asparagus officinalis l. y su potencial como promotoras de
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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA
Y PARASITOLOGÍA
Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizósfera de
Asparagus officinalis L. y su potencial como promotoras de
crecimiento en plantas
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN
BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA - PARASITOLOGÍA
PRESENTADA POR:
Br. Basty Berenize Sánchez Villarreal
LAMBAYEQUE, PERÚ
2017
Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizósfera de
Asparagus officinalis L. y su potencial como promotoras de
crecimiento en plantas
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA - PARASITOLOGÍA
APROBADO POR:
Dr. Eduardo Tejada Sánchez
PRESIDENTE
MSc. Consuelo Rojas Idrogo
SECRETARIA
Dra. Gianina Llontop Barandiaran
VOCAL
Dra. Carmen Carreño Farfán
PATROCINADORA
LAMBAYEQUE, PERÚ
2017
Índice
I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1
II. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 3
2.1 Antecedentes de la investigación ........................................................................................... 3
2.2 Base teórica .................................................................................................................................... 7
2.2.1 Actinobacteerias………………………………….…….………………….…..9
III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 14
3.1 Material ............................................................................................................................................ 14
3.1.1 Muestra biológica…………………….…………………..……………….….14
3.1.2 Población y muestra .............................................................................. 14
3.2 Métodos .......................................................................................................................................... 14
3.2.1 Variable de la fase descriptiva ............................................................... 14
3.2.2 Variables de la fase experimental .......................................................... 14
3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis ......................... 15
3.2.4 Lugar de muestreo ................................................................................ 15
3.2.5 Obtención de muestras ......................................................................... 18
3.2.6 Aislamiento e identificación fenotípica de Actinobacterias.……………..18
3.2.7 Mantenimiento de cultivos de Actinobacterias.……………………………22
3.2.8 Cuantificación de nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles
producidos ............................................................................................. 22
3.2.9 Selección de Actinobacterias……………………………………………….. 27
3.2.10 Efecto de Actinobacterias en plantas de espárrago ............................. 27
3.2.11 Análisis estadisticos de los datos ....................................................... 32
IV RESULTADOS ................................................................................................ 33
4.1 Actinobacterias aisladas e identificadas en Asparagus officinalis L…………...33
4.2 Nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos por
Actinobacteria ............................................................................................................................. 41
4.3 Cultivos de Actinobacterias seleccionados ...................................................................... 41
4.4 Efecto de Actinobacterias en la altura y número de tallos de Asparagus
officinalis L. ………………………………………………………………………….41
V. DISCUSIÓN ..................................................................................................... 60
VI. CONCLUSIONES ........................................................................................... 64
VII. RECOMENDACIONES .................................................................................. 65
VIII. RESUMEN .................................................................................................... 66
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 67
X. ANEXOS.......................................................................................................... 75
Índice de tablas
Tabla 1. Lote de procedencia demuestras de raíces con suelo rizosferico de
Asparagus officinalis L. en el fundo Josymar, Viru, La
Libertad……………………………………………………………………... 17
Tabla 2. Analisis físico – químico de suelo rizosferico de Asparagus officinalis L.
en Viru, La Libetad, 2016 …...…………………..………………………….. 19
Tabla 3. Frecuencia de morfotipos de colonias de Actinobacterias aislados de
rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. …………………………. 35
Tabla 4. Frecuencia de géneros identificados en Actinobacterias aisladas de
rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. …………………………. 37
Tabla 5. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Actinobacterias aisladas de
rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. ……………………........ 43
Tabla 6. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilización por Actinobacterias
aisladas de rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. ……........... 46
Tabla 7. Indoles producidos (ppm) por Actinobacterias aisladas de rizoplano y
rizosféra de Asparagus officinalis L. ………………………………………. 48
Tabla 8. Valores (ppm) de amonio, fósforo soluble e indoles correspondientes a
cultivos de Actinobacterias seleccionados. ………………………..……... 49
Tabla 9. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en la altura de
Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días. …..………....................... 52
Tabla 10. Prueba de Tukey de la altura de plantas de Asparagus officinalis L. a
los 30, 45 y 60 días después de la inoculación de Actinobacteria. ......... 53
Tabla 11. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en el número de tallos de
Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días. …………………….......... 54
Índice de figuras
Figura 1. Diseño completamente aleatorio para determinar el efecto de Actinobacterias en Asparagus officinalis L. ………………………… 16
Figura 2.
Ubicación de la provincia de Virú, región La Libertad, abril 2016 (https://www.google.com.pe/maps/place/Vir%C3%BA/@-8.5664616,78.794859,10z/data=!4m5!3m4!1s0x91ac59407c7b0391:0x6c172095672753ce!8m2!3d-8.5528417!4d-78.6254767).........
17
Figura 3. Extraccion de raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. …………………………………………………………………………
19
Figura 4. Raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. deshidratadas…………………………………………………..………..
20
Figura 5. Suspensión de raíces y suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en solución salina esterilizada………………..…………………….. 20
Figura 6. Siembra en agar avena mediante la técnica de agotamiento y estria …………………………………………………………………….. 21
Figura 7. Actinobacterias desarrolladas en agar avena.……………………….. 21
Figura 8. Cultivo de Actinobacterias en agar avena para la caracterización macroscópica. ……………………………………………………………
23
Figura 9. Láminas portaobjetos lista para la observación microscópica.…………………………………………………………….. 23
Figura 10. Cultivos puros de Actinobacterias en agar avena…………............... 24
Figura 11. Caldo extracto de suelo cultivado con Actinobacterias.………….…. 26
Figura 12. Caldo National Botanical Research Institute’s phosphate cultivado con Actinobacterias..……….............................................................. 26
Figura 13. Caldo tripticasa soya suplementado con triptofano cultivado con Actinobacterias.……………..…………………………………………… 28
Figura 14. Coronas de Asparagus officinalis L. ………………………………….. 28
Figura 15. Inmersión de coronas de Asparagus officinalis L. en solución de fungicida.…………………………………………………………………. 30
Figura 16. Inoculo bacteriano asperjado en coronas de Asparagus officinalis L…………………………………………………………………………… 30
Figura 17. Medición de altura de tallos de Asparagus officinalis L. ……………. 31
Figura 18. Conteo del número de tallos de Asparagus officinalis L…………….. 31
Figura 19. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis L. positivas al aislamiento de Actinobacterias en agar avena.……………….......................................................................... 34
Figura 20. Colonias de Actinobacterias desarrolladas en agar avena…………. 34
Figura 21. Observación microscópica de los esporóforos de Streptomyces sp. no espiralados (a), espirales primitivos (b), espirales abiertos (c), espirales cerrados (d). …….……………………………………………. 38
Figura 22. Observación microscópica de Nocardia sp…………………………… 39
Figura 23. Observación microscópica de Micromonospora sp........................... 39
Figura 24. Observación microscópica de Nocardioides sp. …………………….. 40
Figura 25. Observación microscópica de Pseudonocardia sp. …………………. 40
Figura 26. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que fijaron nitrógeno in vitro.…………………………………............... 42
Figura 27. Coloración observada en la cuantificación de amonio…................... 42
Figura 28. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que solubilizaron fosfato in vitro.………………………………………. 45
Figura 29. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble........... 45
Figura 30. Coloración observada en la cuantificación de indoles.……………… 47
Figura 31. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.5.5. …………………………………………………… 51
Figura 32. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.4.3. ……………………………………………………………………. 51
Figura 33. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación de Actinobacterias.………………………………………… 52
Figura 34. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación de Actinobacterias. ……............................................. 53
Figura 35. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.5.5. ……………………........................................... 54
Figura 36. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.44.2. …………………………………………………………………... 55
Figura 37. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 45 días después de la inoculación de Actinobacterias. ………………………………………. 55
Figura 38. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 45 días después de la inoculación de Actinobacterias……………………………………… 56
Figura 39. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.5.5. …………………………………………………… 56
Figura 40. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.50.1. ……............................................................... 57
Figura 41. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 60 días después de la inoculación de Actinobacterias. ……………………………………….. 57
Figura 42. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 60 días después de la inoculación de Actinobacterias. …………………………………….. 59
1
I. INTRODUCCIÓN
El cultivo de Asparagus officinalis L. “espárrago” es el producto abanderado
de las exportaciones hortofrutícolas peruanas (Canto et al., 2008), alcanzando uno
de los mayores rendimientos a nivel mundial (2,2 tha-1). Éste, como en la mayoría
de países depende de la aplicación de insumos químicos como los fertilizantes
(Altamirano et al., 2014), que correctamente utilizados incrementan la
productividad y rentabilidad de los cultivos agrícolas como el espárrago; no
obstante, cada año aumenta la cantidad de fertilizantes por aplicar, debido a la
menor eficacia de adsorción en el suelo y absorción por la planta (Nicolalde &
Quintana, 2010), a la vez que también se incrementa la contaminación del
ambiente (Perleche & Rentería, 2013).
Con el objetivo de mitigar el impacto ambiental causado por el uso de
fertilizantes en la agricultura, se investiga la diversidad de microorganismos
rizosféricos como las rizobacterias promotoras de crecimiento en plantas (Plant
Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR), que incluyen especies de
Actinobacterias. Estas bacterias estimulan los ciclos biogeoquímicos de los
nutrientes, fijan nitrógeno atmosférico, solubilizan fosfatos, producen reguladores
de crecimiento y sideróforos así como también reducen el ataque de
fitopatógenos e insectos (Hernández et al., 2006; Bhattacharyya & Jha, 2012).
Las Actinobacterias se encuentran ampliamente distribuidas por su
versatilidad y formación de esporas que les permiten sobrevivir en condiciones
adversas. Estas bacterias tienen potencial para la promoción de crecimiento en
plantas, debido a la producción de reguladores de crecimiento (Franco, 2008;
Cabrera & Paredes, 2013), solubilización de fosfatos (Rico, 2009; Otero, 2011),
fijación de nitrógeno (Otero, 2011; Cabrera & Paredes, 2013) y control biológico
2
de fitopatógenos (Anitha & Rabeeth 2009; Otero, 2011; Suwan et al., 2012). Se
han reportado investigaciones sobre Actinobacterias, en las que se ha
demostrado incremento en la germinación (Cabrera & Paredes, 2013) y
emergencia (Aguilar & Deza, 2014), desarrollo vegetativo (Julón, 2014; Ramírez,
2015) y rendimiento (Paredes, 2014) de los cultivos agrícolas.
En el rizoplano y rizósfera de las plantas de espárrago se encuentran
especies de Actinobacterias con características de promotoras de crecimiento en
plantas; sin embargo, no se ha realizado investigación para aislarlas y determinar
su potencial, con la perspectiva de aplicarlas en los cultivos agrícolas como
biofertilizantes. La presente investigación permitirá identificar especies de
Actinobacterias propias de la región, con potencial para la biofertilización,
generando valor agregado a la biodiversidad regional, a la vez que se disminuye
el riesgo de la salud de los seres vivos y el efecto negativo de los insumos
químicos en el ambiente. Por lo expuesto, se planteó el siguiente problema;
¿Cúales son las Actinobacterias aisladas en el rizoplano y rizosfera de espárrago
y cuál es su potencial como promotoras de crecimiento en plantas?
El objetivo general fue: Aislar e identificar Actinobacterias en el rizoplano y
rizósfera de espárrago y determinar su potencial como promotoras de crecimiento
en plantas. Los objetivos específicos fueron: Aislar e identificar fenotípicamente
Actinobacterias en el rizoplano y rizósfera de plantas de espárrago, cuantificar el
nitrógeno fijado, fosfato solubilizado, indoles producidos in vitro por las
Actinobacterias, seleccionar los seis cultivos de Actinobacterias con los mayores
valores en el nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos y
determinar el efecto de las Actinobacterias seleccionadas en la altura y número de
tallos de plantas de espárrago. La hipótesis planteada fue: Las Actinobacterias
aisladas del rizoplano y rizósfera de espárrago fijan nitrógeno, solubilizan fosfatos,
producen indoles e incrementan la altura y número de tallos de las plantas de
espárrago.
3
II. MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes de la investigación
Las especies de Actinobacterias son ubicuas y pueden ser aisladas de raíces
y rizósfera de diversos cultivos agrícolas como Dianthus caryophyllus “clavel”
(Márquez et al., 2002), Trifolium repens L. “trébol blanco” (Franco, 2008),
Theobroma cacao “cacao” (Barreto et al., 2008), Solanum tuberosum L. “papa”
(Rico, 2009), Physalis peruviana L. “uchuva” (Venner & Martin, 2009), Musa sp.
(Otero, 2011), Capsicum sp. (Srividya et al., 2012), Triticum aestivum L. “trigo” (Aly
et al., 2012), Zea mays L. “maíz” (Cabrera & Paredes, 2013), Lycopersicon
esculentum Mill “tomate” (Núñez & Vásquez, 2013), Jatropha curcas L. “piñón
blanco” (Aguilar & Deza, 2014) e incluso de suelos sin cultivos establecidos
(Huamán & Lupuche, 2002), suelos degradados (Sandoval & Vásquez, 2001),
malezas (Arrunátegui, 2015) y hormigas de la tribu Attini (Horna & Sialer, 2002).
Las Actinobacterias favorecen el crecimiento de las plantas a través de
mecanismos directos e indirectos. Los directos son: fijación de nitrógeno (Otero,
2011; Cabrera & Paredes, 2013; Nuñez & Vásquez, 2013; Gómez & Yarlaqué,
2013), solubilización de fosfato (Rico, 2009; Otero, 2011; Cabrera & Paredes,
2013) y producción de ácido indolacético (Núñez & Vásquez, 2013). En los
mecanismos indirectos o de control biológico destaca la antibiosis (Rico, 2009;
Anitha & Rabeeth, 2009; Otero, 2011; Suwan et al., 2012). Los compuestos
sintetizados por las Actinobacterias tiene amplia diversidad química y actividad
biológica de aplicación en la agricultura, como insecticidas (Hernández &
Mondragón, 2002), fungicidas (Anitha & Rabeeth, 2009; Hassan et al., 2011),
herbicidas (Doumbou et al., 2002) y reguladores del crecimiento (Franco, 2008;
Cabrera & Paredes, 2013).
