análisis de alimentos con columnas shodex · gel de polímero hidrofílico [poly(vinyl)alcohol] y...
Post on 03-Aug-2020
5 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Sacáridos, ácidos orgánicos, vitaminas, ácidos grasos y aminoácidos
Análisis de alimentos con columnas Shodex
CUADERNO TÉCNICO
No.3
Contenido
1. Introducción
2. Sacáridos
2-1. Mecanismo de separación
2-2. Monosacáridos y disacáridos
2-3. Sacáridos y alcohol de azúcar
2-4. Fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua
2-5. Sacáridos con aminoácidos o ácidos orgánicos
2-6. Polisacáridos
2-7. Endulzantes
3. Ácidos orgánicos
3-1. Mecanismo de separación
3-2. Ácidos orgánicos
4. Vitaminas
4-1. Vitaminas solubles en grasas
4-2. Vitaminas solubles en agua
5. Otros ingredients en los alimentos
5-1. Ácidos grasos superiores
5-2. Ácidos nucleicos como componentes del gusto
5-3. Aminoácidos
6. Apéndice
A. Lista de volumen de elución de sacáridos (todas las columnas)
B. Lista de volumen de elución de sacáridos y ácidos orgánicos
(concentración de eluente, SH1011)
C. Lista de volumen de elución de ácidos orgánicos
(concentración de eluente, KC-811)
D. Lista de volumen de elución de ácidos orgánicos
(temperatura de la columna, KC-811)
1
1
2
4
8
9
10
11
11
12
12
14
16
17
19
21
21
22
23
24
24
26
27
28
1. IntroducciónEn los últimos años, se han realizado una gran variedad de análisis de alimentos, entre ellos, de residuos agroquímicos y aditivos alimentarios, con un interés cada vez mayor en su seguridad. Este cuaderno técnico describe los análisis de ingredientes en los alimentos, especialmente de aquellos basados en la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).
2. SacáridosLos análisis de sacáridos y alcoholes de azúcar basados en HPLC se realizan de diferentes modos, como de fase normal, de intercambio de ligandos, por exclusión de tamaño e intercambio iónico. Existen dos series de columnas Shodex para los análisis de sacáridos: las que se aplican principalmente en modo de intercambio de ligandos (series SUGAR) y en modo de fase normal (columnas amino polimericas Asahipak NH2P-50). En las columnas de series SUGAR, se utiliza como material base un copolimero duro de estireno y divinilbenceno diseñado para el análisis de sacáridos y una resina de intercambio cationico fuerte que incorpora sulfogrupos funcionales asociados con contraiones metalicos como empaque. Las columnas de series SUGAR se encuen-tran disponibles en 14 tipos, según el contraión, el tamaño de los poros, la estructura de los poros, y con selec-tividad diferencial para los diferentes sacáridos. Por otra parte, las columnas Asahipak NH2P-50 comprenden un gel de polímero hidrofílico [poly(vinyl)alcohol] y una poliamina estable y quimicamente unida al gel. Como tales, estas amino columnas con base de silice tienen excelente durabilidad sin el problema del deterioro con el tiempo. Ambas series son adecuadas para la separacion de sacáridos, análisis de alimentos, áreas de bioquímica y sustancias naturales. Columnas como las Asahipak GS-220 HQ empacadas con polímeros para el modo de exclusión por tamaño analizan fibras dietéticas de bajo peso molecular y solubles en agua; y las colum-nas OHpak SB-800 HQ empacadas con polímeros para el modo de exclusión por tamaño analizan polisacáridos, como las columnas SUGAR KS-800. La tabla 1 muestra la alineación de las columnas Shodex empacadas para el análisis de sacáridos.
*1 : SEC (exclusión por tamaño), IEX (exclusión iónica), LEX (intercambio de ligandos), NP (fase normal)*2 : La cifra entre ( ) es por valor estimado.
Tabla 2-1. Columnas para análisis de sacáridos (1)
Código deproducto Nombre del producto Contraión Modo de
separación*1
Limite de exclusión (pululano)
Número de plato teórico (PT/columna)
Tamaño de la partícula
(µm)
Diámetro x largo
(mm)
- 1 -
F6378100F6378101F6700080F6378102F6378103F6700090F6378105F6700081F7001400F6700120F7001300F6700110F6378010F6378020F6378025F6378035F6378050F6378060F6700020F6378070F6700021F7600005F6710019F7630002F7630001F6710016F7630006F6713000F6710100
F6379230
SUGAR SH1011SUGAR SH1821SUGAR SH-GSUGAR SC1011SUGAR SC1821SUGAR SC-LGSUGAR SP0810SUGAR SP-GSUGAR SC1211SUGAR SC-GSUGAR SZ5532SUGAR SZ-GSUGAR KS-801SUGAR KS-802SUGAR KS-803SUGAR KS-804SUGAR KS-805SUGAR KS-806SUGAR KS-GSUGAR KS-807SUGAR KS-807GAsahipak GS-220 HQAsahipak GS-2G 7BAsahipak NH2P-50 4DAsahipak NH2P-50 4EAsahipak NH2P-50G 4AAsahipak NH2P-50 2DAsahipak NH2P-50G 2AAsahipak NH2P-LF
USPpak MN-431
SEC + IEXSEC + IEX
—SEC + LEXSEC + LEX
—SEC + LEX
—NP + LEX
—NP + LEX
—SEC + LEXSEC + LEX
SECSECSECSEC—
SEC—
SEC—NPNP—NP——
SEC + LEX
1.00010.000
Guarda columna1.000
10.000Guarda columna
1.000Guarda columna
— Guarda columna
— Guarda columna
1.00010.00050.000
400.0005.000.000
(50.000.000)*2
Guarda columna(200.000.000)*2
Guarda columna3.000
Guarda columna— —
Guarda columna—
Guarda columnaFiltro lineal
—
> 17.000> 17.000
> 13.000 > 13.000
— > 11.000
— > 5.500
— > 5.500
— > 17.000 > 17.000 > 17.000 > 17.000
> 9.000> 9.000
—> 4.000
—> 19.000
> 5.000> 7.500
> 3.500
> 4.000
66
1066
107
106
10666667
1717103030
6955555
—
—
8,0 x 3008,0 x 3006,0 x 508,0 x 3008,0 x 3006,0 x 508,0 x 3006,0 x 506,0 x 2504,6 x 106,0 x 1504,6 x 108,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3006,0 x 508,0 x 3008,0 x 507,5 x 3007,5 x 504,6 x 1504,6 x 2504,6 x 102,0 x 1502,0 x 108,0 x 75
4,0 x 250
H+
H+
H+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Pb2+
Pb2+
Ca2+
Ca2+
Zn2+
Zn2+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
——
——————
Ca2+
2-1. Mecanismo de separación
2-1-1. Separación de anómeros en sacáridosLos azucares reductores pueden adoptar diversas estruc-turas cíclicas, así como estructuras lineales. En dichos casos, se producen dos tautómeros, tipo α y tipo β, ya que los átomos de carbonilo se vuelven asimétricos. La relación entre el tipo α y el tipo β se denomina “anómero”. (Fig. 2-1)
Fig. 2-1 Anómeros
Fig. 2-2 Influencia de la separación de anómeros en el análisis de sacáridos
α-D(+)-glucosa
Glucosa
25˚C
Separación de anómeros
70˚C
No separación de anómeros
Galactosa Manosa Xilosa Arabinosa
tipo α
β-D(+)-glucosa
tipo β
- 2 -
En condiciones donde el índice de conversión de tautómeros es bajo, los anómeros α y β son separados por la columna, haciendo que los picos máximos se dividan o amplíen. (Fig. 2-2)
Existen dos métodos para evitar la separación de anómeros.*Análisis a temperatura alta*Análisis bajo condiciones alcalinas fuertes
F6429100
F6429101
F6429102
F6429103
F6429104
F6429105
F6429106
F6709430
F6429108
F6709431
OHpak SB-802 HQ
OHpak SB-802.5 HQ
OHpak SB-803 HQ
OHpak SB-804 HQ
OHpak SB-805 HQ
OHpak SB-806 HQ
OHpak SB-806M HQ
OHpak SB-G
OHpak SB-807 HQ
OHpak SB-807 G
4.000
10.000
100.000
1.000.000
4.000.000
(20.000.000)*1
(20.000.000)*1
Guarda columna
(500.000.000)*1
Guarda columna
> 12.000
> 16.000
> 16.000
> 16.000
> 12.000
> 12.000
> 12.000
—
> 15.000
—
8
6
6
10
13
13
13
10
35
35
0
100
100
75
75
75
75
75
75
75
0
75
75
75
75
75
75
75
75
75
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
8,0 x 300
8,0 x 300
8,0 x 300
8,0 x 300
8,0 x 300
8,0 x 300
8,0 x 300
6,0 x 50
8,0 x 300
6,0 x 50
Muestra: 1% c/u, 5μL
Columna : Shodex SUGAR SC1211Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,7ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : (A) 70°C, (B) 25°C
*1 : La cifra entre ( ) es un valor estimado.
Tabla 2-2. Columnas para análisis de sacáridos (2)
Códigode producto
Nombre del productoLímite deexclusión(Pululano)
Solventes orgánicos utilizables (Máx. %) Número de plato teórico(PT/columna)
Tamaño de la partícula
(μm)
Diámetro x largo (mm)Metanol Acetonitrilo DMF
2-1-3. Shodex Asahipak NH2P-50 seriesLas series Shodex Asahipak NH2P-50 son amino columnas que no solo mantienen el gran rendimiento de separación de las amino columnas convencionales con base de sílice, sino que también solucionan el problema de la disminución de retención con el tiempo. Esto se debe a la unión estable de la poliamina con el gel de polímero hidrofílico. A continuación se mencionan otras ventajas.
* Es posible el análisis bajo condiciones moderadas (pH de 7 aproximadamente y temperatura ambiente).* Se pueden obtener picos cerrados y casi simétricos para una gran variedad de sacáridos.* Se puede realizar una determinación cuantitativa adecuada.* Se puede utilizar una gran variedad de eluentes, como diferentes soluciones buffer, alcalinas o ácidas. * Es posible el lavado alcalino de las columnas.
