NOMBRE DEL PROYECTO, PAÍS Y ÁREA TEMÁTICA

Proyecto: Flujo de genes del arroz cultivado (O. sativa) al arroz maleza (O. sativa) y a la especie silvestre (O. glumaepatula) en un centro de diversidad tropical: determinación de la estructura genética y capacidad de sobrevivencia de los híbridos de arroz cultivado maleza.

País: Costa Rica

Área temática: Flujo de genes.

INVESTIGADORES Y ESTUDIANTES PARTICIPANTES

Griselda Arrieta Espinoza, MSc. Biología molecular y bioseguridad, CIBCM-UCR, investigadora y coordinadora del proyecto

Eric Fuchs Castillo, Ph.D. Genética de poblaciones y estadística, Escuela de Biología y CIBCM-UCR, investigador

Bernal E. Valverde Mena, Ph.D. Malherbología y flujo de genes, The University of Copenhagen, Denmark/IDEA Tropical, Costa Rica, investigador

Federico Albertazzi Castro, Ph.D Biología Molecular, CIBCM-UCR, coordinador nacional LAC-Biosafety.

Amanda Calvo Santana, Lic. Biología, Flujo de genes de arroz comercial a silvestre mediante AFLPs

Cindy Aguilar Bartels, Lic. Agronomía, CIBCM-UCR, asistente técnica de laboratorio

Melania Muñoz Vargas, MSc.en Biotecnología, Estudio flujo de genes de arroz comercial a silvestre mediante AFLPs

Adriana Orozco Portuguez, estudiante de Licenciatura en Biología, Estudios de competencia híbridos producidos por el cruce entre arroz comercial y maleza (Asistente: 2011 – 2012)

Eddier Villalobos Cascante, estudiante de Licenciatura en Biología, Estudios de habilidad combinatoria híbridos arroz comercial y silvestre (Asistente: 2011 – 2012).

Elena Vásquez Céspedes, estudiante de Licenciatura en Biología, Estudios de habilidad combinatoria de híbridos arroz maleza y cultivado (Asistente: 2011 – 2012).

Daniela Salazar Espinoza, Asistente investigación y coordinación labores de invernadero, cruces dirigidos (Asistente: 2011 a 2012)

Daniel Alejandro Corrales Valverde, estudiante agronomía apoyo cruces dirigidos y labores de invernadero (Asistente: 2012).

Fernando Vives Saborío, estudiante agronomía apoyo invernadero y laboratorio (Asistente, 2011).

José Pablo Castro Sánchez, estudiante agronomía apoyo invernadero y laboratorio (Asistente, 2011).

Mauricio Arce Guzmán, estudiante agronomía apoyo invernadero y laboratorio (Asistente, 2011).

Mario Quesada Lacayo, estudiante agronomía apoyo invernadero y laboratorio (Asistente, 2011).

América Latina: Desarrollo de capacidad multi-país en cumplimiento del Protocolo de Cartagena en Bioseguridad (COLOMBIA, PERU, COSTA RICA, BRASIL)

2

CONTEXTO GENERAL Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

La utilización de cultivos genéticamente modificados (CGM) sin afectar los recursos naturales es una prioridad en América Latina y el Caribe (ALC) debido a su condición de centros de origen y diversidad. El proyecto Multi-país para la construcción de capacidad para el cumplimiento del Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad, está en armonía con el acuerdo multilateral respecto al movimiento transfronterizo de organismos genéticamente modificados (OGM) que puedan implicar un riesgo a la diversidad biológica. La información sobre el flujo de genes entre el arroz cultivado (Oryza sativa) los posibles receptores de genes el arroz maleza (Oryza sativa) y el silvestre (O. glumaepatula) es muy importante previo a la liberación de un arroz GM. En forma similar a otras regiones del mundo, la producción de arroz en los países de ALC se ve seriamente limitada por varias enfermedades, plagas y, sobre todo, las malas hierbas. Por otra parte, los países de ALC son el hogar de cuatro especies silvestres de Oryza: O. alta, O. grandiglumis, O. latifolia todos tetraploides (genoma tipo CCDD), y O. glumaepatula diploide (genoma AA) este que es más propenso a hibridar con el arroz cultivado (también AA). La eventual siembra de OGMs requiere de información previa sobre flujo de genes, o posible transferencia de características, del OGM a un pariente silvestre. En Costa Rica existen tres especies silvestres de arroz, entre ellas Oryza glumaepatula que podría ser una potencial receptora de polen del arroz cultivado debido a la similitud del genoma AA con el arroz cultivado. De ahí la importancia de obtener información sobre O. glumaepatula en cuanto a la diversidad intrapoblacional e interpoblacional de la especie y cuantificar la magnitud del flujo de genes interespecífica en poblaciones naturales de Oryza en los centros de la biodiversidad tropical, ya que la información es escasa. El arroz transgénico resistente a herbicidas (RH) puede ser utilizado para facilitar el control selectivo de malezas con herbicidas de amplio espectro. Sin embargo, su posible liberación comercial ha aumentado la preocupación de bioseguridad debido a la posibilidad de flujo genético entre variedades transgénicas y parientes silvestres y malezas relacionadas. Por lo tanto, los reguladores en bioseguridad requieren de estudios de referencia diseñados para entender la interacción entre las especies de arroz cultivado malezas y silvestres, como potenciales receptores de transgenes, y la posibilidad de híbridos que los porten.

OBJETIVOS PLANTEADOS

Objetivo 1: Estudiar la adaptabilidad de los híbridos arroz maleza y arroz resistente a herbicida recolectados en campo en

condiciones de invernadero y competencia.

Objetivo 2. Determinar la habilidad combinatoria entre el arroz cultivado y maleza mediante cruces artificiales.

Objetivo 3: Estudiar la adaptabilidad de los híbridos arroz maleza y arroz resistente a herbicida producidos por cruces

artificiales.

Objetivo 4: Estudiar la diversidad genética y determinar en forma indirecta el flujo génico histórico en las poblaciones de O.

glumaepatula localizadas en el humedal del río Medio Queso (Los Chiles, Alajuela) y Murciélago (Guanacaste) y el arroz

cultivado O. sativa.

3

Objetivo 5. Transferir una metodología estandarizada del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) para el monitoreo

a gran escala del flujo de genes entre O. sativa y las especies silvestres y malezas relacionadas.

Objetivo 6. Diseñar y discutir estrategias de manejo para minimizar el flujo de genes de un eventual arroz GM al arroz maleza

(Oryza sativa) y silvestre (Oryza glumaepatula).

Objetivo 7. Producir una guía de bioseguridad que compile la información generada por el subproyecto en relación a la

determinación del flujo de genes e introgresión de O. sativa al arroz maleza y silvestre.

METODOLOGÍA GENERAL UTILIZADA

Objetivo 1: Para estudiar la adaptabilidad de los híbridos producto del cruce entre el arroz maleza y arroz resistente a herbicida

recolectados en campo en condiciones de invernadero y competencia se recolectaron semillas de plantas de arroz maleza en

campos de arroz comercial. Estos materiales proceden de los lotes Río Seco y Playitas (finca arrocera Pelón de la Bajura,

Guanacaste). Es estos lotes se utilizó el sistema Clearfield con anterioridad, y se reportó la presencia de arroz maleza resistente

al herbicida imidazolinona lo cual es un indicador de la posible hibridación del arroz maleza con esta variedad. Las semillas se

sembraron y se evaluó la resistencia o susceptibilidad al herbicida mediante bioanálisis con plantas enteras para determinar la

respuesta de los biotipos selectos a dosis crecientes de imazapir, de modo que pudiera calcularse la dosis requerida para

reducir el crecimiento en un 50% (ED50). Los valores de ED50 de plantas de arroz maleza resistentes al herbicida fueron

equivalentes (altamente resistentes) o aproximadamente la mitad (resistencia intermedia) de los obtenidos con la variedad

Clearfield de arroz comercial en concordancia con su naturaleza homocigota o heterocigota, respectivamente. En los

experimentos de competencia se utilizó la prole de plantas individuales de arroz maleza, caracterizadas como susceptibles (S) y

altamente resistentes (R) a imazapir. Se transplantó diez plántulas individuales, de tamaño uniforme, a macetas de 25 cm de

diámetro para que crecieran en competencia de acuerdo a un arreglo sustitutivo (serie de reemplazo). De esta forma,

manteniendo una densidad constante de plantas, se establecieron seis proporciones porcentuales entre individuos de arroz

maleza S y R correspondientes a (80:20, 60:40, 40:60, 80:20) y los respectivos monocultivos (100% S y 100% R). El

experimento contó con seis repeticiones en un diseño irrestrictamente al azar. Se realizaron evaluaciones periódicas iniciando

tres semanas después del transplante para caracterizar el crecimiento de los individuos (altura, número de culmos) y su

morfología relacionada con la resistencia al herbicida (textura de hojas, color de base de los culmos). Conforme las plantas

maduraron se determinó el número de culmos fértiles y a la conclusión del experimento la biomasa fresca individual separada

entre los componentes vegetativo y reproductivo. Para corroborar la respuesta a imazapir de los individuos empleados en el

experimento, los nuevos culmos que rebroten posteriores a la cosecha se tratarán con dosis discriminantes del herbicida de

4

acuerdo con la resistencia o susceptibilidad al herbicida de los materiales. Los datos se sometieron a análisis de varianza y

pruebas de medias o de regresión no lineal según correspondiera.

