Niveles de lipoperóxidos y nitroperoxicarbonilos como biomarcadores en el apoyo diagnóstico en

neumonía nosocomial asociada a ventilación mecánica en niños mestizos mexicanos

Unidad de Terapia Intensiva Pediátrica y Servicio de Infectología Pediátrica

Alumno: Efrén González Arenas

Asesores: D.C. Guillermo Cevallos Reyes

D.C. Ramón Coral Vázquez

Maestría en Ciencias Médicas Universidad AnáhuacSede: Centro Médico Nacional “20 de noviembre” ISSSTE

Infección del parénquima pulmonar que aparece en pacientes con soporte ventilatório después de 48-72hrs de iniciada ó 48-72hr después de retirada la ventilación mecánica.

- Garner JS. Et al. CDC Definitions for nosocomial infections. Am J Infect Control 1988; 16: 128-140- Flores HA. Gonzalez AE. Et al, Cuevas SRMB. Neumonía nosocomial: consideraciones sobre patogenia, prevención y control. Rev Enfer Infecc.1998;11(45):137-44.

Neumonía Nosocomial Asociada a Ventilación Mecánica (NNAVM)

FACTORES DE RIESGO

EPIDEMIOLOGÍA

NEUMONIA NOSOCOMIAL ASOCIADA A VENTILACÓN MECÁNICA

Freacuencia de NN no Asociada a Ventilación Mecánica: 0.5 – 5%

Frecuencia de NNAVM 17%

4.7/1000/dias de ventilación (12.8 – 17.6)

Ventilación Mecánica aumenta a 6 veces la probabilidad

Niños segunda causa de Infección Nosocomial

Agente etiológico: Bacilos Gramnegativos

Cocos Grampositivos

Mortalidad bruta de 30-70%

Incidencia CMN “20 noviembre” ISSSTENumero de ingresos

--

Avila FC et al. Prevalencia de Infecciones Nosocomiales en niños. Encuesta de 21 hospitales en México. Salud Publica Mex. 1999.(41) Supl. 18-25Lopez CC et al. Complicacions ventilatorias en neonatos. Act. Ped Mex. 2007;28(2):63-68

AvilaFs et al. Prevalencia de Infecciones Nosocomiales en niños. Encuesta de 21 hospitales en México. Salud Publica Mex. 1999.(41) Supl. 18-25

RECOMENDACIONES PARA EL DIAGNÓSTICO NNAVM

Arch Bronconeumol. 2001;37:325-34

Criterios clínicos:

- Sensibilidad 98-100%

- Especificidad de 3,4-20%

Criterios radiológicos:

26% de las opacidades NO fueron observadas por TAC.

Citoquímico de Lavado Broncoalveolar (LBA):- Sensibilidad 42 a 93%- Especificidad 45 a 100%

Cultivos cuantitativos:- Sensibilidad 38 - 100%, - Especificidad 14 -100%

- Álvarez LF, Torres MA, Rodríguez de CF. Recomendaciones para el diagnóstico de la neumonía asociada a ventilación mecánica Arch Bronconeumol. 2001;37:325-34- Grossman RF, Fein A. Evidence-based assessment of diagnostic tests for ventilator-associated pneumonia. Chest 2000; 117 (Supl): 177-181.

MECANISMOS FISIOPATOÓGICOS

IsquemiaReperfusión

Disfunción renal

PROMOTOR MOLECULAR

Receptor Pseudo Toll

NF-

Genes (C-Fos, C-Jun)

Citocinas proinflamatorias

Citocinas antiinflamatorias

Complemento

Trombina

Factor activador de plaquetas

Endotelinas

INTERACCIÓN: BACTERIA-CELULA EPITELIAL

Andersen HA, Regueira HT, Leigthon F. Estrés Oxidativo en el Paciente Critico. Rev Med Chile.2006;134:649-56

