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BIOCATÁLISIS EN MEDIOS NO
CONVENCIONALES
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
1.DISOLVENTES ORGÁNICOS2.FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS3.LÍQUIDOS IÓNICOS
Enzimología en Disolventes Orgánicos ?
El uso de disolventes orgánicos en altas proporciones paraincrementar la solubilidad de reactantes fue examinado en 1975 en la reacción con colesterol oxidasa aislada para producircolestenona.
Pero la síntesis enzimática se creyó que era incompatible con la mayoría de las síntesisorgánicas realizadas en medios no acuosos(DOGMA ).
Buckland, B.C., Dunnill, P., Lilly, M.D. The enzymatic transformation of water-insoluble reactants in non aqueous solvents. Conversion of cholesterol to cholest-4-ene-3-one by a Nocardia sp., Biotechnol. Bioeng. 1975 17, 815-826
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EL DOGMA: La catálisis enzimática solo en medios acuososLa estructura 3D activa de una
enzima depende de una granvariedad de factores:
Lipasa de Rhizomucor miehei:
Residuos hidrofóbicos
Residuos hidrofílicos
Exposición de residuosaminoacídicos :
Los resíduos hidrofílicos están(principalmente) expuestos al disolvente (acuoso).
Los resíduos hidrofóbicos están(principalmente) enterrados en el interior de la enzima.
Se establece un equilibrio entre unos y otros
Si las propiedades del medioenzimático se varían de agua a disolventes mas hidrofóbicos y menos polares este equilibriopodría fallar ⇒ desnaturalización.
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Esta situación cambió despues de la publicación de los trabajosde A. M. KLIBANOVhacia la midad de los 80, cuando mostróque las ENZiMAS (al menos algunas de ellas) ERAN CAPACES DE TRABAJAR EN DISOLVENTES ORGÁNICOS
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IMPORTANCIA DE LOS DISOLVENTES ORGANICOS :
Los Químicos Orgánicos comenzaron a usar enzimas
Los sustratos interesantes para trabajar con ellos son generalmente insolubles en agua
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BIOTRANSFORMACIONES EN DISOLVENTES ORGANICOS : VENTAJAS
1.- Mejor recuperación de productos como consecuencia de la omisión de etapas de extracción durante la purificación.
Los agentes causantes de la formación de emulsiones se pueden suprimir y la recuperación de producto(s) se facilita por el uso de disolventes orgánicos de bajo punto de ebullición.
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Un ejemplo industrial
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2.- Incremento en la solubilidad de los sustratos orgánicos (no polares), aumentando la velocidad de reacción.
3.- Un medio orgánico es un medio hostil para la vida de las células, por tanto la contaminación microbiana es despreciable (decisivo a escala industrial, donde mantener la esterilidad podría ser un serio problema)
4.- La desactivación y/o la inhibición causada por los sustratos y/o los productos lipofílicos se reduce al mínimo puesto que su baja solubilidad en los disolventes orgánicos conduce a una concentración local reducida en la superficie de la enzima.
5.- Algunas reacciones secundarias (hidrólisis de grupos lábiles – e.g., epóxidos o anhídridos - polimerización de quinonas, racemisación de cianohidrinas) son dependientes de agua y por tanto suprimidas en medios orgánicos.
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
6.- La inmovilización de enzimas es a menudo innecesaria ya que pueden ser recuperadas por simple filtración. Si se quiere puede ser suficiente la adsorción sobre la superficie de un soporte barato, como Celita (tierra de diatomeas), sílice o bolas de vidrio (no desorción).
7.-Algunas de las reacciones responsables de la desnaturalización de enzimas son mediadas por agua:
Hidrólisis de enlaces peptídicos (especialmente en asparragina).
Hidrólisis de enlaces amida en cadenas laterales (asparragina y glutamina).
Eliminación y oxidación (principalmente residuos cisteína)
Por tanto, las enzimas deberían ser mas estables en un entorno con bajo contenido en agua
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Oglno, H., Nakagawa, S., Shinya, K., Muto, T., Fujimura, N., Yasuda, M., and Ishlkawa, A.: Purification and characterization of organic solvent-stable lipase from organic solvent-tolerant Pseudomonas aeruginosa LST-03. J. Biosci. Bioeng., 89,451-457 (2000).
