clase an lisis de flujos metab licos mfa carlos gomez
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Análisis de Flujos Metabólicos (MFA)
BT7434/5301 - Ingeniería Metabólica y FermentaciónAyudante: Carlos Humberto Gomez R.
10 de abril de 2014
La ingeniería metabólica evalúalos cambios que se generan enforma controlada en elmetabolismo
Estrategias basadas en laaplicación de la IngenieríaGenética, así como laoptimización del proceso logranincrementar de maneraimportante el rendimiento delproducto.
pero ?
Para lograr rendimientos de expresión cercanos al teórico, solo se lograría con la alteración de algunas de las rutas del metabolismo.
La velocidad de formación comoel rendimiento están limitadosen última instancia por lacanalización del carbono desdeel metabolismo central hacia laruta de biosíntesis del Producto.
Se debe contar entonces conmodelos matemáticos quedescriban el metabolismo de lacélula de interés.
La simulación matemática de unared metabólica permitedeterminar los nodos principales
de la misma y el rendimientoteórico del producto
Niveles de regulación de las rutas metabólicas
Control de la velocidad de reacción.
Control de las enzimas reguladoras.
Control genético.
Flujos metabólicos
• Concepto:
– Flujo metabólico: tasa o velocidad a la que un sustratose convierte en producto mediante reaccionesbioquímicas, rutas metabólicas.
SustratoMetabolito Intermedio Producto
– Los metabolitos intracelulares (intermediarios) son muydifíciles de cuantificar.
– Desarrollo de herramientas para solucionar esteinconveniente.
Mediante el MFA se obtiene la distribución de flujos intracelulares en función de la medición de metabolitos externos.
Análisis de flujos metabólicos (MFA)
• Concepto:
– Análisis de flujos metabólicos (MFA): cálculo y elanálisis de la distribución de flujos de una víametabólica en un sistema biológico.
Ejemplo 1
Nomenclatura Significado
A Sustrato
C, E, F Producto
B, D, NADH Metabolitos intermediarios
NADH Co-factor
v Flujo metabólico
Definir el sistema.
Identificar las entradas y salidas del sistema.
Identificar restricciones (metabolitos).
Numero de reacciones.
Plantear los balances de materia.
Determinar los grados de libertad.
Modelación matemática del metabolismo
𝒅𝑵𝒊𝒅𝒕= 𝑭𝒊𝟎 − 𝑭𝒊+
𝒋=𝟏
𝒋=𝒏
𝜶𝒊𝒋𝒅𝜺𝒊𝒅𝒕
𝑁𝑖 = cantidad de sustancia del compuesto i
𝐹𝑖0= flujo de la sustancia i que entra al sistema (mol/tiempo)
𝐹𝑖= flujo de la sustancia i que sale del sistema (mol/tiempo)
𝛼𝑖𝑗= coeficiente estequiometrico del metabolito i
n = numero de reacciones en la red metabólica (sistema)
𝑑𝜀𝑖
𝑑𝑡=velocidad de la reacción o flujo metabólico
Ejemplo 1
Nomenclatura
Significado
A Sustrato
C, E, F Producto
B, D, NADH
Metabolitos intermediarios
NADH Co-factor
v Flujo metabólico
Plantear los balances de materia.
𝒅𝑵𝑨
𝒅𝒕= 𝑭𝑨𝟎 − 𝑭𝑨 - V1 + 0 + 0 + 0 + 0
𝒅𝑵𝒊𝒅𝒕= 𝑭𝒊𝟎 − 𝑭𝒊+
𝒋=𝟏
𝒋=𝒏
𝜶𝒊𝒋𝒅𝜺𝒊𝒅𝒕
𝒅𝑵𝑪
𝒅𝒕= 𝑭𝑪𝟎 − 𝑭𝑪+ 0 + V2 + 0 + 0 + 0
𝒅𝑵𝑩
𝒅𝒕= 𝑭𝑩𝟎 − 𝑭𝑩+ V1 - V2 - V3 + 0 + 0
𝒅𝑵𝑫
𝒅𝒕= 𝑭𝑫𝟎 − 𝑭𝑫+ 0 – 0 + V3 – V4 - V5
𝒅𝑵𝑬
𝒅𝒕= 𝑭𝑬𝟎 − 𝑭𝑬 + 0 + 0 + 0 + V4+ 0
𝒅𝑵𝑭
𝒅𝒕= 𝑭𝑭𝟎 − 𝑭𝑭 + 0 + 0 + 0 + 0 + V5
𝒅𝑵𝑵𝑨𝑫𝑯
𝒅𝒕= 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯𝟎 − 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯+0+V2+ 0 – 0 - 2V5
Importante:
Asumir estado pseudo-estacionario para los metabolitos intermediarios
B, D y NADH, los cambios metabólicos son muy rápidos (milisegundos
a décimas de segundos) en comparación con el crecimiento celular
(horas a días)
Ejemplo 1
𝒅𝑵𝑪
𝒅𝒕= 𝑭𝑪𝟎 − 𝑭𝑪+ 0 + V2 + 0 + 0 + 0
𝒅𝑵𝑨
𝒅𝒕= 𝑭𝑨𝟎 − 𝑭𝑨 - V1 + 0 + 0 + 0 + 0
𝒅𝑵𝑩
𝒅𝒕= 𝑭𝑩𝟎 − 𝑭𝑩+ V1 - V2 - V3 + 0 + 0
𝒅𝑵𝑫
𝒅𝒕= 𝑭𝑫𝟎 − 𝑭𝑫+ 0 + 0 + V3 – V4 - V5
𝒅𝑵𝑬
𝒅𝒕= 𝑭𝑬𝟎 − 𝑭𝑬 + 0 + 0 + 0 + V4+ 0
𝒅𝑵𝑭
𝒅𝒕= 𝑭𝑭𝟎 − 𝑭𝑭 + 0 + 0 + 0 + 0 + V5
𝒅𝑵𝑵𝑨𝑫𝑯
𝒅𝒕= 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯𝟎 − 𝑭𝑵𝑨𝑫𝑯 +0 +V2 + 0 + 0 - 2V5
−1000100
0100−101
0000−110
00100−10
00010−1−2
𝐴𝐶𝐸𝐹𝐵𝐷𝑁𝐴𝐷𝐻
= .
𝑉1𝑉2𝑉3𝑉4𝑉5
Ejemplo 1
Grados de libertad ?𝟎 = 𝟎 − 𝑭𝑪+ 0 + V2 + 0 + 0 + 0
𝟎 = 𝑭𝑨𝟎 − 𝟎 - V1 + 0 + 0 + 0 + 0
𝟎 = 𝟎 − 𝟎 + V1 - V2 - V3 + 0 + 0 𝑩
𝟎 = 𝟎 − 𝟎 + 0 + 0 + V3 – V4 - V5 (D)
𝟎 = 𝟎 − 𝑭𝑬 + 0 + 0 + 0 + V4 + 0
𝟎 = 𝟎 − 𝑭𝑭 + 0 + 0 + 0 + 0 + V5
𝟎 = 𝟎 − 𝟎 + 0 + V2 + 0 + 0 - 2V5 (NADH)
Importante:
Asumir estado pseudo-estacionario para los metabolitos intermediarios
B, D y NADH, los cambios metabólicos son muy rápidos (milisegundos
a décimas de segundos) en comparación con el crecimiento celular
(horas a días)
Ejemplo 1
Grados de libertad = # de reacciones - # metabolitos
Grados de libertad = 5 -3Nomenclatura
Significado
A Sustrato
C, E, F Producto
B, D, NADH Metabolitos intermediarios
NADH Co-factor
v Flujo metabólico
T: matriz de coeficientes estequiométricos
𝐴𝐶𝐵𝐷𝑁𝐴𝐷𝐻
= .
𝑉1𝑉2𝑉3𝑉4𝑉5
𝑭𝑪 = 0 + V2 + 0 + 0 + 0
−𝑭𝑨𝟎= - V1 + 0 + 0 + 0 + 0
𝟎 = V1 - V2 - V3 + 0 + 0 𝑩
𝟎 = 0 + 0 + V3 – V4 - V5 (D)
𝑭𝑬 = 0 + 0 + 0 + V4 + 0
𝑭𝑭 = 0 + 0 + 0 + 0 + V5
𝟎 = 0 – 0 + V3 –V4 - V5 (NADH)
Ejemplo 1
−1 0 0 0 00 1 0 0 0100
−101
−110
0−10
0−1−2
r : vector de flujos medibles
experimentalmente.
V : vector de flujos
intracelulares.
r = T T · V
T -1 *r = v
Revolver para :
A=1.0 mol/s
C=0.5 mol/s
Ejemplo 2
Sustrato (S)
1
Metabolito Intracelular 1 (A)
2 3
Metabolito Intracelular 2 (B) Producto 1 (P1)
4
Metabolito Intracelular 3 (C)
5 6
Producto 2 (P2) Producto 3 (P3)
Definir el sistema.
Identificar las entradas y salidas del sistema.
Identificar restricciones (metabolitos).
Numero de reacciones.
Plantear los balances de materia.
Determinar los grados de libertad.
Ejemplo 2
Paso 2: Balance en estado estacionario para metabolitos intracelulares
A: 1 - 2 = 0 1 = 2
B: 2 - 3 - 4 = 0 2 = 3 + 4
C: 4 - 5 - 6 = 0 4 = 5 + 6
Balance en estado estacionario.
Ecuación de balance metabólico
-rs -1 0 0 0 0 0 1
rp1 0 0 1 0 0 0 2
rp2 0 0 0 0 1 0 3
rp3 = 0 0 0 0 0 1 4
0 1 -1 0 0 0 0 5
0 0 1 -1 -1 0 0 6
0 0 0 0 1 -1 -1
6 reacciones, 3 metabolitos en estado estacionario.Hay 3 grados de libertad, hay que medir 3 flujos:
rs = 1 rp1 = 0,3 rp2 = 0,5
Ecuación de balance metabólico
-1 -1 0 0 0 0 0 1
0,3 0 0 1 0 0 0 2
0,5 0 0 0 0 1 0 3
0 = 1 -1 0 0 0 0 4
0 0 1 -1 -1 0 0 5
0 0 0 0 1 -1 -1 6
Se omitió rp3, la cual queda en función de v6. Es posible calcular rp3 resolviendo el sistema. Esto se utiliza para corroborar lo medido experimentalmente (rp3).
rp3 = 0 0 0 0 0 1
Ecuación de balance metabólico
-1 -1 0 0 0 0 0 1
0,3 0 0 1 0 0 0 2
0,5 0 0 0 0 1 0 3
0 1 -1 0 0 0 0 = 4
0 0 1 -1 -1 0 0 5
0 0 0 0 1 -1 -1 6
-1
Ecuación de balance metabólico
-1 0 0 0 0 0 -1 1
-1 0 0 -1 0 0 0,3 2
0 1 0 0 0 0 0,5 3
-1 -1 0 -1 -1 0 0 = 4
0 0 1 0 0 0 0 5
-1 -1 -1 -1 -1 -1 0 6
Ejercicio 1BA
C
D E
F G
H
1
ATP
CO2
2 NAD+
NADH
3ATP
4
CO2
5
ATP
CO2
6 NAD+
NADH
7
NAD+
NADH
ATP
ADP
ADP
ADP
ADP
Reacciones
1
1. A + ATP C + CO2
2
2. B + NAD+ C3
3. C D + ATP4
4. C E + CO2
5
5. D + ATP F + CO2
6
6. D G + NAD+
7
7. F + ATP H + NAD+
Ojo! Sólo considerar una especie de cada par de co-factor: o ATP o ADP; o NAD+ o NADH, etc.
Balance en estado estacionario para metabolitos intracelulares
C: 1 + 2 - 3 - 4 = 0 1 + 2 = 3 + 4
D: 3 - 5 - 6 = 0 3 = 5 + 6
F: 5 - 7 = 0 5 = 7
ATP: - 1 + 3 - 5 - 7 = 0 3 = 1 + 5 + 7
NAD+: - 2 + 6 + 7 = 0 2 = 6 + 7
Balance en estado estacionario.
7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos:rA = -2 rB = -3
Ecuación de Balance Metabólico
RA -1 0 0 0 0 0 0
RB 0 -1 0 0 0 0 0
RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1
RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2
RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3
RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4
0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5
0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6
0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7
0 -1 0 1 0 -1 0 -1
0 0 -1 0 0 0 1 1
7 incógnitas, 5 metabolitos en estado estacionario 2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos:RA = -2 RB = -3
Ecuación de balance metabólicoRA -1 0 0 0 0 0 0
RB 0 -1 0 0 0 0 0
RE 0 0 0 1 0 0 0 ν1
RG 0 0 0 0 0 1 0 ν2
RH 0 0 0 0 0 0 1 ν3
RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 ν4
0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν5
0 0 0 1 0 -1 -1 0 ν6
0 0 0 0 0 1 0 -1 ν7
0 -1 0 1 0 -1 0 -1
0 0 -1 0 0 0 1 1
Ecuación de Balance Metabólico
-2 -1 0 0 0 0 0 0 ν1
-3 0 -1 0 0 0 0 0 ν2
0 1 1 -1 -1 0 0 0 ν3
0 = 0 0 1 0 -1 -1 0 ν4
0 0 0 0 0 1 0 -1 ν5
0 -1 0 1 0 -1 0 -1 ν6
0 0 -1 0 0 0 1 1 ν7
Ecuación de Balance Metabólico
-1 0 0 0 0 0 0 -2 ν1
0 -1 0 0 0 0 0 -3 ν2
0 -1 0 1 1 0 1 0 ν3
-1 0 -1 -1 -1 0 -1 0 = ν4
0,5 -0,5 0 0,5 1 -0,5 0,5 0 ν5
-0,5 -0,5 0 -0,5 0 0,5 0,5 0 ν6
0,5 -0,5 0 0,5 0 -0,5 0,5 0 ν7
Resultado
2 ν1
3 ν2
3 ν3
2 = ν4
0,5 ν5
2,5 ν6
0,5 ν7
2 3
3
2
0.5
2.5
0.5
BA
C
D E
F G
H
ATP
CO2
NAD+
NADH
ATP
CO2
ATP
CO2
NAD+
NADH
NAD+
NADH
ATP
ADP
ADP
ADP
ADP
Matriz de coeficientes estequiométricos
Nomenclatura Significado
S Sustrato
P Producto
M Metabolitos intermediarios
T =
Matriz:1. Rango Completo. No hay dependencia lineal.2. Número de condicionamiento <100. Baja propagación de error.
• Sistema exactamente determinado:– Si el número de tasas de metabolitos medidos es igual al
número de grados libertad del sistema, entonces lasolución es única.
• Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistemapuede encontrarse de 3 formas:1. Determinado.2. Sobredeterminado.3. Subdeterminado
Análisis de flujos metabólicos
vT)(T r (T) -1-1
r -1)(T v
vT r
Análisis de Flujos metabólicos• Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistema puede
encontrarse de 3 formas:1. Determinado.2. Sobredeterminado.3. Subdeterminado
vT r
• Sistema sobredeterminado:– Si el número de tasas de metabolitos medidos es mayor al
número de grados libertad del sistema, entonces lasredundancias de valores de flujos pueden ser usadas para:– Calcular la «mejor» distribución de flujos intracelulares.– Corroborar la hipótesis de estado estacionario comparando
los valores calculados de flujos extracelulares versus losvalores experimentales (no empleados para solucionar elsistema).
• Sistema subdeterminado:– Si el número de tasas de metabolitos medidos es menor al
número de grados libertad hay un número infinito desoluciones para la red metabólica.
– Es necesario agregar restricciones: solución con optimizaciónlineal, imponiendo una función objetivo apropiada (max.biomasa; min. hidrólisis de ATP, etc.).
– Así, se obtiene una única distribución de flujos intracelularespor medio de la optimización.
Análisis de Flujos metabólicos
vT r
• Según la estructura de la matriz estequiométrica, el sistemapuede encontrarse de 3 formas:1. Determinado.2. Sobredeterminado.3. Subdeterminado
max biomasa
Análisis de flujos metabólicos (MFA)
• Herramienta utilizada para determinar flujos metabólicosintracelulares en función de las tasas de consumo (o producción) decompuestos medibles extracelularmente.
• Se emplean modelos estequiométricos de las vías y balances de masapara metabolitos intracelulares.
• Se miden los flujos de metabolitos extracelulares.– Unidad de medida característica: [mmol X · gDCW-1 · h-1]. Donde X es un
compuesto medible extracelularmente; DCW: biomasa en peso seco; h:tiempo (horas, días, etc.).
• Se obtiene un mapa de flujos metabólicos que permite comparardistintas condiciones y encontrar particularidades en la vía:– Nodos rígidos.
Por lo tanto, para utilizar MFA se necesita:• Matriz estequiométrica (T ).• Vector de flujos en estado estacionario (v).• Vector de flujos medibles (r). Considerar grados de libertad.
• Indica el número mínimo de tasas extracelulares a medir para resolverel sistema.Grados de libertad = n° Reacciones – n° metabolitos intracelulares.
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