FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

TRABAJO FIN DE GRADO

Biocatálisis en disolventes verdes: La mejor

estrategia para la producción de fármacos en

disolventes sostenibles

Autor: Iván González Barrios

Tutor: María José Hernáiz Gómez-Dégano

Convocatoria: Julio

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Resumen:

La síntesis química con frecuencia involucra múltiples etapas de protección y

desprotección, así como el uso de reactivos y disolventes nocivos y peligrosos en

condiciones severas que tienen un impacto perjudicial sobre el ambiente y la salud

humana. Como consecuencia de ello, surge la necesidad de encontrar nuevos métodos

más sostenibles. La química verde ofrece las herramientas adecuadas para desarrollar

estos procesos, tanto a nivel de investigación, como a escala industrial. El empleo de

biocatalizadores para llevar a cabo la síntesis de fármacos ofrece una alternativa más

sostenible para obtener estos compuestos, ya que las reacciones catalizadas por enzimas

pueden llevarse a cabo bajo condiciones suaves de presión y temperatura en presencia

de disolventes sostenibles (agua, biodisolventes, líquidos iónicos o fluidos supercríticos)

y con una elevada eficiencia en la incorporación de los componentes de reacción en el

producto final (eficiencia atómica). Como ejemplo de sínesis de fármacos en

condiciones sostenibles a escala industrial he seleccionado la síntesis de la sitagliptina y

del diltiazem ya que son usados disolventes menos cotaminantes que los tradicionales.

Introducción y antecedentes

Biocatálisis como herramienta en la síntesis de fármacos:

La biocatálisis se define como la utilización de células o enzimas para catalizar

biotransformaciones que conducen a la obtención de compuestos de interés, que

satisfacen las necesidades humanas.[1] En etapas incipientes, la biocatálisis se

fundamentaba en el empleo de células enteras, como puede constatarse en la resolución

racémica del ácido tartárico descrita por Pasteur. Sin embargo, el hallazgo de algunas

enzimas que pueden desempeñar transformaciones en medios orgánicos, como las

hidrolasas, es lo que ha supuesto un verdadero cambio de paradigma, pues ha permitido

la transformación de sustratos insolubles en agua y llevar a cabo síntesis de compuestos

como amidas, ésteres, etc, imposibles de darse en medios acuosos.[2]

La biocatálisis es de gran utilidad en la síntesis de fármacos, existiendo un interés

creciente en la implementación de procesos biotecnológicos basados en la utilización de

biocatalizadores (enzimas o células), lo cual puede confirmarse por el gran número de

ejemplos industriales en los que se emplean los mismos.[3]

La generalización de la utilización de biocatalizadores a nivel industrial comporta una

serie de ventajas:

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1) Al tratarse de catalizadores eficientes se necesita una menor cantidad de los mismos

para llevar a cabo las reacciones, siendo procesos altamente competitivos en términos

económicos.[2]

2) Permiten trabajar en condiciones de temperatura y presión ambiente con excelente

economía atómica, evitándose de esta manera reacciones no deseadas como la

isomerización, epimerización, racemización, etc.[4]

3) Se mejora la quimio- regio y estereoselectividad en condiciones suaves de reacción

evitándose así establecer estrategias sintéticas basadas en procesos de protección y

desprotección.[1]

4) Reducción del uso de combustibles fósiles y de metales pesados lo que implica, por

tanto, una disminución de la contaminación ambiental y del calentamiento global.[5]

5) Es posible desempeñar reacciones sobre grupos no activados, lo cual no sería factible

químicamente.

6) Las enzimas son biodegradables y además presentan la posibilidad de ser

inmovilizados permitiendo su reutilización en diferentes ciclos.[6]

Por otro lado, la utilización de enzimas no está exenta de ciertos inconvenientes:

1) Su elevado coste.

2) Fácil desactivación en condiciones diferentes a las naturales.

3) Posibilidad de ser inhibidas por los sustratos o el producto de reacción.