Objetivos 2 y 3: Con la finalidad de determinar la habilidad combinatoria y adaptabilidad de los híbridos producidos mediante

cruces artificiales entre el arroz maleza y el cultivado, se inició con la producción de los híbridos. Para ello se utilizaron 10

accesiones de arroz maleza del banco de semillas del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM-UCR),

pertenecientes a 5 morfotipos, tipo sativa e intermedio (Arrieta-Espinoza et al. 2005) y recolectadas en el 2000 previo a la

liberación de las variedades resistentes a imidazolinonas. La semilla de las variedades resistentes a herbicida se sembró

semanalmente en el invernadero, para la sincronización de la floración entre el arroz maleza y las variedades. Se realizaron

cruces manuales dirigidos entre los arroces maleza (líneas maternas) y las variedades Clearfield® (líneas paternas) y también

se realizó el tipo de cruce inverso. Para su obtención, se utilizó el protocolo implementado por Sarkarung (1991), que se

modificó y adaptó para mantener las plantas en invernadero en macetas y la metodología empleada en el Centro de

Investigación en Agricultura Tropical (CIAT). Semanalmente, se sembraron plantas del arroz maleza y comercial, para poder

contar cuatro meses después de la siembra con las plantas en floración y realizar los cruces. Una vez que las plantas iniciaron

la floración temprana (panzoneo), se emascularon las espiguillas de las plantas que serian madre previo a la apertura de las

mismas, se cortó el ápice de la lema y palea de cada espiguilla con una tijera de disección y con la ayuda de una lupa de

aumento y con una pipeta de vidrio tipo Pasteur conectada a una bomba de vacío se extrajeron las anteras de cada una. Luego

la panícula se cubrió con un sobre o bolsa de papel y al día siguiente se elimin cualquier espiguilla que tuviera alguna antera y

se realizó la polinización cuando se diera la liberación del polen con la planta que se utiliza como padre. Por último, se

cubrieron de nuevo las panícula para proteger las espiguillas y la semilla se revisó tres a cuatro semanas después de realizado

el cruce. Este procedimiento se realizó para cruzar accesiones de arroz maleza (AR136, AR157, AR556, AR571, AR573,

AR585, AR977, AR993, AR997, AR1002, AR-599, AR-) y las variedades de arroz resistentes a herbicida CFX-18 y Puitá-Inta.

Para lo cual, se utilizaron 3 plantas de cada accesión de arroz maleza por tipo de cruce. Se realizaron cruces utilizando el arroz

maleza como madre (receptoras de polen) y las variedades comerciales resistentes al herbicida como padres (donadoras de

polen) y también el cruce inverso en el que el arroz maleza fue el donador de polen y la variedad comercial la receptora.

La semilla híbrida (F1) obtenida se germinó in vitro con papel filtro y agua destilada estéril, a una temperatura de 26 °C, 41%

humedad y fotoperiodo 12/12, hasta alcanzar una altura aproximada de 10 cm cuando se trasplantó y se aclimató en

invernadero. Junto con esta semilla se germinó semilla de líneas parentales de arroz maleza y las variedades. Se realizaron 7

evaluaciones cada 15 días, hasta llegar a los 105 días de edad, en plantas híbridas y líneas parentales. Las variables medidas

fueron: altura de la planta (desde base hasta hoja más larga), número de culmos por planta, número de hojas, ancho de la hoja

5

bandera y se registró el tiempo requerido para iniciar la floración. Se comparó promedios de altura y número de brotes entre los

híbridos y padres por morfotipo y se realizaron curvas de crecimiento de los híbridos y los padres por tipo sativa e intermedio.

Para determinar diferencias significativas se realizó una prueba de diferencia significativa honesta (DSH) de Tukey. Asimismo,

se realizó un análisis multivariado de componentes principales (PCA). Una vez que se obtuvo la semilla (F2) una parte se

guardó para las pruebas de competencia y la otra para continuar con el estudio de habilidad combinatoria en las siguientes

generaciones. Para determinar a nivel molecular la presencia del gen de resistencia en las plantas híbridas, se extrajo ADN

genómico de todas las plantas evaluadas a partir de tejido foliar deshidratado por dos días en una estufa a 50°C. Las hojas se

maceraron con un triturador de muestras FastPrep® a una velocidad de 6 m/s durante 40 s (2 veces) y se continuó con el

procedimiento del protocolo de extracción de Lodhi y colaboradores (1994) modificado para arroz. El ADN genómico se visualizó

mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% y fue cuantificado mediante un NanoDrop 2000c (Thermo Scientific). Se

realizó la detección de la mutación S653D en el gen que codifica para la enzima acetolactato sintetiza (ALS) presente en la

variedad CFx-18, mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), utilizando los

imprimadores alelo específicos ALS653ResF (CTGCCTATGATCCCAAGGGA) y ALSR3 REV (TGGGTCATTCAGGTCAAACA)

diseñados por Kadaru y colaboradores (2005). Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en un gel de

agarosa al 2%. Asimismo, se realizó la detección de los híbridos por medio de los microsatélites (RM-180, RM-234, RM-251),

los cuales previamente han sido utilizados en la identificación de híbridos entre arroz maleza y cultivado (Gealy et al. 2002,

Raguro et al. 2005). Los productos de PCR se visualizaron un gel de agarosa al 2% en una electroforesis. Los protocolos e

información molecular utilizada en esta parte de los objetivos se dió gracias a la capacitación y transferencia recibida por

investigadoras y asistentes del CIBCM con la investigadora Luisa Fory del CIAT.

Objetivo 4: El estudio de la diversidad genética y la determinación en forma indirecta del flujo génico histórico en las

poblaciones de arroz silvestre O. glumaepatula localizadas en el humedal del río Medio Queso (Los Chiles, Alajuela) y

Murciélago (Guanacaste) y el arroz cultivado O. sativa inició con la recolecta de material silvestre en el campo. Se recolectaron

y georeferenciaron las muestras de individuos de seis poblaciones de arroz silvestre del humedal del Río Medio Queso en Los

Chiles, Alajuela y una de Murciélago, Cuajiniquil, Guanacaste en Costa Rica. El arroz cultivado, se obtuvo de plantas

sembradas en invernadero y producidas con semilla genética de las variedades CR-5272 y CR-1821 donada por el Centro de

Investigación en Granos y Semillas de la Universidad de Costa Rica (CIGRAS-UCR). Se recolectaron y georeferenciaron 150

muestras de O. glumaepatula distribuidas en seis poblaciones del humedal del Medio Queso y 20 muestras de una población en

Murciélago. En cada sitio de recolecta, se colectaron muestras de hoja, se colocaron en bolsas de plástico etiquetadas en una

hielera con hielo, hasta ser trasladadas al laboratorio donde se almacenaron a -20°C. El ADN total de cada muestra se extrajo

6

con un FastDNA ® Kit y con el triturador de hojas FastPrep ®. La cantidad y calidad del ADN se visualizó en geles de agarosa al

1% y se determinó su concentración con una escalera cuantificación molecular. Un total de 150 muestras de O. glumaepatula y

diez de las variedades cultivadas de arroz O. sativa. Se utilizó la técnica molecular AFLP (Amplified Fragment Length

Polymorphism, por sus siglas en inglés) para hacer el análisis genético de todas las muestras de acuerdo con lo descrito por

Vos et al. 1995. Para ello, se siguió el protocolo de la compañía Applied Biosystems y se hizo una preamplificación con los

imprimadores M-C y E-A y se evaluaron 32 combinaciones de imprimadores para la amplificación selectiva. Las amplificaciones

se realizaron en un termociclador Hybaid Sprint. Los fragmentos obtenidos de la amplificación selectiva fueron separados por

su tamaño en un secuenciador ABI 310 de Applied Biosystems. Los electroferogramas obtenidos se analizaron con el programa

GeneMarker. Se analizaron los fragmentos de un tamaño entre 150 y 500 pares de bases (pb), y se realizó una matriz binaria

según la presencia (1) o ausencia (0) de dichos fragmentos. Se calculó la diversidad genética de seis poblaciones de Oryza

glumaepatula en Los Chiles y una de Guanacaste mediante el índice de Shannon y por métodos Bayesianos (Holsinger and

Wallace, 2004). El programa Structure (Pritchard, 2000) se utilizó para confirmar si las poblaciones de la especie silvestre de

Oryza glumaepatula forma grupos que se han cruzado al azar (grupos panmíticos) y también para determinar la existencia de

mezcla genética entre las variedades comerciales y la especie silvestre.

