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MC Roxana Regalado Rafael
Médico Patólogo Clínico
Complejo Mayor de
Histocompatibilidad
HLA
Trasplante de Médula Ósea: Un largo camino
Siglo XIX, el médico hematólogo alemán Arthur Pappenheim propuso concepto de Célula Precursora como el origen de todas las líneas celulares hematopoyéticas.
En 1956, Lorenz et. al define la colonización de la médula ósea del receptor por las células progenitoras hematopoyéticas (CPH) del donador.
Revista de Investigación Clínica/Vol.57, Num. 2 / Marzo – Abril 2005/ pp. 129-131
En 1959, Jean Dausset (Francia) describe el sistema del Complejo Mayor de Histocompatibilidad – HLA. “Si los leucocitos de dos personas son compatibles, sus tejidos también lo son”, deducción que permitió el estudio de histocompatibilidad del HLA entre el donante y el receptor para lograr un trasplante exitoso.
Premio Nobel de Medicina - 1980
Fundación Jean Dausset
(CEPH)
PERÚ ONDT -2013 501 Trasplantes,- diversos órganos, 95% riñón 3.2 x millón de habitantes son donantes
Tipaje de HLA en TPH con doble objetivo • Construir registros de donantes voluntarios • Desarrollar la búsqueda de pacientes que
precisaran un donante compatible
24 845 466 24 225 182 donantes y 620 284 CBU's
En 1969, el médico estadounidense Donald Thomas comunicó el primer trasplante en un paciente adulto con Leucemia Aguda.
En Perú, se crea en 1990 la primera unidad de trasplante de médula ósea en el Hospital Edgardo Rebagliati EsSALUD. En 1994 se realiza el primer trasplante autólogo en un paciente con enfermedad de Hodgkin.
Revista de Investigación Clínica/Vol.57, Num. 2 / Marzo – Abril 2005/ pp. 129-131
SALAVERRY GARCÍA, Oswaldo. Historia de la medicina peruana en el siglo XX, Vol.1
CLASIFICACION DE LOS TRASPLANTES
Naturaleza del tejido trasplantado
Rol Funcional e Importancia de Cèlulas Madre Hematopoyèticas
1. Supervivencia: Reconocimiento de los Propio y lo Extraño.
2. Respuesta y Regulación Inmunológica.
3. Tolerancia Inmunologica: Transplante, Aloinmunización, Refractariedad.
4. Autoinmunidad y predisposición a Enfermedades (Resistencia o suceptibilidad)
5. Estudio de poblaciones y Paternidad.
1. TPH Autólogo:
Se colectan
células madre
del paciente
Las células madre
autodonadas se reinfunden
en el paciente
El paciente recibe
quimioterapia o radiación
TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYETICOS
2. TPH Alogénico: Relacionado – No Relacionado El paciente recibe
quimioterapia o radiación Se colectan las
células madre del
donante
Las células madre son
infundidas en el paciente
TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYETICOS
3. TPH Singénico o Isotrasplante:
4. Xenotrasplante:
TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYETICOS
Hermanos gemelos Tejido de animales
Un receptor y un donante deben ser HLA compatibles
• De la misma forma que en una transfusión de sangre el donante y el receptor necesitan ser compatibles en el grupo sanguíneo del Sistema ABO.
• En un trasplante de órganos o de médula ósea, ambos necesitan ser compatibles en el Sistema HLA, o de Antígenos Leucocitarios Humanos.
Sistema Principal de Histocompatibilidad
¿Qué es el Sistema HLA?
• Los Antígenos Leucocitarios Humanos – HLA son moléculas que se encuentran en los glóbulos blancos (o leucocitos) de la sangre y en la superficie de casi todas las células de los tejidos de un individuo.
• Tienen la función de reconocer lo propio y lo ajeno y aseguran la respuesta inmune, capaz de defender al organismo de algunos agentes que generan infecciones.
• Ese conjunto de moléculas y las formas en que son transmitidas de padres a hijos constituyen un Sistema también denominado de Histocompatibilidad (histo = tejidos) o de la individualidad (lo propio y lo ajeno).