4
En la literatura científica se encuentran reportes del beneficio de las
Actinobacterias en diferentes cultivos agrícolas, mencionándose incremento en el
poder germinativo de tomate (Núñez & Vásquez, 2013), emergencia de piñón
blanco (Gómez & Yarlaqué, 2013), número de radículas de Latuca sativa L.
“lechuga” (Salazar & Ordóñez, 2013), longitud de raíces de Capsicum annuum “ají
chili” (Suwan et al., 2012), número de tubérculos, peso fresco y seco de tubérculos
e índice de cosecha de papa (Rico, 2009; Stechmann, 2011), rendimiento de
Cucumis sativus L. “pepino” (Pérez, 2012) y tomate (Anitha & Rabeeth, 2009).
El marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp.dianthi
(Foxd) es uno de los problemas mas limitantes en el cultivo de clavel. En la
búsqueda de alternativas de control a los fungicidas químicos, se aislaron
actinomicetos de clavel para investigar su capacidad antagónica in vitro sobre el
fitopatógeno. Las pruebas de antagonismo in vitro se realizaron en agar papa
dextrosa, PDA, mediante la técnica de enfrentamiento en cultivo dual. Se
obtuvieron diez aislados de actinomicetos, entre los que 70% presentó actividad
antagónica a F. oxysporum después de 8 días. El porcentaje de inhibición micelial
fue de 56-91%. El mayor valor correspondió a Streptomyces sp., con un halo de
inhibición de 1,2 cm, demostrándose el potencial de esta bacteria para el control
de F. oxysporum (Márquez et al., 2002).
Los biofertilizantes posibilitan la disminución del fertilizante químico. En este
contexto, se investigó el potencial de Actinobacterias de la rizósfera de malezas
asociadas a maíz. Las bacterias se aislaron en agar avena y se reconocieron por
el micelio aéreo y de sustrato, la pigmentación y morfología de los esporóforos. Se
identificaron los géneros Streptomyces (32%), Nocardia (30,5%), Pseudonocardia
(22,5%), Nocardioides (13,5%) y Micromonospora (1,5%). Se cuantificaron
1,0-38,75 ppm de ácido indolacético; 1,5-31,10 ppm de nitrógeno fijado como
amonio y 5,27 ppm de fósforo solubilizado, así como también se determinó
actividad proteolítica, quitinolítica y antagónica a Fusarium verticillioides. El 73%
de las bacterias incrementó la emergencia y ninguna afectó negativamente la
5
sobrevivencia de las plantas de maíz. Se demostró la posibilidad de utilizar
Actinobacterias como promotores de crecimiento en maíz (Infante & Zurita, 2013).
En la rizósfera de plantas de piñón blanco se aislaron bacterias del género
Streptomyces, con el objetivo de investigar su potencial biológico y efecto en la
emergencia de semillas. Se colectaron muestras de suelo rizosférico, se
diluyeron en solución salina esterilizada, se tomaron alícuotas y se sembraron en
agar avena, obteniéndose 245 aislados. Según los morfotipos se seleccionaron
100 estreptomicetos, determinándose que el 65% presentó actividad proteolítica,
38% actividad quitinolítica, 100% sintetizó ácido indolacético, 38% fijó nitrógeno,
4% solubilizó fosfato dicálcico y 10% incrementó la emergencia de semillas de
piñón blanco, alcanzando 100%, en comparación con 66% del testigo agua
destilada. Las bacterias investigadas pueden ser utilizadas para acelerar la
emergencia y desarrollo vegetativo del piñón blanco (Gómez & Yarlaqué, 2013).
En la rizósfera de tomate se investigaron actinomicetos del género
Streptomyces para determinar su potencial como rizobacterias promotoras de
crecimiento en plantas. Se colectaron muestras de suelo rizosférico y se
sembraron en agar avena, obteniéndose 282 cultivos de actinomicetos, entre los
que se identificó Streptomyces (42,91%), Nocardia (31,56%), Pseudonocardia
(22,34%), Streptosporangium (2,13%) y Micromonospora (1,06%). Con los
estreptomicetos se detectó actividad proteolítica, quitinolítica, antagónica a
Fusarium verticillioides, producción de ácido indolacético (33 ppm), fijación de
nitrógeno (34ppm amonio), fosfato solubilizado (16ppm) e incremento del poder
germinativo de semillas de tomate. Los resultados evidenciaron que las bacterias
investigadas tienen la capacidad para promover el crecimiento de plantas de
tomate (Núñez & Vásquez, 2013).
El cultivo de piñón blanco importante para la obtención de biodiesel puede
ser mejorado con bacterias promotoras de crecimiento en plantas. En este
contexto, se investigaron 30 cultivos de bacterias del género Streptomyces
previamente aisladas, con el objetivo de verificar la producción de ácido
6
indolacético, AIA, fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos y determinar el
efecto en la emergencia, supervivencia y altura de las plantas. El AIA se
cuantificó mediante la reacción colorimétrica de Salkowski, el nitrógeno fijado
como amonio por el método del fenolhipoclorito y el fosfato solubilizado por el
método del molibdato. Las bacterias del género Streptomyces sintetizaron 48,20-
69,75 ppm de AIA, fijaron nitrógeno, cuantificándose 1,49-21,0 ppm de amonio y
14,80-38,75 ppm de fósforo soluble. Asimismo, incrementaron la emergencia y la
altura de las plántulas de piñón, alcanzando índices de efectividad de 25-245%.
Los resultados mostraron que los estreptomicetos pueden mejorar el desarrollo
de las plantas de piñón (Aguilar & Deza, 2014).
En el suelo rizosférico de maíz y malezas asociadas se aislaron bacterias del
género Streptomyces y se investigó el potencial como promotoras de crecimiento
en plantas. El aislamiento de actinomicetos se realizó en agar avena,
identificando el género Streptomyces en el 88% de los actinomicetos aislados de
maíz y 32% de malezas. Con Streptomyces spp. se detectó actividad proteolítica
y quitinolítica y se cuantificaron 1,00-38,75ppm de ácido indolacético; 1,5-31,10
ppm de nitrógeno fijado como amonio y 0,64-11,21 ppm de fósforo soluble.
Streptomyces spp. 1ML, 1M y 2ML inoculados en las semillas incrementaron la
altura (IE máximo= 25,98%), peso de la biomasa aérea (IE= 69,93%) y radicular
(IE=75,87%), así como también disminuyeron el número de días a la floración de
maíz amarillo duro simple. Se demostró el potencial de Streptomyces spp.
nativas como promotores de crecimiento en maíz (Arrunátegui, 2015).
La producción de ácidos orgánicos como un mecanismo de solubilización de
fosfatos se investigó en 15 Actinobacterias previamente aisladas de la rizósfera
de plantas nativas. Las bacterias se cultivaron con fosfato tricálcico y fosfato de
aluminio y los ácidos orgánicos producidos se identificaron por cromatografía
líquida de alta eficiencia (HPLC). La Actinobacterias con el mayor valor en la
eficiencia de solubilización, se cultivó en caldo NBRIP con fosfato tricálcico,
fosfato de aluminio y roca fosfórica, a 23°C, 120 rpm, durante 7 días y cada 24
horas se cuantificó el fósforo soluble. Las Actinobacterias identificadas como
7
Streptomyces spp. solubilizaron los fosfatos minerales, con producción de ácido
oxálico, cítrico, glucónico y succínico. El fósforo soluble liberado con
Streptomyces sp.T3A fue 122 mg PL−1 con fosfato tricálcico, 14 mg PL−1 con
fosfato de aluminio y 19,6 mg PL−1 con roca fosfórica. Se demostró la capacidad
de las Actinobacterias para solubilizar fosfatos minerales, pudiendo constituir
biofertilizantes para los cultivos agrícolas (Prieto et al., 2015).
2.2 Base teórica
La implementación de la fertilización orgánica, como una forma de agricultura
ecológica sostenible, donde se utilizan abonos verdes, humus, compost o
microorganismos como las PGPR, para movilizar y reciclar nutrientes y
aprovechar la fertilidad del suelo, es importante y de gran interés como una
alternativa ecológica de la cual se van a generar mejores resultados que los
obtenidos por el uso de fertilizantes convencionales (Barrer, 2009).
En la rizósfera de las plantas se consideran tres componentes: el suelo
rizosférico, el rizoplano y la raíz misma. El suelo rizosférico es la zona del suelo
influenciada por las raíces, a través de la liberación de exudados por efecto de la
actividad microbiana. El rizoplano es la superficie de la raíz, incluidas las
partículas fuertemente adheridas a la raíz, La raíz misma también forma parte de
la rizósfera, porque determinados microorganismos son capaces de colonizar los
tejidos internos (Nihorimbere et al., 2011).
Kloepper & Schroth (1978), mencionados por Bhattacharyya & Jha (2012),
propusieron el término rizobacterias para las bacterias del suelo que
competitivamente colonizaban las raices, estimulaban el crecimiento de las
plantas y a la vez reducían la incidencia de las enfermedades. En 1981, estos
mismos investigadores denominaron a estas bacterias promotoras de
crecimiento en plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR). En la
actualidad, este concepto se usa para las bacterias que cumplen con dos de las
tres criterios establecidos, como son colonización agresiva, estimulación del
crecimiento vegetal y biocontrol.
8
Las PGPR benefician a los cultivos agrícolas a través de mecanismos
directos e indirectos. La promoción directa ocurre cuando las PGPR sintetizan
metabolitos y facilitan a las plantas la toma de nutrientes, mientras que la
promoción indirecta es consecuencia de la disminución o prevención del efecto
deletéreo de fitopatógenos. Los mecanismos directos incluyen la síntesis de
reguladores del crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), solubilización de
fosfatos minerales, fijación de nitrógeno atmosférico, producción de sideróforos y
estimulación del sistema de absorción de iones. Entre los mecanismos indirectos
o de biocontrol se encuentran la competencia por un nicho ecológico o por
nutrientes, interacción directa con los patógenos (parasitismo y lisis enzimática),
antibiosis o amensalismo, producción de sideróforos e inducción de resistencia
sistémica a la planta (Delgado et al., 2003; Hernández et al., 2006;
Bhattacharyya & Jha, 2012).
El efecto positivo de las PGPR está relacionado con el aumento en el
número y longitud de raíces laterales y pelos radiculares, cambios que se
asocian con la síntesis de auxinas, citoquininas y giberelinas. En un modelo
hipotético, el AIA sintetizado por una bacteria adherida a las semillas o raices, es
tomado por la planta y junto con el AIA endógeno (de la planta) puede estimular
la división y alargamiento de las células o bien promover la síntesis de ácido
1-amino-ciclopropano-1-carboxílico (ACC), con la activación de la enzima ACC
sintasa. Por lo tanto, aumenta el ACC, que es un precursor del etileno y que a su
vez inhibe la elongación de las raíces. El ACC es hidrolizado por las bacterias
(enzima amino ciclopropano carboxilasa desaminasa, ACC desaminasa),
transformándose en alfa-cetobutirato y amonio. Las bacterias inducen a la planta
a sintetizar más ACC de lo que necesita para que éstas tengan una fuente de
nitrógeno disponible. Una consecuencia directa de la disminución del ACC
(endógeno y bacteriano) es la reducción de etileno, con incremento significativo
en la formación de los pelos radiculares (Loredo et al., 2004).
La solubilización de fosfatos precipitados consiste en la liberación de fosfato
inorgánico soluble a partir de fosfatos insolubles y las PGPR responsables del
9
proceso se denominan solubilizadoras del fósforo. El principal mecanismo para la
solubilización de fosfatos, es la producción de ácidos orgánicos, aunque también
se consideran los ácidos inorgánicos como el sulfhídrico, nítrico y carbónico, la
excreción de protones acompañada de la asimilación del ion amonio y la acción
de mecanismos reductores de los cationes. Por su parte, en el proceso de
mineralización del fósforo, las PGPR pueden movilizar el fósforo de la materia
orgánica no soluble del suelo y convertirlo en fósforo inorgánico soluble,
mediante la excreción de las enzimas hidrolíticas fosfatasas, fitasas y
fosfonatasas (Carreño, 2009).
La fijación de nitrógeno es catalizada por el complejo enzimático nitrogenasa,
estrictamente procariotico compuesto por dos proteínas solubles la proteína de
hierro (dinitrogenasa reductasa o Componente II) y la proteína del MoFe
(dinitrogenesa o Componente I). El hierro y molibdeno son cofactores esenciales
en la dinitrogenasa. Algunos fijadores de nitrógeno tienen una dinitrogenasa
alternativa que contiene vanadio, en lugar de molibdeno; no obstante, esta clase
de dinitrogenasa solo es sintetizada en ausencia de molibdeno disponible. Las
dos enzimas del complejo funcionan conjuntamente: la dinitrogenasa reductasa
reduce la dinitrogenasa y ésta ultima reduce el nitrógeno hasta amoniaco
(Coyne, 2000; Altamirano et al., 2014).
2.2.1 Actinobacterias
Las Actinobacterias son bacterias Gram positivas ubicuas, que se
encuentran en la gran mayoría de sustratos naturales, ampliamente distribuidos
en una variedad de hábitats diferentes: suelo, agua marina, agua dulce, aire,
estiércol, fango de los ríos y fondo de los lagos. Son saprófitos y algunas
especies producen enfermedades a las plantas, animales domésticos e incluso al
hombre. Se encuentran en casi todos los tipos de suelo y bajo condiciones
extremas disminuyen levemente la concentración de su población. Su número
varía en gran proporción según el caso, pero es común encontrarlos en suelos
fértiles en una concentración de 106 UFC g-1 de suelo seco (Balakrishna et al.,
2012).