Objetivo 5. La transferencia de una metodología estandarizada por el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) para

el monitoreo a gran escala del flujo de genes entre O. sativa y las especies silvestres y malezas relacionadas se realizó

mediante una capacitación. Esta actividad se coordinó con los investigadores Dr. Gerardo Gallego y MSc. Luisa Fory del Centro

Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) quienes aportaron los protocolos de la capacitación, infraestructura y reactivos.

Desde el punto de vista de la logística el CIAT cubrió los traslados y almuerzos. El presente subproyecto financió tiquetes

aéreos, impuestos de salida, hospedaje y viáticos para el personal de Costa Rica. Para transferir la metodología estandarizada

por el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en primera instancia se seleccionaron las personas que recibirían la

capacitación. Para ello, se seleccionaron en base a sus conocimientos en biología molecular y su permanencia en la institución

ejecutora del proyecto, de tal manera que pudieran entender los conceptos y protocolos rápidamente y además ser

capacitadoras de la metodología a otros colegas e instituciones una vez finalizada la ejecución del proyecto.

El trabajo de laboratorio se coordinó en función del objetivo planteado y se trabajó con muestras de ADN extraído de los

híbridos producidos obtenidos en Costa Rica por medio del cruce entre las accesiones del arroz maleza (madre) y la variedad

de arroz CFX-18 resistente a herbicida (padre). Se incluyeron como controles el arroz maleza, las variedades de Costa Rica, y

la variedad CF205 resistente al herbicida comercializada en Colombia y las variedades no resistentes a herbicida CR-5272, CR-

1821. Además, se recibió capacitación en cuanto al protocolo de extracción masiva de ADN (96 muestras) utilizado en yuca por

7

el laboratorio del CIAT. Por último, se hicieron experimentos con la metodología estandarizada para la detección del gen de

resistencia al herbicida en el ADN de grupos masales de plantas en arroz y por medio de la utilización de diluciones seriadas

que puede implementarse para el monitoreo a gran escala del flujo de genes entre el arroz cultivado O. sativa y el arroz maleza

y silvestre.

Objetivo 6. El diseño y discusión de estrategias de manejo para minimizar el flujo de genes ante la eventual liberación de una

arroz GM al arroz maleza (Oryza sativa) y silvestre (Oryza glumaepatula) se realizó mediante tres actividades. En primera

instancia, conjuntamente con los productores de arroz que colaboraron con el proyecto, durante las visitas que se realizaron a

los productores de arroz para la recolecta de arroz maleza resistente al herbicida, también se procedió a discutir y recopilar

información sobre el manejo que se realiza en estas fincas productoras y en los lotes en donde se han encontrado problemas de

resistencia al herbicida en el arroz maleza. Las fincas colaboradoras fueron El Pelón de la Bajura, ubicada en Bagaces,

Guanacaste, en proyecto contó con el apoyo de la Ing. Angélica Villegas Quesada encargada de investigación

(avillegas@grupopelon.com) y Ing. Leonel Fernández, Gerente Agrícola (lfernandez@grupopelon.com) y La Hacienda Mojica,

Cañas, Guanacaste con el Ing. Hernán Rodríguez (hrodriar23@gmail.com). Estas dos fincas productoras de arroz fueron las

primeras que utilizaron la variedad resistente a herbidica desde su liberación en Costa Rica en el 2005. Además, se realizó la

recopilación de artículos científicos (fechados desde el 2000 hasta 2012) relacionados con el flujo de genes de arroz cultivado

(Oryza sativa) y el manejo de variedades de arroz resistentes a herbicida. Se realizó un taller de dos días y dos días de visitas

a las fincas colaboradores todo en coordinación con el proyecto de capacitación de Costa Rica del LAC-Biosafety. En este

taller, los investigadores del proyecto de flujo de genes y de los otros subproyectos presentaron los resultados obtenidos y

además se contó con el espacio para discutir y analizar las medidas y estrategias que deberían tomarse en cuenta ante la

eventual liberación de un arroz genéticamente modificado con resistencia al herbicida para evitar y manejar el flujo de genes.

Es importante destacar que se contó con la visita del Dr. David Gealy, especialista en flujo de genes de arroz cultivado al arroz

maleza, Universidad Arkansas – USDA quien impartió charlas sobre los estudios del flujo de genes del arroz cultivado al arroz

maleza al utilizar variedades de arroz resistentes a herbicidas producidos por mutación e híbridas. Con la finalidad de maximizar

los recursos y el tiempo del proyecto para obtener la mayor difusión y posibilidad de discutir el tema con los distintos actores

relacionados con el tema del flujo de genes en arroz, la estrategia fue tener públicos distintos los tres días. El primer día, el

público meta fue exclusivamente la Comisión Nacional Técnica de Bioseguridad (CTNBio) y el segundo día se trató de un taller

enfocado a técnicos de empresas distribuidoras de agroquímicos, empresas productoras de semillas de arroz, personeros de la

Corporación Arrocera Nacional (CONARROZ), de la Oficina Nacional de Semillas, de la Comisión Nacional para la Gestión de la

8

Biodiversidad (CONAGEBIO) y la Universidad de Costa Rica y Universidad Nacional, Instituto Tecnológico de Costa Rica,

estudiantes de pregrado y posgrado de las carreras de Agronomía, Biología y Biotecnología. El tercer y cuarto día, se visitaron

las Finca el Pelón de la Bajura y Hacienda Mojica en donde se impartieron las charlas del Dr. David Gealy y visitaron los lotes

más problemáticos y discutió el manejo realizado. El taller, se realizó los días 7 y 8 de mayo de 2012 y la visita y reuniones de

campo los días 10 y 11 de mayo de 2012 (Anexo 2, programas y hojas de asistencia).

Objetivo 7. Para producir la guía de bioseguridad compilé la información generada por el subproyecto en relación a la determinación del flujo de genes e introgresión de O. sativa al arroz maleza y silvestre, la información y productos derivados de cada objetivo del proyecto se presentarán en el formato de una comunicación corta y se entregarán a las autoridades de Bioseguridad ambiental. Por otra parte, esta sirvió de insumo para la valoración de riesgo ambiental realizada en el marco del subproyecto “Fortalecimiento de la capacidad técnica para la estimación del riesgo ambiental potencial de cultivos de arroz modificado genéticamente” por Sergio Bermúdez y Federico Albertazzi Castro (CIBCM-UCR). Por último, se anexan? los pdf de las publicaciones

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RESULTADOS OBTENIDOS

Objetivo 1: Adaptabilidad de los híbridos arroz maleza y arroz resistente a herbicida recolectados en campo en competencia. El experimento de competencia bajo series de reemplazo mostró que durante la etapa vegetativa de las plantas no hubo diferencias en altura entre individuos resistentes (R) y susceptibles al herbicida (S) (Figura 1). La altura promedio de las plantas resistentes fue 74 cm y en las susceptibles de 73 cm en la primera evaluación (1A) y mientras que en la evaluación realizada 15 días después la altura fue de 80 cm y 79 cm, respectivamente.

73.7473.09

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 R/ 100 S 20 R/ 80 S 40 R/ 60 S 60 R/ 40 S 80 R/ 20 S 100 R/ 0 S Promedio

Tratamiento

Alt

ura (

cm

)

R S

79.9979.18

0

20

40

60

80

100

120

0 R/ 100 S 20 R/ 80 S 40 R/ 60 S 60 R/ 40 S 80 R/ 20 S 100 R/ 0 S Promedio

Tratamiento

Alt

ura

(cm

)

R S

1A 1B

Figura 1: Altura de plantas de arroz maleza resistentes (R) y susceptibles (S) al herbicida imidazolinona en los condiciones de competencia en la fase vegetativa (1A: 1 de mayo de 2012, 1B: 17 de mayo 2012). Al comparar la altura de las plantas en las diferentes proporciones utilizadas en el experimento, tampoco se observan diferencias importantes. Por lo cual el resultado evidencia que en las condiciones experimentales estudiadas esta característica no se ve modificada por la resistencia o susceptibilidad al herbicida y no confiere a los híbridos mayor adaptabilidad. En relación con el número de culmos, se observó que las plantas resistentes al herbicida (R), produjeron una cantidad ligeramente mayor 7,34 y 7,49 en promedio que las susceptibles 6,36 y 6,47, en todas las proporciones estudiadas en el experimento. Ello evidencia la alta capacidad de las plantas resistentes al herbicida para producir biomasa y ocupar un mayor espacio.

