre una colección a otra, tal es así que oscila de 0.8 ml a 1.0 ml y
excepcionalmente se ha reportado 12 ml (Bustinza, 2001). Con respecto a la
concentración hay una variación extensa desde 22.5 a 875 millones/ml (Vaughan et
al, 2003). Así también según Sumar y Leyva, (1981) indica que en el semen de
alpaca no hay motilidad masal por la baja concentración relativa de espermatozoides
y porque se ha observado una motilidad progresiva individual, esta última
observación obedece a que el plasma seminal es altamente viscoso por lo que el
movimiento de los espermatozoides es lento en cuanto a su desplazamiento
comparado con el ovino y bovino. A ello se agrega que la cuantificación promedio
de la motilidad individual en semen fresco es de 85% con rangos de 69% a 91%
(Bustinza, 2001).
CRIOBIOLOGÍA DEL SEMEN.
La criopreservación y su empleo para la inseminación artificial han causado
un gran impacto sobre la reproducción animal. Innumerables crías de diferentes
especies han nacido a partir del uso del semen congelado. Sin embargo
constantemente se modifican los protocolos de congelación a fin de obtener mejores
resultados en relación a la supervivencia y fertilidad del semen congelado. Múltiples
Criobiología del semen
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factores afectan la sobrevivencia de los espermatozoides al descongelamiento como
la concentración espermática en el diluyente, el envasado, la composición del
diluyente empleado, el shock de frío entre otros (Stornelli et al, 2005).
Durante el proceso de congelación y descongelación se pierde
aproximadamente el 50% de la población inicial de espermatozoides debido a los
efectos de criopreservación sobre las membranas celulares, el citoesqueleto, aparato
locomotor y núcleo del espermatozoide. Se considera que el principal sitio de daño
asociado a los cambios de temperatura son las membranas espermáticas,
considerándose a esta causa como la más asociada a la reducción de la fertilidad del
semen congelado durante los procesos de refrigeración, congelación y
descongelación. (Watson, 1995).
La optimización del protocolo de congelación debe contemplar no solo la
obtención de un alto número de espermatozoides sobrevivientes sino también la
habilidad funcional de esta población (Stornelli et al, 2005). La eficiencia para la
congelación del semen varía entre las especies y entre machos individuales de una
misma especie. Estas variaciones se relacionan con las características biofísicas y
bioquímicas de las membranas espermáticas (Hafez, 2002).
FACTORES QUE AFECTAN AL ESPERMATOZOIDE DURANTE EL
PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN.
Para obtener buenos resultados de supervivencia espermática y fertilidad de
los espermatozoides es necesario comprender a que tipo de estrés se ven sometidos
los espermatozoides durante los procesos de congelación y descongelación así como
la manera en que las células responden a las agresiones físico-químicas y
medioambientales (Stornelli et al, 2005).
CAMBIOS DE VOLUMEN.
Cuando los espermatozoides son congelados y descongelados se ven
sometidos a varios ciclos de deshidratación e hidratación lo que resulta en
cambios significativos de volumen. El primer cambio de volumen ocurre
cuando la célula es colocada dentro de un diluyente, el cual contiene
sustancias crioprotectoras como glicerol, y posteriormente cuando la
solución es congelada. Mas tarde ocurren cambios de volumen cuando la
solución es descongelada. Estos cambios de volumen están asociados a
cambios de la concentración de iones y electrolitos en las soluciones intra y
extra celulares. La forma en que ocurren estas modificaciones determinan la
mayor o menor capacidad de la célula para soportar el daño a la que se ve
sometida. El cambio de volumen es solo uno de los factores de estrés a los
que la célula se ve sometida durante el proceso de criopreservación (Leivo y
Dradey, 1999).
SHOCK DE FRÍO.
Es bien conocido que el enfriamiento rápido del semen entre 30 ºC y
0 °C induce un estrés letal en algunas células, el cual es proporcional a la
tasa de enfriamiento. Es así que el enfriamiento en este rango de temperatura
debe ser realizado cuidadosamente (Watson, 1981). Este fenómeno es
Criobiología del semen
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conocido como shock de frío y puede apreciarse durante el enfriamiento de
espermatozoides de cualquier especie. En el porcino este fenómeno se
manifiesta inmediatamente después de la eyaculación haciéndose la célula
cada vez más sensible al mismo en las horas siguientes (Pursel et al, 1978).
El estrés de la membrana puede continuar por debajo de 0 °C sin que
el cambio de fase sea completo, sin embargo es bien conocidoque los
cambios de fase ocurren, en su mayoría, entre los 5 °C y 15°C (Dobrins et al,
1993).
En un estudio sobre la función de permeabilidad de la membrana del
espermatozoide al criopreservar semen de verraco, se ha demostrado la
importancia de la composición lipídica del medio ambiente donde se
encuentra la membrana plasmática durante el enfriamiento, esto relaciona al
componente lipídico en la participación del paso de moléculas en la
membrana e interviene en el mecanismo del daño celular (Pettit y Bhur,
1998).
El agregado de preparaciones lipídicas purificadas a los
espermatozoides reduce significativamente el shock de frío y el daño
producido por la congelación – descongelación (Graham, 1987), por lo que
usualmente se incluye yema de huevo en la preparación de los diluyentes
debido a que los fosfolípidos y las lipoproteínas de baja densidad poseen un
efecto protector contra el shock del frío (Quinn et al, 1980).
EL CRIOPROTECTOR Y EL ESTRÉS CELULAR.
El crioprotector permite mantener una mayor proporción de agua
líquida intracelular a bajas temperaturas y en consecuencia una menor
concentración de electrolitos posibilitando la supervivencia celular durante
el proceso de criopreservación. Sin embargo, estos compuestos y los
diluyentes producen un estrés transitorio pero importante sobre la membrana
plasmática de los espermatozoides (Stornelli et al, 2005).
La magnitud de este hecho esta íntimamente relacionado con la
capacidad penetrante de los crioprotectores (Gao et al, 1993). El
crioprotector de elección es comúnmente el glicerol, el cual produce una
alteración osmótica. A la vez se ha observado que la hiperosmolaridad
producida por este compuesto posee un efecto estimulador para la reacción
del acrosoma (Aitken et al, 1983).