Con las amino columnas, los sacáridos de mayor polaridad se eluyen primero, debido a la función de la cromatografía de fase normal. Por lo general, se usa como eluente una mezcla de acetonitrilo y agua. Cuando el índice de mezclado del acetonitrilo aumenta, la polaridad del eluente se reduce, creando una interacción fuerte entre los sacáridos y el material de empaque dando como resultado un volumen de elución mas largo.
Como las columnas NH2P-50 tienen amino grupos alcalinos débiles, la condición dentro de la columna es alcalina. Esto permite que los sacáridos sean analizados sin causar la separación de los anómeros, incluso a temperatura ambiente.
Hay columnas llamadas amido columnas que se utilizan para el análisis de sacáridos bajo las mismas condiciones de elución que las amino columnas. Aunque las amido columnas tienen grupos acrilamida, el análisis debe hacerse a una temperatura alta porque el grupo acrilamida no es alcalino. (Fig. 2-4)
2-1-2. Serie Shodex SUGARUna característica fuerte de las columnas Shodex SUGAR reside en el mecanismo de separación en el modo de intercambio de ligandos. El intercambio de ligandos se refiere al modo de separación basado en la interacción (potencial de intercambio de ligandos) entre los grupos hidroxilo y los iones metálicos que forman un complejo. Los sacáridos tienen una estructura de anillo de cinco miembros (furanosa) o de seis miembros (piranosa), con una gran cantidad de grupos hidroxilo. Estos grupos hidroxilo se unen ya sea de manera ecuatorial o axial con relación al carbono. Esta conformación de los grupos hidroxilo difiere según la clase de sacárido.La figura 2-3 muestra la relación entre la conformación del grupo hidroxilo y la interacción contraiónica.
En la figura 2-3(a), tres grupos hidroxilo forman un complejo con el ión metálico. En la figura 2-3(b), solo dos grupos hidroxilo forman un complejo con el ión metálico, debido a la conformación del grupo hidroxilo. Por lo tanto, el potencial de intercambio de ligandos es mayor para (a) que para (b).
El potencial de formación de complejos también difiere según la clase de ión metálico.
* Cuando se utiliza una columna de la serie SUGAR, el análisis se debe realizar a varias temperaturas altas para evitar la separación de anómeros. En condiciones alcalinas fuertes, es probable que los sacáridos isomeri-cen con posibilidades de descomposición de los polisacáridos.
Fig. 2-3 Diferencia de la interacción del contraión
Fig. 2-4 Efectos de temperatura en patrones de elución (comparación con la amido columna)
- 3 -
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6x250mm) Amido columna de compañía A (4,6x250mm)Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30°C, 80°C
NH2P-50 Amino columna
30˚C30˚C 80˚C
Muestra: 5mg/m c/u,10μL
1. Fructosa, 2. glucose, 3.sacarosa, 4.maltosa
- 4 -
Eluente : CH3CN/H2O=75/25 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30°C
NH2P-50 4E Amino columna con base de sílice
Las columnas NH2P-50 muestran una buena reproductibilidad por mucho tiempo, dado que la estructura química del material de empaque es estable. Con las amino columnas en base de sílice, la retención de sacári-dos se reduce con el paso de tiempo, lo que resulta en una ampliación significativa de todos los picos. Esto indica claramente el deterioro de la columna. (Fig. 2-5)
Fig. 2-5 Reproductibilidad de los cromatogramas con la columna NH2P-50 4E y la amino columna con base de sílice.
2-1-4. Detección de sacáridosEl detector utilizado más comúnmente para sacáridos es el índice refractivo (RI) diferencial, que se basa en las diferencias del índice refractivo entre los componentes de la muestra y la fase móvil. Aunque el detector RI es muy versátil, muestra poca selectividad y no es apropiado para la elución en gradiente. Otra desventaja es la tendencia a una sensibilidad menor a la de otro tipo de detectores. En casos donde se necesita una gran sensibi-lidad y selectividad, el detector de absorción ultravioleta (UV) y el detector de fluorescencia (FL) son efectivos. No obstante, cabe destacar que los sacáridos deben derivatizarse, ya que no poseen una estructura que permita la absorción UV ni la emisión de fluorescencia. Otros métodos de detección disponibles son, entre otros, el espec-trómetro de masas (MS), el detector electroquímico (EC) para sacáridos ionizados en condiciones alcalinas y el detector evaporativo de dispersión de la luz (ELS), que detecta los sacáridos mediante la evaporación de un eluente y un láser irradiante.
2-2. Monosacáridos y disacáridosEn general, el término “sacárido” se refiere a los sacáridos simples, los oligosacáridos, los polisacáridos, y los alcoholes de azúcar. Los sacáridos simples, es decir, los monosacáridos y los disacáridos, no incluyen los alcoholes de azúcar. No se permiten las etiquetas como "Muy bajo contenido de azúcar", "Baja azúcar” ni “Sin azúcar” a menos que el contenido del tipo relevante de azúcar no supere los 5 gramos cada 100 gramos (2,5 g/100 ml para los refrescos) y ni los 0,5 gramos por 100 gramos (0,5 g/100 ml para los refrescos), respectiva-mente. Los estándares que regulan las etiquetas de información nutricional en Japón especifican el uso de una amino columna (4,6 mm de diámetro interior x 250 mm de largo) para analizar los sacáridos simples y los oligosacáridos (figura 2-6). Shodex puede ofrecer numerosas clases de columnas para el análisis de sacáridos.
Carbohidrato
Sacárido (o azúcar) Sacárido simple (o azúcar) Monosacárido,DisacáridoOligosacárido
Alcohol de azúcar
PolisacáridoFibra dietética
Primer uso después 180hrs Primer uso después 120hrs
- 5 -
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C
Muestra: 0,1% c/u, 20µL1. Fructosa2. Sorbosa3. Galactosa4. Glucosa5. Celobiosa6. Sacarosa7. Lactosa8. Maltosa
Altu
ra d
el p
ico
(µV
)
Altu
ra d
el p
ico
(µV
)
Concentración de la muestra (mg/ml)
Concentración de la muestra (mg/mL)
Fructosa
Sacarosa
Lactosa
Maltosa
meso-eritritol
Xilitol
Manosa
Maltitol
0,9998
0,9999
0,9997
0,9998
0,9999
0,9999
0,9999
0,9997
Condición de la Fig. 2-8 y la Tabla 2-3
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/H2O=75/25 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C
(0,01mg/ml~10mg/ml)
Fig. 2-6 Condiciones de análisis de los sacáridos y oligosacáridos
Fig. 2-7 Sacáridos estándar con NH2P-50 4E
Tabla 2-3. Correlación para otros sacáridos (R2)
Fig. 2-8 Curvas de calibración con NH2P-50
Columna : Una columna empacada con gel de polímero o sílice unida a un amino grupo (propil) (4,6mm de diámetro x 250mm) Shodex Asahipak NH2P-50 4EEluente : CH3CN/H2O = 75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente Vol. de inyección : 20µL
Columna : Una columna empacada con gel de polímero o sílice unida a un amino grupo (propil) (4,6mm de diámetro x 250mm) Shodex Asahipak NH2P-50 4EEluente : CH3CN/H2O = 75/25Índice de flujo : 1,0ml/min Detector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente Vol. de inyección : 20µL
Monosacárido, disacárido Oligosacárido
Estándares para las etiquetas de información nutricional en Japón, ver. 3 (Ley japonesa de Sanidad Alimentaria)
50000
0
0
0
5000
10000
15000
0 0,2 0,4
5 10
Sorbitol
R2=0,9999
Glucosa
R2=0,9998
100000
150000
200000
0
12
3
4
5
6
78
5 10
min
15 20
- 6 -
Muestra : 20µL1. Fructosa2. Galactosa3. Glucosa4. Sacarosa5. Lactosa
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm) Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C
(Pretratamiento de la muestra)(1) Medir 5g de yogur en un vaso de precipitado.(2) Agregar 30ml de agua pura al yogur. Revolver la mezcla y
luego, neutralizarla con una solución acuosa de hidróxido de sodio al 10v/v%.
(3) Después de 30 minutos de extracción ultrasónica, agregar agua pura hasta que el volumen total sea 50ml.
(4) Pasar la solución (3) por un filtro de papel Nº 5B. Agregar a 3ml del líquido filtrado el mismo volumen de acetonitrilo y revolver la mezcla.
(5) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al HPLC.
Fig. 2-9 Sacáridos en yogur con azúcar agregada
Muestra : 20µLJarabe fructo-oligosacárido al 2,5%1. Fructosa2. Glucosa3. Sacarosa4. 1-Kestosa5. Nistosa6. 1F-Fructofuranosil-D-nistosa
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/H2O=70/30Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C
Con las columnas NH2P-50, los sacáridos se eluyen por orden de polaridad debido a la función de la cromatografía de fase normal. La polaridad se vuelve más fuerte con cadenas más largas y la absorción se vuelve más fuerte.Con el análisis de los oligosacáridos, se recomienda un índice alto de agua de solvente para una elución temprana.
Fig. 2-11 Jarabe fructo-oligosacárido
Muestra : 20µL1. Fructosa2. Glucosa3. Sacarosa4. Maltosa
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm) Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente (25°C)
(Pretratamiento de la muestra)(1) Hacer una pasta de la muestra con un procesador de
alimentos.(2) Colocar 3 g de la pasta en un vaso de precipitado y agregar 30
ml de etanol al 50%(V/V).(3) Extraer las sustancias de la pasta con un vibrador ultrasónico
durante 30 minutos.(4) Colocar la pasta y el etanol en un matraz aforado de 50 ml y
agregar etanol al 50%(V/V) para obtener una solución de 50 ml.(5) Filtrar la solución con un filtro de papel (Nº 5B) para quitar la
pasta.(6) Tomar una parte de la solución filtrada y agregar el mismo
volumen de acetonitrilo.(7) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al
HPLC.
Fig. 2-10 Sacáridos en la batata, asada
0
1 2
3
4
5 10
min
15 20
0
12 3
4
5
5 10
min
15 20 25 30
0
1
2
3
4
5
6
5 10
min
15 20 25
- 7 -
Muestra : 5µLSalsa inglesa con dilución quíntuple1. Polisacáridos y anión2. Polisacáridos3. Sacarosa4. Glucosa5. Fructosa
Columna : Shodex SUGAR KS-801 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,7ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°C
Con SUGAR KS-801, los pesos moleculares altos y los compuestos aniónicos son eluidos primero, seguidos por sacáridos de bajo peso molecular. Por lo tanto, KS-801 se puede utilizar para el análisis de sacáridos sin desalinización previa de las muestras, como la salsa inglesa, que por lo general contiene grandes cantidades de cloruro de sodio y ácidos orgánicos.