10

7.34

6.36

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 R/ 100 S 20 R/ 80 S 40 R/ 60 S 60 R/ 40 S 80 R/ 20 S 100 R/ 0 S Promedio

Tratamiento

No.

de c

ulm

os

R S

7.49

6.47

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 R/ 100 S 20 R/ 80 S 40 R/ 60 S 60 R/ 40 S 80 R/ 20 S 100 R/ 0 S Promedio

Tratamiento

No

. d

e c

ulm

os

R S

`

2A 2B

Figura 2: Número de culmos producidos en las plantas de arroz maleza resistentes (R) y susceptibles (S) al herbicida imidazolinona en los condiciones de competencia. Sin embargo, al inicio de la etapa reproductiva los biotipos susceptibles en promedio tienen un mayor número de hijos fértiles (2.44) que los resistentes (1.88). La proporción de hijos fértiles también favorece al susceptible con 38% comparado con 26% de hijos fértiles en los biotipos resistentes. Esta tendencia, se observó en una segunda evaluación durante esta fase, en donde los individuos resistentes (R) en promedio tenían un menor número de hijos fértiles (3.03) que los susceptibles (4.11) (S) al herbicida.

11

El éxito competitivo o fitness de las plantas R y S se determinó con base en la fertilidad de las plantas y cantidad de semilla viable producida en relación con los cambios en la proporción relativa entre individuos R y S en las mezclas evaluadas. En la figura 3 se observa como las plantas resistentes al herbicida son más fértiles que las plantas susceptibles en condiciones no competitivas. La capacidad competitiva de las plantas resistentes al herbicida fue muy evidente e importante al producir mayor semilla que las plantas susceptibles en dos condiciones extremas (80R/20S) y (20R/80S). No obstante, produjeron menos semilla y por lo tanto fueron menos competitivas que las plantas susceptibles al herbicida en proporciones similares (60R/40S y 40R/60S). En términos generales, los resultados indican que no hay una penalización en el éxito competitivo de las plantas de arroz maleza al adquirir la resistencia al herbicida y que las plantas R son más competitivas en términos de producción de semillas que las susceptibles.

Figure. 2. Porcentaje de fertilidad de las plantas resistentes y susceptibles al herbicida imidazolinona según el tratamiento de densidad en un experimento de competencia de series de reemplazo.

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Objetivos 2 y 3: En relación con la habilidad combinatoria se obtuvo un total de 467 plantas, de las cuales 337 son híbridos resultantes de cruces manuales entre arroces maleza y variedades CFx-18 (98 plantas) y Puitá INTA (239 plantas) (Cuadro 1). Lo cual corresponde a 10 líneas diferentes de acuerdo con la accesión de arroz maleza que se obtuvieron. No se obtuvieron semillas híbridas de los cruces inversos ya que por un problema fitosanitario con un ataque de cochinilla y la pocas semilla producida se cubrió de hongos por lo que se perdieron todas las semillas obtenidas. Ante esta situación y por la limitación del tiempo disponible se decidió concentrar los esfuerzos y evaluaciones en la semilla híbrida de los cruces obtenidos entre el arroz maleza como madre y las variedades resistentes como padres. Se evidencia que el arroz comercial y maleza muestran una alta habilidad combinatoria debido a que se producen híbridos con todos los morfotipos evaluados. Sin embargo esta es diferencial y depende en gran medida de las accesiones individuales de arroz maleza y de la variedad comercial. En términos generales, la hibridación con la variedad Puitá es mayor que con la CFX-18. Cuadro 1: Líneas de híbridos arroces maleza x variedades Clearfield (CFx-18 y Puita INTA).

Accesión Morfotipo Tipo Plantas

parentales

Plantas híbridas

x CFx-18 x Puita INTA

AR136 WM-023 intermedio 15 13 0

AR157 WM-121 intermedio 18 5 26

AR556 WM-020 sativa 9 9 58

AR571 WM-020 sativa 12 9 2

AR573 WM-020 sativa 16 14 21

AR585 WM-020 sativa 15 28 14

AR977 WM-073 intermedio 9 0 25

AR993 WM-120 sativa 10 20 24

AR997 WM-120 sativa 4 0 67

AR1002 WM-120 sativa 8 0 2

CFx-18 - O. sativa 9 - -

Puita INTA

- O. sativa 5

- -

Total 130 98 239

13

Las plantas crecieron y se evaluaron en condiciones de productividad a razón de dos plantas por pote. En la primera generación (F1) se observó claramente un vigor hídrido en las plantas producto del cruce entre el arroz maleza (madre) y el arroz cultivado con resistencia a herbicida (padre). La altura que en promedio fue de 100 a 120 cm, es mayor a la del arroz cultivado cuya altura es en promedio 80 cm (Figura 4). Las plantas híbridas son muy similares en altura con las líneas maternas en ambos cruces (Puitá y CFx-18), y difieren en mayor grado con las líneas paternas en todos los casos. Además, el promedio el ancho de la hoja bandera es muy similar entre todos los materiales evaluados las líneas paternas, maternas e híbridos. El número de brotes varió según el arroz maleza utilizado para el cruce. En el caso de los híbridos que tuvieron como madre los morfotipos (WM-073 y WM-120) se observó un mayor número de brotes comparado con sus progenitores. Pero al analizar el número de brotes y número de panículas no se encuentran diferencias significativas entre los materiales. No obstante se producen 30 a 50% de semillas en las panículas de los híbridos.

Figura 4. Altura promedio y número de brotes (a los 105 dias de edad) de la línea paterna (Puitá INTA), híbridos (F1) y línea materna (arroces maleza). Promedios conectados por la misma letra indican diferencias no significativas.

a

b b b b

a a

b b

a

a

b

a a a a a

a

a

b

a ab

a

b

14

Al analizar la curva de crecimiento de las plantas híbridas en comparación con sus progenitores, se observa que los híbriodos crecen más rápidamente sobre todo en etapas tempranas de la fase vegetativa entre los 20 y 30 días, pero que tiende a estabilizarse en etapas tardías del crecimiento vegetativo 40 a 60 días (Figura 5). Los resultados muestran un alto vigor híbrido de las plantas en etapas tempranas del crecimiento vegetativo pero además inician su proceso de floración y producción de semilla más tempranamente. Figura 5. Curva de crecimiento de los híbridos (línea punteada) y líneas parentales: A) híbridos entre arroz maleza y Puitá INTA, B) híbridos entre arroz maleza y CFx-18. La presencia de la mutación S653D se detectó en plantas de la variedad comercial CFx-18, donde se observa un fragmento de

aproximadamente 150pb. Mientras que en plantas de arroz maleza que sirvieron como plantas madre no fue detectado ya que

carecen de la resistencia al herbicida (Figura 6). Una vez, estandarizadas las condiciones de amplificación para los controles

positivos y negativos se utilizarán con los híbridos producto del cruce entre el arroz maleza con esta variedad. Para la detección

de los híbridos, con los microsatélites sólo se obtuvo amplificación con el RM-234. Sin embargo, este permite diferenciar

claramente la variedad comercial CFX-18, el arroz maleza y los híbridos producto del cruce entre estas dos plantas (Figura 7).

Mientras que los imprimadores RM-180 y RM-251 no se obtuvieron productos de amplificación. Sin embargo, este resultado

obedece a que se requiere un cambio en la temperatura de annealing durante la reacción de PCR para obtener la amplificación

deseada.

A) B)

15

Figura 6: Detección de la mutación S653 utilizando los iniciadores ALS653ResF (CTGCCTATGATCCCAAGGGA) y ALSR3 REV

(TGGGTCATTCAGGTCAAACA)diseñados por Kadaru et al. (2005). Línea 1: control variedad CF (Colombia), línea 2: variedad CFx-18 (planta 1), línea 3: CFx-18 (planta 6), línea 4: CFx-18 (planta 8), línea 5: AR997 (planta 9), línea 6: AR136 (planta 16), línea 7: control negativo (agua), línea 8: marcador molecular (50 pb).

Figura 7: Detección de los híbridos mediante tipo RM-234. Línea 1: CFx-18 (planta 3), línea 2: híbrido 5.1 (AR136 x CFx-18), línea 3: híbrido 27.10 (AR993 x CFx-18), línea 4: híbrido 28.1 (AR993 x CFx-18), línea 5: AR573 (planta 7), línea 6: AR993 (planta 15), línea 7: control negativo (agua), línea 8: marcador molecular (50 pb).

16

Al realizar un análisis de componentes principales con las variables medidas en las plantas, se observa que no hay una agrupación clara de los datos (Figura 8), los híbridos traslapan con las líneas maternas, y lo mismo ocurre entre los arroces maleza y la variedad CFx-18. Además, se observa una alta contribución por parte de las variables altura y ancho de hoja bandera en el componente 1, que explican 91% de la varianza y una baja contribución por parte del número de brotes y número de panículas que explican un 5.8% de la varianza total de los datos en el componente 2. Además, se encontró que cuatro variables que explican el 96% del porcentaje de la varianza de los datos en la fase vegetativa. Al analizar estas variables, se observa que los híbridos en madurez poseen pocas diferencias morfológicas entre las líneas maternas y la variedad comercial.