Además del glicerol existen otros compuestos que poseen
propiedades crioprotectoras como por ejemplo el etilen glicol,
propilenglicol, dimetil sulfóxido o metanol (Navarro et al, 2004).
ESTRÉS OSMÓTICO.
El estrés, inducido por la formación de cristales de hielo está
asociado a los cambios en la presión osmótica de la fracción no congelada
(Watson, 1988). Cuando una solución es enfriada por debajo del punto de
congelación los cristales de hielo se integran y el agua pura se cristaliza
formando hielo. Los solutos permanecen disueltos en la fracción de agua
líquida y por lo tanto la presión osmótica de la solución aumenta. La
Criobiología del semen
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proporción de agua cristalizada como hielo y la presión osmótica de la
solución restante depende de la temperatura, velocidad de descenso de la
misma y el volumen de la fracción no congelada (Stornelli et al, 2005).
Por tal sentido la duración de la exposición a estos eventos debería
minimizarse para lograr una óptima sobrevivencia, implicando entonces que
el enfriamiento celular debería ser rápido. Sin embargo la tasa de
enfriamiento debe ser suficientemente lenta como para permitir la salida de
agua, y prevenir la formación de cristales de hielo intracelular, lo cual es
letal para la célula (Holt y North, 1991). Así también refieren que el
porcentaje de células que sobrevive a un proceso de congelación esta
determinado por la sensibilidad al estrés osmótico durante la adición y
remoción de crioprotectores durante el enfriamiento y el recalentamiento
(Stornelli et al, 2005). Las células espermáticas poseen mayor permeabilidad
al agua que otros tipos celulares (Noiles et al, 1993). Si bien puede haber
diferencias entre especies en la sensibilidad del espermatozoide a la
criopreservación, el eyaculado es heterogéneo habiendo una resistencia
variable al estrés osmótico entre las células espermáticas (Katkov et al,
1998).
Los signos de estrés manifestado por los espermatozoides luego de la
descongelación no se relacionan solo con el estrés osmótico sufrido en el
descongelado sino también con el estrés sufrido durante el congelado (Holt y
North, 1991). Es por eso que cada tipo celular posee una velocidad óptima de
congelación que garantiza su supervivencia luego de la criopreservación. Si
la velocidad de congelación es demasiado rápida o demasiado lenta el estrés
producido por el proceso de criopreservación aumenta. Mazur, (1984) hizo
un calculo empírico acerca del congelamiento de las células espermáticas
estimando un rango de 15 a 60 °C/minuto como la velocidad optima de
congelación que permite mayor probabilidad de obtener una mejor tasa de
sobrevivencia celular.
ALTERACIONES A LOS ESPERMATOZOIDES DURANTE EL PROCESO DE
CRIOPRESERVACIÓN.
Uno de los efectos comprobados producidos durante el proceso de
criopreservación es la disminución de la motilidad del espermatozoide (Hafez,
2002; Stornelli et al, 2005).
En tanto que una pequeña parte de la población celular exhibe un
movimiento progresivo vigoroso, la mayoría de las células muestran variables
grados de alteración de la motilidad post congelado en comparación con la
motilidad del semen fresco. Este hecho puede estar íntimamente relacionado con la
pobre capacidad fecundante del semen congelado. En un estudio con semen
criopreservado realizado en humanos se encontró que tanto la motilidad progresiva
como el vigor del movimiento celular eran factores relacionados estrechamente con
la fertilidad (Kelly et al, 1997).
Criobiología del semen
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Si bien, estudios de fertilización in vitro han demostrado que los
espermatozoides criopreservados son capaces de fertilizar, solo algunos acceden al
proceso pero muchos otros estan estructuralmente afectados y son incapaces de
fertilizar (Ellinton et al, 1999).
EFECTO DE LA CRIOPRESERVACIÓN SOBRE EL ESPERMATOZOIDE.
Una vez que los crioprotectores ingresan al citoplasma a favor del gradiente
de concentración, el fluido intracelular puede ser enfriado a temperaturas entre -5 y -
15, sin que ocurra la formación de cristales hielo, debido a que estas sustancias
disminuyen el punto de congelación por medio de la interacción entre las moléculas
de agua, a estos rangos de temperatura los cristales de hielo comienzan a formarse
en el medio externo. Cuando las temperaturas descienden por debajo de estos
rangos, se inicia la formación de cristales de hielo intracelular (Vincent et al, 1998).
La temperatura a la cual deben ser incorporados los crioprotectores a la
solución de semen y el tiempo de exposición celular, dependen del grado perjudicial
del crioprotector principalmente en volúmenes excesivos y de su velocidad de
difusión a través de la membrana plasmática. Esta difusión puede verse afectada por
el descenso de la temperatura, ya que durante este proceso la membrana celular
aumenta la proporción de colesterol con el propósito de lograr mayor estabilidad
mecánica; sin embargo, este aumento del colesterol también disminuye la
permeabilidad de la membrana a pequeñas moléculas, pudiendo afectar la
penetración del crioprotector en la célula de una manera efectiva (Spinel, 2002).
Los mecanismos de acción especifica de los agentes crioprotectores a nivel
celular no están bien explicados, al parecer la interacción ocurre en el ámbito de la
bicapa lipídica específicamente en la interacción con los fosfolipidos, a lo indicado,
no solo es importante establecer como interactúa el crioprotector, sino que es
necesario y mas imprescindible determinar el efecto perjudicial de estos para poder
tomar el control celular (Medina et al, 2005).
1.5.1 CRIO DAÑO SOBRE LA BICAPA LIPÍDICA
Las propiedades de la membrana están dadas por la proporción
lipídica de un 70% de fosfolipidos, 25% de lípidos neutros (principalmente
colesterol), y 5% glicolípidos (Muller et al, 1994). Los fosfolipidos al formar
la mayor parte de la membrana, pueden conferir gran fluidez, pero también
mayor inestabilidad, que es contrarrestada por las cantidades variables de
colesterol (Holt, 2000).