Fig. 2-12 Sacáridos en la salsa inglesa
Muestra: Mermelada de frambuesa1. Oligosacárido(DP-6)2. Oligosacárido(DP-5)3. Oligosacárido(DP-4)4. Oligosacárido(DP-3)5. Maltosa6. Glucosa7. Fructosa
Columna : (izquierda); Shodex SUGAR SC1011 (derecha); Shodex SUGAR SC1821 (8,0mm de diámetro x 300mm c/u)Eluente : H2O Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°C
Se analizó la mermelada de frambuesa. Se encontró un grancontenido de oligosacáridos en la muestra. Se utilizó SUGARSC1011 o SC1821 y se obtuvo una mejor separación con SC1821por el tamaño mayor de sus poros.(Pretratamiento de la muestra)(1) Colocar 5g de mermelada de frambuesa en un vaso de
precipitado y agregar 20ml de agua pura.(2) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al
HPLC.
Fig. 2-14 Sacáridos en la mermelada de frambuesa
Muestra: Harina de soja1. Estaquiosa2. Rafinosa3. Sacarosa4. Maltosa5. Glucosa
Columna : Shodex SUGAR SP-G (6,0mm de diámetro x 50mm) + SP0810 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : H2O Índice de flujo : 0,4ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°C
(Pretratamiento de la muestra)(1) Colocar la harina de soja en un vaso de precipitado y agregar
agua pura diluida 50 veces.(2) Extraer las sustancias de la pasta en el agua con un vibrador
ultrasónico durante 30 minutos.(3) Realizar la ultrafiltración (mw : 10.000).(4) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al
HPLC.
Fig. 2-13 Sacáridos en la harina de soja
0
1
2
34
5
5 10 15 min
0
1
2
3
4 5
10 20 30 40 50 60 min
Muestra: Mermelada de frambuesa2 µL
Muestra:Mermelada de frambuesa2 µL
0
1
1
2233
44
5
7 7
5
6
6
5 10 15 20 min 0 5 10 15 20 min
(SC1821)
(SC1011)
- 8 -
2-3. Sacáridos y alcoholes de azúcar
Las amino columnas (4,6mm de diámetro x 250mm) y las columnas de modo de intercambio de ligandos son algunos de los métodos oficiales de análisis de los alcoholes de azúcar. (Fig. 2-15)
Fig. 2-15 Condiciones de análisis en alcoholes de azúcares.
Columna : Una columna empacada con sílice o gel de polímero unida a un grupo amino (propil) (4,6mm de diámetro x 250mm) Shodex Asahipak NH2P-50 4EEluente : CH3CN/H2O = 75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambienteVol. de inyección : 20 µL
Columna : Una columna empacada con gel de poliestireno sulfonato (Pb o Caligand) (7,8-8,0mm de diámetro x 300mm c/u) Shodex SUGAR SP0810, SC1011Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 85°CVol. de inyección : 5 µL
Alcohol de azúcar (1) Alcohol de azúcar (2)
Estándares para las etiquetas de información nutricional en Japón, ver. 3 (Ley japonesa de Sanidad Alimentaria)
Columna : Shodex SUGAR SP0810 Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm c/u)Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 85˚C
Fig. 2-16 Sacáridos estándares y alcohol de azúcar con SP0810, SC1011
Fig. 2-17 Xilitol en productos de confitería
Muestra: 1% c/u, 5 µL 1. Sacarosa 2. Glucosa 3. Xilosa 4. Galactosa 5. Fructosa 6. meso-eritritol 7. Lactitol 8. Manitol 9. Xilitol10. Sorbitol
Muestra: 1% c/u, 5 µL1. Sacarosa2. Glucosa3. Lactitol4. Fructosa5. meso-eritritol6. Manitol7. Sorbitol
Muestra: Productos de confitería 20 µL1. Sorbitol2. Xilitol
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm) Eluente : H2O/CH3CN=25/75 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30˚C
(Pretratamiento de la muestra)* Se pasó por un filtro (0,45 µm) una solución acuosa de la muestra al 2% y se agregó el mismo volumen de acetonitrilo.
0
1 234
56
78
910
10min
20 30 40 0
1
2
3
4
5 6
7
10min
20
0
1
2
5 10 min
- 9 -
Fig. 2-18 Jugo de manzana
2-4. Fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua
Por lo general, las fibras dietéticas se cuantifican mediante el método de Prosky (método enzimático-gravimétrico). No obstante, se utiliza el método HPLC enzimático para las fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua que no pueden cuantificarse mediante el método Proxy. En este análisis, la muestra se divide en dos fraccio-nes: fibras dietéticas (trisacáridos y superiores), mono y disacáridos. Posteriormente, se determina el índice del área de picos de la fracción de fibra dietética y de la glucosa (o estándar interno).
Fig. 2-19 Condiciones de análisis de fibras dietéticas solubles en agua
Columna : Columnas de cromatografía por exclusión de tamaño (Límite de exclusión MW: ca. 5.000) o columnas de intercambio de ligandos (tipo Na o Ca)
Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°CVol. de inyección : 20 µL
Fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua
Estándares para las etiquetas de información nutricional en Japón, ver. 3 (Sociedad japonesa de salud y nutrición)
Fig. 2-20 Fibra dietética soluble en agua
Columna : Shodex Asahipak GS-220 HQ (7,5mm de diámetro x 300mm) x 2 Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C
Con GS-220 HQ, los monosacáridos, disacáridos y alcoholes de azúcar se eluyen después de la posición indicada por la flecha y es fácil dividir las dos fracciones.
Muestra: Jugo de manzana, 5 µL1. Sacarosa2. Glucosa3. Fructosa4. Sorbitol
Columna : Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : H2O Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 85°C
(Pretratamiento de la muestra)(1) Colocar 5g de jugo de manzana en un vaso de precipitado,
agregar 30 ml de agua pura y neutralizar con NaOH ac. al 10% (V/V) enfriado con hielo.
(2) Aplicar vibración ultrasónica durante 30 minutos y hacer una solución de 50 ml con agua pura.
(3) Filtrar con un filtro de membrana de 0,45 micrones.
1
2
3
4
10 20 min
0 10 20 30 40 min
- 10 -
2-5. Sacáridos con aminoácidos o ácidos orgánicos
Por lo general, los aminoácidos y los ácidos orgánicos se encuentran en los alimentos con sacáridos.
Fig. 2-23 Sacáridos y ácidos orgánicos
Muestra: 0,5% c/u, 10 µL1. Maltotriosa2. Maltosa3. Glucosa4. Ácido succínico5. Ácido láctico6. Glicerol7. Ácido acético8. EtOH
Columna : Shodex SUGAR SH1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : 5mM H2SO4 ac.Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C
Los eluentes ácidos, como los ácidos orgánicos se separan con el modo de exclusión iónica y el modo de fase reversa. Los sacáridos se separan con SEC.
Fig. 2-22 Sacáridos y aminoácidos (2)
Muestra:1. Sacarosa2. Glucosa3. Fructosa4. Taurina5. mio-Inositol
Columna : Shodex SUGAR SC1211 (6,0mm de diámetro x 250mm)
Eluente : H2O/CH3CN=60/40Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 70˚C
La taurina es un aminoácido y se conoce como uno de los ingredientes que desde hace poco tiempo se agregan a las bebidas energizantes.
Fig. 2-21 Sacáridos y aminoácidos (1)
Muestra: 0,1% c/u, 10 µL1. Maltosa2. Glucosa3. Fructosa4. Ácido glutámico5. Ácido aspártico6. Treonina7. Serina8. Glutamina9. Alanina
Columna : Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : 10mM CaSO4(pH6,0)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80˚C
Generalmente, las columnas de modo de intercambio de ligandos se utilizan con un eluente acuoso, pero la adición del mismo catión que el contraión permite la separación de muestras mediante el modo de intercambio iónico, e intercambio de ligandos. Se utiliza una solución acuosa de CaSO4 para la columna SUGAR SC1011, ya que su contraión es Ca2+. Esto significa que el intercambio de ligandos ocurre entre los contraiones del material de empaque, los grupos hidroxilo de sacáridos y el intercambio iónico que ocurren entre los grupos sulfonato y los grupos amino de los sacáridos.
0
1 23
4
5
678
9
10 20 30 min
0
1
23
4
5
8 16 24 min
0 5
12
3
4
5
6
7 8
10 15 20 25 30 min
- 11 -
2-6. Polisacáridos
Los polisacáridos se utilizan como espesantes/estabilizadores para espesar o solidificar alimentos, entre otros fines. Los polisacáridos tienen diversos pesos moleculares, por lo tanto, se realiza su análisis no sólo para su cuantificación, sino también para determinar su peso molecular.
2-7. Endulzantes
Generalmente, los aditivos alimentarios se analizan con columnas de modo de fase reversa: sin embargo, los sacáridos son difíciles de analizar debido a su gran polaridad. Por lo tanto, se recomiendan columnas para análisis de sacáridos y para analizar endulzantes.
Fig. 2-26 Acesulfamo K y sacáridos
Muestra : 10 µL1. Acesulfamo K al 0,005%2. Sacarosa al 0,5%3. Glucosa al 0,5%4. Fructosa al 0,5%
Columna : Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm) Eluente : 10mM CaSO4 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI), UV (254nm)Temp. de la columna : 80˚C
La concentración de acesulfamo K es mínima, difícil de detectar con RI. Los sacáridos no tienen absorción ultravioleta, por lo tanto, no hay picos mediante detección UV.
Se analizó la carboximetilcelulosa con OHpak SB-806M HQ (una columna para separación de GFC). Se calcularon Mw y Mn como pululano.
Fig. 2-24 Alginato de sodio
Muestra: Alginato de sodio al 0,1%, 100 µl
Columna : Shodex OHpak SB-806M HQ (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 0,1M NaNO3 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C
Columna : Shodex OHpak SB-806M HQ (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2 Eluente : 0,1M NaCl ac.Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C
500-600cp
Fig. 2-25 Carboximetilcelulosa
Muestra : Carboximetilcelulosa (CMC) al 0,1%Viscosidad media, 200 µl
En el apéndice A, se muestran las tablas de volumen de elución de los sacáridos con cada columna.
150-300cp
6 10 14 18 22 26 min
6 10 14 18 22 26 min
Mw = 101 x 104
Mn = 10,5 x 104
Mw/Mn = 9,6
0 4 8 12 16 20 24 28min
0
1
2
34
5 10 15 min
- 12 -
F6378030
F6700030
F6700010
F7008140
F6700510
F7001004
F7001005
F7009030
F7001006
F6700150
F7001007
F6700151
F6378100
F6378101
F6700080
F6995244
F6995245
F6709620
RSpak KC-811
RSpak KC-G
RSpak KC-LG
RSpak NN-814
RSpak NN-G
RSpak DE-613
RSpak DE-413
RSpak DE-413L
RSpak DE-413S
RSpak DE-G
RSpak DE-213
RSpak DE-SG
SUGAR SH1011
SUGAR SH1821
SUGAR SH-G
IC SI-90 4E
IC SI-50 4E
IC SI-90G
IEX+RP
IEX+RP
IEX+RP
IEX+RP
IEX+RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
RP
SEC + IEX
SEC + IEX
-
AEC
AEC
AEC
> 17.000
(Guarda columna)
(Guarda columna)
> 9.000
(Guarda columna)
> 7.000
> 11.000
> 17.000
> 3.000
(Guarda columna)
> 8.000
(Guarda columna)
> 17.000
> 17.000
(Guarda columna)
> 5.000
> 10.000
(Guarda columna)
6
10
12
10
10
6
4
4
4
10
4
4
6
6
10
9
5
9
8,0 x 300
6,0 x 50
8,0 x 50
8,0 x 250
6,0 x 50
6,0 x 150
4,6 x 150
4,6 x 250
4,6 x 50
4,6 x 10
2,0 x 150
2,0 x 10
8,0 x 300
8,0 x 300
6,0 x 50
4,0 x 250
4,0 x 250
4,6 x 10
*1 : (Exclusión por tamaño), IEX (Exclusión iónica), RP (Fase reversa) , AEC (Intercambio aniónico)
Tabla 3-1. Columnas Shodex para el análisis de ácidos orgánicos
Código deproducto
Nombre del productoModo de
separación*1
Número deplato teórico(PT/columna)
Tamaño de la partícula
(µm)
Diámetro x largo (mm)
RSpak KC-811
RSpak NN-814
RSpak DE-413
SUGAR SH1011
SUGAR SH1821
IC SI-90 4E
IC SI-50 4E
Exclusión iónica + fase reversa
Exclusión iónica + fase reversa
Fase reversa
Exclusión por tamaño + exclusión iónica
Intercambio aniónico
Ácidos orgánicos generales
Ácidos orgánicos aromático
Ácidos orgánicos generales
Ácidos orgánicos y aniones
Ácidos orgánicos y aniones
Tabla 3-2. Selección de columnas para las muestras
Columna Modo de separación Muestra
3. Ácidos orgánicos
Los ácidos orgánicos son sustancias ácidas débiles con grupos carboxilo en su estructura molecular; también se les llama “ácidos carboxílicos”. Cuando se analizan ácidos orgánicos, se utilizan la exclusión iónica, la fase reversa, el intercambio iónico (cromatografía iónica), la exclusión por tamaño y otros tipos de cromatografía. Las columnas Shodex para el análisis de ácidos orgánicos incluyen RSpak KC-811 (una combinación del modo de exclusión iónica y fase reversa), RSpak DE-413 (columna de polímero de fase reversa) e IC SI-50 4E (columna de cromatografía aniónica), así como SUGAR SH1011 (columna para el análisis de sacáridos y ácidos orgánicos, descripta en la sección 2). La tabla 3-1 muestra una alineación de columnas de empaque Shodex para el análisis de ácidos orgánicos.
3-1. Mecanismo de separación
Shodex puede ofrecer diversas columnas para el análisis de ácidos orgánicos según las sustancias de la mues-tra. (Tabla 3-2)
3-1-1. Modo de exclusión iónicaEn el análisis de ácidos orgánicos, se utiliza una resina de alto intercambio catiónico con grupos sulfo unidos a la superficie del empaque. Los ácidos débiles, como los orgánicos, sólo muestran una disociación parcial cuando se disuelven en agua. En un estado de disociación (con carga negativa), la carga positiva del catión se neutraliza y es excluida por la carga negativa de los grupos sulfo en la superficie de la resina. No es de interés la absorción de ácido orgánico en la resina. En estado de no disociación, por otra parte, no ocurre la exclu-sión iónica, sino que tiene lugar la absorción hidrofóbica en el sustrato de la resina, para permitir la retención de ácidos orgánicos por parte de la resina (Figura 3-1).
Por lo tanto, los ácidos orgánicos se eluyen en orden de pKa ascendente (orden de acidez descendente) y en orden descendente de polaridad. El sustrato del empaque de KC-811 es de un copolímero de estireno-divinilbenceno, por lo tanto, se recomienda utilizar NN-814 para analizar ácidos orgánicos aromáticos de baja polaridad, ya que tiene un sustrato de empaque de mayor polaridad que la columna KC-811. El sustrato de empaque de NN-814 es poli(hidroximetacrilato).
- 13 -
3-1-2. Modo de fase reversaEs el modo de separación de HPLC más comúnmente utilizado. Este modo se basa en la interacción hidrofóbica entre la porción de baja polaridad del empaque y la porción de baja polaridad de la muestra. Por lo tanto, la elución ocurre en orden descendente de polaridad. Una clave para un análisis exitoso de ácidos orgánicos en modo de fase reversa es suprimir totalmente la disociación de los ácidos orgánicos y reducir la polaridad de la muestra. Generalmente, los ácidos orgánicos no se disocian cuando el eluente tiene un pH de 1,5 menos que el pKa.
3-1-3. Modo de intercambio aniónicoLa superficie de resina se carga positivamente. El catión de la resina es mezclado por el anión de la fase móvil consti-tuyente y el anión del ácido orgánico (anión); la elución ocurre en orden ascendente de absortividad.
3-1-4. Modo de exclusión por tamañoLos ácidos orgánicos se eluyen en orden ascendente según el tamaño molecular. Las moléculas más grandes que el tamaño del poro de la resina se eluyen en posición V0.
3-1-5. Detección de ácidos orgánicosEl grupo funcional compartido por los ácidos orgánicos es el grupo carboxilo, que tiene una absorción UV de entre 200 y 210nm, lo que permite el uso de un detector UV. No obstante, dado que muchas otras sustancias orgánicas tienen la misma longitud de onda para la absorción UV, y también porque el coeficiente de extinción molar es de 50 a 70, es posible que la detección de ácidos orgánicos sea influida por las impurezas. El detector RI carece de selectivi-dad y sigue siendo algo problemático respecto de la sensibi-lidad. La detección con el detector de conductividad (CD) es propensa a la variación de sensibilidad según la clase de ácido orgánico. Como método de detección selectiva de ácidos orgánicos, se encuentra disponible el método post-columna con indicador de pH, que emplea un espectrosco-pio de absorción visible (VIS). (Fig. 3-2)
Fig. 3-2 Comparación de cromatogramas con diversos detectores
Fig. 3-1 Modo de exclusión iónica
Columna : Shodex RSpak KC-G (6,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm)x2 Eluente : 3mM HClO4 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minTemp. de la columna : 50˚C
Muestra:1. Ácido cítrico 800ppm2. Ácido tartárico 900ppm3. Ácido málico 800ppm4. Ácido succínico 700ppm5. Ácido láctico 1.100ppm6. Ácido fórmico 600ppm7. Ácido acético 700ppm8. Ácido levulínico 1.500ppm9. Ácido piroglutámico 1.500ppm
Método post-columnaVIS (430nm)
UV(210nm)
Detector de conductividad (CD)
Índice de refracción (RI)
resina
Estado de no disociación
Exclusión iónica
Estado de disociación
5
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6
6
6
7
7
7
7
8
8
8
8
9
9
9
9
10
5 10
15 20 min
15 20 min
5 10 15 20 min
5 10 15 20 min
Ka: constante de disociación de ácidos
- 14 -
Muestra:1. Ácido cítrico2. Ácido tartárico3. Ácido pirúvico4. Ácido málico5. Ácido succínico6. Ácido glicólico7. Ácido láctico8. Ácido fumárico9. Ácido acético10. Ácido levulínico11. Ácido piroglutámico12. Ácido propiónico13. Ácido isobutírico14. Ácido n-butírico
Columna : Shodex RSpak KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 6mM HClO4 ac.Reactivo : ST3-R diluido 10 veces (para el método de post-columna)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : VIS (430nm)Temp. de la columna : 50 °C
Se analizaron los ácidos orgánicos generales con el método de postcolumna. Después de la separación con la columna KC-811, se agregó un reactivo y se detectó con 430nm.
Muestra:1. Ácido succínico2. Ácido láctico3. Ácido fórmico4. Ácido acético5. Ácido propiónico6. Ácido isobutírico7. Ácido n-butírico8. Ácido isovalérico9. Ácido n-valérico
Muestra: Salsa de soja1. Ácido cítrico2. Ácido pirúvico3. Ácido málico4. Ácido succínico5. Ácido láctico6. Ácido fórmico7. Ácido acético8. Ácido piroglutámico
Columna : Shodex RSpak KC-LG (8,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2 Reactivo : ST3-R diluido 10 veces (para el modo de post-columna)Índice de flujo : (Eluente);1,0ml/min (Reactivo); 0,5ml/minDetector : VIS (430nm)Temp. de la columna : 47˚C
El tiempo de elución de los ácidos orgánicos con hidrofobicidad fuerte puede acortarse agregando 10% del acetonitrilo al eluente.
Columna : Shodex RSpak KC-G (6,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2 Eluente : 3mM HClO4 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minTemp. de la columna : 50˚C
Para muestras reales de alimentos que contienen aminoácidos, azúcares, NaCl, iones, sustancias orgánicas, etc., se recomienda el método de post-columna, ya que permite un análisis altamente selectivo. La detección UV (210 nm) detecta numerosas sustancias que no son ácidos orgánicos y la detección de conductividad produce un pico importante de iones de CI no incluidos en la posición correspondiente a 10 minutos aproximadamente. Por lo tanto, la cuantificabilidad de los ácidos orgánicos se ve afectada con estos métodos. En el caso de la detección RI, los ácidos orgánicos son difíciles de cuantificar, ya que se detectan casi todos los componentes, entre ellos, los azúcares.
Fig. 3-3. Análisis de ácidos orgánicos con método de post-columna
Fig. 3-4 Efecto de elución de ácidos orgánicos con adición de acetonitrilo
Fig. 3-5 Comparación de los resultados de la salsa de soja con diversos detectores
Eluente : 2mM HCIO4
Eluente : 2mM HCIO4/CH3CN=90/10
3-2. Ácidos orgánicos
10
1
2
3
4 56 8
9
10
11
12
13 14
7
20 30 min
15 20
20
1
2 3 45
6 7 8 9
25 30 35 40
25 30 min
Método post-columnaVIS(430nm)
UV(210nm)
Detector deconductividad (CD)
Índice de refracción (RI)
3 µL salsa de soja1 µL salsa de soja
10 µL salsa de soja1 µL salsa de soja
5
1
1
12
5
5
7
8
2
212
3
44
5
4
5
6
6
7 7
78
8 8
10 15 20 25 min
min5 10 15 20 25
min5 10 15 20 25 30
5 10 15 20 25 30 min
- 15 -
Muestra: Vino, 10 µL1. Ácido cítrico2. Ácido tartárico3. Ácido málico4. Ácido succínico5. Ácido láctico6. Ácido fumárico7. Ácido acético8. Ácido piroglutámico
Columna : Shodex RSpak KC-LG (8,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 3mM HClO4 ac.Reagent : 1/10 ST3-R (para el método de post-columna)Índice de flujo : (Eluente); 1,0ml/min (Reactivo); 0,7ml/minDetector : VIS (430nm)Temp. de la columna : 45˚C
Las uvas son ricas en ácido málico. Se sabe que el vino se añeja como resultado de la conversión del ácido málico en ácido láctico por la acción de las enzimas durante la fermentación maloláctica. La reserva de vinos tienen casi todo el ácido málico convertido en ácido láctico.
Muestra:1. Ácido glioxílico, 1,78mg/ml2. Ácido tartárico, 1,95mg/ml3. Ácido málico, 2,06mg/ml4. Ácido láctico, 2 µL/mL5. Ácido malónico, 1,95mg/ml6. Ácido láctico, 2 µL/mL7. Ácido succínico, 2,05mg/ml8. Ácido levulínico, 1,95mg/ml9. Ácido propiónico, 2 µL/mL
Muestra: Cerveza diluida 10 veces, 30 µL 1. Ácido acético 2. H2PO4
-, Ácido succínico Ácido piroglutámico 3. Ácido láctico, ácido pirúvico 4. Cl-
5. Ácido málico, Br-
6. NO3-
7. Ácido oxálico 8. Ácido cítrico 9. SO4
2-
10. Ácido tartárico
Columna : Shodex RSpak DE-413 (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : 10mM H3PO4 aq.FÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 50˚C
Cuando se utiliza el agua como eluente con una solución buffer al 100%, la vida de las columnas ODS por lo general se acorta. Dado que el material del empaque de RSpak DE-413 es químicamente estable, se puede lograr una larga vida de la columna y resultados estables incluso cuando se usa el agua como eluente en una solución buffer al 100%.
Columna : Shodex IC I-524A (4,6mm de diámetro x 100mm) Eluente : 1,5mM de ácido ftálico + 1,38mM de tris(hidroximetil) aminometano (pH4,0) + 300mM de ácido bóricoÍndice de flujo : 1,2ml/minDetector : Detector de conductividad (CD)Temp. de la columna : 40˚C
El eluente utilizado aquí es apropiado para el análisis simultáneo de aniones inorgánicos y ácidos orgánicos dibásicos y tribásicos con IC I-524A. Los ácidos orgánicos se encuentran en la cerveza e interfieren en la cuantificación de aniones. Cl-, NO3
- y SO42- pueden ser separados sin la
interferencia de los ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos, el ácido oxálico y el ácido cítrico también pueden analizarse sin interferencia.
Fig. 3-6 Ácidos orgánicos en el vino blanco
Fig. 3-7 Ácidos orgánicos (modo de fase reversa)
Fig. 3-8 Ácidos orgánicos y aniones en la cerveza (modo de intercambio aniónico)
Vino de alta calidad Vino de mesa
En los apéndices B, C y D se muestra la tabla de volumen de elución de los ácidos orgánicos con cada columna.
10 15 20 25 min 10 15 20 25 min
2
2
1
5
5 6
7
783
3
44
0 1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8 min
98
0
1
2
4
3
5 67
89
5 10 15 20 min
- 16 -
F7621001F7621002F7620002F7620001F6710001F6710023F7620004F7620003F6710022F7620009F6713001F7001004F7001005F7009030F7001006F6700150F7001007F6700151F7630002F7630001F6710016F7630006F6713000F6650050F6650051
Asahipak ODP-40 4DAsahipak ODP-40 4EAsahipak ODP-50 6DAsahipak ODP-50 6EAsahipak ODP-50G 6AAsahipak ODP-50 4BAsahipak ODP-50 4DAsahipak ODP-50 4EAsahipak ODP-50G 4AAsahipak ODP-50 2DAsahipak ODP-50G 2ARSpak DE-613RSpak DE-413RSpak DE-413LRSpak DE-413SRSpak DE-GRSpak DE-213RSpak DE-SGAsahipak NH2P-50 4DAsahipak NH2P-50 4EAsahipak NH2P-50G 4AAsahipak NH2P-50 2DAsahipak NH2P-50G 2ASilica 5SIL 4DSilica 5SIL 4E
> 11.000> 17.000> 9.000> 14.000
(Guarda columna)> 2.500> 9.000> 14.000
(Guarda columna)> 5.000
(Guarda columna)> 7.000> 11.000> 17.000> 3.000
(Guarda columna)> 8.000
(Guarda columna)> 5.500> 7.500
(Guarda columna)> 3.500
(Guarda columna)> 9.000
> 15.000
445555555556444
10445555555
4,6 x 1504,6 x 2506,0 x 1506,0 x 2506,0 x 104,6 x 504,6 x 1504,6 x 2504,6 x 102,0 x 1502,0 x 106,0 x 1504,6 x 1504,6 x 2504,6 x 504,6 x 102,0 x 1502,0 x 104,6 x 1504,6 x 2504,6 x 102,0 x 1502,0 x 104,6 x 1504,6 x 250
Tabla 4-1. Columnas Shodex para análisis de vitaminas(Absorción y partición)
Fig. 4-1 Categorías de las vitaminas
Código deproducto
Nombre del productoNúmero de plato
teórico(PT/columna)
Tamaño de la partícula
(μm)
Diámetro x largo
(mm)
4. Vitaminas
Existen dos tipos de vitaminas, la vitamina soluble en grasa y la vitamina soluble en agua. (Fig. 4-1) Es posible analizar las vitaminas de manera simultánea, aunque muchos métodos oficiales muestran los respectivos métodos de análisis. Los principales análisis mediante HPLC son el de fase reversa o el de fase normal; además, puede aplicarse la cromatografía por exclusión de tamaño. La tabla 4-1 muestra la alineación de las columnas empacadas de Shodex para análisis de vitaminas con modos de separación.
Vitaminas solubles en grasas
Vitaminas solubles en agua
A
D
E
K
B1
B2
B3
B5
B6
B12
B13
BT
C
H
M
Retinol, β-Caroteno
Ergocalciferol (D2), Colecalciferol (D3)
α, β, γ, δ-Tocoferol
Filoquinona (K1), Menaquinona (K2), Menadiona (K3)
Tiamina
Riboflavina
Niacina (ácido nicotínico), Niacinamida (Niacinamida)
Ácido pantoténico
Piridoxina, piridoxal, piridoxamina
Cianocobalamina
Ácido orótico
Carnitina
Ácido ascórbico
Biotina
Ácido fólico
Diámetro xlargo(mm)
β
α β γ δ
- 17 -
F6028010
F6700300
GPC KF-801
GPC KF-G
> 18.000
(Guarda columna)
6
8
1.500 8,0 x 300
4,6 x 10
( Exclusión por tamaño )
Código deproducto Nombre del producto
Número de plato teórico
(PT/columna)
Código deproducto Nombre del producto
Número de plato teórico
(PT/columna)
Tamaño de la partícula(μm)
Límite deexclusión
(poliestireno)
Tamaño dela partícula
(μm)
Diámetro xlargo(mm)
F7008140
F7008150
F6700510
F7008160
RSpak NN-814
RSpak NN-614
RSpak NN-G
RSpak NN-414
> 9.000
> 4.000
(Guarda columna)
> 6.000
10
10
10
10
8,0 x 250
6,0 x 150
6,0 x 50
4,6 x 150
( Multi modo )
Muestra : 20 μL1. Menadiona (Vitamina K3)2. Retinol (Vitamina A)3. Acetato de retinol (acetato de Vitamina A)4. Menadiona (Vitamina D2)5. Colecalciferol (Vitamina D3)6. α-tocoferol acetato (acetato de Vitamina E)7. α-tocoferol (Vitamina E)8. Filoquinona (Vitamina K1)
Columna : Shodex Asahipak ODP-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/CH3OH=50/50Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : UV(280nm)Temp. de la columna : 30˚C
Muestra : 100 μL1. Palmitato de retinol (palmitato de Vitamina A)2. α-tocoferol (Vitamina E)3. Colecalciferol (Vitamina D3)4. Menadiona (Vitamina K3)
Columna : Shodex GPC KF-801 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : THFÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV(280nm)Temp. de la columna : 40˚C
Fig. 4-2 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en grasas (modo de fase reversa)
Fig. 4-3 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en grasas (modo de fase reversa)
4-1. Vitaminas solubles en grasas
0 5
1
2
3
4
5
6 7
8
10 15 20 25min
0
1
3
4
2
5 10 15 20 25min
- 18 -
Muestra: Margarina al 0,2%, 100 μL1. Palmitato de retinol (Palmitato de vitamina A)
Columna : Shodex GPC KF-801 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : THFÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (325nm)Temp. de la columna : 40˚C
El palmitato de vitamina A fue analizado con GPC KF-801. Se utilizó para la detección una longitud de onda de 325nm en una absorción UV máxima. Sólo mediante la disolución de la muestra en el eluente (THF) y filtrándola con un filtro descartable (0,45 μm), se pudo analizar el palmitato de vitamina A sin otro pretratamiento como la saponificación.
Fig. 4-4 Palmitato de vitamina A en la margarina (modo por exclusión de tamaño)
Muestra: Tocoferol1. α-Tocoferol2. β-Tocoferol3. γ-Tocoferol4. δ-Tocoferol
Columna : Shodex Silica 5SIL 4D (4,6mm de diámetro x 150mm) Eluente : n-Hexano/2-Propanol=99,5/0,5 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV(280nm)Temp. de la columna : 30˚C
Se separaron alfa, beta, gamma y delta-tocoferol mediante el modo de fase normal con una mezcla de n-hexano/isopropanol como eluente.
Fig. 4-6 Vitamina E (modo de fase normal)
Muestra: 0,1 μg/ml c/u, 100 μL1. Ergocalciferol (Vitamina D2)2. Colecalciferol (Vitamina D3)
Columna : Shodex Asahipak ODP-50 6D (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : CH3CN/CH3OH=90/10Índice de flujo : 1,5ml/minDetector : UV (265nm)Temp. de la columna : 27˚C
La vitamina D2 y D3 se separaron con Asahipak ODP- 50 6D (columna con base de polímero) con el modo de fase reversa. Dado que el rango de pH utilizable de la columna ODP-50 es muy amplio y puede lavarse tanto con solventes ácidos como alcalinos, es de gran duración, incluso cuando se utiliza para muestras en bruto.
Fig. 4-5 Vitaminas D2 y D3 (modo de fase reversa)
0
1
5 10 15 20 25
min
0 5
1
2
10 15min
0
1
2
3
4
5 10 15 min
- 19 -
Muestra: 20 μL1. Ácido ascórbico (Vitamina C)2. Niacina (Vitamina B3)3. Piridoxina (Vitamina B6)4. Niacinamida (Vitamina B3)5. Tiamina (Vitamina B1) 6. Cianocobalamina (Vitamina B12)7. Riboflavina (Vitamina B2)
Columna : Shodex RSpak DE-413 (4,6mm de diámetro x 150mm) Eluente : (A); 1/30M Solución buffer de fosfato de potasio (pH6,8) /CH3CN=98/2 (B); H2O/CH3CN=50/50 0 min a 4 min, 100% (A) 4 min a 15 min, 100% (A) a 70% (B) Después de 15 min, 70% (B)Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Shodex UV (254nm)Temp. de la columna : 35˚C
Fig. 4-7 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en agua (modo de fase reversa)
Columna : Shodex RSpak NN-614 (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : 45mM KH2PO4 + 55mM Na2HPO4 ac.Reactivo : 0,01% K3Fe(CN)6 + 15% NaOHÍndice de flujo : 0,7ml/minDetector : Fluorescencia (Ex. 375nm, Em. 450nm)Temp. de la columna : 25˚C
La cantidad total de vitamina B1 fue medida con RSpak NN- 614 con un eluente de solución buffer de fosfato. La vitamina B1 separada por la columna se convierte en tiocromo con un reactivo post columna con un detector de fluorescencia. Este método fue recomendado por Métodos estándar de análisis para químicos de higiene con comentario (1990).
Fig. 4-9 Vitamina B1 (multi modo)
Muestra: 0,25% c/u, 3 μL1. Ácido pantoténico2. Ácido orótico3. Piridoxina HCI (Vitamina B6)4. Nicotinamida5. Vitamina B1
6. Vitamina B2
Columna : Shodex RSpak NN-814 (8,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : 45mM KH2PO4 + 55mM Na2HPO4 + 7% CH3OH Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (210nm)Temp. de la columna : Temp. ambiente
NN-814 es una columna multi modo (fase reversa + intercambio catiónico). Con NN-814, se puede realizar un análisis isocrático y no requiere un reactivo de par iónico.
Fig. 4-8 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en agua (multi modo)
4-2. Vitaminas solubles en agua
Muestra: 1ng/μL hidrocloruro de tiamina, 10 μL
0
1
2
3
4 5
6
7
5 10 15 20min
0
1
2
3 4
5 6
10 20 30 min
Inte
nsid
ad d
e flu
ores
cenc
ia
Vitamina B1 (ng)0
5
50 100
10
10 20 min.
Vitamina B1 (tiamina) Tiocromo
Reagent
- 20 -
Columna : Shodex Asahipak ODP-50 6D (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : 50mM Sodium phosphate buffer(pH2,0)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (254nm)Temp. de la columna : 30˚C
Los miembros de familia de la vitamina B6 son difíciles de separar, debido a su similitud estructural. Aunque el método usual de separación emplea un reactivo de par iónico, el análisis en modo de fase reversa es posible según las leves diferencias de hidrofobicidad entre las muestras individuales, siempre que la acidez sea elevada, por ejemplo, pH2,0. En realidad, fueron separados tres ingredientes en aproximadamente 5 minutos con la columna de polímero de fase reversa Asahipak ODP-50, que es estable incluso en un pH de 2,0.
Fig. 4-10 Vitamina B6 (modo de fase reversa)
Columna : Shodex RSpak NN-814 (8,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : 0,1M KH2PO4 ac.Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente
La carnitina (Vitamina BT) estándar fue separada con RSpak NN- 814 (multi-modo). El principal pico se observó a los 12 minutos y se observaron picos de impurezas a los 8 a 10 minutos.
Equilibrio: Después de pasar 60mM de ácido fosfórico en la columna a razón de 0,5ml/min durante 2 horas, se reemplaza por el eluente.
Fig. 4-12 Vitamina BT (multi-modo)
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluent : 20mM NaH2PO4+30mM H3PO4 ac. /CH3CN=20/80Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (254nm)Temp. de la columna : 30˚C
Generalmente, se utilizan amino columnas o columnas de sílice para el análisis del ácido ascórbico. El uso de amino columnas están bastante generalizado porque el ácido isoascórbico (eritórbico), al igual que el ácido ascórbico, pueden ser analizados simultáneamente. No obstante, las amino columnas convencionales con base de sílice no son químicamente estables, por lo tanto, su tiempo de vida no es prolongado.
Asahipak NH2P-50 4E tiene un tiempo de vida prolongado, dado que es una columna estable con base de polímero.
Fig. 4-11 Vitamina C (modo de fase normal)
Muestra: Carnitina (Vitamina BT)
0
1
2
3
5 min
0
O=C
ácido eritórbico
ácido L-ascórbico
OHOC
HOC
HCOH
CH3OH
HC
5
1
2
10 min
O=C
OHOC
HOC
OHCH
CH3OH
HC
Muestra : 5 µg/n1. Ery2. Aso
0 5 10 min
1 = 1µg2 = 2µg3 = 1,2µg
- 21 -
Muestra : CnH2n+1COOH, 40 µL1. Ácido cáprico (n=9)2. Ácido láurico (n=11)3. Ácido mirístico (n=13)4. Ácido palmítco (n=15)5. Ácido esteárico (n=17)6. Ácido araquídico, ácido eicosanoico (n=19)7. Ácido behénico, ácido docosanoico (n=21)
Columna : Shodex RSpak DE-413 (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : CH3CN/THF/H2O=45/20/35Índice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C
Fig. 5-1 Ácidos grasos superiores (1)
Muestra:1. EPA (ácido eicosapentaenoico)2. DHA (ácido docosahexaenoico)3. Ácido araquidónico4. Ácido linoleico
Columna : Shodex ODSpak F-411 (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : H2O/CH3CN=20/80Índice de flujo : 0,7ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30˚C
Se sabe que el EPA y el DHA, son ácidos grasos esenciales abundantes en los pescados que son efectivos para prevenir trombosis y mejorar la función cerebral.
Fig. 5-2 Ácidos grasos superiores (2)
5. Otros ingredientes en los alimentos
5-1. Ácidos grasos superiores
F7001004
F7001005
F7009030
F7001006
F6700150
F7001007
F6700151
F6604112
F6605110
F6604113
RSpak DE-613
RSpak DE-413
RSpak DE-413L
RSpak DE-413S
RSpak DE-G
RSpak DE-213
RSpak DE-SG
ODSpak F-411
ODSpak F-511
ODSpak F-411/S
> 7.000
> 11.000
> 17.000
> 3.000
(Guarda columna)
> 8.000
(Guarda columna)
> 8.000
> 14.000
> 10.000
6
4
4
4
10
4
4
5
5
3
—
—
—
—
—
—
—
14
14
14
6,0 x 150
4,6 x 150
4,6 x 250
4,6 x 50
4,6 x 10
2,0 x 150
2,0 x 10
4,6 x 150
4,6 x 250
4,6 x 100
Tabla 5-1. Columnas Shodex para el análisis de ácidos grasos superiores(Absorción y partición)
Código deproducto Nombre del producto
Número de plato teórico(PT/columna)
Contenidode carbono
(%)
Tamaño dela partícula
(µm)
Diámetrox largo(mm)
0
1 23
45
6
7
2 4 6 8 10 12 14
14
16 18 20 min
5 10
1
2
34
20 min
- 22 -
Fig. 5-3 Ácidos nucleicos como componentes del gusto
IMP, GMP y AMP (nucleótidos), ingredientes representativos del umami (Ácidos nucleicos del gusto) y todos sus metabolitos fueron analizados mediante elución isocrática con la columna Asahipak GS-320 7E. No solo el modo de exclusión por tamaño (modo principal) sino también el modo de fase reversa y el de intercambio iónico, por lo tanto, la columna GS-320 7E es capaz de separar completamente en 30 minutos un total de nueve ingredientes (nucleósidos correspondientes y algunas bases) desde IMP, GMP, AMp y otros nucleósidos.
5-2. Ácidos nucleicos como componentes del gusto
F7610005
F6710019
Asahipak GS-320 7E
Asahipak GS-2G 7B
7,5 x 300
7,5 x 50
Tabla 5-2. Columnas Shodex para análisis de compuestos del gusto(Multi modo)
Código deproducto
Nombre del productoDiámetrox largo(mm)
Columna : Shodex Asahipak GS-320 7E (7,5mm de diámetro x 250mm) Eluente : 10mM solución buffer de fosfato de sodio (pH5,0)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (260nm)Temp. de la columna : 30˚C
Muestra :
0
1
2
3
4
56
7 89
10 20 30 min
- 23 -
Fig. 5-4 Aminoácidos (modo de intercambio catiónico fuerte)
5-3. Aminoácidos
Columna : Shodex CXpak P-421S (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : No.1; 0,12M de solución buffer de citrato de sodio (pH3,3) No.2; 0,13M de solución buffer de citrato de sodio (pH3,2) No.3; 0,11M de solución buffer de citrato de sodio (pH4,0) No.4; 1,02M de solución buffer de citrato de sodio (pH4,9) No.5; 0,2M NaOH + 10% C2H5OH (Solución de enjuague) Gradiente de presión baja 0min, No.1 1,2min, No.2 10,0min, No.3 21,2min, No.4 40,0min, No.5Índice de flujo : 0,5ml/minDetector : VIS (570nm) (Reacción de ninhidrina; 0,35ml/min, 120˚C) Temp. de la columna : 63˚C
Fig. 5-5 Aminoácidos (multi modo)
Los aminoácidos ácidos, como el ácido aspártico, se separan con por el modo de exclusión iónico y se eluyen más rápidamente. Las sustancias neutrales se separan mediante fase reversa y los aminoácidos alcalinos se separan mediante una mezcla de fase reversa (en caso de estructura hidrofóbica) y modo de intercambio iónico. Por lo tanto, los aminoácidos se eluyen en este orden: primero los aminoácidos ácidos, después los aminoácidos neutrales y por último los aminoácidos alcalinos.
Columna : Shodex RSpak NN-814 (8,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : 40mM H3PO4 ac.Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C
F6354211
F6700210
CXpak P-421S
CXpak P-GIntercambio catiónico fuerte
6
10
4,6 x 150
4,6 x 10
Tabla 5-3. Columnas Shodex para el análisis de aminoácidos(Intercambio catiónico fuerte)
Código deproducto
Nombre del producto Modo de separaciónTamaño dela partícula
(µm)
Diámetrox largo(mm)
Código deproducto
Nombre del producto Modo de separaciónTamaño dela partícula
(µm)
Diámetrox largo(mm)
F7008140
F7008150
F6700510
F7008160
RSpak NN-814
RSpak NN-614
RSpak NN-G
RSpak NN-414
Exclusión iónica+
Intercambio iónico+
Fase reversa
10
10
10
10
8,0 x 250
6,0 x 150
6,0 x 50
4,6 x 150
Tabla 5-3. Columnas Shodex para el análisis de aminoácidos(multi modo)
Muestra : 20 µL1. Ácido aspártico2. Glicina3. Alanina4. Valina5. Metionina6. Isoleucina
Muestra: 2,5nmol c/u, 100 µL
0
1
23
4
5
6
20 40 60 80 min
- 24 -
Apéndice
A. Volumen de elución de sacáridos
N-acetil-α-D-glucosamina
D(+)-arabinosa
D-Arabitol
Aspartamo
2-desoxi-D-glucosa
Anhídrido de difructosa III
Dulcitol
Meso-eritritol
Etanol
1-fructofuranosil nistosa
D(-)-fructosa
D(+)-fucosa
D(+)-galactosa
4'-galactosil lactosa
Ácido α-D-galacturónico
Gentiobiosa
Glucosa
Glicerol
Glicirricina
Mio-inositol
Isomaltosa
Isomaltotriosa
1-Kestosa
Kojibiosa
Lactitol
Lactosa
Lactosilfructósido
Lactulosa
Maltitol
Maltoheptaosa
Maltohexaosa
Maltopentosa
Maltosa
Maltotriosa
Mannitol
D-manosa
D(+)-melezitosa
Melibiosa
Metil-α-D-manopiranósido
Nistosa
Palatinita
8,9
10,4
15,9
-
8,8
7,1
20,2
12,7
11,1
6,1
11,1
10,5
9,7
7,4
-
7,2
8,6
-
12,8
7,7
7,1
6,8
7,6
13,3
8,1
7,1
9,1
12,2
7,9
7,5
15,8
10,7
6,9
8,2
11,1
6,4
2picos
7,8
8,9
11,3
-
7,6
6,3
12,8
10,1
11,3
5,3
8,9
8,8
8,0
6,0
6,3
6,1
7,3
-
8,9
6,3
5,8
5,8
6,2
8,1
6,5
5,9
7,0
8,3
6,3
5,9
11,1
8,2
5,8
6,5
8,9
5,5
2picos
6,7
8,2
7,6
-
7,2
5,8
7,4
7,9
10,1
4,8
7,7
8,1
7,6
5,4
4,4
5,8
7,2
-
8,0
6,0
5,3
5,3
5,9
6,1
6,0
5,3
6,2
6,0
5,9
5,4
7,2
7,6
5,2
6,0
7,8
4,9
5,9
-
5,1
7,3
-
4,3
4,3
9,5
5,7
-
31,4
5,4
4,5
6,5
19,0
-
10,5
5,9
-
12,6
10,6
21,2
13,1
9,7
16,4
10,1
14,7
9,2
13,0
8,7
13,8
8,8
5,8
13,6
11,7
4,0
20,1
2picos
4,1
5,6
8,2
34,0
4,0
*
11,3
6,3
4,3
*
5,9
5,0
5,0
*
5,6
*
4,8
2,7
7,9
*
*
*
*
6,7
4,1
*
4,7
6,8
*
*
9,0
5,0
*
4,2
4,4
*
2picos
6,7
6,2
6,3
-
6,0
7,8
7,5
5,4
-
-
6,8
5,4
8,1
21,7
-
16,4
8,6
-
10,0
15,2
27,6
20,1
14,8
11,8
13,3
19,0
10,7
11,8
14,2
25,0
7,4
7,8
19,3
14,7
4,7
31,9
12,7
17,4
14,2
17,1
16,6
16,8
17,8
15,6
14,7
15,3
15,5
15,7
15,8
14,8
14,6
14,3
16,1
15,6
14,7
SP0810Pb2+
SC1011Ca2+
KS-801Na+
SZ5532Zn2+
SC1211Ca2+ NH2P-50 4E
GS-220 HQx 2
Sustancias
Volumen de elución (ml)
Serie SUGAR Asahipak Asahipak
( - ) no se puede detectar ( * ) no se puede separar del pico del solvente.
- 25 -
Columna : Shodex SUGAR SP0810, SC1011, KS-801 (8,0mm de diámetro x 300mm c/u)Eluente : H2OÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80˚C
Columna : Shodex SUGAR SZ5532 (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : H2O/CH3CN=25/75Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C
Columna : Shodex SUGAR SC1211 (6,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : H2O/CH3CN=65/35Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 70˚C
Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : H2O/CH3CN=25/75Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30˚C
Columna : Shodex Asahipak GS-220 HQ (7,5mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C
Palatinosa
Panosa
L-fenilalanina
D(+)-rafinosa
D(+)-ramnosa
D(-)-ribosa
Rutinosa
Sacarina sódica
D(-)-sorbitol
D(+)-sorboss
Estaquiosa
Esteviósido
Sacarosa
α-D-Talosa
Theanderosa
Trehalosa
Trehalulosa
Xilitol
Celobiosa
D(+)-xilosa
D-Xilulosa
7,8
7,1
-
7,1
9,8
19,4
7,8
7,0
21,6
9,7
6,8
-
7,5
21,3
2picos
7,6
8,9
19,9
8,2
9,2
10,6
6,5
5,8
-
5,8
8,2
13,7
6,5
5,4
13,3
8,0
5,6
-
6,3
12,6
2picos
6,3
7,0
13,1
6,7
7,1
9,0
5,9
5,3
-
5,3
7,4
9,0
5,8
4,3
7,4
7,4
5,0
-
5,9
8,8
2picos
5,8
6,1
7,9
6,4
7,7
8,0
8,1
16,9
-
16,4
3,9
4,8
6,7
6,8
9,8
5,1
-
4,1
7,9
5,7
2picos
10,9
9,5
7,8
5,7
4,6
4,1
3,99mL
*
31,6
*
4,4
8,6
*
*
11,9
4,9
*
*
*
8,5
*
*
4,8
10,2
*
4,5
5,1
12,1
25,6
-
20,3
5,5
5,5
10,9
5,7
7,1
7,4
36,2
6,1
11,9
6,5
2picos
13,3
11,7
6,1
9,1
6,6
5,4
15,1
16,6
14,3
16,3
16,9
17,5
SP0810Pb2+
SC1011Ca2+
KS-801Na+
SZ5532Zn2+
SC1211Ca2+ NH2P-50 4E
GS-220 HQx 2
Sustancias
Volumen de elución (ml)
Serie SUGAR Asahipak Asahipak
( - ) no se puede detectar ( * ) no se puede separar del pico solvente
- 26 -
B. Volumen de elución de sacáridos y ácidos orgánicos (SH1011)
Ácido oxálico
Estaquiosa
Isomaltotriosa
Panosa
Maltotriosa
Gentiobiosa
Isomaltosa
Melibiosa
Kojibiosa
Maltosa
Trehalosa
Nigerosa
Palatinita
Palatinosa
Trehalulosa
Lactosa
Celobiosa
Maltitol
Ácido D-glucurico
Ácido cítrico
Ácido α-cetoglutárico
Ácido maleico
Lactitol
Ácido N-Acetilneuramico
Ácido tartárico
Glucosa
Ácido pirúvico
Sorbosa
5,1
5,2
5,3
5,4
5,4
5,7
5,8
5,9
5,9
5,9
5,9
5,9
6,0
6,0
6,0
6,0
6,1
6,1
6,1
6,2
6,2
6,2
6,3
6,3
6,4
6,8
6,9
6,9
5,6
5,2
5,3
5,4
5,5
5,7
5,8
5,9
5,9
5,9
5,9
5,9
6,0
5,9
6,0
6,0
6,1
6,2
6,2
6,3
6,9
7,1
6,3
6,6
6,6
6,8
7,7
6,9
MuestraEluente
5mM 20mM
Mio-inositol
Ácido málico
D-manosa
D(+)-galactosa
D(+)-xilosa
Ácido malónico
D(-)-fructosa
Ácido trans-aconítico
Manitol
D(-)-sorbitol
D(+)-ramnosa
D(+)-arabinosa
D(-)-ribosa
D-arabitol
Xilitol
D(+)-fucosa
Ácido succínico
Meso-eritritol
N-acetil-α-D-glucosamina
Ácido láctico
N-acetil-α-D-galactosamina
Ácido fórmico
Ácido acético
Ácido adípico
Ácido mesacónico
Ácido L-piroglutamico
Ácido propiónico
Etanol
7,0
7,0
7,1
7,1
7,2
7,2
7,2
7,2
7,4
7,5
7,5
7,6
7,8
7,8
8,0
8,0
8,3
8,3
8,4
8,8
9,3
9,4
10,1
10,4
11,0
11,4
11,7
14,1
7,1
7,2
7,1
7,2
7,2
7,5
7,2
7,5
7,4
7,5
7,5
7,7
7,8
7,9
8,0
8,0
8,3
8,3
8,4
8,9
9,3
9,5
10,2
10,5
11,4
11,7
11,7
14,1
MuestraEluente
5mM 20mM
Columna : Shodex SUGAR SH1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : 5mM or 20mM H2SO4 aq.FÍndice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C
- 27 -
C. Volumen de elución de ácidos orgánicos (KC-811)
Ácido oxálico
Ácido maleico
ácido alfa-cetoglutárico
Ácido oxalacético
Ácido pirúvico
Ácido 2-cetoglucónico
Ácido fosfórico
Ácido cítrico
Ácido tartárico
Ácido isocítrico
Ácido glucurónico
Ácido trans-aconítico
Ácido malónico
Ácido galacturónico
Ácido glucónico
Ácido glioxílico
Ácido málico
Ácido alfa-hidroxi-glutárico
Ácido ascórbico
Ácido fumárico
Ácido succínico
Ácido glicólico
Ácido itacónico
Ácido láctico
Ácido 2-hidroxi-isobutírico
Ácido adípico
Ácido beta-hidroxipropiónico
Ácido fórmico
Ácido mesacónico
Ácido úrico
Ácido piroglutámico
Ácido acético
Ácido levulínico
Ácido propiónico
CO32-,HCO3-
Ácido isobutírico
Ácido n-butírico
Ácido isovalérico
Ácido n-valérico
9,3
9,7
10,0
10,5
10,5
10,6
10,6
10,8
11,1
11,1
11,2
11,5
11,5
11,8
12,3
12,4
12,5
13,5
13,5
14,5
15,3
15,6
15,9
16,0
16,5
16,7
16,9
17,2
17,2
17,9
18,6
19,2
20,0
22,3
24,7
25,4
27,3
31,9
38,4
9,4
10,2
10,4
11,2
11,2
11,1
11,0
11,3
11,7
11,5
11,4
12,4
12,4
12,1
12,5
12,9
13,0
13,9
13,7
16,1
15,5
15,9
16,4
16,4
16,8
19,8
17,0
17,6
19,2
17,9
20,3
19,3
20,2
22,4
24,7
25,5
27,5
32,1
38,6
9,6
10,5
10,9
11,8
11,8
11,5
11,3
11,7
12,1
11,9
11,7
13,1
13,0
12,4
12,8
13,3
13,4
14,0
13,9
17,2
15,8
16,3
16,8
16,7
17,1
20,2
17,2
17,9
20,5
18,3
21,0
19,4
20,3
22,5
24,5
25,6
27,6
32,3
38,9
9,7
11,1
11,4
12,5
12,5
11,7
11,6
11,8
12,3
11,9
11,8
13,5
13,4
12,4
12,5
13,9
13,4
14,2
13,8
17,8
15,7
16,2
16,8
16,7
17,1
20,0
17,1
17,9
21,1
18,0
21,7
19,4
20,2
22,5
24,7
25,6
27,6
32,2
38,8
Sustancia
Volumen de elución (ml)
1mMHCIO4
2mMHCIO4
3mMHCIO4
5mMHCIO4
Columna : Shodex RSpak KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : HClO4 aq.Índice de flujo : 1,0ml/minTemp. de la columna : 50˚C
- 28 -
D. Volumen de elución de ácidos orgánicos (KC-811)
Ácido oxálico
Ácido maleico
Ácido fosfórico
ácido α-cetoglutárico
Ácido 2-cetogluconico
Ácido glucurónico
Ácido pirúvico
Ácido cítrico
Ácido oxalacético
Ácido isocítrico
Ácido tartárico
Ácido galacturónico
Ácido glucónico
Ácido malónico
Ácido trans-aconítico
Ácido glioxílico
Ácido málico
Ácido ascórbico
Ácido α-hidroxi-glutárico
Ácido succínico
Ácido glicólico
Ácido láctico
Ácido 2-hidroxi-isobutírico
Ácido 3-hidroxipropiónico
Ácido itacónico
Ácido fórmico
Ácido fumárico
Ácido acético
Ácido úrico
Ácido levulínico
Ácido piroglutámico
Ácido adípico
Ácido propiónico
Ácido mesacónico
CO32-,HCO3-
Ácido isobutírico
Ácido n-butírico
Ácido isovalérico
Ácido n-valérico
9,7
10,7
11,0
11,1
11,6
11,7
11,9
11,9
12,0
12,1
12,4
12,5
12,8
13,3
14,0
13,3
13,7
14,1
14,6
16,5
16,6
16,8
17,0
17,5
17,8
18,2
19,2
19,9
20,7
22,1
22,9
23,1
23,5
24,0
24,3
27,1
29,8
35,7
45,1
Sustancia
Volumen de elución (ml)
30˚C
9,6
10,7
11,1
11,0
11,5
11,7
11,8
11,8
11,9
12,0
12,2
12,4
12,8
13,1
13,5
13,3
13,5
14,0
14,3
16,1
16,4
16,8
17,1
17,3
17,3
18,0
18,0
19,7
19,3
21,1
21,8
21,4
23,0
21,9
24,5
26,4
28,7
33,9
41,8
40˚C
9,6
10,5
11,3
10,9
11,5
11,7
11,8
11,7
11,8
11,9
12,1
12,4
12,8
13,0
13,1
13,3
13,4
13,9
14,1
15,8
16,3
16,7
17,1
17,2
16,8
17,9
17,2
19,4
18,3
20,3
21,0
20,2
22,5
20,5
24,5
25,6
27,6
32,3
38,9
50˚C
9,6
10,5
11,4
10,8
11,5
11,7
11,7
11,6
11,8
11,7
12,0
12,3
12,8
12,8
12,7
13,2
13,2
13,7
13,8
15,4
16,1
16,5
16,9
17,0
16,3
17,6
16,4
19,1
17,4
19,5
20,3
19,0
22,0
19,2
24,5
24,8
26,5
30,6
36,1
60˚C
9,5
10,5
11,5
10,7
11,4
11,7
11,7
11,5
11,7
11,6
11,9
12,3
12,9
12,7
12,5
13,1
13,0
13,6
14,0
15,1
15,9
16,4
16,8
16,8
15,9
17,5
15,8
18,8
16,8
18,9
19,8
18,1
21,5
18,1
24,4
24,0
25,5
29,0
33,6
70˚C
9,5
10,4
11,7
10,6
11,4
*
11,7
11,4
11,7
11,5
11,8
12,2
12,9
12,6
12,2
13,1
12,9
*
13,9
14,8
15,7
16,2
16,7
16,6
15,5
17,3
15,3
18,6
16,2
18,3
19,3
17,3
20,7
17,3
24,2
23,1
24,5
27,5
31,3
80˚C
Columna : Shodex RSpak KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 3mM HClO4 ac.Índice de flujo : 1,0ml/min
1. Leer en su totalidad el manual de instrucciones que acompaña el producto antes de utilizar las columnas.
2. Las especificaciones para los productos están sujetas a cambios sin aviso con el propósito de realizar mejoras.
3. No se ofrece garantía acerca de las cifras que aparecen en esta hoja técnica, dichas cifras deben utilizarse solo como referencia.
4. Si bien en este manual no hay advertencias en cuanto a la seguridad o peligro de los reactivos y productos químicos, asegúrese de tomar las precauciones habituales cuando toque los productos.
5. Los productos que se describen aquí no fueron diseñados para el uso en exámenes clínicos en el área médica.
Aviso
TNE.No.03E.(4)10.D.JUN.TR
Bienvenido ahttp://www.shodex.net/
Shodex ofrece información acerca de nuevos productos y tecnologías para análisis mediante correo
electrónico.
Si le interesa recibir boletines informativos por correo electrónico, únase a nuestra lista de boletines
“Chromato Mail” Mediante nuestro sitio Web.
Si tiene alguna pregunta acerca de este cuaderno técnico, recibiremos sus consultas a través del
sitio Web que aparece a continuación.
Oficinas de Shodex
(OFICINAS CENTRALES)Showa Denko K.KShodex (Separation & HPLC) Group
(NORTEAMÉRICA Y LATINOAMÉRICA)Showa Denko America, Inc.
(EUROPA Y ÁFRICA)Showa Denko Europe GmbH
(CHINA)Shodex China Co. Ltd.
(JAPÓN)Shoko Co.,Ltd.
(COREA)Shoko Korea Co.,Ltd.
5-1, Ogimachi, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanagawa 210-0867, JAPÓNTel.: +81-(0)44-329-0733 Fax: +81-(0)44-329-0794 Correo electrónico: Sdk_Shodex_Lab@sdk.co.jp Web: www.shodex.com
420 Lexington Avenue, Suite 2850, New York, NY 10170 EE.UU.Tel.: +1-212-370-0033 Fax: +1-212-370-4566 Correo electrónico: support@shodex.net Web: www.shodex.net
Konrad-Zuse-Platz 4, 81829 Múnich, ALEMANIATel.: +49-(0)89-93996237 Fax: +49-(0)89-93996250 Correo electrónico: info@shodex.de Web: www.shodex.de
18F, Wang Wang Building, No.211 Shi Men Yi Road, Jing An, Shanghái, 200041, CHINATel.: +86-(0)21-6217-6111 Fax: +86-(0)21-6217-9879 Correo electrónico: sales@shodexchina.com Web: www.shodex.com/index_ch.html
4-1, Shibakohen 2-chome, Minato-ku, Tokio, 105-8432, JAPÓNTel.: +81-(0)3-3459-5104 Fax: +81-(0)3-3459-5081 Correo electrónico: shodex.lab@shoko.co.jp Web: www.shodex.com
#322. Chungjeongno 3-ga, Seodaemun-gu, Seúl 120-013 COREATel.: +82-(0)2-784-5111 Fax: +82-(0)2-784-5125 Correo electrónico: shoko.korea@shokokorea.com Web: www.shodex.com/index_kr.html
SHOWA DENKO K.K.
Fabricado por
top related