ERO

ERN

NADPH oxidasasXantin oxidasas

Tioles

NADPH oxidasasXantin oxidasasTioles

ESTRÉS NITROXIDANTE

NOS NO*O2-*

Mitocondria NAD (P) Hox NOS-desacoplada

ERO-N

Nitrasión de proteínasPeroxidación molecularHidroxilaciónAlteración en la señalización

Perdida de actividad del NO*Alteraciones vascularesHiperreactividad plaquetaríaDisfunción mitocondrial

AMPK ATP/AMP APOPTOSIS

GlucólisisATP/AMP SOBREVIDA

Biosíntesis Guzman et al: Oxido Nitrico, Estrés Nitrosante y Función Mitocondrial. 2006;14(4):227-32Membreno M JP et al. Fisiopatología de la Septicemia. Un enforque molecular. 2008;24(4):304-12

FNT LinfotoxínaCaspasa-3Caquéctina

DAÑO CELULAR POR ERO - ERN

ONPro antioxidante lipofílico endógeno

Difunde Oxidante

O2 NO ONOO- DEGRADACIÓNDEGRADACIÓN

Nitrosante

Protonarse

ONOOH LIPOPEROXIDACIÓN (LD)

Radical lipídico (LO)O2

Peróxido de acido graso (LOO)

Depende de la concentración de O2

NOS*

Carrazco LR, Castillo PR, Huerta ¨P, Salinas RR. Shock Séptico y Estrés Oxidativo.CIMEL, 2005, vol 10.(2): 53-62 Yang Z,Ming FX. Recent Advances in Understanding Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis.Clinical Medicine & Research.2006:4(1)53-65.* PERSPESTIVAS D en C Rámon Coral V

REGULACIÓN Genes expresiónActividad enzimáticaDegradación de ON*

POLIMORFISMOS

No existe criterios suficientes y altamente específicos en el diagnósticos

de Neumonía Nosocomial Asociados a Ventilación Mecánica en niños

El estándar de oro, para su diagnóstico son los criterios de sospecha de

Neumonis relacionada con ventilación mecánica

Es necesario implementar pruebas de laboratorio que ofrezcan

mayor apoyo al diagnóstico

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

JUSTIFICACIÓN

Causa de 7 - 9 días adicionales de hospitalización

Costo de aproximado, 9.000 pesos por día/cama

Ventilación mecánica

Isquemia reperfusión

Invasión tisular por bacterias

Respuesta inflamatoria

Daño oxidativo

Daño nitroxidativo

PERPETUA INFLAMACIÓN PATOGENO-CELULA HUESPED Segmentados

ER0s ERNs

Proteínas Lípidos

Daño Oxidación y Nitración ERO - ERNRNADNA

Disfunción mitocondrial

Quimiotaxis

Señalizaciónbioquímica

citas

PEROXIDACIÓN DE LíPIDOSAGP

HO*

Radical centro carbono (R-HC*-CH3)

O2

Radical centro oxigeno (R-HCOO*-CH3)

AGP

Autoalimentación del ciclo

Radical lipídico

Peróxido lipídico (R-HCOOH-C3)

MEMBRANA CELULARFLUIDEZ

POTENCIAL Y PERMEABILIDD IÓNICA

-Burcham PC Kuham YT. Introductions of carbonyl groups into proteins by the lipid peroxidation product; malondialdehyde. Biochem. Biophys. Res Commun. 1996;220(3):996-1001.-- Esterbauer H, Jurgens G, Quehemberg O, Modification of human low density lipoprotein by lipid peroxidation. Basic Life Sci. 1998;49:369-73.

PEROXIDACIÓN DE PROTEINAS

Lisina - Tirosina – Arginina –Prolina - Histidina -Homocisteína

THIOLACIÓN NITROSILACIÓN NITROSACIÓN

OXIDACIÓN: ERO-NDirecta

- Desaminación Bitirosina

- Decarboxilación Carbonilos

Indirecta

- Glúcidos, lípidos

-Deneshvar P. Et al. Analysis of native human plasma proteins, and haemoglobin for the presence of bityrosine by high-performance liquid chomatography. Pharmatocol toxicol. 1997;81:205-08.