Se ha sugerido que el estrés térmico sobre la membrana plasmática
durante el enfriamiento resulta en la transición de la fase líquida a una fase
de gel en los fosfolipidos de la membrana, como resultado de esta transición,
las proteínas integrales de la membrana pueden ser excluidas de los
dominios de los lípidos de la fase de gel y son agrupadas, algunas veces de
forma irreversible. La actividad de muchas enzimas asociada a las
membranas se reduce, así como la tasa de difusión de proteínas por
lateralización dentro del plano de la bicapa, reduciendo de este modo la
eficiencia de los procesos relacionados con la difusión (Labbé et al, 1997).
Criobiología del semen
17
Durante la exposición al frío se ha observado la reducción en la
proporción de ácidos grasos saturados e incremento en la proporción de
ácidos grasos insaturados. Cuando aumenta la temperatura, la relación de los
fosfolipidos y los contenidos de colesterol se correlacionan positivamente;
estos cambios originan una reorganización de la membrana, lo que ayuda a
la célula a sobrevivir a las nuevas temperaturas (Labbé et al, 1997).
Se ha demostrado que un largo periodo de aclimatación térmica
induce a algunas modificaciones en los patrones de ácidos grasos de los
fosfolipidos de la membrana plasmática de los espermatozoides. Sin
embargo, esto podría ser el resultado del cambio fisiológico que sufren los
animales para mantener la fluidez de la membrana, donde la composición de
los ácidos grasos y la proporción de moléculas de colesterol se modifica en
función de la temperatura del ambiente. Se observó una mejor resistencia a
la criopreservación, los espermatozoides que se mantuvieron bajos en
contenidos de colesterol en la membrana plasmática, esta baja cantidad de
colesterol se correlacionó con una mejor capacidad de fertilización de los
espermatozoides después de la criopreservación (Spinel, 2002).
1.5.2 CRIO DAÑO SOBRE LA INTEGRIDAD MITOCONDRIAL
La integridad mitocondrial juega un papel importante. Los
procedimientos de congelación y descongelación inducen una disminución
en la producción de ATP, la cual varía con el crioprotector utilizado. Esta
disminución puede resultar del estrés osmótico durante la adición del
crioprotector o el congelamiento del agua externa. Las diferencias entonces,
en la capacidad entre el glicerol y el metanol para prevenir la disminución en
la síntesis de ATP, pueden ser parcialmente explicadas por el hecho de que
el medio de congelación con glicerol permite los más altos valores de
osmolaridad y con el metanol los más bajos (Ogier et al, 1997).
Los cambios morfológicos determinados por microscopia electrónica,
revelan daños en la pieza media del espermatozoide en la fase de post
descongelación, conllevando a la formación de protuberancias o
ensanchamientos de la membrana en esta zona como resultado de la perdida
de la envoltura densa de las mitocondrias. La formación de protuberancias
también ha sido determinada en el flagelo y la cabeza del espermatozoide,
con pérdida de cromatina nuclear, dándose una pérdida de la funcionalidad
mitocondrial y una disminución de las reservas de energía necesarias para el
movimiento flagelar del espermatozoide, comprometiendo la
osmoregulación celular (Yao et al, 2000).
Aparentemente la toxicidad de los crioprotectores está dirigida sobre
el estado bioenergético del espermatozoide, interfiriendo con el balance
entre síntesis y utilización de ATP, ya que frente a una deficiencia de ATP,
durante la congelación, el control metabólico sobre los procesos celulares
dependientes de iones podría verse afectado, ocasionando una inapropiada
Criobiología del semen
18
activación de fosfolipasas y proteasas afectando un daño celular irreversible
(Holt, 2000).
1.6 PROCESAMIENTO PARA EL CONGELADO DEL SEMEN.
1.6.1 LOS DILUYENTES O DILUTORES.
Este medio debe realizar la función de aporte de nutrimentos como
una fuente de energía, proteger contra el efecto nocivo del enfriamiento
rápido, ser amortiguador de tal manera que impidan los cambios
perjudiciales de pH, mantener la presión osmótica apropiada y el balance
electrolítico, inhibir la proliferación electrolítica, incrementar el volumen del
semen y proteger a las células durante el congelamiento (Hafez, 2002),
generalmente a este primer medio de solución se denomina diluyente A.
Prácticamente, todos los diluyentes para semen líquido o congelado
tienen yema de huevo o leche descremada o una combinación de estas dos,
como componentes básicos. Es posible que el suero sanguíneo al igual que la
yema de huevo ofrezca una protección a la membrana del espermatozoide al
congelamiento, que consistiría en una interacción de la superficie celular
más con los lípidos que con las proteínas, señalando que el suero posee una
inclusión proteínica de 7 gr/ml (Palacios y Zarco, 1995).
A continuación se mencionan varios ejemplos del empleo de
dilutores en diferentes especies. En semen de carnero Angulo et al, (1999)
utilizaron un dilutor conformado por tris 36.05 gr, ácido cítrico 20.2 gr,
fructuosa 14.88 gr, agua bidestilada 100 ml y 20% de yema de huevo. En el
caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) empleó un dilutor compuesto de
74 partes de citrato de sodio, 25 partes de yema de huevo, 1 parte de glucosa,
1000 UI/cc de penicilina y 500 mg/cc de estreptomicina. Por otro lado Cueto
et al, (2003) en una dilución de semen de caprino emplearon 10% de leche
descremada en polvo (50 ml de agua bidestilada y 5 gr de leche), glucosa 1%
(0.5 gr de glucosa), 1 gr de penicilina y estreptomicina (1000 UI) por
mililitro de diluyente, en caso del caprino antes de unir al dilutor, se debe
proceder a lavar el semen, es decir separar del plasma seminal mediante
centrifugación a 2000 rpm/10 minutos. En otro estudio con fines de
congelación se utilizaron dilutores para semen de cerdo compuesto a base
yema de huevo y lactosa, previo a esta se mantuvieron a 15 °C/24 horas y se
centrífugo (250gr) a 1500 rpm/10 minutos (Gosálvez et al, 2003).
Antes de la dilución debe mantenerse a 30°C para evitar el shock
térmico, se extrae una porción de semen para su evaluación y el resto puede
mezclarse con tres o más partes de diluyente a 30°C, en toros el semen no
congelado puede diluirse en una proporción de 200 a 300 veces (Hafez,
2002).