4) Necesidad de cofactores para ejercer su acción en algunas ocasiones, como por

ejemplo en oxidorreductasas.[6]

Como biocatalizadores pueden emplearse células enteras o enzimas aisladas y su

elección depende de factores como el tipo de reacción, la escala a la que se realizará el

proceso o la necesidad de utilizar cofactores. El empleo de células tiene un coste menor

pues se produce un reciclaje de cofactores y no es necesario añadirlos. Sin embargo,

pueden darse reacciones secundarias a consecuencia del metabolismo celular, la

tolerancia hacia los disolventes orgánicos es reducida y se trabaja con elevados

volúmenes, lo cual es complejo. Estos problemas pueden solventarse con el manejo de

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enzimas aisladas. A pesar de que el coste de estas últimas es elevado, si aplicamos

técnicas de inmovilización, pueden reutilizarse durante varios ciclos catalíticos.[2]

Entre las principales clases de enzimas empleadas en la síntesis de fármacos pueden

citarse las oxidorreductasas y las hidrolasas:

Las oxidorreductasas catalizan reacciones redox. Su uso es extremadamente interesante

en la hidroxilación selectiva de enlaces C-H no activados, así como otras reacciones de

reducción de cetonas para obtener alcoholes quirales. Estas reacciones son difíciles de

llevar a cabo mediante métodos químicos convencionales. Es necesaria la presencia de

cofactores redox como el NADP, FAD, etc para la donación de los equivalentes

químicos de oxidación y reducción.[2] Estos son costosos, aunque la aparición de

cofactores sintéticos, cuyas propiedades pueden modularse para aumentar su

estabilidad, reactividad y coste, así como la posibilidad de acoplar sistemas de reciclaje

del cofactor, como el empleo de un segundo enzima y un sustrato para este o bien

emplear un segundo sustrato para la regeneración del cofactor que es convertido por el

mismo enzima que cataliza nuestra reacción de interés (El sustrato de la regeneración

tiene que ser barato y el producto derivado fácilmente eliminable) permiten una mayor

amortización de los biocatalizadores. Un método novedoso de reciclaje del cofactor es

aquel en el que el producto deseado se forma mediante la reacción de regeneración del

cofactor[7].

Las hidrolasas son los biocatalizadores más empleados, de hecho se estima que un 80%

de todas las enzimas usadas en procesos industriales pertenecen a esta clase. Esto está

justificado por la ausencia de necesidad de cofactores, que son caros; la buena

disponibilidad comercial a precios asequibles; la capacidad de reconocimiento

específica de sustratos, a veces muy alejados de la estructura de sus sustratos naturales

(promiscuidad catalítica); posibilidad de utilización en disolventes no acuosos, lo que

permite llevar la biocatálisis en el sentido de la esterificación en lugar de la hidrólisis.[8]

En este grupo destacan las lipasas, que son serín hidrolasas, desempeñando una función

esencial en la nutrición del ser humano y otros animales superiores que consiste en la

hidrólis de triacilglicéridos. Es interesante su cinética en la que cuando el sustrato se

encuentra disuelto en un estado monomérico, apenas son activas, si bien una vez se

supera la Cs formándose una segunda fase lipofílica se vislumbra un brusco incremento

en la actividad. Esto se conoce como activación interfacial. La cinética se explica a

nivel molecular por la existencia de una hélice α en algunas lipasas que cubre el acceso

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al sitio activo cuando el enzima se encuentra en un sistema monofásico acuoso. Por el

contrario, se reorganiza su estructura y la hélice α, al formarse una segunda fase

lipídica, se desplaza y el enzima se situa en la interfase acuoso/lipídica, mostrando

actividad catalítica. Por esta razón las lipasas, a diferencia de otras hidrolasas, presentan

una afinidad inherente por medios apolares y son extremadamente útiles en química

orgánica para la resolución de mezclas racémicas.[6,9]

El desarrollo experimentado por la biocatálisis ha sido plausible gracias al desarrollo de

las técnicas de la biología molecular, que permitieron la obtención a gran escala de

enzimas y microorganismos modificados genéticamente, así como su adaptación a las

exigentes condiciones industriales.[2] Las estrategias para la búsqueda de nuevos

catalizadores o la mejora de los existentes se catalogan en tres grandes grupos:

Screening de organismos naturales para la búsqueda de enzimas y metagenómica:

Uno de los métodos tradicionales para la búsqueda de nuevas enzimas radica en el

aislamiento de microorganismos a partir de muestras ambientales o bien de colecciones

tipo. La limitación que presenta esta técnica consiste en que sólo una pequeña

proporción de microorganismos tomados en una muestra ambiental pueden desarrollarse

en condiciones de laboratorio bien porque se desconocen las condiciones para su

adecuado cultivo, presentan tasas de crecimiento lento o requieren de la simbiosis para

su desarrollo. Esto reduce la diversidad de organismos existente en el ambiente natural,

perdiéndose muchas posibilidades de investigación.[10] Estos inconvenientes se superan

mediante la metagenómica.[11] (11 fig1).

Figura 1: Metagenómica

En esta técnica se extrae el DNA genómico completo directamente desde las muestras

ambientales y se procede a secuenciarlo, fragmentarlo y clonarlo para obtener

genotecas. A posteriori, se realiza una búsqueda de genes que codifiquen enzimas con la

actividad deseada. Finalmente, se va a clonar el gen en un microorganismo para que sea

sobreexpresado y se obtenga el enzima deseado en grandes cantidades.[12]

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Mutagénesis y evolución dirigida: Ambas técnicas permiten mejorar las propiedades

de un biocatalizador tales como la estabilidad, las condiciones óptimas de reacción, etc.

(11 fig2) La primera de ellas, el diseño racional o mutagénesis, se fundamenta en la

modificación de residuos concretos de la

estructura del enzima y estudiar cómo afecta a la

actividad. Para esta estrategia se necesita conocer

la estructura del enzima o saber utilizar

herramientas informáticas de cálculo y simulación

para determinar el tipo de modificaciones a

realizar. La evolución dirigida emula el proceso

de adaptación de las especies descrito en la

hipótesis evolutiva Darwiniana; primero, es

necesario identificar el gen que codifica el enzima, clonación del mismo y desarrollo de

un sistema de expresión adecuado (E. coli, B. subtilis,etc) al que se van a aplicar

procesos mutagénicos aleatorios y así se obtiene un conjunto de variantes representada

en una librería de genes mutantes. Posteriormente, se lleva a cabo la expresión de la

librería de genes mutantes y se someten a un proceso de análisis de los clones mediante

selección de alto rendimiento para obtener candidatos mejorados. A continuación, se

les aplicarán procesos de mutación y así sucesivamente hasta producir enzimas con las

propiedades catalíticas deseadas. La ventaja de la evolución dirigida sobre la

mutagénesis dirigida radica en que no se requiere un conocimiento previo detallado de

la estructura del enzima.[2,12]

Diseño de novo, enzimas a la carta: Se lleva a cabo mediante el concurso de

programas informáticos como Rosetta u ORBIT. Una vez definido un mecanismo

catalítico para una reacción dada y caracterizado el estado de transición en fase gaseosa,

se diseña un centro activo idealizado en el que los grupos funcionales, que mimetizan el

papel que ciertos residuos tendrían en un entorno enzimático, se disponen de forma que

se maximiza la estabilización del estado de transición. Finalmente, se diseñan posibles

esqueletos proteicos que alojen a ese centro activo y las enzimas obtenidas se optimizan,

Figura 2: Técnicas de ingeniería proteica.

Figura 3: Diseño de enzimas a la carta.

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sustituyendo aminoácidos mediante métodos combinatorios in silico que mejoren la

unión en el estado de transición.[11] (11 fig3).

Las enzimas presentan dos grandes problemas como son su limitada estabilidad y la

dificultad que entraña su separación del medio de reacción una vez finalizada ésta,

impidiendo su reutilización y contaminando el producto. Estos inconvenientes han sido

superados mediante la inmovilización, mejorando a su vez la rentabilidad económica de

muchos procesos industriales, al permitir el trabajo en continuo y por la posibilidad de

reutilizarlas.[2] La inmovilización restringe la difusión y la accesibilidad de los sustratos

al centro activo y la salida del producto, lo cual implica una pérdida en la actividad.

Asimismo, se puede producir una alteración de la estructura con respecto a su estado

nativo lo que puede afectar a la selectividad o incluso conducir a la inactivación del

enzima.

Figura 4: Métodos de inmovilización mediante retención física e inmovilización química.

Los métodos de inmobilización son clasificados en dos grandes grupos (7 fig4): 1) la

retención física y 2) la inmovilización química. En la primera no se forman enlaces

covalentes mientras que en la segunda sí que ocurre.[13]

1) Adsorción: La unión al soporte tiene lugar en este caso mediante interacciones

iónicas, puentes de hidrógeno, etc. Los principales factores a controlar son el pH del

medio que influye en la carga de la proteína y del soporte y limitar la fuerza iónica del

medio, ya que los iones se unen más intensamente al soporte que a la proteína. Es un

método sencillo y barato que permite retener altas actividades catalíticas, pero la unión

al soporte es débil perdiéndose enzima en operaciones de lavado, siendo necesario

optimizar las condiciones que controlan la adsorción.

Atrapamiento: Consiste en la contención del enzima en una matriz polimérica que se

genera de forma simultánea a la inmovilización por un cambio de temperatura, en el

caso de geles o por la adición de un reactivo, en el caso de polímeros. También se puede

llevar a cabo el atrapamiento en membranas de fibra hueca, como veremos más

Retención física Inmovilización química

Adsorción Atrapamiento o encapsulación Unión covalente Entrecruzamiento

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adelante. Es un método sencillo en el que no se modifica el enzima, pero que requiere

un control exhaustivo de las condiciones para la formación de la matriz, comprobándose

que no se alteran los grupos reactivos del enzima.

2) Inmoviliazción por unión covalente: Constituye la técnica más utilizada y de la que

mayor información se dispone. El soporte empleado debe mostrar resistencia mecánica

a las condiciones en que se opera y ser fácilmente separable del medio líquido. La unión

covalente procede mediante un ataque nucleofílico de determinados aminoácidos de la

superficie externa del enzima, a través de residuos no esenciales para la actividad, y

grupos químicos reactivos de un soporte funcionalizado. Debido a la estrecha unión

entre enzima y soporte, que permite estabilizar la estructura terciaria, la proteína

adquiere una alta estabilidad térmica. Asimismo, permite trabajar en reactores en

continuo al no perderse por elución el biocatalizador y la carga del enzima en el soporte

permanece constante. Es necesario tener en cuenta que este proceso al no permitir a las

moléculas de enzima tener movimiento libre, conduce a una pérdida de la actividad. Al

mismo tiempo, la estructura del centro activo puede verse alterada y es recomendable

llevar a cabo la inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el centro

activo.

Entrecruzamiento: Esta técnica combina la unión covalente con el atrapamiento. Se

emplean reactivos bifuncionales que permiten la unión entre moléculas de enzima. Se

seleccionan como entrecruzadores diisocianatos, dialdehídos, siendo el más empleado el

glutaraldehído, entre otros, que reaccionan con las lisinas de la superficie del enzima

formándose bases de Schiff. Para evitar las pérdidas de actividad por impedimentos en

la difusión, se realiza el coreticulado en

presencia de una proteína sin actividad y

rica en residuos de lisina, como la albúmina.

Una técnica en boga es la cristalización de

enzimas para posteriormente acometer el

reticulado con glutaraldehído (CLECs). Una

gran ventaja de este método es que no

requiere soporte alguno.

No existe una técnica universal de

inmovilización aplicable para todas las

enzimas y para la elección de la técnica más apropiada se contemplan criterios como las

Figura 5: Proporción de procesos en los que se emplea la

biocatálisis en cada sector.

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condiciones de reacción, el tipo de reactor a utilizar, la naturaleza del sustrato,

etc.[2,6,13,14]

Existen infinidad de ejemplos a nivel de laboratorio donde se emplean biocatalizadores

para la obtención de compuestos de interés para la industria farmacéutica, química y

otras (3 fig5). El problema radica en el escalado posterior para su implementación a

nivel industrial. En este sentido, los ejemplos más numerosos a pequeña escala se

concentran en el sector farmacéutico.[3]

Biocatálisis y química verde:

El término química verde (QV) fue acuñado en la década de los noventa y se define

como "el diseño de procesos y productos químicos que reduce o elimina la generación

de sustancias peligrosas". Esta disciplina surge por la demanda por parte de la sociedad

de instaurar procesos químicos sostenibles con el medio ambiente y benignos para la

salud.[15] Se circunscriben en ella doce principios (16 Fig6).

La sostenibilidad de los procesos se cuantifica por medio de parámetros como el factor

E, permitiendo además, la comparación entre ellos. Se define como la relación entre la

masa de residuos por kilogramo de producto deseado. Valores elevados implican mayor

generación de residuos y peor impacto ambiental. Lo deseable es obtener un valor 0 o

cercano a este. En su cálculo contempla como residuo todo aquello que no es producto,

incluso la energía requerida, aunque generalmente se desdeña el agua, ya que por un

lado no ocasiona un impacto ambiental y es barata, y por otro, su inclusión conduciría a

valores excesivamente altos y complicaría las comparaciones.[17] El factor E es más

elevado para el sector farmacéutico que para la industria química como consecuencia de

Figura 6: Principios de la química verde.

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un amplio uso de reactivos estequiométricos, cuyo precio es prohibitivo en el sector

químico y por otro lado, por la mayor complejidad molecular de los fármacos que lleva

aparejada la necesidad de más etapas sintéticas.[18]

Si estudiamos los residuos generados en un proceso, los disolventes constituyen el

mayor porentaje de los mismos y contribuyen al aumento del factor E; esto junto con los

aspectos relacionados con la salud han hecho que se encuentren bajo un estricto control.

La FDA y la industria han desarrollado guías para una selección de los disolventes más

sostenibles y una clasificación de los mismos (18 Tabla1) en función de su riesgo para

la salud y el medio ambiente, recomendando la sustitución de los indeseables.

Tabla 1: Guía de selección de disolventes de Pfizer.

Objetivos:

Exponer la relevancia de la biocatálisis y la química sostenible en el panorama

actual introducciendo al lector en ambas disciplinas. Se revisarán los

biocatalizadores más empleados, estrategias para la optimización de su actividad

y ténicas de inmovilización.

Desarrollo de los disolventes sostenibles utilizados con más frecuencia junto con

ejemplos a nivel de laboratorio que ilustran sus características ventajosas.

Descripción de reacciones sintéticas a gran escala para la obtención de fármacos

con interés terapéutico en las que se emplean biocatalizadores y disolventes

menos contaminantes y seguros.

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Metodología:

Para el desarrollo de este proyecto se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica

consultando en diversas bases de datos secundarias como son Pubmed®, Science direct®

y Embase®.

Resultados y discusión:

Disolventes sostenibles:

El medio de reacción influe notablemente en la estructura del enzima. Estas proteínas

poseen aminoácidos hidrófilos más expuestos hacia el exterior como -OH, -NH3+, etc,

mientras que los restos hidrofóbicos se

encuentran hacia el interior de su propia

estructura. La estructura y estabilidad de esta,

va a depender del orden de unión de los

aminoácidos en la cadena, así como de las

distintas interacciones covalentes (enlace

peptídico) y no covalentes (electrostáticas,

puente de hidrógeno, etc) entre los grupos

funcionales de las cadenas laterales y entre

éstos y las moléculas de agua del medio (6 fig7). Parte del agua se encontrará unida al

enzima en forma de monocapa, otra parte se disuelve en el disolvente y una tercera en el

soporte, polímeros, etc. Las variaciones en el medio pueden modificar estas

interacciones y alterar la estructura nativa del enzima y por tanto su actividad.[6]

En la búsqueda de una optimización de las biotrasformaciones, además de modificar las

propiedades de los biocatalizadores, se pueden diseñar las condiciones adecuadas para

que un enzima catalice con máxima actividad y estabilidad una reacción en cualquier

medio. Esto se conoce como ingeniería del medio de reacción.[2]

Las enzimas alcanzan una estabilidad óptima en agua, pero no todos los sustratos son

solubles en ésta. De ahí radica el interés en en disolventes orgánicos, cuyo uso

proporciona numerosas ventajas en la biocatálisis como son el incremento de la

solubilidad de sustratos no polares, posibilidad para la reversión del equilibrio hacia la

hidrólisis, se evitan las reacciones secundarias debidas a la presencia de agua, se

posibilita la modificación de la especificidad de sustrato y la enantioselectividad, y se

Figura 7: Representación del agua estructural en la

lipasa B de C. albicans.

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dificulta la contaminación microbiológica. Tampoco es necesario la inmovilización de

las enzimas ya que pueden recuperarse por filtración.[19,20]

Bajo la denominación de medios no convencionales se agrupa a los disolventes

orgánicos miscibles o inmiscibles con el agua lo que depende del valor de log P. En

función de la cantidad de agua en el medio y la naturaleza del disolvente orgánico, las

reacciones se pueden llevar a cabo en tres sistemas:[2]

Sistema monofásico: Conformado por un cosolvente orgánico miscible con el

agua para mejorar la solubilidad de compuestos relativamente insolubles en esta. Se

reducen las limitaciones en la transferencia de masa conduciendo a velocidades de

reacción más elevadas para sustratos hidrofóbicos. Concentraciones del cosolvante

superiores a cierto umbral redundan en la desnaturalización del enzima ya que compiten

con la monocapa de agua fuertemente unida en la formación de puentes de hidrógeno.

Este tipo de reacciones son altamente útiles en síntesis de ésteres y péptidos al favorecer

el equilibrio hacia la síntesis sobre la hidrólisis. Normalmente se emplean a una

concentración 10-50 % (v/v). Los disolventes más utilizados so alcoholes de cadena

corta (etanol, metanol) o disolventes polares como la acetona, dioxano,

dimetilformamida, etc.[19]

Sistemas bifásicos: Constan de una fase acuosa que contiene el enzima disuelta

y otra donde reside el disolvente inmiscible con el agua, formándose entre ambas una

interfase donde se sitúa el enzima rodeada de una concentración limitada de compuestos

orgánicos, con lo que se evita la

inhibición enzimática. Los sustratos se

reparten en ambas fases en función del

coeficiente de reparto, llevándose a cabo

la biotransformación en el medio acuoso.

Las ventajas residen en que el producto

se recupera fácilmente en la fase orgánica

y al ser el sistema bifásico se facilita la

eliminación del producto de la superficie

del enzima y por tanto, que se complete la reacción con rapidez. La agitación es esencial

para mejorar la transferencia de masa y la velocidad, pero puede conducir a la

desnaturalización del enzima al aumentar el contacto con el disolvente orgánico.[2,19] Un

ejemplo elegante de este tipo de sistemas lo constituyen los reactores de membrana (21

fig8). En una estructura cilíndrica hueca discurre un flujo de agua en el que se disuelve

Figura 8: Sistemas de membrana para síntesis

enzimática

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un reactivo, el cual atravesará una capa impermeable para el producto y alcanzará una

matriz multicapa, donde se encuentra atrapada físicamente el enzima, generándose un

producto impermeable a la membrana inicial que difundirá hacia la fase orgánica que

recorre el exterior de la estructura. El movimiento de los sustratos y produtos se explica

por el mantenimiento de una presión positiva.[21]

Disolvente orgánico puro: Las enzimas en su forma nativa son insolubles en

disolventes orgánicos y para solubilizarlas es necesario llevar a cabo modificaciones

como la adición de polímeros hidrofóbicos. El contenido de agua en el medio es

relevante, pues de ello depende que el biocatalizador retenga una buena actividad. La

actividad de agua debe de corresponderse con un valor inferior a 1. Los disolventes

hidrofóbicos posibilitan mayores actividades que los hidrofílicos.[19] Una correcta

agitación, al igual que en el caso de los sitemas bifásicos, permite que el intercambio de

los sustratos y el producto se produzca con una mayor celeridad y por tanto se

incremente la velocidad de la biotransformación.[1]

Los disolventes comunmente empleados son altamente volátiles, lo que resulta en

contaminación ambiental y un riesgo de toxicidad laboral para los trabajadores

expuestos. Esto puede ser solventado con los disolventes neotéricos, es decir, aquellos

nuevos, recientes, modernos, según la definición registrada en la RAE para este

término.[2]

Profundizaremos en los más utilizados en biocatálisis: fluidos supercríticos, líquidos

iónicos y biodisolventes.

Fluidos supercríticos (FSC): Se tratan de aquellos sometidos a una presión y

una temperatura superior al punto crítico, aquel en el que no se observa una clara

diferenciación entre el estado líquido y el sólido, mostrando una densidad comparable a

la de un líquido y una viscosidad semejante a la de los gases.[2] Propiedades como la

transferencia de masa y la polaridad son muy sensibles a las variaciones de presión, por

lo que los FSC son interesantes para la extracción de principios activos mediante

despresurización controlada. Al reducir la presión por debajo del punto crítico, el FSC

pierde sus propiedades y precipitan los productos.[1] Los cambios en propiedades como

la constante dieléctrica promovidos por la variación de presión durante el proceso,

pueden efectar asimismo a la actividad del enzima.[23] El elevado coste de los equipos es

un escollo para la aplicación industrial a gran escala. El SCF más empleado es el CO2,

ya que es barato, inerte, no inflamable, presenta baja temperatura y presión críticas y es

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fácilmente eliminable tras la reacción. Una posible reacción secundaria es la formación

de ácido carbónico por reacción con el agua del medio, lo que conduciría a una

disminución de pH y desactivación del enzima; se puede prevenir con bicarbonato

sódico.[1] En este disolvente se han descrito reacciones hidrolíticas catalizadas por

lipasas, glicosidasas y proteasas.[2] Palocci y col. han descrito como el empleo de CO2sc

puede modular la regioselectividad en la acilación del 6-O-tritil-β-D-glucopiranósido

usando la lipasa de C. rugosa (24 fig9). En presencia de este disolvente la reacción era

dirigida claramente a la formación del derivado acilado en la posición 3 que constituía

un 90% del producto final mejorando el rendimiento y la regioselectividad con respecto

a otros disolventes. Modificando la presión y temperatura también se modificaba el

rendimiento y la regioselectividad.[24]

Figura 9: Acilación catalizada por CRL en CO2sc

Líquidos iónicos (LI): Son sustancias líquidas a temperatura ambiente y que están

formadas por un catión y un anión, siendo normalmente el catión de naturaleza

heterocíclica (piridina, imidazol).[5] La estructura del anión y del catión (5 fig10)

modulan sus propiedades fisicoquímicas como densidad, viscosidad, etc. Entre sus

desventajas podemos citar que son ecotóxicos para organismos como algas, peces y

plantas, lo cual puede reducirse seleccionando cuidadosamente los cationes (ej. colina,

amino ácidos, etc) y disminuyendo las etapas sintéticas, obteniéndose los LI de tercera

generación.[1,25] Las fortalezas son la alta

estabilidad térmica y química, la escasa

volatilidad, bajo punto de fusión y su capacidad

para ser reutilizados. Los LIs se encuentran en

auge a nivel industrial al ser buenos sustitutos de

los disolventes orgánicos volátiles ya que no

causan desactivación y aumentan la selectividad

enzimática y se evitan los perjuicios ambientales

de la volatilidad.[26] Algunos de ellos (28 fig11) se han empleado en la síntesis de los

disacáridos Gal-β-(1-3)-GlcNac o Gal-β-(1-3)-GlcNac mediante la β-galactosidasa de B.

circullans ATCC 31382 con rendimientos del 99% manteniéndose una total

Figura 10: Iones comunes que forman parate de

los LIs

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regioselectividad y sin hidrólisis destacable, lo cual supone una mejora considerable con

respecto a la utilización de buffers acuosos y otros disolventes.[27]

Figura 11: Reacciones de transglicosilación por β-Gal-3 en LIs

Biodisolventes: Proceden de materias primas renovables aprovechándose un potencial

residuo para la obtención de un disolvente. Comparten ciertas características con los

disolventes orgánicos como la inflamabilidad, pero ventajas como una buena

biodegradabilidad, baja toxicidad y su producción sostenible, les confiere una elevada

competitividad. Ejemplos son el ácido láctico, los derivados de glicerol, el 2-MeTHF.

Su aplicación ha posibilitado rendimientos cuantiosos y estupenda regioselectividad en

la síntesis de disacáridos, como Gal-β(1-3)-GlcNAc, al igual que los LIs.[1,2]

Ejemplos de biocatálisis para la obtención de fármacos:

Sitagliptina:

Codexis y Merck han logrado desarrollar la biotransformación de la prositagliptina por

aminación directa en (R)-sitagliptina (Januvia®) con un rendimiento de hasta el 92% de

la forma enantioméricamente pura (2 fig 12), ejemplo en el que se integran varias de las

técnicas comentadas durante el trabajo. Se superan así las limitaciones de los métodos

químicos como las hidrogenaciones catalíticas con catalizadores de rodio o la reacción

de inversión de Mitsonobu.[28] Esta molécula actúa como un inhibidor de la dipeptidil

peptidasa 4 que degrada la incretina GLP-1, la cual estimula la secreción de insulina por

los islotes de Langerhans, suprime el glucagón posprandial, interviene en el control de

la saciedad en cerebro y enlentece la evacuación gástrica; acciones todas ellas que

revierten en un descenso de la glucemia, lo que explica su indicación en diabetes de tipo

II.[29]

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Figura 12: Biotransformación en la síntesis del antidiabético Januvia.

Las transaminasas son altamente selectivas para su sustrato y no aceptan sustituyentes

mayores a un grupo metilo en la posición adyacente a la cetona. Con la asistencia de

modelado computacional y una

variedad de metodologías de

ingeniería proteica, se sugirió que el

centro activo de la transaminasa

ATA-117 estaba constituido por un

bolsillo grande (L) y otro

pequeño (S) con las

limitaciones para los sustratos citadas (31 fig 13A), por lo que no uniría la

prositagliptina (31 fig13B). La aplicación de evolución dirigida, tras sucesivas rondas,

permitió obtener un enzima con bolsillos adecuados al sustrato que incluía 27

mutaciones, 10 de ellas en el centro activo, y mostraba una actividad 75 veces mayor

que la nativa (31 fig13E). A pesar de ello, era necesario optimizar las condiciones de

reacción para la aplicación industrial. La solubilidad de la prositagliptina era reducida

(<1g/L), siendo necesario un cosolvente para favorecerla. Se obtuvieron buenos

resultados con metanol (catalogado dentro de los preferidos por Pfizer) y DMSO. Como

el incremento de la temperatura aumenta la solubilidad, las condiciones óptimas de

trabajo son 40ºC empleando DMSO con alto punto de ebullición, lo que permite

aumentar la solubilidad de sustrato hasta 200 g/L. Un exceso del sustrato isopropilamina

permite desplazar el equilibrio de reacción hacia la formación del producto, lo cual

también puede obtenerse mediante la eliminación del producto acetona.[30]

Diltiazem:

Los fármacos bloqueantes de los canales de calcio constituyen un grupo diverso desde

el punto de vista químico y farmacológico. Esta benzotiazepina se une a los canales de

Ca2+ tipo L en corazón y vasos cuya indicación es el tratamiento de la hipertensión y el

control del dolor en el tórax (angina). Los efectos originados son la relajación de los

vasos sanguíneos facilitando el bombeo del corazón y el aumento de suministro de

sangre y oxígeno al corazón, así como un efecto antiarrítmico.[29] El diltiazem presenta

Figura 13: Modelos que reflejan el centro activo de transaminasa. Naranja,

bolsillo grande; turquesa, bolsillo pequeño; verde, residuos catalíticos.

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dos carbonos asimétricos, siendo

uno de los enantiómeros, el

eutómero, el que ejerce la acción

farmacológica. La resolución óptica

se desarrolla en la síntesis química

sobre un compuesto de alto peso

molecular, lo que lleva aparejado la

formación de grandes cantidades de

residuos. Las compañías DSM-

andeno y Tanabe Pharmaceutical (31

fig14) han comercializado una lipasa

que permite la resolución del éster metílico correspondiente del ácido (+)-(2S,3R)-trans-

3-(4-metoxifenil)-glicídico (MPGM), un sintón quiral muy importante en la síntesis del

fármaco, reduciéndose de esta manera el número de etapas sintéticas.[31]

La lipasa empleada por DSM-andeno procede de Rhizomucor miehei, mientras que

Tanabe la obtiene de Serratia marcescens. Sin embargo, el proceso es similar en ambos

casos, siendo el objetivo la hidrólisis del racémico Rac-50 para limpiar el enantiómero

deseado (2S,3R)-50 del ácido producto de la hidrólisis enzimática (2R,3S)-51, el cual se

descompone espontáneamente a un aldehido.

En el proceso descrito por Tanabe (32 fig 15), en un reactor de membrana se combinan

las operaciones de hidrólisis, separación y cristalización del Rac-50. Se emplea un

sistema bifásico agua-tolueno en el que en el tolueno del medio, disolvente catalogado

como utilizable de acuerdo con Pfizer, se disuelve el sustrato racémico y este es dirigido

hacia un biorreactor de membrana. La composición del mismo es poliacrilonitrilo y en

él se encuentra inmovilizado el enzima. La lipasa cataliza la hidrólisis del enantiómero

no deseado originando el ácido (2R,3S)-51, que discurre a través de la membrana hasta

la fase acuosa que atraviesa el hueco interno del sistema, gracias al gradiente de

presiones existente. Disuelto en ella se encuentra bisulfito, que va a reaccionar a su vez

con el aldehido formado por la decarboxilación espontánea del ácido, impidiéndose de

esta manera la desactivación de la lipasa El enantiómero deseado permanece en la fase

tolueno y cristaliza. El rendimiento del proceso fue de un 43% con el 100% de pureza

enatiomérica.[32]

Figura 14: A la derecha ruta química tradcional, a la

izquierda biotransformación de MPGM.

- 18 -

Figura 15: Sistema de membrana empleado por Tanabe

Conclusiones:

La biocatálisis y la química verde constituyen un pilar fundamental en la

química a nivel de laboratorio, al llevar aparajadas una serie de ventajas de

carácter medio ambiental, económico y metodológico, y en el futuro también lo

serán a escala industral.

Los disolventes neotéricos superan las inconvenienrtes de los disolventes

orgánicos tradicionales ya que disminuyen la contaminación ambiental y la

toxicidad laboral. Asimismo, han posibilitado la obtención de mejores

rendimientos y modificaciones de la regioselectividad en algunas

biotransformaciones.

A nivel industrial se aplican varias de las técnicas analizadas durante el trabajo,

lo que ha permitido una optimización en cuanto a número de etapas, recursos y

rendimientos, mostrando la relevancia de la biocatális en la actualidad y en el

futuro.

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