-- Stadtman ER. Et al. Protein oxidation. Ann NY.Aca Sci;2000;899:191-208.

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

Hay elevación en los niveles endotraqueales y séricos de lipoperóxidos y nitroperoxicarbonilos en niños con NNAVM?

Pueden ser utilizadas estas elevaciones como apoyo diagnostico en pacientes pediátricos con NNAVM ?

HIPÓTESIS

La elevación sérica y endotraqueal de lipoperoxidos y nitroperocarbonilos se encontraran elevados en ---- % en pacientes con diagnóstico de Neumonía Nosocomial Asociada a Ventilación Mecánica en niños mestizos mexicanos

OBJETIVOS

PRIMARIO

Determinar la concentración serica y endotraqueal de lipoperóxidos y nitroperoxicarbonilos en niños mestizos mexicanos con Neumonía Nosocomial Asociada a Ventilación Mecánica

SECUNDARIO

Determinar la probable correlación entre el aumento en la concentración de lipoperóxidos y nitroperoxicarbonilos, con los criterios mayores y menores en la NNAVM

Implementar un nuevo métodos de apoyo en el diagnóstico con de NNAVM en pacientes pediátricos

Intervención:

Observacional

Muestreo:

Aleatorio simple

Asignación:

Aleatorio

Comparación:

Analítico

Tipo de grupo de comparación:

Concurrente

Componente del grupo

Homodemico

Seguimiento:

Longitudinal

Dirección del seguimiento:

Prospectivo

Fuente de datos:

Prolectivo

Evaluación

Abierta

TIPO Y DISEÑO DEL ESTUDIO

* En la diapo 26 menciona que es un muestreo no probablisitico

Serán incluidos todos aquellos pacientes que cumplan

con los criterios de sospecha diagnostica de Neumonía

Nosocomial Asociada a Ventilación Mecánica

n = Zα 2 p x q

√ √(p1 - p2)2

2

+ Zβ (p1 x q1) + (p 2x q2)

TAMAÑO DE MUESTRA

Hay que poner variable a la que se le aplica la formula y valores

POBLACIÓN EN ESTUDIOCRITERIOS DE INCLUSIÓN

Niños mestizos mexicanos criticamente enfermos, hospitalizados en la unidad de terapia intensiva pediátrica o Servicio de Infectología Pediátrica, que cumplan los criterios de NNAVM en el Centro Médico Nacional “20 de Noviembre” ISSSTE

Esten bajo Ventilación Mecánica por un mínimo de 48 hrs

Ambos géneros

Pacientes; mayores de 1 mes y menores de 18 años

Firma de consentimiento bajo información del padre o tutor del menor

CRITERIOR DE EXCLUSIÓN

Paciente con neumonía de la comunidad

Paciente con Neumonia Nosocomial por hongos

Pacientes séptico

Paciente con choque séptico

CRITERIOS DE ELIMINACION

Fallecimiento durante el estudio

Muestras de laboratorio incompletas

Muestras de laboratorio no procesadas adecuadamente

*Desición de los padres o tutores de abandonar el estudio

TIPO DE MUESTREO

Pacientes hospitalizados en la UTIP o Servicio de Infectología Pediátrica, que cumplen con los criterios de NNAVM. Se utilizara un muestreo no probabilístico, consecutivo, durante el periodo de agosto del año 2009 a julio del año 2110.

A las Variables cuantitativas (lipoperóxidos y nitroperoxicarbonilos) de los pacientes en estudio serán tomadas a su ingreso y cada tres días durante el soporte ventilatório tanto séricas como endotraqueales.