Bravo, (1998) indica que en camélidos, se viene aún investigando
dilutores adecuados para trabajos de congelamiento. Los dilutores que
mantuvieron mayor número de espermatozoides vivos, en orden de
importancia según Vaughan et al, (2003), son: tris tamponado 70%; tryladil
65%; yema de huevo, glucosa y citrato 8%.
Criobiología del semen
19
Así también Aller et al, (2003) utilizaron citrato sódico, yema de huevo,
glucosa, penicilina, sulfato de estreptomicina para emplearlo en semen de
llama.
1.6.2 REFRIGERACIÓN.
Luego de la mezcla realizada se enfría gradualmente hasta 5°C en
todas las especies excepto en el verraco que suele mantenerse a 15°C. El
enfriamiento debe ser lento, tomando por lo menos 1 hora, este proceso suele
realizarse protegiéndose con un recipiente en una camisa de agua para
amortiguar el shock térmico (Hafez, 2002).
El enfriamiento se realiza a razón de 2°C cada 3 minutos y
permanece a 5°C durante 45 a 60 minutos antes de proceder al agregado del
diluyente B que contiene el crioprotector (Cueto et al, 2003).
Similarmente Angulo et al, (1999), sometieron el semen de carnero
en un recipiente de 22°C e introdujeron a refrigeración a 0°C durante 2
horas, tiempo suficiente que paulatinamente alcanza 5°C, afirma que no
sufre choque térmico con este procedimiento. Del mismo modo Medrano et
al (2004), refrigeraron pajillas con semen de caprino hasta 5 ºC por dos
horas. El procedimiento no tiene diferencia entre pajuelas, pellets u otro, en
cuanto a refrigeración.
1.6.3 ADICIÓN DEL CRIOPROTECTOR.
Por lo general se añade el crioprotector al semen después de enfriarlo
y esta incorporación debe ser por etapas lo que permite una mayor
proporción de espermatozoides sobrevivientes (Gao et al, 1993). La cantidad
final del crioprotector en las diferentes especies puede variar desde 5% en
medios de yema de huevo o azúcar a 10% en leche. En caso del verraco se
utiliza 2% de glicerol (Hafez, 2002).
Para el caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) emplearon 14% de
glicerol en la fracción B a base de yema y citrato, es decir quedando una
concentración final de 7% de glicerol, este proceso es general en la
criopreservación de semen, y para el periodo de estabilización un tiempo
entre 3 a 6 horas.
Angulo et al, (1999) mencionan, que para poder congelar semen de
carnero debe utilizarse 5% de glicerol más un dilutor a base de tris, yema de
huevo y ácido cítrico.
Otro estudio en semen de cerdo fue realizado por Gosálvez et al,
(2003) quienes utilizaron 4% de glicerol mas yema de huevo y lactosa,
dejando una proporción final de 2% del crioprotector, que por lo general la
concentración de glicerol es baja en esta especie.
Cueto et al, (2003) trabajando con semen de caprino usó 6% de
glicerol, agregado que fue en tres partes cada 10 minutos, teniendo en cuenta
un pH entre 6.8 y 7.2.
Hafez, (2002) afirma que la mezcla del semen y el diluyente en
cualquier especie se debe dejar reposar durante varias horas antes de
Criobiología del semen
20
congelarla, para permitir que las células espermáticas se equilibren con el
diluyente, 4 a 6 horas como óptimo dependiendo del medio utilizado.
Mientras Medrano et al, (2004) emplearon solo 2 horas antes de
someter a congelamiento.
1.6.4 ENVASADO O EMPACADO DEL SEMEN
Se pueden realizar de 3 formas; a) En pajillas de 0.25 a 0.5 ml de
semen diluido. b) En ampolletas de vidrio de 0.5 a 1 ml que son recipientes
estériles que se pueden rotular, llenar y sellar de manera automática y c) Por
píldoras o pellets de 0.1 a 0.2 ml, que requieren poco espacio cuando se
almacena masivamente y es una forma económica, su principal desventaja es
la dificultad para identificar cada píldora (Hafez, 2002).
Por otro lado, en un estudio con semen de carneros se demostró que
en pajillas de 0.25 ml puede envasarse el semen con 300 x 106
espermatozoides motiles (Angulo et al, 1999).
1.6.5 CONGELAMIENTO DEL SEMEN.
Olivares y Urdaneta, (1985) precisaron, que posterior al periodo de
equilibrio con el crioprotector debe procederse a precongelar las pajuelas de
semen, en vapores de nitrógeno a –120 °C por 10 minutos y luego introducir
a –196 °C.
Para realizar el congelamiento de semen de carnero Angulo et al,
(1999) sometieron a 4.5 cm sobre el nivel superior del nitrógeno durante 10
minutos.
Hafez, (2002) menciona que en caso de las pajillas suelen congelarse
en vapores de nitrógeno y almacenados a –196°C, a menudo las ampolletas
se congelan a razón de 3°C/minuto hasta –15 y este desciende hasta llegar a
–150 °C, es ahí entonces donde se depositan a –196°C. Para el método de
píldoras se colocan gotas en un volumen aproximado de 0.1 ml, en huecos de
forma hemisférica hechos en bloques de hielo seco (-78 º C), este
procedimiento muestra buena supervivencia al descongelado.
En otra investigación con semen de caprino se demostró que es
posible el congelamiento en vapores de nitrógeno en pajillas o en pastillas
(pellets) en hielo seco en volúmenes de 0.2 ml por un tiempo de 1 a 2
minutos, por cualquiera de estos métodos se conservan en termo de
nitrógeno líquido (Cueto et al, 2003).
Criobiología del semen
21
Fig. Nº 01 : Espermatozoides en criopreservación.
1.6.6 DESCONGELAMIENTO DEL SEMEN Y EVALUACIÓN POST
CONGELACIÓN.
Después de congelarse, los espermatozoides no resisten un segundo
congelamiento, pues no sobreviven como los que han sido congelados en
una primera oportunidad por ello es necesario asegurarse la utilización del
semen congelado (Stornelli et al, 2005).
La motilidad espermática es la primera característica de evaluación y
una de las principales que se realiza, pues es un importante indicador de vida
del espermatozoide que se realiza antes y después de la criopreservación
(Hafez, 2002).
Se estima que entre el 40% y 50% de la población de
espermatozoides sobreviven al proceso de congelación–descongelación.