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Ogino, H., Watanabe, F., Yamada, M., Nakagawa, S., Hirose, T., Nogachi, A., Yasuda, M., and Ishikawa, H. Purification and characterization of organic solvent-stable proteasefrom organic solvent-tolerant Pseudomonas aueruginosa PST-01. J. Biosci. Bioeng., 87, 61-68 (1999).
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Asp
His
SerON NH H
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
OO
O
O H
H
R2O O-
Asp
His
SerO
C OR1
N NH
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
O H
H
HO O-
C O
R1
R2O INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1
INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2
ENZIMA ACILADA
C O
R1
R2OC O
R1
HO
R2OH
OH
H
H2O
8.- Último pero no menos importante: los equilibrios pueden ser invertidos
MECANISMO DE SERIN HIDROLASASEN AGUA
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Asp
His
SerON NH H
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
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C
R1
N N
O(Glu)
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HNHN O
HN
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HN
NH
O
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OO
O
O H
H
HO O-
Asp
His
SerO
C OR1
N NH
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
O H
H
O O-
C O
R1
HO INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1
INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2
ENZIMA ACILADA
C O
R1
HOC O
R1
R2O
OH
R2
R2-OH
H2O
R2
EN DISOLVENTES ORGANICOS
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
OTROS SISTEMAS DIFERENTES
1.- AGUA-CO-SOLVENTE MISCIBLE : SISTEMAS MONOFÁSICOS
La enzima, el sustrato y/o el producto están disueltos en unadisolución monofásica de agua y un co-solvente.
Que disolventes?:
Alcoholes de cadena corta: MeOH, EtOH, PrOH, …
Disolventes polares: DMSO, DMF, acetona, dioxano, THF…
Usados para la transformación de sustratos lipofílicos, escasamentesolubles en agua, para acelerar la velocidad de reacción.
En algunos casos, las selectividades de esterasas y proteasas podríaser mejorada.
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En general la mayor parte de los cosolventes pueden ser usados hastaaprox.. 10% (V/V) sin producir problemas en la enzima.
En algunos casos pueden usarse combinaciones enzima/disolvente de hasta 50-70%.
Si la proporción alcanza un cierto umbral, el agua esencial unida eseliminada conduciendo a la desnaturalización.
Solo raramente algunas enzimas (inusualmente estables) permanecencataliticamente activas en disolventes orgánicos miscibles en agua con bajo contenido en agua:
Subtilisina
Algunas lipasas: eg, CAL (lipasa de Candida antarctica)
Estos cosolventes han sido usados para disminuir la temperatura de congelación de sistemas acuosos para biotransformaciones realizadas a temperaturas por debajo de 0°C (“crioenzimología”).
1.- AGUA-CO-SOLVENTE MISCIBLE : SISTEMAS MONOFÁSICOS
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2.-AGUA DISOLVEN. INMISCIBLE AGUA
SUSTRATO PRODUCTO
SUSTRATO PRODUCTO
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Separación espacial del biocatalizador de la fase orgánica.
Concentración limitada de compuestos orgánicos (sustrato y producto) alrededor de la enzima:
no inhibición.
La eliminación del producto de la superficie de la enzima nos lleva a que se complete la reacción
La reacción enzimática solo se produce en la fase acuosa :
Una transferencia de masa suficiente de/los reactante/s a los/y producto/s del catalizador y entre las dos fases es necesaria.
Es crucial agitar o remover:
Suficiente para la transferencia de masa pero puede llevarnos a la desactivación por procesos químicos o mecánicos.
Comparación de velocidades: La partición no tiene porqué limitar a la kcat.