Figura 8: Análisis de componentes principales (PCA) para la comparación de los híbridos (F1) con las líneas maternas (Arroz maleza) y paternas (variedades comerciales) en relación con el número de brotes, longitud de la panícula, ancho de la hoja bandera y altura. Variación explicada por el componente 1 (91%), componente 2 (5.8%). La longitud de la línea verde significa la magnitud del cambio en la variable medida.

17

Al analizar estas variables en forma independiente se encuentra que la altura es muy similar entre los híbridos y las líneas maternas, diferenciándose en mayor grado de las líneas paternas. Además, el promedio del ancho de la hoja bandera es muy similar entre las líneas paternas, maternas e híbridos y al analizar el número de brotes y número de panículas, no se encuentran diferencias significativas entre sí Al no existir una agrupación clara de los datos indica que no hay diferencias importantes entre la morfología de los híbridos y las líneas maternas. Sin embargo, sí existe una ligera agrupación de los datos de las variedades comerciales. Esto concuerda con la gran variación que poseen los arroces maleza (Arrieta-Espinoza et al. 2005), así como los híbridos descendientes de estas líneas. Mientras que para las variedades comerciales es menos variable debido a los procesos de domesticación por el cual son seleccionadas estas plantas (Lawton-Rauh y Burgos 2010). Además, este análisis se ve afectado por la cantidad de datos disponibles para la línea paterna (n=8), que en comparación con las líneas maternas o morfotipos es muy bajo por lo que, se recomienda aumentar el tamaño de muestra de la variedad comercial e igualar los datos disponibles. Objetivo 4: En cuanto a la diversidad genética, se encontró una mayor diversidad en la especie silvestre O. glumaepatula, que

presenta 84.2% de polimorfismo entre las plantas mientras que es de 34.3% para el arroz cultivado, confirmado con el índice de

Shannon para Oryza glumaepatula fue de H’ = 0.177 y para el arroz cultivado fue H’=0.135. Asimismo, se encontró una clara

diferenciación genética entre ambas especies (ΦST=0.161, p<0.01). La determinación de la estructura genética de las

poblaciones indica el nivel de similitud o diferencia entre ellas, y al utilizar la técnica de AFLP, se puede deducir en forma

indirecta si ha habido flujo de genes histórico: entre menor es la estructura genética entre las poblaciones, mayor sería el flujo

de genes entre ellas. Las poblaciones de O. glumaepatula ubicadas en Los Chiles y Cuajiniquil no presentaron diferenciación

genética y mostraron una estructura genética baja aunque hay una separación geográfica, lo cual indica que ha ocurrido flujo de

genes entre estas poblaciones de arroz silvestres. Ello puede deberse a eventos de dispersión de semilla, plántulas o en última

instancia por polen. Por último, se analizaron los marcadores predominantes en la especie silvestre y el arroz cultivado los

cuales están representados gráficamente por barras de color rojo y verde respectivamente en la Figura 9.

18

Figura 9. Nivel de mezcla genética entre individuos de Oryza glumaepatula y la variedad comercial (O. sativa). El color rojo denota los marcadores predominantes en O. glumaepatula y el verde en el arroz cultivado. Los individuos del “Muro” y “Guanacaste” presentan barras de dos colores.

Se encontró que el 70% de los individuos recolectados en Muro de Los Chiles y Murciélago, Guanacaste presentan cierta

mezcla genética con las variedades comerciales. Obsérvese que los individuos de estas dos poblaciones aunque tienen barras

predominantemente rojas, indicadoras de los marcadores de la especie silvestre, también presentan secciones verdes que

corresponden a marcadores del arroz cultivado. Los resultados de esta investigación permiten concluir que existe el potencial

de flujo génico entre la especie silvestre Oryza glumaepatula y el arroz cultivado Oryza sativa lo que conlleva una debida

consideración desde el punto de vista de la bioseguridad ambiental.

Así mismo, se destaca la necesidad de utilizar un marcador genético que permita determinar la magnitud y dirección del flujo en

forma directa ya que datos previos mostraron que los híbridos entre estas especies en forma manual (glumaepatula x sativa) no

son fértiles.

Objetivo 5. Asistieron a la capacitación Cindy Aguilar Bartels y Griselda Arrieta-Espinoza, quienes son parte del personal del

CIBCM. Además, se seleccionó a la estudiante de biología Elena Vásquez Céspedes quien actualmente realiza su tesis de

licenciatura en biología en el marco del proyecto de investigación pero quien ingresará al sistema de estudios de Posgrado de la

Universidad de Costa Rica una vez concluida su licenciatura. La capacitación del personal del Centro de investigación en

Biología Celular y Molecular de la Universidad de Costa Rica (CIBCM-UCR) en el Centro Internacional de Agricultura Tropical

(CIAT) permitió obtener metodologías para la confirmación molecular de los híbridos de arroz maleza x arroz con resistencia a

herbicida para las dos variedades de arroz con resistencia a herbicida disponibles en el mercado. Asimismo, se transfirió al

CIBCM una metodología estandarizada para la detección del gen de resistencia al herbicida en el ADN de grupos de 7 plantas

19

que puede implementarse para el monitoreo a gran escala del flujo de genes entre el arroz cultivado O. sativa y el arroz maleza

y silvestre. Durante la capacitación se utilizó ADN extraído de los híbridos entre el cruce del arroz maleza y las variedades

comerciales de arroz resistentes al herbicida CFX-18 y Puitá producidos en Costa Rica. Se utilizó un set de imprimadores alelo

específicos (Cuadro 2) que permitiera la amplificación de un producto relacionado con los sitios de la mutación en la enzima

ALS (Acetolactato sintetasa) que es la misma para la variedad CFX-18 (Costa Rica) y CF 205 (Colombia) que se encuentra en

ambas en la posición S653D. Además, permite la detección de los alelos en forma homocigota o heterocigota (resistente) y el

susceptible.

Cuadro 2: Información de los imprimadores relacionados con las mutaciones en la enzima ALS en las posiciones S654D y S653D. Tomado de Kaduro et al. 2005 y CIAT, 2005.

Serina 654 Aspargina (susceptible)

ALS645Sus F: 5´- CTG CCT ATG ATC CCA AGG GG-3´

Detección homocigotas resistentes (mutación S653D). CIAT, 2005.

ALS-R1 12-76 FOR: 5´- AGCATGTGCTGCCTATGATCCCAAGTAA-3´

Serina 654 Aspargina (resistente)

ALS645ResF: 5´- CTG CCT ATG ATC CCA AGG GA-3´

ALS-R1 12-76 REV: 5´- TACATGATATCTTGTGATGCATATGCCTACGG-3´

Ser 653 Asparagina (susceptible) ALS653SusF: 5´- GTG CTG CCT ATG ATC CTA AG-3´

Detección de heterocigotas (mutación S653D). CIAT, 2005.

ALS-R2 14-74 FOR: 5´- CATGTGCTGCCTATGATCCCAAATGA -3´

Ser 653 Asparagina (resistente)

ALS653ResF: 5´- CTG CCT ATG ATC CCA AGG GA-3´

ALS-R2 14-74 REV: 5´- GTAGGACAAGAAACTTACATGATATCTTGTGATGCA-3´

Imprimador reverse

ALSR3 REV: 5´- TGG GTC ATT CAG GTC AAA CA-3´

Detección homocigotas susceptibles CIAT, 2005.

ALS-S3 18-73 FOR: 5´- ATCATGTCCTTGAATGCGCGCC -3´

ALS-S3 18-73 REV: 5´- GAGTTGGCATTGATCCGCATTGAGA-3´

Es importante destacar, que los protocolos se transfirieron efectivamente al CIBCM-UCR ya los resultados moleculares que se presentaron en la sección de los objetivos 2 y 3, son similares a los que se dieron durante la capacitación recibida en el CIAT.

20

Objetivo 6. Durante las visitas a los productores de arroz para la recolecta de arroz maleza resistente al herbicida también se

obtuvo información con respecto al manejo que se realiza en el campo al utilizar el arroz IMI, resistente a imidazolinonas.

Aunque hay pequeñas variaciones dependiendo de las fincas, en términos generales los productores usuarios del sistema de

arroz Clearfield, siguen los procedimientos de administración y manejo establecidos (“stewardship”) por la compañía que

distribuye la semilla. Básicamente, el procedimiento consiste en la firma de un compromiso por parte del usuario cuando se

compra la semilla de arroz y del herbicida necesario para realizar únicamente dos aplicaciones. Estas deben servir para el

control de malezas. Durante el ciclo de utilización de la variedad resistente al herbicida se realiza un monitoreo para evaluar la

efectividad de la aplicación. El otro punto importante es que sólo se puede sembrar la variedad resistente al herbicida durante

dos ciclos consecutivos de producción. Después de este tiempo, debe realizarse una rotación con una variedad convencional.