10
Por lo general, se aíslan Actinobacterias en la superficie del suelo y en
profundidades entre 2 y 15 cm. Más allá de esta profundidad disminuyen las
poblaciones. El tamaño de la comunidad depende del tipo de suelo,
particularmente de algunas de las características físicas, del contenido de
materia orgánica y pH del medio ambiente. Los principales géneros aislados a
partir de suelos son Streptomyces, Nocardia y Micromonospora, que pueden
estar presentes como conidias o como hifas vegetativas; sin embargo, los
métodos de aislamiento convencionales muestran que el 95% de los
actinomicetos aislados a partir de suelo pertenecen al género Streptomyces
(Franco, 2008).
Una espora típica de Streptomyces en condiciones favorables, germina,
emergiendo uno o dos tubos germinativos, que a su vez crecen por alargamineto
apical y se ramifican formando el micelio vegetativo, que se introduce en el
sustrato. Después, debido a la disminución de nutrientes, se inica la producción
de metabolitos secundarios y la diferenciación morfológica. Las hifas aéreas
rompen la tensión superficial, escapan del ambiente acuoso del micelio de
sustrato y crecen hacia arriba. Este micelio aéreo después es dividido por septas,
originándose los compartimientos de las pre-esporas, que a su vez desarrollan
paredes gruesas, sintetizan un pigmentos gris y adquieren las caracterisiticas de
esporas maduras, que pueden sobrevivir por largos periodos de sequedad
(Flardh & Buttner, 2009).
En medio sólido las Actinobacterias crecen como formas miceliales
constituidas por filamentos ramificados carentes de septas internas. Sus paredes
celulares están compuestas de una capa simple de peptidoglicano, carente de
membrana externa, organización que facilita la liberación de proteínas al medio
extracelular. Además, secretan una amplia variedad de metabolitos que incluyen
antimicrobianos, antifúngicos, inmunosupresores, enzimas hidrolíticas e
inhibidores enzimáticos proteicos. Asimismo, los buenos resultados obtenidos en
la producción de enzimas homólogas y algunas heterólogas han estimulado que
en los últimos años se investigue la habilidad natural de secretar proteínas
11
biológicamente activas por algunas especies de actinomicetos como
Streptomyces lividans y S. coelicolor (Pimienta & Vallin, 2005).
Los actinomicetos tienen gran importancia por su participación en la
degradación de la materia orgánica, además de ciertas propiedades fisiológicas
que los hacen particulares, como la producción de un olor típico a suelo húmedo,
debido a la síntesis de un metabolito denominado geosmina. Asimismo,
producen terpenoides, pigmentos y enzimas extracelulares, con las que son
capaces de degradar los residuos de origen vegetal y animal (Ezziyyani et al.,
2004).
2.2.2 Asparagus officinalis L.
El espárrago es una planta herbácea perenne, formada por tallos aéreos
ramificados y una parte subterránea denominada comúnmente “garra” constituida
por un tallo subterráneo, corona o rizoma, a partir del cual se producen yemas
que originarán los turiones o espárragos y las raíces principales o de
almacenamiento (Borrego, 2014). Éstas son cilíndricas, gruesas y carnosas y
acumulan reservas para la produccion de turiones. Los turiones son la parte
comestible y comercializable y cuando se dejan vegetar son los futuros tallos
ramificados (Kirschenbilder et al., 2015).
El ciclo vital de las plantas de espárrago verde se divide en cuatro fases: de
crecimiento temprano, los primeros 2 años desde la plantación, caracterizados
por un fuerte desarrollo vegetativo; de productividad creciente (3º-4ºaños) que
correspondan a los 2 primeros años de cosecha; de productividad estable
(4º-10º años) y finalmente de productivdad decreciente (más de 10 años). El
aumento de temperatura propicia la emergencia de brotes jóvenes llamados
turiones a partir del rizoma. Despues, de la cosecha, los turiones se desarrollan y
forman el follaje o helecho (Asprelli et al., 2005). Las plantas son diocas, siendo
más productivas las plantas masculinas que femeninas. Las estaminadas tienen
mayor número de turiones mientras que en las pistiladas los turiones tienen
mayor diámetro (Kirschenbilder et al., 2015).
12
La siembra del espárrago puede ser directa por semillas o por trasplante de
plántulas o de garras. Las plántulas se obtienen de semillas hibridas, al momento
del trasplante presentan plumerillos de 10-12cm de longitud y después de
1-2 años se cosecha. Las garras se obtienen en los semilleros y después de
1 año se realiza la primera recolección. El primer riego tiene lugar en la
plantación, para mantener la humedad del sistema radicular y favorecer la
formación de la garra. Los otros dos riegos corresponden a la recolección y al
desarrollo anual de la parte aérea. El riego de recolección debe mantener la
humedad en la zona donde van a emerger los turiones y el riego de desarrollo de
la parte aérea se debe hacer por gravedad sino se dispone de riego por goteo;
aplicando 1-2 riegos semanales. El ultimo riego se realiza 3 meses antes de la
cosecha para evitar las brotaciones tardías que puedan consumir las reservas de
las raíces (Reyes, 2006; Delgado, 2007; Vallejo et al., 2009).
Según el manejo agronómico, los espárragos son blancos, morados y
verdes. Los blancos se cultivan bajo la tierra, sin recibir la luz del sol y se
cosechan cuando la tierra se eleva ligeramente, antes que la yema esté en
contacto con la luz. Los espárragos morados se cultivan igual que los blancos,
pero se recolectan cuando la yema ha traspasado la superficie de la tierra y ha
entrado en contacto con la luz solar. Los espárragos verdes se cultivan al aire
libre, reciben su color de la luz solar y se recolectan cuando sobresalen
20-25cm de la tierra. Su sabor es más aromático, parecido al espárrago silvestre
y contienen mayor cantidad de vitaminas por la clorofila (Reyes 2006; Delgado,
2007).
La producción nacional de espárrago está centralizada en la costa, siendo
La Libertad la región con mayores rendimientos y producción. Desde enero a
abril existe una alta productividad, pero con una baja calidad del cultivo,
incrementándose el porcentaje de descarte. Por el contrario, de mayo a
setiembre la calidad es mayor, pero con menor productividad. Los mejores
meses para cosechar son octubre a diciembre. Casi la totalidad del volumen de
producción, a diferencia de China, esta destinada al mercado externo porque el
13
consumo local es menor a 1 Kg percápita anual, evidenciándose que este
producto no es habitualmente consumido por el poblador peruano (Agrobanco,
2007).
14
III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales
3.1.1 Material biológico
El material biológico estuvo constituido por raíces con suelo rizosférico
adherido de espárrago, cultivos puros de Actinobacterias y coronas de espárrago
cultivar UC-157 F2.
3.1.2 Población y muestra
En la investigación descriptiva la población estuvo constituida por las plantas
de espárrago del fundo Josymar (50ha) en Virú, Trujillo y se investigó una
muestra no probabilística de 96 plantas colectadas durante abril de 2016. El
número de muestras fue calculado, tomando en cuenta una prevalencia de 90%
(Vásquez et al., 2012), determinada en un estudio piloto por los investigadores
(Anexo 1). En la investigación explicativa la población fueron las Actinobacterias
aisladas e identificadas en el rizoplano y rizósfera de espárrago durante abril de
2016 y la muestra no probabilística y por conveniencia estuvo constituida por seis
cultivos de Actinobacterias seleccionados.
3.2 Métodos
3.2.1 Variable de la fase descriptiva
Variable cuantitativa: Potencial como promotoras de crecimiento en plantas
(nitrógeno fijado, fosfato solubilizado, indoles producidos).
3.2.2 Variables de la fase explicativa
Variable independiente: Cultivos (6) de Actinobacterias.
Variable dependiente: Desarrollo vegetativo de plantas de espárrago (altura
y número de tallos).
15
3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis
La investigación se realizó en dos fases. La primera fase descriptiva
correspondió al aislamiento e identificación de Actinobacterias, cuantificación de
nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos. En la segunda fase
explicativa se determinó el efecto de seis cultivos de Actinobacterias en la altura y
número de tallos de plantas de espárrago, durante 60 días, en invernadero.
La hipótesis en la primera fase se contrastó con el diseño no experimental de
“Solo Después” (Vásquez et al., 2012) y en la segunda fase con el diseño
experimental completamente aleatorio, DCA (Hernández et al., 2014). Los
tratamientos fueron ocho correspondientes a T1: Testigo absoluto (agua destilada),
T2: Testigo químico (urea 46% N), T3 a T8 Actinobacterias. En cada tratamiento se
consideraron tres repeticiones, totalizando 24 unidades experimentales (Figura 1).
3.2.4 Lugar de muestreo
Las 96 muestras de raíces con suelo rizósferico de espárrago se colectaron
en el fundo Josymar, ubicado en el lote 10,6 del sector IV, Proyecto Especial
Chavimochic, en la provincia Virú, región La Libertad (Figura 2, tabla 1). Virú tiene
una superficie de 3218,74 km2 y limita por el norte con la provincia de Trujillo, por el
este con las provincias de Julcán y Santiago de Chuco, por el sur con la región de
Ancash y por el oeste con el océano Pacífico (Municipalidad Distrital de
Guadalupito,2016). El fundo Josymar tiene 50 ha, distribuidas en 24 lotes de
aproximadamente 1,5 ha cada uno. Al momento del muestreo 19 lotes estaban
sembrados con espárrago cultivar UC-157 F2 (cuatro plantas por metro lineal), con
1,8-2,5 años transcurridos después del transplante de coronas y una población
promedio de 30 000 plantas ha-1.
16
T1: Testigo absoluto
T2: Testigo químico
T3 – T8: Actinobacterias.
Figura 1. Diseño completamente aleatorio para determinar el efecto de Actinobacterias en Asparagus officinalis L.
1
2
3
4
5
6
7
8
2
3
4
5
6
7
8
1
3
4
5
6
7
8
1
2
17
Figura 2. Ubicación de la provincia de Virú, región La Libertad, abril, 2016 (https://www.google.com.pe/maps/place/Provincia+de+Vir%C3%BA/@8.
4182934,78.5870067,10.34z/data=!4m5!3m4!1s0x91ac59407c7b0391:
0x6c172095672753ce!8m2!3d-8.5410584!4d-78.6757807).
Tabla 1. Lote de procedencia de muestras de raíces con suelo rizósferico de
Asparagus officinalis en el Fundo Josymar, Virú, La Libertad
Lote
No de surcos
No de muestras
A1-B1-C1
54
15 (1-15)
A2-B2-C3 61 15 (16-30)
A3-B3-C3 62 15 (31-45)
A4-B4-C4 63 15 (46-60)
C5 56 5 (61-65)
A6-B6-C6 64 15 (66-88)
C7 49 5 (81-85)
C8 55 6 (86-91)
C9 51 5 (92-96)
Total: 19 lotes 515 96
18
3.2.5 Obtención de muestras
En el campo de cultivo de espárrago, cada cinco surcos se seleccionó la
planta más vigorosa y se extrajeron aproximadamente 50g de raíces con suelo
adherido (Figura 3), se depositaron en bolsas de polietileno debidamente
identificadas e inmediatamente se transportaron en una caja térmica (10 ± 1°C)
hacia el Laboratorio de Microbiología y Parasitología, sección Biotecnología
Microbiana de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruíz
Gallo en Lambayeque.
En simultáneo al muestreo de raíces con suelo rizosférico de espárrago para
el aislamiento de Actinobacterias, se colectó una muestra representativa de 1kg
de suelo para realizar el análisis físico-químico en el Instituto Nacional de
Innovación y Extensión Agraria, Estación Experimental Vista Florida de Chiclayo.
Según los resultados (Tabla 2), el suelo es ligeramente ácido (pH 6,5) y
ligeramente salino (CE 3,06 dSm-1), con textura arenosa, niveles bajos de materia
orgánica (0,23%), nitrógeno (0,103ppm), fósforo disponible (6,0ppm) y potasio
(203,0ppm).
3.2.6 Aislamiento e identificación fenotípica de Actinobacterias
Para el aislamiento de Actinobacterias (Cabrera & Paredes, 2013) las
muestras de raíces con suelo adherido (Figura 4) se deshidrataron bajo sombra a
temperatura ambiente, por 72 horas y después, se cortaron en fragmentos de
aproximadamente 5 cm. Aleatoriamente se tomaron submuestras de 10g de raíces
junto con el suelo adherido y se depositaron en frascos de 250 mL de capacidad,
conteniendo 90 mL de solución salina esterilizada, NaCl 0,85% p/v (Figura 5).
Después de agitar el contenido de los frascos (10-1), se tomaron alícuotas y se
sembraron mediante la técnica de agotamiento y estría en agar avena con
antimicótico (Figura 6, anexo 2), se incubaron a 30ºC, hasta por 7 días y se
seleccionaron las colonias típicas de Actinobacterias (Figura 7), tomando en cuenta
la textura, coloración del micelo aéreo y de sustrato, forma y tamaño de las
colonias y los pigmentos producidos. Las colonias desarrolladas se agruparon
según sus características y se seleccionó una representativa de cada grupo para
su posterior siembra en agar avena, constituyendo los aislados de Actinobacterias.
19
Figura 3. Extraccion de raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L.
Tabla 2. Análisis físico-químico de suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en Virú, La Libertad, 2016
Clase
Textural
pH
CE
(dSm-1)
MO
(%)
N
(%)
P
(ppm)
K
(ppm)
Arenosa
6,5
3,06
0.23
0,103
6,0
203,0
20
Figura 4. Raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. deshidratadas.
Figura 5. Suspensión de raíces y suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en
solución salina est erilizada.
21
Figura 6. Siembra en agar avena mediante la técnica de agotamiento y estría.
Figura 7. Actinobacterias desarrolladas en agar avena.