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Algunos ejemplos industriales
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3.- DISOLVENTES ORGÁNICOS PUROS
Dos posibilidades:
1) ENZIMAS SUSPENDIDAS (Catálisis heterogénea)
a.- Enzima en polvo (liofilizada)
c.- Enzima adsorbida sobre un soporte poroso
b.- Cristales de enzima
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2) ENZIMAS SOLUBILIZADAS (Catálisis Homogénea)
d.- Enzimas modificadas covalentemente e.- Enzimas solubilizadas por surfactantes.
f.-Enzimas solubilizadas por polímeros. g.-Enzimas solubilizadas por microemulsiones
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Reemplazando todo el agua (alrededor del 98%) por agua inmiscible en disolventes orgánicos nos lleva a una suspensión de la enzima sólida en una disolución orgánica monofásica.El biocatalizador parece estar “seco” a un nivel macroscópico, pero allípermanece unido a una cantidad de agua residual.La superficie total de las enzimas sólidas está en el rango de 1 a 3 x 106
m2/kg, similar a sílice o carbón activo.Casi uno o dos tercios del volumen total está hueco, con numerosas cavidades ocupadas por el disolvente, y canales que lo atraviesan dando lugar a un agregado macroscópico como una esponja.Si se provee suficiente agitación, el sustrato no solo es transformado por los centros activos expuestos a la superficie, también por los que están ocultos.
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3.-DISOLVENTES ORGÁNICOS PUROS
CONSECUENCIA:LAS PROTEINAS EN DISOLVENTES
HIDROFÓBICOS RETIENEN SU ESTRUCTURA NATIVA
DOGMA!
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Este hecho es causado por un atrapamiento cinético de la conformación activa por:
3.-DISOLVENTES ORGANICOS PUROS
1.- Fuertes puentes de hidrógeno entre los átomos de proteína.2.- Estructura más rígida.
En disolventes hidrofóbicosimmiscibles en agua, cualquier agua que estuviera presente, permanecerá en la superficie de la proteína debido a la naturaleza hidrofílica y solvofóbica de dicha superficie.
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
231 moléculas de agua en el cristal
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Pregunta crucial: Qué cantidad de agua es requerida para retener la actividad catalítica de las enzimas en esta clase de disolventes?Respuesta: Se ha comprobado y aceptado que se requiere un valor aproximado de 0.2 g H2O / g proteina.
R.M. Daniel, R.V. Dunn, J.L. Finney, and J.C. Smith. The role of dynamics in enzyme activity. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2003, 32:69–92.
Depende mucho del tipo de enzima:α-quimotripsina necesita solo 50 moléculas de agua por molecula de proteína para permanecer cataliticamente activa (mucho menos que una monocapa).Subtilisina y lipasas son mas o menos similares.Polifenol oxidasa requiere 3.5 x 107 moléculas de agua.
Como podemos determinar la cantidad de agua necesaria?
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Primera aproximación: controlar la cantidad de agua
HN
O
O
OCl
n-PrOH, THF
subtilisinHN
O
O
O
Affleck et al. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environtments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1100-1104
Debe ser medida,y es variable dependiendo de la naturaleza del disolvente
A medida que es mas hidrofílico, mayor la cantidad de agua retenida por el disolvente.
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Aproximación óptima: controlar la ACTIVIDAD DE AGUA
Que es la actividad de agua?
A + B C + D
Keq = [A] x [B]
[C] x [D]FALSO !
Keq = aA x aB
aC x aDai = γiXi
γi = coeficiente de actividadXi = fracción molar
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Analogía entre a w y temperatura
La misma temperatura, perodiferente cantidad de calor ⇒diferentes capacidades caloríficas
El calor se distribuye de
forma diferente,
pero la temperatura es la misma.
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Agua en la fase vapor
Agua en el disolvente
Agua en el microentorno de la enzima
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The solubility of water: higher in solvent than in
FIXED WATER AMOUNT
FIXED WATER ACTIVITYWATER IN THE ENZYME
WATER IN THE VAPOUR
WATER IN THE SOLVENT
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La concentración de agua alrededor de la enzima, en el disolvente y en la fase gas será diferente.
Pero la actividad de agua debería ser la misma en los tres componentes, una vez que se ha alcanzado el equilibrio.
Así, los efectos de equilibrio, como la hidratación de la enzima y el balance entre la hidrólisis y síntesis (en hidrolasas) dependerán de aw.
Simplificando, aw puede ser considerado como una medida de la preferencia del agua para estar en un entorno mejor que en otro.
Las moléculas de agua en un medio a altos valores de awse mueven a otro de menor aw. El movimiento resultante reduce las diferencias entre los valores de aw del medio, hasta que son iguales en el equilibrio.
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
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