Así bien, parte de la población de espermatozoides que sobreviven
han sufrido daños que les convierte en incapaces de fecundar (Watson,
2000).
Cuando el semen criopreservado se descongela, se transfiere del
tanque de nitrógeno a 37°C durante 3 a 5 minutos o a una unidad de
descongelamiento automático (Hafez, 2002).
Cueto et al, (2003) por otro lado afirma que la evaluación de un 10%
de las dosis congeladas en semen de caprino es importante, lo cual debe ser
sometida a varias observaciones y poseer una motilidad masal al
descongelamiento superior al 30% y un vigor del movimiento igual o
superior a 2.5 según escala (1 - 5) enunciada por Hafez, (2002).
Se han descongelado pajillas de semen de vacuno a 37°C con buenos
resultados, mientras que las píldoras se descongelan mejor en un medio
líquido a 40°C, en condiciones prácticas de campo (Hafez, 2002).
Se obtuvieron buenos resultados al descongelar semen de cerdo a 42
°C/20 seg, obteniendo una motilidad de 28.8% y manteniendo 36.2% de
células con acrosomas normales (Gosálvez et al, 2003).
Criobiología del semen
22
Otro resultado al descongelar semen de carnero a 38 °C por 8
segundos se obtuvo una motilidad progresiva de 51.2%, para ello se
consideró que el semen fresco debía tener mayor a 60% de motilidad
(Angulo et al, 1999).
Para congelar el semen en camélidos sudamericanos (caso de la
llama) se utilizó yema de huevo, glicerol y tris a lo cual se hallo una
motilidad de 10% al descongelamiento (McEvoy et al, 1992).
Se ha indicado que el dilutor PBS más 40% de suero sanguíneo, 5%
de yema de huevo y 5% de glicerina logra conservar al post congelamiento
una motilidad de 34% a partir de un promedio inicial de 69% en semen de
alpacas (Bustinza, 2001).
Al congelar semen de llama y utilizando el dilutor a base de citrato
sódico, yema de huevo, glucosa mas los crioprotectores el DMSO (dimetil
sulfóxido) a 6% y glicerol a 8% se alcanzó una motilidad individual de 20.4
% y una viabilidad de 32,4 % al descongelado (Aller et al, 2003).
Para la congelación de semen de alpaca se sirvieron del dilutor
comercial Biladyl A y B mostrando buenos resultados frente a otros dilutores
comerciales empleados en otras especies, encontrando un rango de motilidad
entre 10 y 40% con un promedio de 21.3%, los cuales fueron congelaron en
pajillas de 0.5 ml, los resultados en pellets (pastillas) mostraron 10% menor
actividad motil (Vaughan J. et al. 2003).
Para someter a congelamiento el semen de alpaca y llama
procedentes del conducto deferente, se utilizaron como componentes del
dilutor: TRIS buffer, ácido cítrico monohidratado, fructuosa y yema de
huevo, como crioprotector el glicerol a 7.5 %, se obtuvo un promedio
general de 41.0 % de motilidad individual progresiva y 43.0% de motilidad a
5% de glicerol en llamas, el procedimiento de descongelamiento fue a 37 °C
por 30 seg (Pérez et al, 2004).
Criobiología del semen
23
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 DEL LUGAR
Se realizó en el Banco de Germoplasma de Camélidos Sudamericanos
Domésticos del C. I. P. Quimsachata, en el INIA-Puno que se encuentra a 15° 04’
00” de Latitud Sur y a 70° 18’ 00” Longitud Oeste a una altitud 4200 m.s.n.m.
cuenta con una área 6,282.50 has. El acceso es por trocha carrozable a 12 km del
Distrito Santa Lucia, Provincia de Lampa y Región de Puno.
2.2 MATERIALES Y EQUIPOS.
2.2.1 MATERIALES.
Se utilizaron los siguientes materiales:
Maniquí de madera
cubierto por piel de alpaca
hembra.
Vagina artificial de PVC
de 2 pulgadas de diámetro.
Funda recta de látex de uso
en vacunos.
Funda cónica de
polietileno.
Tubo colector falcón
graduado de 15 ml.
Termos de capacidad de 2
litros.
Jeringas descartables de 1,
5 y 10 ml.
Cubre objetos de 0.8 x 0.8
cm.
Porta objetos de 3.5 x 1.0
cm.
Pipetas de 1 ml y 10 ml.
Gradilla.
Algodón.
Cinta adhesiva masking
type.
Rotulador.
Vasos de precipitación de
500 ml.
Guantes quirúrgicos
descartables.
Tubos de ensayo.
Viales de 2 ml.
Mechero.
Pinza.
Detergente.
Caja térmica de tecnopor.
Superficie plana de acrílico
(8 x 15 cm).
Inflador.
Esponjas pequeñas.
Ligas de sujeción.
Toallas.
Baldes.
Lavador.
Cocina a gas.
Criobiología del semen
24
2.2.2 MATERIAL QUÍMICO.
Dilutor:
TRIS (hidroximethyl) aminomethan AR 99.5%, laboratorio
GMBH.
Penicilina - Streptomicina 1000 UI, laboratorio Gibco.
Glucosa, laboratorio Merck.
Ácido cítrico, laboratorio Mallenckodt.
Yema de huevo fresco (no mayor a tres (03) días).
Crioprotectores:
Glicerol 99.5% pureza. Laboratorio SIGMA - ALDRICH
Etilen glicol 99.5% pureza. Laboratorio Malunckrodt.
Otros:
Alcohol.
Desinfectante.
Nitrógeno líquido.
Combustible (gasolina de 84 oct.)
2.2.3 EQUIPOS.
Microscopio de contraste de fases con 4 objetivos, marca Micros.
Termómetro digital marca Checktemp 1, con una escala de –50 a 150 °C.
Balanza de precisión, capacidad 0.01 gr a 200 gr, marca Ohaus.
Frazadilla eléctrica de 110V, fabricado en México.
Tanque de nitrógeno de 18 litros, GM.
Selladora, marca Impulse Sealer.
Cámara fotográfica marca Olympus de 3.5 megapixeles.
Generador de luz de 220 voltios, marca Honda 650.
Refrigeradora marca National de 14 pies, a gas propano.
2.3 ANIMALES DONADORES DE SEMEN.
Se utilizaron los siguientes animales:
Cuadro N° 01: Alpacas donadoras de semen.
Nº ARETE RAZA COLOR EDAD
01 103298 Huacaya Café Adulto
02 13145 Suri Blanco Adulto
03 EEI-021 Suri Gris Adulto
04 EEI-022 Huacaya Café Adulto
05 EEI-005 Huacaya Blanco Adulto
06 289298 Huacaya Lf Adulto
07 2170294 Huacaya Api Adulto
Criobiología del semen
25
08 1299M Huacaya Lf Adulto
09 040299 Huacaya Lf Adulto
10 14803 Huacaya Blanco Adulto
Fuente: Elaboración propia.
2.4 METODOLOGÍA.
2.4.1 PREPARACIÓN SEMINAL PRE CONGELAMIENTO.
2.4.1.1 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SEMEN.
En este proceso se utilizaron 10 alpacas machos adultos
preparados como donadores de semen, además se contó un maniquí
que estuvo incorporado en su interior con una vagina artificial
acondicionado con una frazadilla eléctrica con la finalidad de
mantener la temperatura constante a 38 °C durante el tiempo de
cópula, este procedimiento se repitió a intervalos de 3 días por cada
animal para poder obtener muestras de calidad, una vez que se cuenta
con una buena muestra de semen se sometió a baño maría a una
temperatura promedio de 36°C según INIA, (2004) enseguida se
realizó el análisis macroscópico y microscópico, es en esta
evaluación donde se determina si las muestras procederán con la
investigación.
Fig. Nº 02: Animales empleados.
Criobiología del semen
26
Fig. Nº 03: Muestra de semen una vez obtenida.
2.4.1.2 EVALUACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DEL
SEMEN.
Para la evaluación macroscópica se tomó en cuenta un
volumen mínimo de 0.5 ml.
Para la evaluación microscópica se evaluaron la motilidad y
mortalidad. Para la evaluación de la motilidad y mortalidad se
realizaron observaciones objetivas empleando para ello un
microscopio de contraste de fases, analizando las muestras en un
mínimo de 10 observaciones por muestra en distintos campos para
una mayor precisión, las muestras fueron observadas a aumentos de
40X para semen fresco y 100X para análisis de viabilidad, los
resultados se expresaron en porcentajes.
2.4.1.3 PREPARACIÓN DEL DILUTOR.
Para la preparación del dilutor A se mezclaron los siguientes
agentes químicos TRIS (0.36 gr), ácido cítrico (0.19 gr), que
similarmente usaron en ovinos y vacunos Angulo et al, (1999),
Olivares y Urdaneta, (1985); Adicionalmente se empleó glucosa
(0.05 gr), agua bidestilada estéril (8.5 ml), antibiótico (0.1 gr de
penicilina -streptomicina 1000 UI), utilizado también en ovinos por
Cueto et al, (2003), y como último componente se utilizó yema de
huevo (1.4 ml) que representa el 14%.
Para la preparación del dilutor B, primero se incorpora el
dilutor A más la adición de los crioprotectores en 8 %, 10 % de
glicerol y etilen glicol respectivamente.
Criobiología del semen
27
Fig. Nº 04: Dilutor congelado, nótese la coloración
amarilla brindada por la yema de huevo.
2.4.2 PREPARACIÓN Y PROCESO DEL CONGELAMIENTO SEMINAL.
2.4.2.1 PROCESO DE REFRIGERACIÓN Y AGREGADO DEL
CRIOPROTECTOR. En primer lugar se realizó la dilución del semen en el dilutor
A en una proporción 1:1 (mezcla A) a 36 ºC, para mantener dicha
temperatura se sometió a baño maría, enseguida la mencionada
mezcla A es sometida a refrigeración por espacio de 2 horas y 30
minutos aproximadamente hasta llegar a una temperatura de 5 ºC,
tiempo adecuado para poder estabilizar la muestra a dicha
temperatura (Angulo et al, 1999; Hafez, 2002; Cueto et al, 2003;
Medrano et al, 2004).
Fig. Nº 05: Muestras de semen y dilutor sometidas a baño maría.
Criobiología del semen
28
Una vez alcanzada los 5 ºC se procedió a agregar el dilutor B
a la mezcla A, lo cual se añadió en 3 partes cada 15 minutos, todo
ello en igual proporción 1:1 formando la mezcla B (dilutor B y
mezcla A) enseguida se deja en un periodo de tiempo de 2 horas para
permitir el equilibrio con el crioprotector.
2.4.2.2 PROCESO DE CONGELAMIENTO.
Concluida el tiempo de equilibrio, se procede a preparar una
caja térmica con las siguientes dimensiones (24 x 13 x 15 cm), en
dicha caja se deposito el nitrógeno líquido (NL) hasta una altura de 3
cm, enseguida se sumergió una superficie plana de acrílico con las
medidas (20 x 10 x 0.3 cm), por un lapso de 10 segundos hasta que el
NL cese de ebullir, e inmediatamente después se eleva la mencionada
superficie en posición horizontal quedando ubicado a 2 cm sobre el
nivel del NL y expuestos sobre los vapores del mismo; quedando
listo para depositar la muestras que estuvieron a 5 ºC, para ello con la
ayuda de una jeringa de 1 ml se ubican sobre la superficie en un
volumen que varía desde 0.10 ml a 0.15 ml por un espacio de 2
minutos (precongelación), luego las muestras en precongelación
junto a la superficie de acrílico se sumergen al nitrógeno líquido (-
196°C) para alcanzar la congelación, es en este medio que se separan
por si solos los pellets de la superficie acrílica para luego proceder a
depositar y envasar en viales de 2 ml debidamente identificados, para
su posterior análisis post congelamiento.
Fig. Nº 06: Obtención de las muestras para su congelación.
Criobiología del semen
29
Fig. Nº 07: Precongelación en vapores de nitrógeno.
Tapa externa
Pellets o pastillas en pre congelacion
Nitrógeno líquido (-196 C)
Superficie solida5 cm4 cm3 cm2 cm
1 cm
Fig. Nº 08: Vista lateral del procedimiento realizado.
Tapa externa
Superficie solida
5 cm4 cm3 cm2 cm
1 cm
Fig. Nº 09: Nótese los pellets sumergidos a NL .
Criobiología del semen
30
2.4.3 EVALUACIÓN POST CONGELAMIENTO.
Las muestras se obtienen del tanque de nitrógeno y se procede a
someter al baño preparado a 38 ºC por un espacio de 90 segundos, enseguida
se deposita una alícuota entre una lámina porta y cubre objeto que
previamente fue temperada a 37º para su observación, los resultados de
motilidad fueron expresados en porcentajes, para ello se efectuó varias
observaciones por muestra analizada. La evaluación de la motilidad se
ejecutó con la misma metodología mencionada en el item de evaluación
macroscópica y microscópica del semen.
2.4.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Para la presente investigación se evaluaron cuatro tratamientos:
T1 = 8% glicerol, T2 = 10% glicerol, T3 = 8% etilen glicol y T4 = 10%
etilen glicol, con 10 repeticiones cada una, haciendo un total de 40 muestras.
Para el análisis estadístico se empleó un diseño completamente al azar
(DCA), para la comparación de grupos se utilizó la prueba de media de
contrastes ortogonales.
El modelo aditivo lineal que se utilizó fue:
Y ij = µ + Ci + Eij
Donde:
Yij = Es el efecto del crioprotector en la
criopreservación del espermatozoide de alpaca después del congelamiento.
µ = Efecto de la media general
Ci = Efecto del i-ésimo crioprotector:
i1 = Glicerol 8%
i2 = Glicerol 10%
i3 = Etilen glicol 8%
i4 = Etilen glicol 10%
jr = 1,2,3…r (r = 10 repeticiones)
Eij = Error experimental.
Criobiología del semen
31
3. RESULTADOS Y DISCUSIONES EVALUACIÓN SEMINAL POST CONGELAMIENTO.
RESULTADO DE MOTILIDAD DEL ESPERMATOZOIDE
POST CONGELAMIENTO.
Los resultados que se muestra en el cuadro Nº 02, evidencian
principalmente que la mejor motilidad que se halló al descongelado
fue con el tratamiento a 8% de glicerol, obteniendo 31.93% en
promedio de motilidad individual, y el siguiente mejor resultado fue
24.04% a 10% de glicerol, los dos siguientes tratamientos a 8 y 10%
de etilen glicol mostraron valores inferiores por lo que se puede
formular que no ejercen igual capacidad crioprotectora a los
espermatozoides.
Al ejecutar el análisis de varianza a los datos mencionados
post congelamiento, se pudo determinar que existen diferencias
altamente significativas entre los tratamientos evaluados en su
motilidad por lo que se demuestra estadísticamente al menos uno de
los tratamiento en cada caso es diferente frente a los otros.
RESULTADO DE MORTALIDAD DEL ESPERMATOZOIDE
POST CONGELAMIENTO.
Criobiología del semen
32
Los resultados que se muestra en el cuadro Nº 03, demuestran
principalmente una elevada mortalidad con el empleo de 8% y 10%
de etilen glicol, en el siguiente caso de las muestras de glicerol
mostraron menor mortalidad con respecto al etilen glicol.
Al ejecutar la desviación estándar en el cuadro de mortalidad
post congelamiento, se pudo determinar que las muestras de glicerol
tienen menor grado de dispersión frente a las de etilen glicol. Para
determinar en forma específica que tratamiento es diferente se
efectuó la prueba de contrastes ortogonales que se muestra en el
siguiente cuadro Nº 04.
Fig. Nº 10: Espermatozoide observados.
Criobiología del semen
33
PRUEBA DE CONTRASTES ORTOGONALES PARA
MOTILIDAD Y MORTALIDAD ESPERMÁTICA POST
CONGELAMIENTO.
En el cuadro Nº 04 al realizar las comparaciones de glicerol y
etilen glicol se determina que hay diferencias altamente significativas
(P<0.01) aseverando que el glicerol es superior en capacidad
crioprotectora frente al etilen glicol a iguales concentraciones.
Así mismo se halló diferencias significativas (P<0.01) entre
las concentraciones de glicerol al 8% y 10% donde resulto mejor la
proporción de 8% demostrando un mejor perfil crioprotector.
Y al efectuar el análisis entre los dos diferentes porcentajes de
etilen glicol (8% y 10%) no existe ninguna diferencia significativa
(P>0.01), afirmando que son similares y que estas concentraciones no
ejercen un buen efecto crioprotector.
Criobiología del semen
34
El presente cuadro destaca cuando se observa el resultado de
contraste entre 8% y 10% de glicerol donde resulta no significativo
(n.s.) debido a su similitud o semejanza entre los promedios y el
grado de dispersión que muestran las unidades muéstrales. De igual
manera los resultados restantes se mantienen igual al cuadro Nº 04 en
su grado de significación.
El mejor resultado en la presente investigación fue empleando
glicerol a 8% logrando una motilidad promedio de 31.93%,
alcanzando niveles máximos de 46%, trascendiendo mejor que varios
estudios realizados en camélidos domésticos hasta la fecha.
Investigaciones anteriores que mostraron resultados inferiores
a la presente investigación podemos mencionar los siguientes: como
el caso de McEvoy et al, (1992) quienes intentaron criopreservar
semen de llama encontrando motilidades desde 5 a 10%, así también
Huanta et al, (1999) en otra oportunidad obtuvo una motilidad de
20% y 25% con glicerol y etilen glicol respectivamente; en otra
ocasión Huanca y Sapana, (2000) congelaron semen de alpaca y
obtuvieron 5.22% de motilidad, mientras Aller et al, (2003)
obtuvieron en llamas resultados semejantes al presente estudio,
encontrando 20.4% de motilidad utilizando los crioprotectores
DMSO (dimetil sulfóxido) y glicerol.
Criobiología del semen
35
Sin embargo equivalentes resultados a la presente
investigación encontraron Vaughan et al, (2003) pero con un rango
mas amplio desde 10 a 40% y un promedio general de 21.3% de
actividad motil; concluyendo estas referencias varios investigadores
atribuyeron estos resultados poco alentadores a las características
seminales de la alpaca.
En ese sentido se plantearon otras alternativas de obtención de
semen y que también alcanzaron resultados similares y ligeramente
superiores, uno de estos intentos fue efectuado por Pérez et al, (2004)
que obtuvo semen procedentes del conducto deferente y usando como
medio de dilución yema de huevo, tris, ácido cítrico y glicerol
encontró un rango de motilidad a la descongelación de 24.4% a
43.0% en distintas proporciones de yema de huevo y glicerol. Similar
resultado encontró Canorio et al, (2006) al congelar semen
epididimario hallando resultados de 34% de motilidad progresiva
usando dimetil acetamina como crioprotector.
En la presente investigación se obtuvo semen casi en las
mismas condiciones naturales y características propias de una copula
normal, en los casos anteriores las muestras de semen fueron
obtenidas de lugares no comunes del aparato reproductor del macho.
Con estos resultados se confirmó lo mencionado por Watson, (1995)
que durante el proceso de congelación – descongelación se pierde
aproximadamente el 50% de la población inicial. Al respecto Katkov
et al, (1998) indicaron que a pesar de que optimicemos el proceso de
criopreservación y minimicemos el riesgo de muerte celular, una
parte de la población celular no es capaz de sobrevivir; y aun así
algunas células sobrevivientes se convierten en incapaces de fecundar
afirmaron Stornelli et al, (2001); por lo que es necesario concentrarse
en la funcionalidad de la población sobreviviente sugieren Katkov et
al, (1998).
Sin duda los mejores resultados en cuanto a criopreservación
de semen de la alpaca están alrededor de 7.5 y 8.0% de glicerol
después del presente estudio podemos concluir que no debe estar
lejos la concentración mas adecuada para su criopreservación y su
empleo en la inseminación artificial.
Los ultimo estudios han reportado el empleo del glicerol a
concentraciones que oscilan desde 2% a 10% en las diferentes
especies domesticas como ovinos, vacunos, porcinos y otros según
Medrano et al, (2004); Cabrera, (2007) y Batista et al, (2007).
El grado de concentración de los crioprotectores es variable
debido a las características seminales que varia entre especies, por
ello no es posible generalizar y adecuar a cualquier especie un
protocolo de congelación que funciona en otra, y por lo que es
necesario realizar algunos cambios y experimentar otros agentes
crioprotectores o nuevas metodologías.
Criobiología del semen
36
Para hacer algunas comparaciones de motilidad con otras
especies a los resultados obtenidos hay una serie de investigaciones
en otras especies como lo efectuado en semen de toros donde
obtuvieron resultados mayor al 50% de motilidad al descongelado
(Cabrera, 2007).
En carneros ya se ha encontrado motilidades de 58.3% y
56.7% en razas de costa y sierra respectivamente Flores y Mellisho,
(2004).
En otro estudio por Flores et al, (2004) en ovinos hallo 48.2%
desde 80.9% de motilidad inicial en semen fresco.
En caprinos Ceiro et al, (2006) al evaluar la respuesta a la
criopreservación de semen pudo hallar una motilidad de 24.61%. En
cerdos la mayoría de los casos, la motilidad es menor a 50%
menciona Watson, (1996), no obstante se ha registrado una motilidad
espermática de 40 a 50% en pellets y de 20 al 40% en pajillas según
publicaron Pursel y Jonhson, (1975). Otro estudio en cerdos halló una
motilidad de 28.8% de motilidad post congelamiento investigación
que fue efectuado por Gosálvez et al, (2003) sin embargo mejor
resultado a lo enunciado por Gosálvez encontró Córdova et al, (2004)
con 47.14% de motilidad post congelamiento a partir de una
motilidad inicial de 80%.
Sánchez et al, (1999) al investigar semen de canino encontró
resultados al descongelado de 47.4%, a partir de una motilidad inicial
de 83.8% de motilidad progresiva.
Por todo lo mencionado antes, por los diversos investigadores
en cuanto a los resultados de congelamiento de semen podemos
afirmar que varios protocolos son sensibles a cambios, pues los
resultados post congelamiento en mejor de los casos están alrededor
de 40% a 50% empleándose así en la inseminación artificial,
fertilización in vitro y otros, desde luego dependiendo de la especie.
Por estos resultados con que actualmente se cuenta se viene
investigando el nivel de eficiencia con el uso de semen congelado en
la inseminación artificial en diferentes especies, a pesar de estas
características de motilidad.
Criobiología del semen
37
CONCLUSIONES
El crioprotector que brindó mejor motilidad individual fue el tratamiento de 8% de
glicerol.
En cuanto al etilen glicol la concentración que mostró mejor motilidad individual
fue al 10%, pero muy inferior al glicerol.
El 8% de glicerol produjo menor mortalidad, confirmando la mejor concentración
de crioprotector en la presente investigación.
La mayor mortalidad hallada al descongelado fue empleando con 8% de etilen
glicol.
RECOMENDACIONES
Para seguir avanzando con este trabajo y tomando como base lo efectuado se sugiere los
siguientes.
Experimentar proporciones mas finas de glicerol de preferencia entre el rango 7.5,
7.6, 7.7 … hasta aproximadamente 8.4, 8.5% de concentración final, para poder
determinar lo mas óptimo.
Investigar otras distancias (alturas) menor o mayor a 2 cm sobre el nivel superior
del nitrógeno líquido, al cual se estudio en el presente.
Realizar pruebas de criopreservación en pajillas de 0.25 ml.
Como investigación secuencial a la presente, se debe ejecutar pruebas espermáticas
para determinar la condición de la membrana celular como la integridad del
acrosoma, pruebas hipoosmóticas entre otros y finalmente la fertilidad de estas
células.
COMENTARIO
Este estudio como se menciona antes se efectuó en pellets, al parecer los resultados
positivos pudo haber sido influido por la forma de la pastilla, pues en el proceso de
congelación a nivel de la lamina sólida fue posible notar que tiene unas 03 etapas antes de
la solidificación total, que se recreara mas adelante en un grafico, pero esto es simplemente
una hipótesis que necesita ser tomada o desechada, en este sentido podemos concluir que
talvez hay una proporción útil de la pastilla optima y otra 02 posiblemente con menor
calidad de células vivas. De todas maneras en todo lo mencionado antes nos podemos dar
cuenta que hay diversas partes en la metodología que requieren ser afinados.
Criobiología del semen
38
Criobiología del semen
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