Asumiendo una relación 1/1 por grupo de estudio, con un valor de Significancía IC95%, con error mínimo del 5% a dos colas

DEFINICIÓN OPERACIONAL DE VARIABLES

DEPENDIENTESNeumonía Nosocomial

• variable discreta, dirección positiva, magnitud mayor probabilidad diagnostica

INDEPENDIENTES– Fiebre: Variable cuantitativa, discreta, definida en grados centígrados

– Citoquímico de aspirado bronquial: Variable cuantitativa, discreta• Leucocitos: Definida en número de células por microlitro. • Neutrófilos: Definida en número de células por microlitro• Deshidrogenasa Láctica• Ácido láctico

– Radiografía de Tórax con infiltrado pulmonar: Variable cualitativa (no puede ser discreta, yo creo que es ordinal si se va a medir con una escala o en grados)

– CARACTERISTICAS DE INTERPRETACION: NEUMONIA

? Nominal dicotomica (si o no )

Leucocitos: Variable cuantitativa continua, definida en número de células por microlitro

Neutrófilos: Variable cuantitativa continua, definida en número de células por microlitro

Concentración de Oxigeno: Variable cuantitativa discreta medida en saturación de oxigeno, por la diferencia entre Po2/ FiO2

Lipoperóxidos: Variable cuantitativa, discreta, dirección positiva, magnitud elevación. Medido en absorbancia a 560 nm (e =4.3X104M-1cm-1). (espectrofotómetro)

Nitroperoxicarbonilos: Variable cuantitativa, discreta, dirección positiva, magnitud elevación. Se cuantifica por método de absorbancia a 360 nm, utilizando un coeficiente de extinción molar () a 22,00 M-1cm-1 (espectrofotómetro)

ANALISIS ESTADISTICO

• Se obtendrá estadística descriptiva• A cada una de las variables se le calculara

– Sensibilidad, Especificidad y Exactitud – Se realizaran curva Roth– Frecuencias relativas– Medidas de tendencia central y de dispersión

• Las variables numéricas continuas entre cada grupos serán analizadas mediante: – t de Student para muestras independientes, si estas presentan una

distribución normal– Suma de rangos de Wilcoxon si su distribución es anormal

• Para examinar la asociación entre ambos grupos y sus variables discretas:– Utilizaremos 2 o prueba exacta de Fisher

DISEÑO DEL ESTUDIOLos pacientes incluidos en el estudio se les realizaran los siguientes estudios a su ingreso y cada

tercer día durante la duración de la ventilación mecánica

Paciente con criterios de NNAVM

Evaluación de ingreso: Clínica , laboratorios y

radiografías

Toma de muestras

ANALISISDE

DATOS

Análisis de muestras

Evaluación cada tercer día: Clínica, laboratorios y radiografías; durante el

soporte ventilatório

Lipoperóxidos y Nitroperoxicarbonilos

Toma de muestra subsecuente

Análisis de muestras

Recolección de datos

TECNICAS DE NIVELES DE HIDROXIPEROXIDOS LIPIDICOS:

Técnica FOX: Esta de base en la reacción de estos con Fe2+, a pH fisiológico se agrega “XILENOL ORANGE” (FXO reagent).

Medido en absorbancia a 560 nm (e =4.3X104M-1cm-1). Espectrofotómetro

DETERMINANTES BIOQUIMICOS

TECNICA DE CUANTIFICACION DE NITROPEROXICARBONILOS

Detección: 2,4-dinitrofenihidrazina (DNPH)

Se cuantifica por método de absorbancia a 360 nm, utilizando un coeficiente de extinción molar () a 22,00 M-1cm-1

Espectrofotómetro

ASPECTOS ÉTICOS

En cada uno de los niños participantes en el estudio el PADRE O TUTOR firmarán previamente consentimiento bajo información para su inclusión en el estudio

El proyecto de investigación será revisado y evaluado por los comités de ética e, investigación del Centro Médico Nacional “20 de Noviembre” del ISSSTE, para su aprobación.