• Su descubrimiento ha permitido a la medicina dar un salto cualitativo en las posibilidades de éxito de un trasplante.
¿Qué es el Sistema HLA?
¿Cuál es la función del CMH?
• Presentar peptidos
Restricción CMH
• ¿Todos los antígenos
deben ser
presentados por CMH ?
• El trasplante como tratamiento de ciertas enfermedades es relativamente reciente.
• Los primeros se efectuaron en los años 60’ siendo el gran problema el rechazo.
• Posterior a la década de los 70’ el descubrimiento del Sistema HLA se pudo valorar mejor el fenómeno del rechazo, EICH y realizar TAMO con menor riesgo medidos por los criterios de compatibilidad.
¿Cómo ayuda el Sistema HLA?
DISTRIBUCIÓN DIFERENCIAL DE LAS MOLÉCULAS CMH
TEJIDO CMH- I CMH-II LT +++ +/- LB +++ +++ Macrofagos +++ ++ CD +++ +++ Células epiteliales Tímicas + +++ Neutrofilos +++ - Hepatocito + - Riñón + - Cerebro (neurona no) + - Eritrocito - - Sincitio trofoblástico - -
CMH = HLA CMH-I: • se expresa constitutivamente en todos los tejidos
• niveles altos: células linfoides
• niveles moderados: mayoría
• bajos: hígado
• Se incrementa por IFN-I VIRUS
¿Cuántas moléculas de CMH-I se expresan en
cada célula nucleada ?
Más de 100.000 de cada CMH-I
CMH-II: • Distribución restringida
• Inducido por IFNg
• Existen «lugares estratégicos» en el Sistema HLA que sirven para examinar si una persona puede ser compatible con otra en caso de injerto: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR y HLA-DQ.
• El tipo de molécula – antígeno – presente en A, B, C, DR y DQ es lo que determina la posibilidad de aceptación del tejido (órgano o médula ósea) de un donante por el organismo de un receptor.
¿Qué significa ser HLA compatible?
Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014
• Para que dos personas sean compatibles los antígenos presentes en cada uno de esos lugares deben ser idénticos o tener ciertas coincidencias.
• Se detecta a través de un análisis de sangre en el que la muestra es sometida a varias técnicas de laboratorio que incluye el análisis de ADN.
¿Qué significa ser HLA compatible?
Los antígenos se identifican por un número y pueden ser enormemente variados. • Se reconocen más de 300 para lugar A. • Alrededor de 500 para el lugar B. • Más de 150 para el C. • 400 para el lugar DR. • Más de 50 para el DQ. • Bajo la lupa de la investigación estos números seguirán
incrementando de forma constante. • Esto nos permite evidenciar un alto número de
COMBINACIONES posibles y por ello lo difícil que ellas sean COINCIDENTES.
¿Qué significa ser HLA compatible?
Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014
Enfermedad Gen HLA Riesgo relativo Síndrome de Reiter B27 37 Espondilitis anquilosante B27 86 Tiroiditis de Hashimoto B47 15 Esclerosis Múltiple DR2 5 Artritis Reumatoide DR4 4 Diabetes Juvenil DR3/DR4 3 – 6 Enfermedad Celíaca DQ2 / DQ8 48
Asociaciones HLA-Enfermedad
• El ADN es el material genético heredado de padres a hijos.
• Se halla en el cromosoma del núcleo de la célula de todo el organismo … GB de la sangre.
• Están químicamente constituidos por un encadenamiento de ELEMENTOS BÀSICOS que se podrían comparar con las letras de un alfabeto.
• Estos EB se combinan para constituir un TEXTO organizado que trasmite un mensaje.
• En este texto se reconocen diferentes secciones que son los GENES.
¿Qué significa ser HLA compatible?
Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014
• El ADN se hereda de los padres en una combinaciòn peculiar para cada hijo.
• Los genes del Sistema HLA se trasmiten siempre en BLOQUE.
• Cada bloque se denomina HAPLOTIPO.
• El padre aporta un haplotipo (mitad del genotipo) y la madre el otro dando origen al GENOTIPO HLA.
• Este es el PERFIL GENETICO propio del nuevo ser.
¿Qué significa ser HLA compatible?
• Este perfil O «Huella Genética» es la que debe COINCIDIR en los «Lugares estratégicos» para que dos tejidos se acepten.
• Esto es llamado COMPATIBILIDAD.
¿Qué significa ser HLA compatible?
Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014
Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014
• Un donante es HLA Compatible cuando su «Huella Genética» controlada en A, B, C, DR y DQ presenta una combinación molecular idéntica o con ciertas coincidencias con la combinación del receptor.
• Según el tipo de trasplante, se necesitará diferentes grado de coincidencias.
¿Somos o no Compatibles?
Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014
¿Somos o no Compatibles?
Los hijos podrán heredar cualquiera de estas cuatro combinaciones del material genético transferido
por los padres.
¿Cuál heredará cada uno?
Depende del azar.
Existen 50% de posibilidades
de que 2 hermanos
compartan un solo haplotipo,
25 % de posibilidades
de que no compartan ninguno
y 25% de que coincidan
en ambos haplotipos
Autor: Dr. Ausberto Chunga Chunga – Hospital Nacional Edgardo
Rebagliati Martins – Banco de Organos y Laboratorio de
Histocompatibilidad, Lima - Perú
¿Cuál heredará cada uno? Las personas con genotipo
a-c; a-d; b-c, b-d descienden de progenitores que
aportan los haplotipos a y b, por un lado, y c y d, por otro.
Un individuo está siempre constituido
por material genético que provienen de los padres biológicos.
¿Cuál heredará cada uno? • Cualquiera de las cuatro combinaciones posibles indica que el
individuo proviene de los mismos padres.
• Sólo ciertas coincidencias en la combinación heredada hacen que un hermano sea HLA compatible.
• Según el tipo de trasplante, receptor y donante deberán compartir uno o dos haplotipos.
¿Qué es la Tipificación HLA? • La tipificación HLA es un análisis complejo que permite
identificar y comparar receptores y donantes en Sistema HLA, y determinar la compatibilidad - o no - de sus perfiles (para un trasplante).
• La tipificación nos permite establecer qué posibilidades tiene una persona de socorrer a otra, en base a la donación de un órgano o de algunos centímetros cúbicos de su médula ósea.
• Dato de suma importancia para el médico tratante quien debe evaluar la posibilidad de encarar un trasplante y sus posibilidades de éxito.
Identifiquemos la
Compatibilidad
BIOLOGIA DEL TRASPLANTE ÉXITO O FRACASO
HISTOCOMPATIBILIDAD DE HLA
IGUAL - SIMILITUD GENETICA - DONANTE Y RECEPTOR ACEPTACION
AUSENCIA - SIMILITUD GENÉTICA- DONANTE Y RECEPTOR RECHAZO
ESTUDIO DE ANTIGENOS DE HLA PARA
TRASPLANTE EXITOSO
Evitar el riesgo de los dos obstáculos
principales:
o Enfermedad de Injerto contra Huésped
o Rechazo de trasplante
COMPATIBILIDAD HLA
Renal 2° 3°
Hepático
SE EXIGE LA MAXIMA C O M P A
T MODERADA I B I L I D A D
DEPENDE DEL AZAR
Cardiaco Pulmonar
MEDULA OSEA
RENAL 1°
¿Para qué Tipificamos?
1. Estudios de histocompatibilidad para trasplante de órganos vascularizados.
2. Estudios de histocompatibilidad para trasplante de médula ósea.
3. Estudios de paternidad. 4. Estudios antropológicos para establecer posibles
relaciones entre distintas poblaciones o grupos étnicos.
5. Estudios de asociación de alelos del HLA con enfermedades (susceptibilidad)
¿Dónde se realiza la Tipificación? • En los Laboratorios de
Histocompatibilidad a partir de una extracción de sangre.
• Las muestras de pacientes y familiares son sometidas a procedimientos altamente especializados y muy específicos que permiten identificar los antígenos presentes en los “lugares estratégicos” de la sangre analizada.
• Hemos implementado desde el inicio la tipificación de los 5 locus para el TAMO de CPH.
• La tipificación HLA requiere una solicitud del médico tratante y una extracción de sangre en día y hora coordinados.
¿Cómo Tipificamos? • Técnicas Serológicas:
- Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki
• Técnicas Moleculares:
- PCR con cebadores específicos de secuencia (SSP)
- PCR con cebadores específicos de locus e
hibridización con sondas marcadas, específicas de alelos (SSOP)
- Secuenciación directa (SBT)
- Hibridación reversa
- Luminex
Resolución HLA Molecular
• Baja Resolución Molecular: Resolución de 02 dígitos.
• Mediana Resolución Molecular: *** AD Resolución de un set de posibles alelos.
• Alta Resolución Molecular: Resolución de alelo único: Resolución de 04 dígitos.
Técnica de PCR - SSO Procesos para el marcaje de DNA
Amplificar Denaturar
Hibridar Marcar
2ul DNA
8 ul
primer
0.2 ul Taq
1.8 ul
Buffer
Amplificación
(90min)
Denaturación/
Neutralizació
n
(10min)
Añadir Beads
Hibridización
(15min-50°C)
Lavado
Añadir
SAPE
Lavado
Lectura
Obtención DNA marcado
Nombre Reactivos
característicos
Procesos
característicos
Polimorfismos
detectados
RFLP Endonucleasas de
restricción
bacteriana
Southern blot
Longitud del
fragmento de
restricción
SSP Cebadores de PCR
específicos a
secuencia
PCR/electroforésis
en gel
Genérico a
antígenos HLA a
nível de alelo
SSOP
Sondas de
aligonucléotido
específicas a
secuencia
PCR/hibridación de
sondas con
producto de la
PCR
Alelos HLA
SBT
Cebadores
marcados/terminald
ores de secuencia
marcados
PCR/establecimien
to de secuencia del
producto de la
PCR
Alelos a nivel de
secuencia exacta
Análisis
hetero-
dúplex
DNA desna-
turalizado de tira
simple/generador
UHG
Reunión de tiras
de DNA /electro-
forésis del DNA
recombinado
Complejos del DNA
característicos de
alelos
Resultado e Informe
de estudios de HLA
Informe Final de Resultados
BIOLOGIA DEL TRASPLANTE ÉXITO O FRACASO
HISTOCOMPATIBILIDAD DE HLA
IGUAL - SIMILITUD GENETICA - DONANTE Y RECEPTOR ACEPTACION
AUSENCIA - SIMILITUD GENÉTICA- DONANTE Y RECEPTOR RECHAZO
ESTUDIO DE ANTIGENOS DE HLA PARA
TRASPLANTE EXITOSO
Evitar el riesgo de los dos obstáculos
principales:
o Enfermedad de Injerto contra Huésped
o Rechazo de trasplante
Medicina & Laboratorio, Volumen 16, Números 1-2, 2010
RESPUESTA INMUNOLOGICA EN EL RECHAZO AGUDO
Medicina & Laboratorio, Volumen 16, Números 1-2, 2010
ETAPAS EN EL RECHAZO CRÓNICO
DONANTE RELACIONADO HAPLOIDENTICO
Los problemas principales que se relacionaban a este tipo de donantes se pueden resumir:
1. Con repleción de células T (no modificado): – Alta tasa de EICH.
– Alta mortalidad relacionada al trasplante.
2. Con Depleción de células T. – Alta tasa de recaída.
– Alta mortalidad relacionada a reemergencia de la enfermedad
MC. Roxana Regalado R.
Blga. Gissella Noroña C.
Blgo. César Saravia P.
Blgo. Pável Rubio R.
Blga. Ruth Roncalla M.
Blga. Rosarella Monteza S.
rregalado@inen.sld.pe
lab_tamo@inen.sld.pe
2016500 Anexo 1428
Equipo de Trabajo
Laboratorio de Histocompatibilidad y
Criopreservación
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