Ahora bien, en base en las conversaciones con los productores y con los profesionales que asistieron a los talleres de flujo de

genes en arroz se evidencia que este sistema es poco efectivo para prevenir el flujo de genes cuando no se está utilizando la

variedad con la resistencia al herbicida. Actualmente, únicamente se cuenta con una variedad de arroz con un solo modo de

acción que inhibe la formación de aminoácidos y los monitoreos a gran escala en las fincas arroceras no son funcionales para la

detección de híbridos o de plantas que escapen a la aplicación del herbicida. Por lo tanto, el manejo de una eventual variedad

de arroz GM con resistencia a herbicida debería establecer un manejo integral y preventivo de eliminación y control de malezas

y plantas voluntarias de arroz en los lotes antes y después de la utilización de una variedad de arroz resistente al herbicida. No

sólo debe enfocarse en la resistencia al herbicida como única fuente de manejo y control de malezas, para disminuir la presión

de selección sobre los posibles híbridos producto del cruzamiento entre el arroz maleza y la variedad comercial y evitar su

establecimiento. Actualmente la producción de arroz con resistencia al herbicida se enfoca en la eliminación de plántulas

provenientes del banco de semillas o remanentes de la cosecha anterior. El método más eficiente, se centra en el manejo de la

lámina de agua para inducir germinación y luego mediante aplicaciones de herbicida Glifosato o maquinaria que arranca las

plántulas del suelo disminuir el banco de semilla de arroz, también la utilización de antídotos después de la siembra, estos

productos están en evaluación en el país. Por otra parte, sería imperante la utilización de semilla certificada que tenga 0

semillas de arroz maleza por kilogramo de arroz ya que actualmente se permiten 2 semillas por kilo de arroz certificado lo cual

sería inadmisible para el caso de un arroz GM con resistencia a herbicida. Otra de las características que deben contemplarse

en el contexto de un posible manejo de un arroz GM es el arriendo de tierras para la producción de arroz. En las condiciones

locales no todos los productores son propietarios y por lo tanto no necesariamente emplean o invierten en las medidas que

aseguren un adecuado control fitosanitario en las tierras. Sería una consideración importante que ante la eventual liberación de

un arroz GM que implica la necesidad previa del desarrollo de protocolos y experimentos de manejo del arroz en campo antes

de la liberación de una variedad transgénica para evitar flujo de genes e introgresión de la característica de resistencia al

herbicida hacia el arroz maleza.

21

Por otra parte, los resultados del proyecto indican que existe la posibilidad del flujo de genes del arroz comercial al silvestre, en

este escenario el manejo de una eventual liberación de arroz GM implicaría la delimitación de zonas de exclusión para la

siembra de estos materiales en las zonas en donde crecen la especie silvestre O. glumaepatula compatible con el arroz.

En cuanto a los resultados del taller de Bioseguridad Ambiental, el día 7 de mayo asistieron ocho miembros de la Comisión

Técnica Nacional de Bioseguridad, dos asistentes de investigación, seis expositores y el coordinador nacional del proyecto. En

el caso del segundo día, 8 de mayo de 2012 se contó con la presencia de 25 personas procedentes de empresas (BASF,

INARROZ, DUWEST), instituciones públicas CONARROZ, Oficina Nacional de Semillas, Ministerio de Agricultura-INTA,

investigadores y estudiantes de la Universidad de Costa Rica y Universidad Nacional. Se cumplió a cabalidad el objetivo de la

actividad que era presentar y discutir por con las autoridades en bioseguridad ambiental y con profesionales y actores del sector

arrocero del país, los resultados del proyecto, brindar y aclarar conceptos básicos sobre flujo de genes, resistencia y tolerancia

a herbicidas, dormancia de semillas de arroz, adaptabilidad de los híbridos (Anexo 1).

Se realizó la recopilación de 100 artículos científicos relacionados con el flujo de genes de arroz cultivado (Oryza sativa) y el manejo de variedades de arroz resistentes a herbicida, que se entregarán a las autoridades de Bioseguridad Ambiental del país, para la actualización de sus bases de datos. (Detalle en Anexo 2: Listado de artículos recientes para la actualización de las bases de datos del Programa de Biotecnología del Programa Fitosanitario del Estado del Ministerio de Agricultura).

Objetivo 7. Para Producir una guía de bioseguridad que compile la información generada por el subproyecto en relación a la determinación del flujo de genes e introgresión de O. sativa al arroz maleza y silvestre La información y productos derivados de cada objetivo del subproyecto y que se están suministrando en el formato de informe final en este momento se entregarán a finales del 2012 en el formato de comunicación corta a las autoridades de Bioseguridad Ambiental nacionales. A la fecha de presentación de este informe, se entregó y contribuyó activamente en el planteamiento de preguntas y variables para la

valoración de riesgo ambiental realizada por el consultor Sergio Bermúdez a cargo de ese subproyecto.

22

LECCIONES APRENDIDAS

1. Efecto de penalización en la adaptabilidad de los híbridos producto del cruce entre el arroz maleza x arroz resistente a herbicida y su competitividad. 2. Determinación de las características que determinan la habilidad combinatoria entre el arroz cultivado y maleza mediante cruces artificiales. 3. Información científica sobre la diversidad genética de la especie silvestre de arroz O. glumaepatula localizadas en el humedal del río Medio Queso (Los Chiles, Alajuela) y Murciélago (Guanacaste) a nivel intrapoblacional e interpoblacional en un centro de diversidad tropical. 4. Información indirecta sobre la posibilidad de flujo génico histórico entre arroz cultivado O. sativa y el silvestre O. glumaepatula. 5. La ejecución del proyecto de flujo de genes en arroz en el marco del proyecto LAC-Biosafety permitió la obtención de

resultados sobre la diversidad de la especie silvestre Oryza glumaepatula que reflejan la necesidad de tomar las medidas para proteger importante recurso filogenético de arroz del humedal del Río Medio Queso

6. Transferencia de una metodología para la detección alelo específica de la resistencia al herbicida imidazolinona y el monitoreo a gran escala del flujo de genes O. sativa y el arroz maleza y silvestre del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) al Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular. 7. Generación de información y metodologías científicas sobre flujo de genes en arroz transferida a los reguladores en forma de talleres de discusión. 8. Formación y capacitación de personal a distintos niveles, estudiantes, técnicos, profesionales en el área de flujo de genes y la bioseguridad ambiental. 9. Importancia de realizar un estudio para comparar la diversidad genética y el flujo de genes de la especie silvestre de arroz Oryza glumaepatula en los países latinoamericanos en donde se ha encontrado esta especie silvestre tales como Colombia, Venezuela y Brasil.

.

23

2. Cuadro resumen avance de actividades subproyecto

Subproject: Gene flow from O. sativa cultivated rice to weedy (O. sativa) and wild (O. glumaepatula) rice in a tropical center of diversity: genetic structure of wild rice natural populations and fitness of hybrids between crop and weedy forms.

Fecha inicio

Fecha final

Indicadores de resultados por actividad

Pro

gra

mad

a

Efe

cti

va

Pro

gra

mad

a

Efe

cti

va

Comprometidos Obtenidos a la fecha de presentación del informe

(20 junio 2012)

Objective 1: To study the fitness of weedy-herbicide resistant IMI-rice hybrids in a greenhouse controlled environment, from samples collected in rice fields under natural competitive conditions.

1.a Monitoring of rice fields

where commercial IMI rice is

produced to collect plants

surviving after commercial

application of imidazolinone

herbicide. Jan

2010

Sep

20

10

Aug

20

10

Jan

20

11

Preliminary observations in commercial IMI rice fields

have shown plants surviving after commercial application

of imidazolinone herbicide.

1. Identification and georeference of ten rice fields where weedy rice plants escape herbicide treatments. Percentage of execution: 100% completed

1.b Collecting of putative

weedy-IMI rice hybrids in IMI-

rice fields.

Jan

uary

2

01

0

August 2

01

0

Septe

mb

er

201

0

August

201

1

At least ten weedy rice plants surviving the application of

imidazolinone herbicides morphologically characterized

in each selected field and their seed collected.

1. Ten weedy rice plants surviving the application of imidazolinone herbicides were selected and morphologically identified. Percentage of execution: 100% completed.

1.c Determination of IMI-

herbicide resistance and hybrid

nature of plants collected in the

field through rapid bioassay

tests with imazapyr and

molecular analyses (PCR with

specific primers or Southern

blot analyses). Septe

mb

er

2

01

0

August 2

01

1

Septe

mb

er

201

1

May

2012

At least fifty weedy-IMI rice hybrids plants characterized

morphologically and herbicide resistant.

1. Fifty weedy-IMI rice hybrids plants resistant to herbicide

resistant were characterized morphologically. Percentage of

execution 100%.

2. Hybrid nature was determined by using bioassay with herbicide

imazapyr. Percentage of execution: 100%

3. The analysis by using PCR with specific primers was carried

out. Percentage of execution: 100% completed

24

1.c Selfing of weedy-IMI rice hybrids and morphological characterization of the plants for one generation.