22
Para la caracterización macroscópica de las Actinobacterias (Franco, 2008),
se observaron las colonias desarrolladas en agar avena durante 5 días y se
registró la textura y la coloración del micelio aéreo y de sustrato en el medio de
cultivo. Para la caracterización microscópica, las Actinobacterias fueron
sembradas en agar avena y en la zona central se introdujo una lámina
cubreobjetos previamente esterilizada, dispuesta con una inclinación de 45º,
respecto a la superficie del agar (Figura 8). Después de la incubación a 30ºC, por
5 días, se retiraron los cubreobjetos y se depositaron sobre una lámina
portaobjetos con una gota de cristal violeta (Figura 9), para la observación bajo el
microscopio (40x) del tipo de micelio vegetativo, fragmentación y características
del micelio aéreo.
3.2.7 Mantenimiento de cultivos de Actinobacterias
Los cultivos puros de Actinobacterias identificados se sembraron en el
medio sólido agar avena (Figura 10) y se mantuvieron a temperatura ambiente
(28°C) y en refrigeración (8°C), realizándose subcultivos cada 30 días.
3.2.8 Cuantificación de nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles
producidos
Con las Actinobacterias aisladas e identificadas se cuantificó el amonio,
producto de la fijación de nitrógeno, el fósforo soluble producto de la solubilización
de fosfatos y los indoles producidos. Para la obtención del inóculo, cada bacteria se
cultivó en 5mL de agar avena a 30°C, durante 96 horas (Córdova, 2016).
Posteriormente, se agregó solución salina esterilizada (NaCl 0,85% p/v), se
centrifugó (3500 rpm) durante 3 minutos, el sobrenadante se eliminó, el sedimento
se lavó con solución salina esterilizada (NaCl 0,85% p/v) y su concentración se
estandarizó a 108 cel mL-1 por turbidimetría con el espectrofotómetro de luz visible a
540nm: absorbancia = 0,20, equivalente a 108 células mL-1 (Rodríguez, 2013).
23
Figura 8. Cultivo de Actinobacterias en agar avena para la caracterización
macroscópica.
Figura 9. Láminas portaobjetos listas para la observación microscópica.
.
24
Figura 10. Cultivos puros de Actinobacterias en agar avena.
25
a. Cuantificación del nitrógeno fijado in vitro
La cuantificación del nitrógeno fijado in vitro por las Actinobacterias
investigadas se realizó con el método colorimétrico de Berthelot o fenol hipoclorito
(Lara et al., 2007; Cadena & Martínez, 2011). El inóculo (5%:0,15mL) de cada
cultivo de Actinobacterias fue sembrado por triplicado en tubos de 15x150mL
conteniendo 3mL de caldo extracto de suelo 10% (Figura 11, anexo 3) y se
incubaron a 30°C, por 192 horas (8 días), con agitación constante (150rpm). A
continuación, se agregaron 9mL de KCl 2M, se agitaron a 150rpm durante 1 hora
y se dejaron en reposo 1 hora adicional, para después tomar 10mL de
sobrenadante y centrifugarlos (3000rpm) durante 5 minutos.
Los sobrenadantes se vertieron en tubos de dilución y se añadieron 0,4mL de
solución alcohólica de fenol al 10%; 0,4mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y
1mL de solución oxidante. Los tubos se agitaron manualmente por 2 minutos y se
dejaron en reposo durante 1 hora adicional. La reacción se consideró positiva a la
fijación de nitrógeno por la aparición de una coloración azul, leyéndose la
absorbancia en espectrofotómetro de luz visible a 632,9nm. Las concentraciones
de amonio se calcularon con la ecuación de la curva de calibración, obtenida
previamente con diluciones sucesivas de una solución de 100ppm de cloruro de
amonio (Anexo 3).
b. Cuantificación del fosfato solubilizado in vitro
La cuantificación de fosfato solubilizado in vitro por las Actinobacterias
investigadas se realizó con el método colorimétrico del molibdato (Alvarado &
Valderrama, 2014). El inóculo (5%: 0,25mL) de cada cultivo bacteriano se sembró
por triplicado en 5mL de caldo National Botanical Research Institute’s phosphate,
NBRIP (Figura 12, anexo 4) y se incubaron a 30°C, con agitación (150rpm), por
192 horas (8 días). Después, los caldos fueron centrifugados a 3000rpm por 5
minutos y en el sobrenadante se cuantificó el fósforo soluble (Rodier & Rodi,
2005), considerándose una coloración azul positiva a la solubilización del fosfato.
La absorbancia se leyó en espectrofotómetro de luz visible a 690nm y las
concentraciones de fósforo soluble se calcularon con la ecuación de la curva de
calibración, obtenida previamente con diluciones sucesivas de una solución de
10ppm de fósforo (Anexo 4).
26
Figura 11. Caldo extracto de suelo cultivado con Actinobacterias.
Figura 12. Caldo National Botanical Research Institute’s phosphate cultivado
con Actinobacterias.
27
c. Cuantificación de indoles producidos in vitro
La cuantificación de indoles producidos in vitro se realizó según la reacción
colorimétrica de Salkowski (Mantilla, 2007; García & Muñoz, 2010). El inóculo
(5%:0,25mL) de cada cultivo bacteriano fue sembrado por triplicado en 5mL de
caldo tripticasa soya suplementado con triptófano (Figura 13, anexo 5). Después
de la incubación a 30°C, por 192 horas (8 días), en agitación constante (150rpm),
los cultivos se centrifugaron a 3000rpm, durante 5 minutos. A continuación, 0,4mL
de cada sobrenadante se depositaron en tubos, se agregaron 1,6mL de reactivo
de Salkowski modificado, se mezclaron y se dejaron en reposo durante
30 minutos en oscuridad. La reacción se consideró positiva a la producción de
indoles por la aparición de una coloración grosella, leyéndose la absorbancia en
espectrofotómetro de luz visible a 530nm. Las concentraciones de indoles se
calcularon con la ecuación de la curva de calibración obtenida previamente con
diluciones sucesivas de una solución de 100ppm de ácido indolacético (Anexo 5).
3.2.9 Selección de Actinobacterias
Los cultivos de Actinobacterias seleccionados para la fase explicativa de la
investigación fueron seis, correspondientes a los valores máximos en la
concentración de nitrógeno fijado (dos cultivos), fosfato solubilizado (dos cultivos),
indoles producidos (dos cultivos).
3.2.10 Efecto de Actinobacterias en plantas de espárrago
Los seis cultivos de Actinobacterias seleccionados se inocularon en
coronas de espárrago (Figura 14), determinándose, durante 60 días el efecto en
el desarrollo vegetatiivo de las plantas, en condiciones de invernadero. El suelo
experimental estuvo constituido por 96 kg de una mezcla de suelo agrícola,
arena de río y humus en la proporción 2:1:1, que fue distribuido en macetas de
arcilla de 4,5kg de capacidad, a razón a 4kg por maceta. El cultivo de espárrago
y la inoculación de Actinobacterias se realizó entre el 19 de octubre de 2017 al
17 de diciembre de 2017, registrándose las temperaturas máximas (25 °C),
mínima (17 °C) y media (21,4 °C), valores obtenidos por la Estación
Meteorológica de la universidad Nacional Pedro Ruíz Gallo, ubicado en el fundo
“El Cienago” de Lambayeque (Anexo 6).
28
Figura 13. Caldo tripticasa soya suplementado con triptofano cultivado con
Actinobacterias.
Figura 14. Coronas de Asparagus officinalis L.
29
En el ensayo se sembraron coronas de espárrago cultivar UC-157 F2,
luego de ser tratadas por inmersión durante 5 minutos (Figura 15), en una
solución del fungicida Benomyl polvo mojable-WP (Benlate), en la dosis de 2gL-1
de agua declorada previamente durante 24 horas. El cultivar UC-157 fue obtenido
en 1980 en Estados Unidos (Farias et al., 2004). Es específico para la producción
de turiones verdes. Se comercializan los híbridos F1 y F2 y son los más precoces
y productivos del mercado (Delgado, 2007).
El inóculo fue obtenido con las Actinobacterias cultivadas en agar avena, a
300C. Después de 96 horas se agregó solución salina esterilizada
(NaCl 0,85% p/v), se centrifugó (3500 rpm) por 3 minutos, el sedimento
nuevamente se lavó con la misma solución y su concentración se estandarizó por
turbidimetría en el espectofotómetro a 600nm (Córdova, 2016).
Transcurridos 30 minutos del tratamiento con fungicida, las coronas de
espárrago se asperjaron con el inóculo bacteriano (100mL por corona), con ayuda
de un pulverizador de plástico de 500mL de capacidad (Figura 16). Después de
30 minutos de reposo a temperatura ambiental (250C), se sembraron en el suelo
experimental, a razón de una corona por maceta. Los riegos se realizaron cada
3 días con agua potable declorada, tomando en cuenta los requerimientos
hídricos de las plantas. Después de 15 días de la siembra, en el testigo químico
se aplicaron 250mL de una solución de fertilizante nitrogenado (Urea 46%), en la
dosis de 5gL-1 de agua, cada 30 días (Regalado, 1999).
Transcurridos 30, 45 y 60 días después de la siembra, se midió la altura de
las plantas (Figura 17) y se contaron los tallos (Figura 18). La altura se expresó en
cm, considerando desde la base del tallo más alto hasta la yema terminal
(Puicón, 2014). Con los valores de altura y número de tallos se calculó el índice
de efectividad de la inoculación (IEI) en porcentaje, mediante la fórmula (Carreño,
2009) siguiente:
IEI (%) =Tratamiento con inoculación − Control sin inoculación
Control sin inoculaciónx100
30
Figura 15. Inmersión de coronas de Asparagus officinalis L. en solución de
fungicida.
Figura 16. Aplicación del inóculo bacteriano en la corona de Asparagus officinalis L.
31
Figura 17. Medición de altura de tallo de Asparagus officinalis L.
Figura 18. Conteo del número de tallos de Asparagus officinalis L.
32
3.2.11 Análisis estadístico de los datos
Para el diseño experimental completamente aleatorio, el modelo aditivo
lineal fue:
Yij = u + ti + Eij
Dónde:
Yij = observación del i- ésimo tratamiento, J- enésima repetición
u = media general de la variable respuesta.
ti = efecto I- ésimo tratamiento, siendo i = 1, 2, 3, … 8
Eij = error experimental en el i- ésimo tratamiento, j- ésima repetición
H0 = u1 = u2 = u3,… = u8
Ha = al menos una media diferente
Con los valores de altura y número de tallos de las plantas se realizaron las
pruebas de normalidad y homogeneidad de varianza y según los resultados se
llevaron a cabo análisis paramétricos y no paramétricos (Hernández et al., 2014).
En el presente trabajo se utilizó el software estadístico SPSS versión 15,0 así como
los programas de Microsoft Office Word, Excel versión 2013 y Minitab 15.
33
IV RESULTADOS
4.1 Actinobacterias aisladas e identificadas en Asparagus officinalis L.
En el 78,13% (75) de las muestras de raíces y suelo rizosférico de espárrago se
aislaron Actinobacterias (Figura 19) que se desarrollaron en agar avena (Figura 20).
Se obtuvieron 110 cultivos puros, agrupados en 31 morfotipos de colonias, según el
color del micelio aéreo, micelio de sustrato, pigmento difusible en el medio de cultivo
y características microscópicas (Tabla 3). Se identificaron (Tabla 4) Streptomyces
(39,09%), Nocardia (37,27%), Micromonospora (9,09%), Nocardioides (8,18%) y
Pseudonocardia (6,37%).
El género Streptomyces se reconoció por el micelio aéreo con esporóforos no
espiralados y espiralados (Figura 21). En estos últimos se observaron espirales
primitivos, abiertos y cerrados. Nocardia presentó micelio de sustrato con tendencia
a fragmentarse en bacilos y elementos cocoides y un micelio aéreo que puede
originar cadenas de esporas (Figura 22). En Micromonospora el micelio aéreo
generalmente estuvo ausente y se observaron esporas aisladas formadas sobre el
micelio de sustrato (Figura 23). Nocardioides se caracterizó por la fragmentación del
micelio aéreo, poco desarrollado y de sustrato en elementos cocoides y bastoncillos
(Figura 24). Pseudonocardia presentó el micelio aéreo no fragmentado con largas
cadenas de esporas (Figura 25).
34
78,13%
21,87%
Positivas
Negativas
Figura 19. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis
L. positivas al aislamiento de Actinobacterias en agar avena.
Figura 20. Colonias de Actinobacterias desarrolladas en agar avena.
35
Tabla 3. Frecuencia de morfotipos de colonias de Actinobacterias aislados de
rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.
Morfotipo
Micelio
Observación n
microscópica
% Aéreo Sustrato Pigmento
difusible
1 Blanco No
pigmentado
No Espirales abiertos 15,45
2 Gris Marrón No Esporas cilíndricas 13,64
3 Gris Marrón No Espirales primitivos 11,82
4 Gris Verde claro No Espirales abiertos 9,09
5 Blanco No
pigmentado
No No espiralado 5,45
6 Gris No
pigmentado
No Espirales abiertos 4,55
7 Crema No
pigmentado
No Micelio sustrato
fragmentado
3,64
8 Gris Crema No Espirales abiertos 3,64
9 Blanco Anaranjado No Espirales cerrado 2,73
10 Gris Marrón No Esporas cilíndricas 2,73
11 Crema No
pigmentado
No Micelio sustrato
fragmentado
1,82
12 Blanco No
pigmentado
No No espiralado 1,82
13 Blanco No
pigmentado
No Micelio sustrato
fragmentado
1,82
14 Gris Rosado No No espiralado 1,82
15 Blanco No
pigmentado
No Espirales primitivos 1,82
16 Gris Rosado Si No espiralado 1,82
36
Continuacion…
Morfotipo
Micelio
Observación n
microscópica
% Aéreo Sustrato Pigmento
difusible
17 Blanco Negro Si Esporas
unicelulares
1,82
18 Blanco Rojo No Micelio sustrato
fragmentado
1,82
19 Marrón No
pigmentado
No Esporas cilíndricas 1,82
20 Gris No
pigmentado
Si Micelio sustrato
fragmentado
0,91
21 Gris Negro No Espirales cerrados 0,91
22 Marrón Negro No Espirales primitivos 0,91
23 Negro No
pigmentado
No Espirales primitivos 0,91
24 Blancos Anaranjado Si Espirales abiertos 0,91
25 Marrón Negro No Micelio sustrato
fragmentado
0,91
26 Marrón Negro Si Micelio sustrato
fragmentado
0,91
27 Granate No
pigmentado
Si Espirales cerrados 0,91
28 Verde
Oscuro
Marrón Si Espirales primitivos 0,91
29 Granate No
pigmentado
No Micelio aéreo
fragmentado
0,91
30 Gris Amarrillo Si No espiralado 0,91
31 Blanco Rosado Si Micelio sustrato
fragmentado
0,91
37
Tabla 4. Frecuencia de géneros identificados en Actinobacterias aisladas de
rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.
Género
Cultivo puros
Número %
Streptomyces 43 40,03
Nocardia 41 37,27
Micromonospora 10 9,09
Nocardioides 9 8,18
Pseudonocardia 7 6,36
38
.
Figura 21. Observación microscópica de los esporóforos de Streptomyces sp. no
espiralados (a), espirales primitivos (b), espirales abiertos (c), espirales
cerrados (d).
b
c d
a b
d
39
Figura 22. Observación microscópica de Nocardia sp.
Figura 23. Observacion microscópica de Micromonospora sp.
40
Figura 24. Observación microscópica de Nocardioides sp.
Figura 25. Observación microscópicas de Pseudonocardia sp.
41
4.2 Nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos por
Actinobacterias
El 92,73% (102) de los cultivos de Actinobacterias (Figura 26) fijaron
nitrógeno in vitro y como producto de la fijación se detectó amonio, evidenciado
por una coloración azul (Figura 27). La concentración de amonio osciló entre
2,267 a 31,513 ppm con Micromonospora sp.10.1 y Nocardia sp.4.3,
respectivamente (Tabla 5).
El 67,27% (74) de los cultivos de Actinobacterias (Figura 28), solubilizaron
fosfato in vitro y como producto de la solubilización se detectó fósforo soluble,
evidenciado por una coloración azul (Figura 29). La concentración de fósforo
soluble osciló entre 0,058 a 4,725 ppm con Streptomyces sp.19.1 y Nocardia
sp.44.2, respectivamente (Tabla 6).
Todos los cultivos de Actinobacterias produjeron indoles in vitro,
evidenciados por una coloración grosella (Figura 30). La concentración de
indoles producidos osciló entre 30,022 a 58,911 ppm con Streptomyces sp.9.3 y
Streptomyces sp.50.1, respectivamente (Tabla 7).
4.3 Cultivos de Actinobacterias seleccionados
Los seis cultivos de Actinobacterias seleccionados correspondieron a
Nocardia sp.4.3 y Streptomyces sp.5.5 con 31,513 y 31,256 ppm de amonio;
Nocardia sp.44.2 y Nocardia sp.35.6 con 4,725 y 4,379 ppm de fósforo soluble;
Streptomyces sp.50.1 y Streptomyces sp.11.3 con 58,911 y 58,466 ppm de
indoles (Tabla 8).
4.4 Efecto de Actinobacterias en la altura y número de tallos de Asparagus
officinalis L.
Los valores de altura y número de tallos de las plantas de espárrago
presentaron distribución normal (p>0,05) y homogeneidad de varianza (p>0,05),
por lo que se realizó el análisis de varianza de un solo factor y la prueba
múltiple de Tukey (Anexos 7 a 12).
42
92,73%
7,27%
Fijaron
No fijaron
Figura 26. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que
fijaron nitrógeno in vitro.
Figura 27. Coloración observada en la cuantificación de amonio
43
Tabla 5. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.
Actinobacterias código UNPRG
Amonio (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Amonio (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Amonio (ppm)
Nocardia sp.4.3
31,513
Streptomyces sp.4.1
19,803
Nocardia sp.15.5
14,803
Streptomyces sp.5.5
31,256
Nocardia sp.41.4
19,307
Nocardioides sp.41.3
14,802
Streptomyces sp.39.1
30,667
Micromonospora sp.40.4
19,142
Streptomyces sp.15.7
14,711
Streptomyces sp.30.1
29,528
Nocardia sp.40.5
18,921
Streptomyces sp.9.2
14.252
Micromonospora sp.15.2
29,307
Streptomyces sp.29.5
18,847
Pseudonocardia sp. 47.3
13.829
Streptomyces sp.1.3
29,050
Streptomyces sp.11.5
18,847
Streptomyces sp.10.2
13,792
Nocardia sp.13.4
28,572
Nocardia sp.29.3
18,700
Streptomyces sp.30.7
13,627
Nocardioides sp.4.2
28,167
Nocardia sp.29.7
18,296
Nocardia sp.44.2
13,167
Nocardia sp.40.2
27,965
Nocardia sp.5.3
18,276
Nocardia sp.4.5
13,039
Pseudonocardia sp.22.1
27,432
Nocardia sp.38.1
18,167
Streptomyces sp.24.1
12,873
Micromonospora sp.41.2
27,175
Nocardia sp.5.6
17,910
Nocardia sp.18.2
12,138
Nocardia sp.40.3
26,899
Nocardia sp.35.1
17,910
Streptomyces sp.11.6
11,844
Streptomyces sp.1.4
26,219
Nocardia sp.15.4
17,322
Micromonospora sp.46.1
11,733
Nocardia sp.37.1
25,741
Streptomyces sp.5.4
17,211
Streptomyces sp.39.3
11,697
Pseudonocardia sp.36.3
25,097
Nocardia sp.31.1
17,119
Nocardia sp.43.1
11,384
Streptomyces sp.23.2
25,006
Nocardioides sp.19.2
17,064
Nocardia sp.7.1
11,347
Pseudonocardia sp.36.2
24,472
Streptomyces sp.46.2
16,770
Nocardia sp.35.6
11,256
Micromonospora sp.12.1
24,454
Nocardia sp.48.1
16,495
Streptomyces sp.48.2
11,090
Nocardia sp.18.3
24,086
Streptomyces sp.42.2
16,439
Streptomyces sp.1.1
10,502
Streptomyces sp.11.2
23,792
Streptomyces sp.8.1
16,439
Streptomyces sp.3.1
10,483
Streptomyces sp.11.3
23,039
Streptomyces sp.11.4
16,403
Nocardioides sp.12.2
9,893
Streptomyces sp.50.1
22,542
Nocardia sp.11.1
16,200
Nocardia sp.30.2
9,436
Streptomyces sp.29.4
22,285
Pseudonocardia sp.24.6
16,145
Nocardia sp.45.3
8,737
Nocardia sp.11.8
23,733
Streptomyces sp.8.2
16,108
Micromonospora sp.45.1
7,744
44
Continuación…
Actinobacterias código UNPRG
Amonio (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Amonio (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Amonio (ppm)
Streptomyces sp.19.1
21.642
Pseudonocardia sp.29.2
16,108
Streptomyces sp.14.2
7,542
Streptomyces sp.12.4
21.439
Streptomyces sp.42.1
16,072
Nocardia sp.35.4
5,520
Streptomyces sp.30.4
21,403
Streptomyces sp.5.2
16,053
Nocardioides sp.21.2
4,233
Streptomyces sp.30.8
21,108
Streptomyces sp.9.3
16,017
Nocardia sp.39.6
4,159
Nocardioides sp.29.6
20,869
Micromonospora sp.41.5
15,978
Streptomyces sp.30.7
3,719
Streptomyces sp.11.9
20,575
Streptomyces sp.41.1
15,906
Streptomyces sp.32.1
3,425
Nocardia sp.44.4
20,465
Micromonospora sp.24.5
15,778
Pseudonocardia sp.51.3
3,314
Nocardia sp.39.2
20,281
Nocardia sp.49.1
15,759
Streptomyces sp.35.2
2,726
Nocardia sp.15.6
20,171
Nocardia sp.45.2
15,722
Streptomyces sp.24.4
2,629
Streptomyces sp.9.1
19,969
Nocardia sp.13.3
15,686
Micromonospora sp.10.1
2,267
45
67,27%
32,73%
Solubilizaron
No solubilizaron
Figura 28. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que
solubilizaron fosfato in vitro.
Figura 29. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble.
46
Tabla 6. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilización por Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.
Actinobacterias código UNPRG
P soluble (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
P soluble (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
P soluble (ppm)
Nocardia sp.44.2
4,725
Nocardia sp.48.1
4,092
Streptomyces sp.1.3
1,228
Nocardia sp.35.6
4,379
Nocardia sp.37.1
3,020
Streptomyces sp.8.1
1,012
Streptomyces sp.11.3
4,292
Pseudonocardia sp.51.3
2,991
Nocardia sp.5.6
0,997
Nocardia sp.39.2
4,205
Nocardia sp.39.6
2,919
Micromonospora sp.12.1
0,896
Nocardia sp.49.1
4,118
Nocardia sp.15.6
2,905
Nocardia sp.18.2
0,838
Streptomyces sp.11.2
4,031
Nocardia sp.45.2
2,861
Nocardia sp.11.1
0,737
Streptomyces sp.9.2
4,017
Micromonospora sp.46.1
2,832
Micromonospora sp.41.2
0,665
Nocardia sp.43.1
3,988
Streptomyces sp.39.1
2,760
Nocardia sp.40.2
0,650
Micromonospora sp.24.5
3,931
Micromonospora sp.45.1
2,746
Streptomyces sp.11.6
0,607
Pseudonocardia sp.47.3
3,916
Streptomyces sp.24.1
2,673
Streptomyces sp.14.2
0,607
Streptomyces sp.23.2
3,873
Nocardia sp.13.4
2,601
Streptomyces sp.12.4
0,592
Streptomyces sp.11.5
3,873
Streptomyces sp.4.1
2,298
Streptomyces sp.1.4
0,520
Nocardia sp.35.4
3,858
Streptomyces sp.15.7
2,283
Nocardioides sp.29.6
0,491
Nocardioides sp.41.3
3,858
Pseudonocardia sp.22.1
2,124
Nocardia sp.38.1
0,434
Nocardia sp.15.4
3,699
Streptomyces sp.29.4
2,081
Pseudonocardia sp.24.6
0,434
Micromonospora sp.10.1
3,699
Nocardia sp.41.4
2,052
Streptomyces sp.42.1
0,419
Micromonospora sp.15.2
3,613
Nocardioides sp.5.7
1,951
Streptomyces sp.9.1
0,419
Nocardia sp.4.3
3,598
Streptomyces sp.30.7
1,821
Nocardia sp.31.1
0,332
Nocardia sp.15.5
3,353
Nocardia sp.35.1
1,806
Streptomyces sp.46.2
0,332
Nocardia sp.39.4
3,338
Micromonospora sp.41.5
1,720
Streptomyces sp.24.4
0,332
Streptomyces sp.48.2
3,295
Nocardia sp.4.5
1,618
Streptomyces sp.50.1
0,275
Streptomyces sp.11.4
3,237
Streptomyces sp.8.2
1,503
Nocardia sp.30.6
0,202
Streptomyces sp.41.1
3,179
Streptomyces sp.3.1
1,286
Streptomyces sp.19.1
0,058
Nocardia sp.45.3
3,150
Streptomyces sp.35.2
1,257
Streptomyces sp.10.2
3,107
Pseudonocardia sp.36.2
1,229
47
Figura 30. Coloración observada en la cuantificación de indoles.
48
Tabla 7. Indoles producidos (ppm) por Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizosféra de
Asparagus officinalis L.
Actinobacterias código UNPRG
Indoles (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Indoles (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Indoles (ppm)
Streptomyces sp.50.1
58,911
Norcardioides sp.50.4
39,800
Nocardia sp.39.6
37,356
Streptomyces sp.11.3
58,466
Streptomyces sp.11.2
39,578
Pseudonocardia sp 24.6
36,911
Nocardia sp.39.2
48,911
Nocardia sp.34.2
39,578
Streptomyces sp.11.6
36,689
Nocardioides sp.12.2
48,244
Micromonospora sp.40.4
39,578
Nocardia sp.13.3
36,689
Streptomyces sp.1.1
47,133
Streptomyces sp 46.2
39,578
Micromonospora sp.10.1
36,467
Nocardia sp.30.6
46,022
Nocardia sp.5.3
39,578
Streptomyces sp.8.2
36,467
Pseudonocardia sp.47.3
44,911
Pseudonocardia sp.51.3
39,578
Nocardia sp 13.4
36,244
Streptomyces sp.11.4
44,689
Streptomyces sp.41.1
39,356
Streptomyces sp.19.1
36,244
Streptomyces sp.3.1
44,689
Nocardia sp.43.1
39,356
Streptomyces sp.24.1
36,022
Nocardia sp.35.4
44,467
Norcardioides sp.45.2
39,356
Streptomyces sp.42.1
36,022
Micromonospora sp.45.1
44,022
Nocardia sp.30.2
39,133
Micromonospora sp.45.1
36,022
Nocardia sp.29.3
43,578
Streptomyces sp.1.3
38,911
Nocardia sp.35.2
35,800
Nocardia sp.38.1
43,578
Streptomyces sp.30.1
38,911
Nocardia sp.41.4
35,578
Nocardia sp.15.4
43,356
Nocardia sp.37.1
38,911
Nocardia sp.7.1
35,578
Norcardioides sp.4.2
43,356
Nocardia sp.48.1
38,911
Streptomyces sp.12.4
35,356
Nocardioides sp.41.3
43,356
Micromonospora sp.15.2
38,687
Norcardioides sp.21.2
35,356
Streptomyces sp. 5.4
43,133
Streptomyces sp.30.7
38,687
Norcardioides sp.19.2
35,133
Micromonosporas sp.41.5
42,689
Streptomyces sp.23.2
38,467
Streptomyces sp.32.1
35,133
Nocardia sp.45.3
42,689
Nocardia sp.39.4
38,467
Nocardia sp.4.3
34,911
Streptomyces sp.30.4
42,244
Streptomyces sp.39.3
38,467
Nocardia sp.35.1
34,689
Pseudonocardia sp.36.3
42,022
Nocardia sp.15.6
38,244
Streptomyces sp.39.4
34,689
Nocardia sp.40.3
41,800
Nocardia sp.18.3
38,244
Streptomyces sp.5.2
34,689
Streptomyces sp.9.1
41,578
Pseudonocardia sp.22.1
38,244
Micromonospora sp.12.1
34,467
Nocardia sp.15.5
41,356
Streptomyces sp.29.4
38,244
Micromonospora sp.24.5
34,467
49
Continuación…
Actinobacterias código UNPRG
Indoles (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Indoles (ppm)
Actinobacterias código UNPRG
Indoles (ppm)
Nocardia sp.49.1
41,133
Streptomyces sp.39.1
38,244
Nocardia sp.11.8
34,244
Streptomyces sp.8.1
41,133
Streptomyces sp.4.1
38,244
Streptomyces sp.29.5
33,800
Streptomyces sp.11.7
40,911
Nocardia sp.5.6
38,244
Streptomyces sp.1.4
33,356
Nocardia sp.31.1
40,911
Streptomyces sp.14.2
38,022
Streptomyces sp.10.2
33,356
Pseudonocardia sp.36.2
40,911
Pseudonocardia sp.29.2
38,022
Streptomyces sp.11.9
33,133
Streptomyces sp.48.2
40,911
Nocardia sp.4.5
38,022
Nocardia sp.40.5
32,911
Streptomyces sp.9.2
40,911
Streptomyces sp.42.2
38,022
Nocardioides sp.5.7
32,911
Nocardia sp.40.2
40,689
Streptomyces sp.24.4
37,800
Micromonosporas sp.46.1
32,244
Micromonosporas sp.41.2
40,467
Nocardia sp.44.2
37,800
Streptomyces sp.15.7
31,133
Nocardia sp.41.5
40,467
Nocardia sp.18.2
37,577
Nocardia sp.29.7
31,133
Streptomyces sp.11.5
40,244
Nocardioides sp.29.6
37,577
Nocardia sp.35.6
30,022
Nocardia sp.38.1
40,244
Streptomyces sp.5.5
37,577
Streptomyces sp.9.3
30,022
Nocardia sp.11.1
40,022
Streptomyces sp.30.8
37,356
Tabla 8. Valores (ppm) de amonio, fósforo soluble e indoles correspondientes a
cultivos de Actinobacterias seleccionados.
Actinobacterias código UNPRG
Amonio (ppm)
Fósforo soluble (ppm)
Indoles (ppm)
Nocardia sp.4.3 31,513 3,598 34,911
Streptomyces sp.5.5 31,256 0 37,577
Nocardia sp.44.2 13,167 4,725 37,800
Nocardia sp.35.6 11,256 4,379 30,022
Streptomyces sp.50.1 22,542 0,275 58,911
Streptomyces sp.11.3 23,039 4,292 58,466
50
La altura de las plantas de espárrago a los 30 días fue de 19,00 a 32,00 cm
con las Actinobacterias; 16,00 cm en el testigo absoluto y 21,67 cm en el testigo
químico (Figuras 31 a 33), registrándose índices de efectividad de 18,8% con
Nocardia sp.35.6 y 100,0% con Streptomyces sp.5.5 (Tabla 9). El análisis de
varianza de los valores de altura demostró alta significancia (Anexo 7) y según la
prueba múltiple de Tukey (Tabla 10) los mayores valores se alcanzaron con
Streptomyces sp.5.5 y Nocardia sp.4.3, sin diferencias significativas entre ellos,
pero si con los demás tratamientos.
El número de tallos de las plantas de espárrago a los 30 días fue de 1,67 a
4,33 con las Actinobacterias; 2,00 tallos en el testigo absoluto y 2,00 tallos en el
testigo químico (Figura 34), registrándose índices de efectividad de 50,0% con
Streptomyces sp.5.5 y Nocardia sp.4.3 y 116,5% con Streptomyces sp.11.3 (Tabla
11). El análisis de varianza de los valores del número de tallos no demostró
significancia (Anexo 8).
La altura de las plantas de espárrago a los 45 días fue de 21,85 a 37,44cm
con las Actinobacterias; 20,80 cm en el testigo absoluto y 23,62 cm en el testigo
químico (Figuras 35 a 37), registrándose índices de efectividad de 5,1% con
Nocardia sp.44.2 y 80,0% con Streptomyces sp.5.5 (Tabla 9). El análisis de
varianza de los valores de altura demostró alta significancia (Anexo 9) y según la
prueba múltiple de Tukey (Tabla 10) los mayores valores se alcanzaron con
Nocardia sp.4.3 y Streptomyces sp.5.5, sin diferencias significativas entre ellos,
pero si con los demás tratamientos.
El número de tallos de las plantas de espárrago a los 45 días fue de 2,33 a
4,67 con las Actinobacterias; 2,33 tallos en el testigo absoluto y 2,67 tallos en el
testigo químico (Figura 38), registrándose índices de efectividad de 14,6% con
Nocardia sp.35.6 y 100,4% con Streptomyces sp.11.3 (Tabla 11). El análisis de
varianza de los valores del número de tallos no demostró significancia (Anexo 10).
La altura de las plantas de espárrago a los 60 días fue de 30,37 a 51,80cm
con las Actinobacterias; 28,29 cm en el testigo absoluto y 29,52 cm en el testigo
químico (Figuras 39 a 41), registrándose índices de efectividad de 7,4% con
Nocardia sp.44.2 y 83,1% con Nocardia sp.4.3 (Tabla 9).
51
Figura 31. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de
coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces
sp.5.5.
Figura 32. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de
coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.4.3.
52
Figura 33. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación de
Actinobacterias.
Tabla 9. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en la altura de Asparagus
officinalis L. a los 30, 45 y 60 días. aaaaaaaaaaaaaaaaa
Actinobacterias código UNPRG
30 días
IE%
45 días
60 días
Nocardia sp.4.3 92,7 77,9 83,1
Streptomyces sp.5.5 100,0 80,0 78,6
Nocardia sp.44.2 22,8 5,1 7,4
Nocardia sp.35.6 18,8 14,4 13,6
Streptomyces 50.1 56,3 39,4 43,5
Streptomyces sp.11.3 54,2 34,0 40,9
Testigo químico 35,4 13,6 4,4
32,0030,83
25,00 24,67
21,6719,67 19,00
16,00
0
5
10
15
20
25
30
35A
ltu
ra (
cm
)
53
Tabla 10. Prueba de Tukey de la altura de plantas de Asparagus officinalis L. a los
30, 45 y 60 días después de la inoculación de Actinobacterias
Figura 34. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 30 días después de la
inoculación de Actinobacterias.
Actinobacterias código UNPRG
30 días
Sign.
45 días Sign.
.
60 días Sign.
Nocardia sp.4.3 30,83 a 37,00 a 51,80 a
Streptomyces sp.5.5 32,00 a 37,44 a 50,54 a
Nocardia sp.44.2 19,00 cd 21,85 cd 30,37 c
Nocardia sp.35.6 19,67 bcd 23,80 bcd 32,13 c
Streptomyces 50.1 25,00 b 29,00 b 40,60 b
Streptomyces sp.11.3 24,67 b 27,88 b 39,88 b
Testigo quimico 21,67 bc 23,62 bcd 29,52 c
Testigo absoluto 16,00 c 20,80 d 28,29 c
4,33
3,67
3,00 3,00
2,332,00 2,00
1,67
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Nú
me
ro d
e t
allo
s
Altura (cm)
54
Tabla 11. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en el número de tallos de
Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días.
Figura 35. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de
coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces
sp.5.5.
Actinobacterias código UNPRG
30 días
IE%
45 días
60 días
Streptomyces sp.5.5 50,0 57,5 49,8
Nocardia sp.4.3 50,0 71,8 62,2
Nocardia sp.44.2 0 0 0
Streptomyces sp.50.1 83,5 85,8 74,9
Nocardia sp.35.6 0 14,6 12,4
Streptomyces sp.11.3 116,5 100.4 99,6
Testigo químico 16,5 14,6 12,4
55
Figura 36. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de
coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia
sp.44.2.
Figura 37. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 45 días después de la inoculación de
Actinobacterias.
Altu
ra (
cm
)
37,44 37,00
29,00 27,88
23,80 23,6221,85 20,80
0
5
10
15
20
25
30
35
40
56
Figura 38. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 45 días después de la
inoculación de Actinobacterias.
Figura 39. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de
coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces
sp.5.5.
4,674,33
4,003,67
2,67 2,672,33 2,33
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5N
úm
ero
de
tallo
s
57
Figura 40. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de
coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.4.3
Figura 41. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 60 días después de la inoculación de
Actinobacterias.
Altu
ra (
cm
)
51,80 50,54
40,60 39,88
32,13 30,37 29,52 28,29
0
10
20
30
40
50
60
58
El análisis de varianza de los valores de altura demostró alta significancia
(Anexo 11) y según la prueba múltiple de Tukey (Tabla 10) los mayores valores se
alcanzaron con Streptomyces sp.5.5 y Nocardia sp.4.3, sin diferencias
significativas entre ellos, pero si con los demás tratamientos.
El número de tallos de las plantas de espárrago a los 60 días fue de 2,67 a
5,33 con las Actinobacterias; 2,67 tallos en el testigo absoluto y 3,00 tallos en el
testigo químico (Figura 42), registrándose índices de efectividad de 12,4% con
Nocardia sp.35.6 y 99,6% con Streptomyces sp.11.3 (Tabla 11). El análisis de
varianza de los valores del número de tallos no demostró significancia (Anexo 12).
59
Figura 42. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 60 días después de la
inoculación de Actinobacterias.
5,33
4,674,33
4,00
3,00 3,002,67 2,67
0
1
2
3
4
5
6
Nú
me
ro d
e t
allo
s
60
V. DISCUSIÓN
En las raíces y suelo rizosférico de espárrago se aislaron Actinobacterias,
microorganismos que también fueron reportados en cultivos agrícolas como
Capsicum annuum L. “pimiento” (Ezziyani et al., 2004), Theobroma cacao “cacao”
(Barreto et al., 2008), Vitis sp. “vid” (Franco et al., 2009), Solanum tuberosum L.
“papa” (Rico, 2009), Lycopersicon esculentum Mill “tomate” (Núñez & Vásquez,
2013), Zea mays L. “maíz” (Arrunátegui, 2015). Asimismo, las Actinobacterias se
aislaron de malezas (Infante & Zurita, 2013), estiércol (Piñero & Rivas, 2004) y
sedimentos de ríos, lagos (Leiva et al., 2004) y litoral marino (León et al., 2007).
Las Actinobacterias son abundantes en el suelo, pero también en los
ambientes acuáticos, dulces y marinos (Leyva et al., 2004; León et al., 2007;
Franco, 2008). En el suelo se encuentran en una concentración promedio de 106
UFC g-1 de suelo seco (Franco, 2008) y sobreviven frente a condiciones adversas
gracias a su versatilidad metabólica (Ezziyani et al., 2004), formación de esporas
(Flardh & Buttner, 2009) y gránulos de polihidroxialcanoatos, PHA (Franco et al.,
2009).
Las Actinobacterias se identificaron fenotípicamente, coincidiendo con
Farfán & Gutiérrez (2009), Salazar & Ordóñez (2013) y Prieto et al. (2015); no
obstante, cuando las condiciones lo permiten se debe realizar la caracterización
molecular (Barreto et al., 2008; Franco, 2008; Prieto et al., 2015). Se identificaron
cinco géneros, previamente reportados por Salazar & Ordóñez (2013) en suelos
de un jardín botánico (Streptomyces, Nocardia), Núñez & Vásquez (2013) en la
61
rizósfera de tomate (Micromonospora, Pseudonocardia) e Infante & Zurita (2013)
en suelo rizosférico de malezas (Norcadioides).
El género Streptomyces predominó en las Actinobacterias investigadas,
coincidiendo con Rico (2009), Salazar & Ordóñez (2013), Infante & Zurita (2013) y
Núñez & Vásquez (2013). Según Franco (2008), con los métodos convencionales
de aislamiento, el 95% de los actinomicetos pertenece al género Streptomyces,
seguido de Nocardia y Micromonospora.
En la caracterización fisiológica de las Actinobacterias se investigó la
fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos y producción de indoles, al igual
que Infante & Zurita (2013) y Núñez & Vásquez (2013); no obstante, también se
puede investigar la actividad enzimática (Moya, 2011; Srividya et al., 2012),
producción de sideróforos (Franco, 2008; Srividya et al., 2012) y actividad
antifungica (Farfán & Gutiérrez, 2009; Rico, 2009).
El 92,73% de los cultivos de Actinobacterias fijaron nitrógeno in vitro,
desarrollando en medio de cultivo sin nitrógeno. De igual forma, Franco (2008)
demostró la fijación de nitrógeno por Actinobacterias aisladas de la rizósfera de
papa y cultivadas en medio mineral sin nitrógeno durante 10 días. Por su parte,
Núñez & Vásquez (2013), Aguilar & Deza (2014) y Arrunátegui (2015) reportaron
la fijación de nitrógeno por bacterias aisladas de tomate, piñon blanco y maíz,
respectivamente.
El amonio producido durante la fijación de nitrógeno se cuantificó
indirectamente con el método colorimétrico del fenol hipoclorito (Cadena &
Martínez, 2011); sin embargo, también se puede realizar la prueba de reducción
de acetileno y la detección del gen nifH, que codifica para la enzima nitrogenasa
(Franco, 2008). La concentración máxima de amonio fue de 31,513 ppm, valor que
se encuentra en el rango 1,4-34,0 ppm registrado para Actinobacterias aisladas de
tomate (Núñez & Vásquez, 2013) y maíz (Arrunátegui, 2015).
El 67,27% de los cultivos de Actinobacterias solubilizaron fosfato,
superando a Rico (2009) quien reportó que el 46,7% de las Actinobacterias
aisladas de la rizósfera de papa fue positivo para la solubilizacion de fosfato
62
tricálcico. De igual manera, Barreto et al. (2008), López (2013) y Prieto et al.
(2015) demostraron la solubilización de fosfatos por estas bacterias. Al respecto,
Prieto et al. (2015) determinaron la producción de ácidos oxálico, cítrico y
glucónico por Actinobacterias solubilizadoras de fósforo. Asimismo, Rico (2009)
demostró la disminución del pH neutro hasta 5,5 del caldo de cultivo con fosfato
tricálcico, evidenciando la acidez generada por las bacterias durante la
solubilizacion; no obstante, Hamdali et al. (2012) reportaron que los sideróforos o
iones queladores, productores de alcalinidad son responsables de la solubilización
de fosfatos por las Actinobacterias.aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Todos los cultivos de Actinobacterias produjeron indoles, superando a Rico
(2009) quien determinó que el 48,8% de las Actinobacterias aisladas de la
rizósfera de papa fue positivo para la producción de estos compuestos. De igual
manera, Barreto et al. (2008), Castellanos et al. (2009), Srividya et al. (2012) y
López (2013) demostraron la producción de indoles por las Actinobacterias. La
concentración máxima de indoles fue de 58,911 ppm valor superior a 51,78 ppm
reportadas por Rico (2009) para aislados de papa.a
Las Actinobacterias fijadoras de nitrógeno, solubilizadoras de fosfato y
productoras de indol incrementaron la altura y número de tallos de las plantas de
espárrago, demostrándose su potencial como promotoras de crecimiento en
plantas. Asimismo, el efecto positivo de las Actinobacterias fue reportado por
Stechmann (2011) en papa, Pérez (2012) en pepino, Suwan et al (2012) en chili,
Cabrera & Paredes (2013) en maíz y Salazar & Ordóñez (2013) en lechuga.
La promoción del crecimiento de las plantas por las Actinobacterias está
asociada a mecanismos directos como la síntesis de auxinas (Otero, 2011),
fijación de nitrógeno (Salazar & Ordóñez, 2013), solubilización de fosfatos (Núñez
& Vásquez, 2013) y también presentan mecanismos indirectos o de control
biológico (Srividya et al., 2012) que disminuyen la agresividad de los fitopatógenos
radiculares (Anitha & Rabeeth, 2009; Cabrera & Paredes, 2013) y foliares (Srividya
et al., 2012).
63
Los mayores índices de efectividad en altura y número de tallos se
alcanzaron con Streptomyces spp. Este género agrupa bacterias con una amplia
actividad biológica de aplicación en la agricultura, como insecticidas (Hernández &
Mondragón, 2002), fungicidas (Hassan et al., 2011), herbicidas (Doumbou et al.,
2002) y reguladores del crecimiento (Balakrishna et al., 2012; Cabrera & Paredes,
2013).
64
VI. CONCLUSIONES
En el rizoplano y rizósfera de espárrago fueron aisladas Actinobacterias,
del género Streptomyces (39,09%), Nocardia (37,27%), Micromonospora
(9,09%), Nocardioides (8,18%) y Pseudonocardia (6,37%).
Las Actinobacterias aisladas e identificadas fijaron in vitro nitrógeno
(2,257 a 31,513 ppm de amonio), solubilizaron fosfato tricálcico (0,058 a
4,725 ppm de fósforo soluble) y produjeron indoles (30,022 a 58,911 ppm
de índoles).
Los cultivos de Actinobacterias seleccionados fueron los que alcanzaron
los mayores valores en la concentración de amonio: Nocardia sp.4.3 y
Streptomyces sp.5.5; concentración de fosforo soluble: Nocardia spp.44.2
y 35.6 y concentración de indoles: Streptomyces spp.50.1 y 11.3.
Las Actinobacterias demostraron su potencial como promotoras de
crecimiento en plantas, al incrementar la altura con IE= 19 a 51% y el
número de tallos con IE= 5,1 a 116% de plantas de espárrago, en
condiciones de invernadero.
65
VII. RECOMENDACIONES
Identificar a nivel molecular Streptomyces spp. 5.5; 50.1; 11.3 y
Nocardia spp. 4.3; 44.2 y 35.6.
Determinar el efecto de Streptomyces spp. 5.5; 50.1; 11.3 y Nocardia
spp. 4.3; 44.2 y 35.6 en el desarrollo vegetativo y rendimiento de
espárrago en condiciones de campo, con y sin fertilizante químico.
Investigar sustratos orgánicos de bajo costo para el incremento masivo
de Streptomyces spp. 5.5; 50.1; 11.3 y Nocardia spp. 4.3; 44.2 y 35.6.
66
VIII. RESUMEN
En el rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis L. “espárrago” se aislaron
Actinobacterias, con el objetivo de determinar su potencial como promotoras de
crecimiento en plantas. Las bacterias se aislaron en agar avena y las colonias
desarrolladas se identificaron fenotípicamente. Se cuantificó el nitrógeno fijado
como amonio, fósforo soluble producto de la solubilización de fosfato tricálcico
e indoles producidos por las bacterias in vitro. Los seis cultivos de
Actinobacterias que alcanzaron los mayores valores, se inocularon por
aspersión en coronas de espárrago cultivar UC-157 F2 y se determinó el efecto
en la altura y número de tallos, durante 60 días en invernadero. Se aislaron
Actinobacterias, identificándose Streptomyces (39,09%), Nocardia (37,27%),
Micromonospora (9,09%), Nocardioides (8,18%) y Pseudonocardia (6,37%).
Las Actinobacterias fijaron nitrógeno, solubilizaron fosfato tricálcico y
produjeron indoles in vitro, cuantificándose 2,257 a 31,513 ppm de amonio;
0,058 a 4,725 ppm de fósforo soluble y 30,022 a 58,911 ppm de indoles. Los
seis cultivos con los mayores valores demostraron su potencial como
promotores de crecimiento en plantas, incrementando la altura (IE= 19 a 51%)
y el número de tallos (IE= 5,1 a 116%) de plantas de espárrago, en condiciones
de invernadero.
67
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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75
X. ANEXOS
76
ANEXO 1
Cálculo del número de muestras para el aislamiento de Actinobacterias
(en Vásquez et al., 2012)
n= Z2 p.q
T2 n= (1,96)2 (0,90. 0,10)
(0,06)2
n = 96,04 muestras
Dónde:
n = Tamaño de la muestra
Z = 1,96 (α= 0,05) valor estándar
p = Prevalencia de Actinobacterias promotaras del crecimiento en
plantas (0,90).
q = 1-p, ausencia (0,10).
T= Error estimado (6%).
77
ANEXO 2
Medios de cultivo y soluciones para el aislamiento, identificación y
mantenimiento de Actinobacterias
a. Agar avena (en Franco, 2008)
En 600mL de agua destilada agregar 60g de avena dejar hervir por
30 minutos, después colar y completar hasta 1000mL.
b. Agar nutritivo (en Escobar & Horna, 2011)
c. Caldo extracto de suelo al 10% (en García & Muñoz, 2010)
Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10%, depositar en un
matraz 250g de suelo agrícola y 500mL de agua destilada. Hervir 2 horas,
completar a 500mL con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25mL
del filtrado y completar a 500mL con agua destilada.
Componentes gL-1
Avena
Agar
1000mL
15,0
Componentes gL-1
Peptona
Extracto de carne
Agar agar
Agua destilada csp
5,0
3,0
15,0
1000 mL
Componentes gL-1
K2HPO4
MgCl2
MgSO4. 7H2O
FeCl3
CaCl2
Triptona
Extracto de levadura
Extracto de suelo al 10 %
Agua destilada
0,4
0,1
0,05
0,01
0,1
1,0
1,0
250mL
750mL
78
d. Medio de cultivo National Botanical Research Institute, NBRIP (en
Alvarado & Valderrama, 2014)
Solución de antimicótico (en Alvarado & Valderrama, 2014)
Disolver una capsula de 150mg de Fluconazol en 10mL de alcohol al 95%.
Agregar 2mL de solución de antimicótico por litro de medio de cultivo para
tener 45mg de Fluconazol por litro.
e. Caldo tripticasa Soya suplementado con triptófano (en Escobar &
Horna, 2011)
Disolver por calentamiento y ajustar a pH 7,3
Componentes gL-1
Glucosa
Ca3(PO4)2
(NH4)2SO4
MgSO4. 7H2O
KCl
MgCl2. 6H2O
Agar agar
Agua destilada
10,0
5,0
0,1
0,25
0,2
5,0
15,0
1000mL
Componentes gL-1
Peptona de caseína
Peptona de harina de Soya
D (+) glucosa (dextrosa)
Cloruro de sodio
Fosofato dipotasico
Triptofano
Agua destilada cps
17,0
3,0
2,5
5,0
2,5
0,01
1000 mL
79
ANEXO 3
Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar el ion
amonio
a. Reactivos (en Lara et al; 2007., Cadena & Martínez, 2011)
• Cloruro de potasio 2M
Cloruro de potasio 149,12g
Agua destilada 1000mL
• Solución alcohólica de fenol 10%
Fenol concentrado 10mL
Alcohol 97º 90mL
• Nitroprusiato de sodio 0,5%
Nitroprusiato de sodio 0,5g
Agua destilada 100mL
• Solución oxidante
Citrato de sodio 20,0g
Hidróxido de sodio 1,0g
Hipoclorito de sodio 5% (lejía comercial) 2mL
Agua destilada 100mL
b. Método colorimétrico de Berthelot para cuantificar el nitrógeno en
amonio (en Lara et al., 2007)
b.1 Fundamento del método colorimétrico de Berthelot (fenolhipoclorito)
Se basa en la formación de un color azul intenso de indofenol, que resulta
de la reacción del ión amonio (NH4) con los compuestos fenólicos, en
presencia de un agente oxidante como el hipoclorito de sodio u o-fenol y un
catalizador, principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. El mecanismo
de la reacción depende de la luz presente, la temperatura ambiente,
catalizadores y pH alcalino. Cuando se utiliza fenol o sodio la reacción puede
ser representada de la siguiente manera:
NH3 + 2C6H60-+ 3ClO- O= C6H4= N-C6H4-O + 2H2O + OH- + 3Cl-
b.2 Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH4Cl
Para obtener la curva patrón se prepara una solución madre de 100ppm
de NH4CI, para lo cual se pesa 0,1g de NH4CI y se disuelve en 1L de agua
bidestilada. Posteriormente, a partir de la solución madre se efectúan las
siguientes diluciones:
80
N° de tubo Solución patrón
[mL]
H2O bidestilada
[mL]
NH4Cl
(Ug/mL = ppm)
NH4Cl
[µg /mL= ppm]
1 0,0 10,0 0
2 0,2 9,8 2
3 0,4 9,6 4
4 0,6 9,4 6
5 0,8 9,2 8
6 1,0 9,0 10
7 1,5 8,5 15
8 2,0 8,0 20
b.3 Procedimiento para la cuantificación de amonio por colorimetría
Obtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4mL de solución
alcohólica de fenol al 10%; 0,4mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y 1mL de
solución oxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1 hora.
Observar una coloración que varía del verde azul al azul intenso según la
concentración de amonio. Leer la absorbancia de cada dilución en el
espectrofotómetro a 632,9nm.
Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de
amonio, corregir los valores y mediante regresión lineal con el programa
Microsoft Excel 2010, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de
determinación (R2) que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión
homogénea de los valores sobre la recta.
Nº tubo NH4 100 (ppm) Absorbancia Absorbancia corregida
01 0 0,058 0,000
02 2 0,199 0,141
03 4 0,311 0,253
04 6 0,480 0,422
05 8 0,576 0,518
06 10 0,619 0,561
07 15 0,884 0,826
81
y = 0.0544x + 0.0387R² = 0.9829
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 5 10 15 20
Absorb
ancia
NH4 100 ppm
Obtenida la absorbancia de las siete concentraciones de amonio, introducir
los datos el el programa Microsoft Office Excel 2007 y construir la curva
patrón de calibración:
En la ecuación obtenida:
Donde:
y: representa la absorbancia captada (variable dependiente).
x: cantidad de amonio en ppm (variable independiente).
Despejar “x” para obtener la cantidad de amonio (ppm) fijado por cada bacteria
nativa.
𝒚 = 𝟎, 𝟎𝟓𝟒𝟒𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟖𝟕
𝐱 = y - 0,0387
0,0544
82
ANEXO 4
Cuantificación de fósforo solubilizado in vitro
a. Reactivos (en Rodier & Rodi, 2005)
Solución de ácido sulfúrico 5N
Ácido sulfúrico (d = 1,84) 14 mL
Agua destilada hasta enrase 100 mL
Solución de molibdato amónico 4 % 20 mL
Solución de ácido ascórbico
Ácido ascórbico 1,76 mL
Agua destilada hasta enrase 100 mL
Solución de amético (Preparar al momento del uso)
Tartrato doble de antimonio y potasio 0,0274 g
Agua destilada hasta enrase 100 mL
Reactivo para determinación de ortofosfatos
Ácido sulfúrico 5 N 40 mL
Solución de Molibdato amónico 12 mL
Solución de ácido ascórbico 24 mL
Solución de emético 4 mL
Solución madre de 0,2 mgL-1 de fósforo
Fosfato monopotásico previamente desecado
en estufa a 100 °C 877 g
Agua destilada hasta enrase 100 mL
Solución hija de 2mgL-1 de fósforo
Diluir 1mL de solución madre en 99mL de agua destilada
(1/100)
b. Método colorimétrico del Molibdato para cuantificar fósforo soluble
( en Rodier Rodi, 2005)
b.1. Fundamento
En medio ácido y en presencia de molibdato amónico, los ortofosfatos
forman un complejo fosfomolíbdico que, reducido por el ácido ascórbico,
83
desarrolla una coloración azul susceptible de una determinación colorimétrica
y cuya aparición se acelera utilizando el catalizador emético, tartrato doble de
antimonio y potasio.
b.2. Limpieza de los recipientes de vidrio
Para la limpieza del material de vidrio no utilizar detergentes que
contengan fosfato. Lavados con ácido clorhídrico diluido y enjuagados
cuidadosamente con agua destilada.
b.3. Preparación de la curva de calibración
Colocar en una serie de matraces aforados de 25 mL:
Número de matraces T I II III
Solución salina de fósforo de 2 mgL-1 (mL) 0 1 2 5
Agua bidestilada (mL) 20 19 18 15
Reactivo indicador (mL) 4 4 4 4
Agua destilada hasta enrase (mL) 25 25 25 25
Correspondencia de fósforo en mgL-1 0 0,1 0,2 0,5
Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en el espectrofotómetro a la
longitud de onda de 690nm en cubetas de 10cm. Construir la curva de
calibración. Los datos de la absorbancia corregida se analizan mediante
regresión lineal con el programa Microsoft Excel 2007 para obtener la
ecuación de la recta y el coeficiente (R2) que deberá ser mayor a 0,9 para
demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la recta.
b.4. Procedimiento para cuantificar fosfatos en la muestra
Introducir 20mL de la muestra a analizar en un matraz aforado de 25mL
Añadir 4mL de reactivo indicador, completar el volumen a 25mL con agua
destilada. Esperar 20 minutos y efectuar la lectura en el espectrofotómetro de
luz visible con una longitud de onda de 690nm. Tener en cuenta el valor leído
para el testigo. Obtener los resultados en la curva de calibración. Para una
muestra de 20mL, la curva indica el contenido de fósforo expresado en
miligramos por litro.
84
N° de tubo Fósforo soluble Absorbancia
(ppm)
1 0,1 0,077
2 0,2 0,085
3 0,5 0,105
Una vez obtenida la absorbancia de las tres concentraciones de fosfato
dicálcico, introducir los datos en el programa Micrsoft Office Excel 2007 y
construir la curva patrón de calibración:
En la ecuación obtenida:
Donde:
y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)
x: cantidad de fósforo en ppm (variable independiente)
Despejar “x” para obtener la cantidad de fósforo (ppm) producido por cada
bacteria nativa.
y = 0.0692x + 0.0705R² = 0.9985
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Ab
sorb
anci
a 69
0 n
m
Fósforo (ppm)
𝐲 = 𝟎, 𝟎𝟔𝟗𝟐𝐱 + 𝟎, 𝟎𝟕𝟏
𝐱 = 𝐲 − 𝟎, 𝟎𝟕𝟏
𝟎, 𝟎𝟔𝟗𝟐
85
ANEXO 5
Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar indoles
a. Rectivos
Reactivo de Salkowski (en García & Muñoz, 2010)
Al momento de la preparación, verter el acido sulfúrico concentrado en un
balón con 250mL de agua destilada y simultáneamente enfriar con chorro de
agua constante. Finalmente agregar el cloruro férrico al 0,5 M.
Utilizar 4mL del reactivo para 1mL de la muestra investigada.
b. Método colorimétrico de Salkowski para cuantificar índoles (en Mantilla,
2007)
b.1. Fundamento de la reacción de Salkowski
Mediante la reacción de Salkowski se detectan grupos indol presentes en
el medio de cultivo y la concentración de indol es directamente proporcional a
la intensidad de color rojo producido. A su vez, el cambio de color es el
resultado de una reacción oxidativa con el ácido sulfúrico, donde por medio de
una transaminación un grupo amino es sustituido por el cloro proveniente del
FeCl3, originando un compuesto visible de color rosado a rojo en el caso del
indolacético. Otras coloraciones indican la presencia de productos intermedios
de la síntesis del ácido indolacético, que pueden ser generados a partir del
triptófano.
b.2. Preparación de diluciones a partir de una solución madre de AlA
Para obtener una curva patrón de ácido indolacético, preparar una solución
madre de 100ppm, para lo cual se pesan 10mg de ácido indolacético y se
disuelven con unas gotas de NaOH en un matraz aforado a 100mL.
Componentes gL-1
H2SO4 concentrado
Agua destilada
FeCl3 0,5M en Agua destilada
150 mL
250 mL
7,5 mL
86
A continuación, enrasar con agua bidestilada y agitar hasta homogenizar.
Posteriormente se realizan las siguientes diluciones:
N° de tubo Solución patrón H2O bidestilada Concentración
(100 µgmL-1) [µL]* AIA (mgL-1)
1 0 1000 0
2 20 980 2
3 40 960 4
4 60 940 6
5 80 920 8
6 100 900 10
7 150 850 15
8 200 800 20
9 300 700 30
10 400 600 40
11 500 500 50
12 600 400 60
*1000 µL = 1 mL
b.3. Procedimiento para la cuantificación de AIA por colorimetría
Obtenidas las concentraciones parciales de AIA extraer de cada tubo
0,4mL de solución, verter en tubos de 13 x 75mm y agregar 1,6mL de reactivo
de Salkowski (1:4). Dejar en reposo en oscuridad por 30 minutos. Observar la
presencia de una coloración rojiza en los tubos. A continuación, leer la
absorbancia de cada dilución en espectrofotómetro a 530nm.
Una vez obtenida la absorbancia en todas las concentraciones de ácido
indolacético, corregir los valores y mediante regresión lineal en el programa
Microsoft Excel 2007, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente (R2) que
deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los
valores sobre la recta.
87
N° de tubo AIA (µg/mL) Absorbancia
01 0 0,000
02 2 0,013
03 4 0,023
04 6 0,034
05 8 0,043
06 10 0,060
07 15 0,087
08 20 0,110
09 30 0,141
10 40 0,202
11 50 0,229
12 60 0,273
Obtenida la absorbancia de las doce concentraciones de ácido indol
acético, introducir los datos en el programa Microsoft Office Excel 2007 y y
construir la curva patrón de calibración:
En la ecuación obtenida:
Donde:
y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)
x: ácido indol acético en ppm (variable independiente)
y = 0.0045x + 0.0089R² = 0.9931
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0 10 20 30 40 50 60 70
Ab
sorb
anci
a
AIA ug/mL
y = 0,0045x + 0,0089
88
Despejar “x” para obtener la cantidad de ácido indol acético (ppm) producido por
cada bacteria nativa.
𝐱 = y - 0,0089
0,0045
89
ANEXO 6
Temperaturas minima, media y máxima durante el cultivo de Asparagus
officinalis L.
Fecha Temperatura Temperatura Temperatura
minima (0C) media (0C) máxima (0C)
19/10/16 18 21 24
20/10/16 17 21 25
21/10/16 17 20,5 24
22/10/16 17 21 25
23/10/16 17 20,5 24
24/10/16 17 20,5 24
25/10/16 17 21 25
26/10/16 16 20 24
27/10/16 17 21 25
28/10/16 16 20 24
29/10/16 16 20 24
30/10/16 16 20 24
31/10/16 16 20 24
01/11/16 16 20 24
02/11/16 15 19,5 24
03/11/16 16 19,5 23
04/11/16 17 20,5 24
05/11/16 17 20,5 24
06/11/16 16 20,5 24
07/11/16 16 20,5 25
08/11/16 17 22 27
09/11/16 17 21,5 26
10/11/16 17 21,5 26
11/11/16 17 21,5 26
12/11/16 17 21,5 26
13/11/16 18 21,5 25
14/11/16 18 21,5 25
15/11/16 17 21 25
16/11/16 17 20,5 24
17/11/16 17 20,5 24
90
Continuación…
Fecha Temperatura Temperatura Temperatura
minima (0C) media (0C) máxima (0C)
18/11/16 16 19 22
19/11/16 14 19,5 25
20/11/16 13 18,5 24
21/11/16 14 19,5 25
22/11/16 16 20 24
23/11/16 16 20 24
24/11/16 17 21 25
25/11/16 18 21,5 25
26/11/16 16 21 26
27/11/16 18 21,5 25
28/11/16 18 21,5 25
29/11/16 17 21 25
30/11/16 18 22 27
01/12/16 18 22 26
02/12/16 19 23 27
03/12/16 18 22,5 27
04/12/16 18 22 26
05/12/16 18 22 26
06/12/16 18 22 26
07/12/16 19 22 25
08/12/16 18 22 26
09/12/16 19 22 25
10/12/16 19 23 27
11/12/16 18 21,5 25
12/12/16 18 22 26
13/12/16 18 22 26
14/12/16 18 22 26
15/12/16 18 21,5 25
16/12/16 19 22,5 26
17/12/16 19 22,5 25
91
Anexo 7
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
de la altura de Asparagus officinalis L. a los 30 días
Tests of Normality a los 30 días
Tratamiento Kolmogorov-Smirnova
Statistic df Sig.
1 ,189 3 ,906
2 ,148 3 ,989
3 ,208 3 ,832
4 ,199 3 ,868
5 ,246 3 ,649
6 ,222 3 ,765
7 ,216 3 ,794
8 ,208 3 ,830
Prueba de homogeneidad de varianzas
ALTURA A LOS 30 DÍAS
Estadístico de Levene g/1 g/2 Sig.
,687 7 16 ,682
92
Anova de un Factor
ALTURA A LOS 30 DÍAS
Suma de cuadrados
gl Media cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 672,323 7 96,046 25,124 ,000
Intra-grupos 61,167 16 3,823
Total 733,490 23
93
Anexo 8
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
del número de tallos de Asparagus officinalis L. a los 30 días
Tests of Normality a los 30 días
Tratamiento Kolmogorov-Smirnova
Statistic df Sig.
1 ,272 3 ,520
2 ,351 3 ,217
3 ,280 3 ,478
4 ,234 3 ,706
5 ,229 3 ,238
6 ,206 3 ,842
7 ,396 3 ,118
8 ,297 3 ,404
Prueba de homogeneidad de varianzas
NÚMERO DE TALLOS A LOS 30 DÍAS
Estadístico de Levene g/1 g/2 Sig.
1,935 7 16 ,130
94
Anova de un Factor
NÚMERO DE TALLOS A LOS 30 DÍAS
Suma de cuadrados
gl Media cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 20,667 7 2,952 1,107 ,405
Intra-grupos 42,667 16 2,667
Total 63,333 23
95
Anexo 9
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
de la altura de Asparagus officinalis L. a los 45 días
Tests of Normality a los 45 días
Tratamiento Kolmogorov-Smirnova
Statistic df Sig.
1 ,214 3 ,827
2 ,232 3 ,997
3 ,299 3 ,952
4 ,175 3 ,999
5 ,253 3 ,991
6 ,179 3 ,923
7 ,231 3 ,979
8 ,243 3 ,871
Prueba de homogeneidad de varianzas
ALTURA A LOS 45 DÍAS
Estadístico de Levene g/1 g/2 Sig.
1,503 7 16 ,235
96
Anova de un Factor
ALTURA A LOS 45 DÍAS
Suma de cuadrados
gl Media cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 889,790 7 127,113 25,047 ,000
Intra-grupos 81,200 16 5,075
Total 970,990 23
97
Anexo 10
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
del número de tallos de Asparagus officinalis L. a los 45 días
Tests of Normality a los 45 días
Tratamiento Kolmogorov-Smirnova
Statistic df Sig.
1 ,175 3 1,000
2 ,253 3 ,991
3 ,292 3 ,960
4 ,175 3 1,000
5 ,276 3 ,976
6 ,304 3 ,929
7 ,328 3 ,904
8 ,385 3 ,766
Prueba de homogeneidad de varianzas
NÚMERO DE TALLOS A LOS 45 DÍAS
Estadístico de Levene g/1 g/2 Sig.
2,118 7 16 ,101
98
Anova de un Factor
NÚMERO DE TALLOS A LOS 45 DÍAS
Suma de cuadrados
gl Media cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 20,292 7 2,899 1,512 ,233
Intra-grupos 30,667 16 1,917
Total 50,958 23
99
Anexo 11
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
de la altura de Asparagus officinalis L. a los 60 días
Tests of Normality a los 60 días
Prueba de homogeneidad de varianzas
ALTURA A LOS 60 DÍAS
Estadístico de Levene g/1 g/2 Sig.
1,357 7 16 ,288
Tratamiento Kolmogorov-Smirnova
Statistic df Sig.
1 ,253 3 ,834
2 ,191 3 ,997
3 ,253 3 ,871
4 ,343 3 ,999
5 ,229 3 ,872
6 ,175 3 ,997
7 ,200 3 ,997
8 ,191 3 ,999
100
Anova de un Factor
ALTURA A LOS 60 DÍAS
Suma de cuadrados
gl Media cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 1850,080 7 264,297 114,518 ,000
Intra-grupos 36,927 16 2,308
Total 1887,006 23
101
Anexo 12
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
del número de tallos de Asparagus officinalis L. a los 60 días
Tests of Normality a los 60 días
Prueba de homogeneidad de varianzas
NÚMERO DE TALLOS A LOS 60 DÍAS
Estadístico de Levene g/1 g/2 Sig.
3,810 7 16 ,013
Tratamiento Kolmogorov-Smirnova
Statistic df Sig.
1 ,253 3 ,766
2 ,385 3 ,991
3 ,276 3 ,978
4 ,175 3 ,976
5 ,337 3 ,766
6 ,292 3 ,886
7 ,385 3 ,991
8 ,314 3 ,926
102
Anova de un Factor
NÚMERO DE TALLOS A LOS 60 DÍAS
Suma de cuadrados
gl Media cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 25,625 7 3,661 2,440 ,066
Intra-grupos 24,000 16 1,500
Total 49,625 23
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