May

2010

August 2

01

0

Jan

uary

201

1

Dec e

mb

er

20

11

Seed of the second generation the weedy-IMI rice

obtained according to fertility of the hybrid.

1. Seed (20 grams) of the second generation the weedy-IMI rice

was obtained according to fertility of the hybrid. Percentage of

execution: 100%

1.e Determination of the competitive ability and fitness traits of selved weedy-IMI rice hybrids derived from field collections under competitive conditions in the greenhouse (experiments repeated in time).

Septe

mb

er

201

0

Fe

bru

ary

2

01

2

April 2

01

1

Jun

e

20

12

Two experiments showing the competitive ability and

fitness traits of selved weedy-IMI rice hybrids compared

to conventional and Clearfield varieties

1. Experiments to determine the competitive ability and fitness

traits of selved weedy-IMI rice hybrids, resistant (RR and Rr) and

susceptible (rr) to herbicide imazapyr were carried out

.Percentage of execution: 100% .

1.f Statistical analyses of data collected from experiments on competition.

May

2011

Marc

h

20

12

Dec e

mb

er

2

01

1

May

2012

Two set of data and figures showing the results

produced in the competition replacement experiments in

terms of weedy-IMI rice fitness.

1. The set of data and figures showing the results produced in the

competition replacement experiments in terms of weedy rice

resistant and susceptible to herbicide showed similar competitive

abilities, in terms of plant high and number of culms are similar.

Plants fertility did not varied significantly among weedy rice plants

resistant and susceptible to herbicide. However, plants resistant to

herbicide produces more seeds that susceptible when planted in

low densities conditions (20 R / S 80). These results shows a

higher fitness ability of those plants under competitive conditions

compare to susceptible to herbicide

1.g Presentation of scientific reports every six months.

Jun

e 2

01

0

Dece

mb

er

20

11

Dec e

mb

er

20

10

July

201

2 A scientific report with the results obtained according to

work plan and log frame (Annex A & B).

Timely presentation of scientific reports according to the format

established by CIAT and NC.

Objective 2: To evaluate the fitness of artificial weedy-herbicide resistant rice hybrids under competitive and greenhouse conditions.

2.a Selection and seed increase of three weedy sativa, rufipogon and intermediate morphotypes from CIBCM seed bank germplasm collected before the commercialization of IMI-rice.

Jan

uary

2

01

0

Septe

mb

er

2

01

0

August 2

01

0

April 2

01

1

Seed increase of weedy rice accessions characterized as

sativa, rufipogon-like and intermediate morphotypes

selected according their hybridization rates with O. sativa

(Sánchez et al. 2009). Enough seed (100 g) of the weedy

rice accessions from CIBCM seed bank.

1. Enough seed (100 g) of the weedy rice accessions from CIBCM

seed bank was produced in order to perform the crosses with

herbicide resistant varieties. Percentage of execution: 100%

25

2.b Training of CIBCM personnel in hand made crosses of rice at CIAT.

May

2010

Octo

be

r 2

01

1

April 2

01

0

Fe

bru

ary

2012

Two persons trained on hand made crosses at CIAT. This training would be carried out in collaboration with the Rice Breeding Unit from CIAT.

1. The training on hand made crosses at CIAT was not carried out

because of the delay starting the execution of the project. In order

to assure the adequate accomplishment of the activities, students

and assistants were trained by Griselda Arrieta at UCR, who

received training in this topic at CIAT in previous collaborations

with this institution. The budget of this training was used in the

training of objective described in the fifth objective. Percentage of

execution: 100%

2.c Weekly planting of weedy

rice plants and herbicide

resistant rice to obtain flowering

overlap and perform the manual

crosses. Jan

ua

ry 2

010

May

201

1

Aug

2010

May

201

2

At least a total of 10 plants of each material by week at

greenhouse in CIBCM.

1. Weedy and IMI-resistant rice were planted weekly (30 plants of

each) to obtain flowering overlap and perform the manual crosses.

Percentage of execution: 100%

2.d Manual production of

controlled weedy rice x IMI-rice

hybrids using selected sativa,

rufipogon and intermediate

morphotypes as maternal lines

under greenhouse conditions.

May 2

01

0

May

201

1

Dece

mb

er

20

10

Dece

mb

er

20

11

Three different weedy-IMI rice hybrids lines, using sativa,

rufipogon and intermediate weedy rice as pollen receptor

1. Two different weedy-IMI rice hybrids lines were produced using

sativa and intermediate weedy rice as pollen receptor. Hybrids

using rufipogon type could not be included as seed did not

germinate. Percentage of execution: 100%

2. Sativa weedy rice morphotypes (AR1002, AR556, AR571,

AR573, AR585 & AR993) and intermediate (AR136, AR157,

AR977 & AR997) were cross with two IMI rice varieties (Puita and

CFX-18) a total of 467 putative hybrids were produced.

Percentage of execution: 100%

2.e Manual production of

controlled IMI-rice x weedy rice

hybrids using sativa, rufipogon

and intermediate morphotypes

as paternal lines under

greenhouse conditions.

May 2

01

0

Fe

bru

ary

2

01

2

Dece

mb

er

2

01

0

May

2012

Three different weedy-IMI rice hybrids lines, using sativa,

rufipogon and intermediate weedy rice as pollen donor.

1. The crosses between weedy-IMI rice to produce hybrids lines,

using sativa and intermediate weedy rice as pollen donor were

produced. Percentage of execution: 100%

2. Seed of these hybrids was not obtained on time because of

phytosanitary problems on the greenhouse. The crosses were

repeated but the seed was not ready in order to pursue

morphological evaluation and competitiveness study during the

execution time of the project.

2.f Determination of the hybrid

nature of the plants using

herbicide selection and

molecular analyses (PCR or

Southern blot).

Septe

mb

er

201

0

Octo

be

r 2

01

1

August 2

01

0

April 2

01

2 At least six lines of weedy-IMI rice hybrids characterized

for herbicide resistant.

1. Ten hybrids lines weedy-IMI rice were produced and

characterized by PCR. Southern blot analyses were not

performed because a PCR with allele specific is enough evidence

to confirm herbicide resistance. Percentage of execution: 100%.

26

2.g Morphological

characterization of the weedy

rice x IMI-rice hybrids produced

by manual crosses.

Septe

mb

er

201

0

Nove

mb

er

20

11

April 2

01

1

May

2012

A set of morphological data (six) (vegetative and reproductive) for weedy-IMI rice hybrids line.

1. Evaluation of vegetative and reproductive characters of hybrids

produced by crossing weedy x IMI-rice was carried out (plant

height, flag leaf length and wide, flowering time, panicle length,

number of seeds and seed shattering). Percentage of execution:

100%.

2.h Selfing of weedy-IMI rice and their hybrids and morphological characterization for one generation.

Septe

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April 2

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12

Seed of the second generation the weedy-IMI rice the

exact amount will depend on the fertility of the hybrids.

1.First and second generation of selved pollinated weedy-IMI rice

hybrids was produced in the plants characterized as described in

activity 2g. Percentage of execution: 100%

2.i Determination of competitiveness between artificial weedy-IMI rice hybrids and parental IMI- and weedy-rice lines under greenhouse conditions in separate paired experiments. J

an

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1

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h 2

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11

Jan

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201

2

Two experiments showing the competitive ability and

fitness traits of selved weedy-IMI rice hybrids compared to

conventional

1. These experiments will not be performed during the execution

time of the project. The data about the competitiveness of the

hybrids will be given by the experiments performed with hybrids

found in rice fields in the first objective.

2.j Statistical analyses of data collected from experiments on competition.

Jan

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20

11

May 2

012

Two set of analyzed data and figures showing the results obtained in competition replacement experiments in terms of weedy-IMI rice fitness.

1.These experiments were not performed during the execution time of the project due to the delay in receiving the funds. However the data related to the competitiveness of the hybrids will be given by the experiments performed with hybrids found in rice fields in the first objective. In this sense the delivery of the data for the regulators will not be affected.

2.k Presentation of scientific reports every six months

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11

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July

201

2 A scientific report with the results obtained according to

work plan (Annex A).

1.Timely presentation of scientific reports according to the format

established by CIAT and NC. A delay in funds transference also

delayed the initiation of the project and the presentation of reports.

Objective 3. To determine the combinatory ability between O. sativa and weedy rice using artificial crosses and quantitative genetics methods.

27

3.a Production of IMI-rice x

weedy rice hybrids using sativa,

rufipogon and intermediate

morphotypes as maternal or

paternal lines on artificial

crosses on greenhouse

conditions.

Septe

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May 2

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April 2

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1

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bru

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2012

Six different weedy-IMI rice hybrids lines, using sativa, rufipogon and intermediate weedy rice as pollen donor and receptor.

1. Ten different types of weedy-IMI rice hybrids lines were

produced using sativa and intermediate weedy rice types as

pollen receptor. Hybrids using rufipogon type will not be

included as seed did not germinate. Percentage of execution:

100%

3.b Morphological

characterization of IMI-rice x

weedy rice hybrids to determine

the combinatory ability between

both agronomic forms.

Septe

mb

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2

010

May

2011

August 2

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0

Marc

h

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12

Figures showing the recombination ability between O.

sativa and weedy rice genomes using morphological traits

evaluated.

1. Evaluation of vegetative and reproductive characters of

putative hybrids produced by crossing weedy x IMI-rice is in

progress (plant height, flag leaf length, flowering time, panicle

length, number of seeds and seed shattering). Percentage of

execution: 100%.

3.c Statistical analyses of

morphological data of weedy

rice x O. sativa hybrids using a

quantitative genetic analyses.

Jan

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1

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11

April

20

11

April

20

12

Estimation of combinatorial ability based on multivariate

statistical analysis.

Estimation of combinatorial ability based on multivariate statistical analysis (PCA) was performed and showed no morphological differences between hybrids and weedy rice plants.

3.e Presentation of scientific reports every six months.

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July

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2

A scientific report with the results obtained according to

work plan and log frame (Annex A & B).

Timely presentation of scientific reports according to the format

established by CIAT and NC. A delay in funds transference also

delayed the initiation of the project and the presentation of

reports.

Objective 4. To determine historic levels of gene flow in Oryza glumaepatula natural populations located at Medio Queso wetland (Los Chiles, Alajuela) and Murciélago (Guanacaste) by analyzing genetic structure and using molecular markers. 4.a Monitoring of the initiation of O. glumaepatula flowering period in Rio Medio Queso Wetland, Los Chiles (Alajuela) and in Murciélago, (Guanacaste) to plan the sampling.

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20

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Nove

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20

11

Description of flowering initiation and finish for at least 5

populations in each site (Medio Queso and Murciélago).

Estimation of synchronicity between individuals.

1. Initiation of flowering period was registered during two years. In 2010, it started at October and finished in December. In the case of year 2011, the flowering started also in September. The flowering was synchronic in all the sub-populations in both years. Percentage of execution: 100%

28

4.b Geo-referenced collecting of O. glumaepatula plants and progenies (seed and mother plant tissue) in Rio Medio Queso Wetland, Los Chiles (Alajuela) and in Murciélago, (Guanacaste).

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Complete plants, seeds and leaf tissue from each

reproductive adult will be collected At least five populations

per site with a minimum of 30 individuals per population.

Collection of a minimum of 300 individuals. Seeds and

plants will be transported to the greenhouses at CIBCM-

UCR for germination

1. Geo-referenced database with 125 samples of O. glumaepatula collected in seven localities in Medio Queso and two in Guanacaste. Besides, 27 samples of O. sativa varieties were included for the study. In October 2011, 200 additional plants and their seeds were collected. Percentage of execution: 100%

4.c Freeze-drying of the vegetative samples and storage

Octo

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A collection of a minimum of 300 individuals freeze-dries

tissue, identified and storage.

1. O. glumaepatula samples (125) and 27 samples of O. sativa freeze stored at CIBCM laboratory. In October 2011 an additional 200 plants and their seeds were collected. A total of 342 plants were collected. Percentage of execution: 100%

4.d DNA isolation from wild rice O. glumaepatula and rice cultivars.

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01

0

Nove

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10

A collection of DNA of a minimum of the 300 individuals

collected.

1. DNA extraction methodology standardized using “FastDNA kit” and DNA isolated from 152 samples including O. glumaepatula and O. sativa plants. Percentage of execution: 100%

4.e Selection and optimization of Applied Biosystems' AFLP Plant Genome Mapping Kits for O. glumaepatula and O. sativa genome. Polymerase Chain Reaction (PCR) using AFLPs Kit and ABI 310 genotyper

May

2010

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Optimized AFLPs protocol and a set of polymorphic loci for

genetic analysis of O. glumaepatula and O. sativa. A data

set containing the most informative combinations.

1. Twelve primer combinations were screened for selective PCR amplifications Three of them were chosen: E-TC/M-CTC, E-AC/M-CTG and E-AG/M-CAT. PCR amplifications were performed in a ABI 310 genotyper. Percentage of execution: 100%

4.f Statistical analysis for determination of O. glumaepatula genetic structure and diversity as an indirect method to infer gene flow.

Dece

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April

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May

2012

An average estimate of population structure. Significance estimates of population structure, based on AMOVA calculations. A phenogram of population relationship based on pairwise genetic structure estimates.

1. A binary matrix was built with GeneMarker V1.97. A total of 550 bands were included in the analysis. The estimation of population structure was determined by using STRUCTURE program (Pritchard, 2000) and genetic diversity using Shannon and Bayesian methods (Holsinger and Wallace, 2004).

4.h Presentation of scientific reports every six months.

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July

201

2

A scientific report with the results obtained according to

work plan and log frame (Annex A & B).

Timely presentation of scientific reports according to the format

established by CIAT and NC. A delay in funds transference also

delayed the initiation of the project and the presentation of reports.

29

Objective 5. To transfer a regional standardized methodology from Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) for large scale monitoring of gene flow between O. sativa and wild rice species. 5.a Selection of two candidates for training at CIAT.

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1

April 2

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2

Two candidates selected based on molecular biology background.

1. Two candidates were selected in January 2012. Cindy Aguilar, CIBCM staff technician and Elena Vásquez, Master degree Student. Percentage of execution: 100%

5.b Training of personnel on the use of molecular protocols to monitor gene flow at large scale.

Jan

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Two persons trained on this protocol. 1. Three persons, Griselda Arrieta, Cindy Aguilar and Elena

Vásquez were trained on the large scale gene flow analysis using molecular tools at CIAT, Cali Colombia by Luisa Fory and Gerardo Gallego. This training took place 3-11

th March 2012.

The methods and protocols were transferred to CIBCM-UCR. Percentage of execution: 100%

5.c Transferring of the protocol to Costa Rica molecular biology laboratories.

Jan

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April 2

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2

Transference of the protocol to CIBCM-UCR where other professional and students will have access to it.

5.d Presentation of scientific reports every six months.

Jun

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July

201

2 A scientific report with the results obtained according to

work plan and log frame (Annex A & B).

Timely presentation of scientific reports according to the format

established by CIAT and NC.

Objective 6. To design crop management strategies to minimize gene flow from the GM rice to weedy rice and Oryza glumaepatula wild relative. 6.a Determination of management procedures and stewardship of IMI-cultivar in rice field conditions.

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April 2

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Key aspects of stewardship program for Clearfield rice assessed through available written materials, interviews and field visits and independent evaluation of management procedures to verify their efficacy and acceptance by farmers and analysis of management procedures of IMI-rice in field conditions

Key aspects of stewardship program for Clearfield rice were assessed by the collaboration of two main rice producers in Costa Rica, Finca el Pelón and Hacienda Mojica, located in Guanacaste. These two farms used herbicide resistant rice during all growing seasons and have in some places herbicide resistant weedy rice. Therefore they shared with the researchers of this project though field visits and discussions the management procedures employed in the rice plots in which weedy rice herbicide resistant plants have been identified. A science and experience-based strategy was discussed and presented to Biosafety Regulators stressing key aspects for the management of a GM rice in order to prevent gene flow as a requirement for the eventual deployment of a GM rice. This information was presented during the workshop described in activity 6.c. Percentage of execution: 100%

30

6.b Compilation of information

on gene flow from cultivated

Oryza sativa to weedy and wild

relatives and its management.

Septe

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An average estimate of gene flow between O. sativa and weedy relatives based on a meta-analysis.

The meta-analysis was not carried out. However, a compilation of scientific paper related with gene flow on rice was delivery to biosafety regulators. Percentage of execution: 100%

6.c Presentation and discussion

of the results obtained by the

project with biosafety

regulators.

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A workshop to present and discuss the results obtained on gene flow project will be carried out.

A workshop to present and discuss the data and results of the project was performed in May 7, 8 and 9 and 10

th May 2012.

Percentage of execution: 100%

6.e Presentation of scientific reports every six months.

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201

2 A scientific report with the results obtained according to

work plan and log frame (Annex A & B) Timely presentation of scientific reports according to the format established by CIAT and NC

Objective 7. To produce an operational biosafety guideline compiling the information generated by the subproject in the assessment of gene introgression from O. sativa to weedy/wild relatives.

7.a Compilation of the results generated in each specific objective of this subproject

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Results of the subproject compile for its use in the biosafety guideline.

The compilation of the results will be presented to the Biosafety regulators in the form of short communication at the end of 2012.

7.b Layout of the biosafety guideline with the information generated by the subproject

May

2011

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A digital biosafety guideline

The results obtained with the execution of gene flow project were transferred to the subproject coordinated by Sergio Bermúdez, for the risk and benefit analysis evaluation to drafted a biosafety guidelines for regulatory authorities.

OBSERVATIONS: