1

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANAUnidad Iztapalapa

PROGRAMA DOCENTE DE INVESTIGACIÓN(PDI)

ALTERACIONES CROMOSÓMICAS EN NIÑOS CON LEUCEMIA

EVERARDO HERNÁNDEZ PLATA

ASESORA INTERNA ASESORA EXTERNA

M. en C. Ma. de los Ángeles AguilarSantamaría

M. en C. Ana Claudia VelázquezWong

Departamento de Ciencias de la Salud(UAM-I)

Hospital de Pediatría(CMN SXXI del IMSS)

Abril, 2005.

2

INTRODUCCIÓN

Las anormalidades cromosómicas en las neoplasias se adquieren durante elproceso de la tumorigénesis. Estas aberraciones están restringidas al tejidoneoplásico y no están presentes en otras células del cuerpo. La distribución de lasanormalidades no es azarosa y se ha visto que tanto los tumores benignos comolos malignos muestran alteraciones cromosómicas1.

Dos clases de eventos mitóticos pueden afectar a los cromosomas en las célulasneoplásicas:

1) La segregación anormal o no disyunción, que resulta en cambios en elnúmero de los cromosomas que van de monosomías o trisomías ahaploidías o poliploidías.

2) El rompimiento de los cromosomas causado por factores exógenos como laradiación ionizante, virus y agentes químicos mutagénicos, y factoresendógenos entre los que se encuentran los sistemas enzimáticos,incluyendo la replicación, transcripción o recombinación del DNA. Estoresulta en deleciones, duplicaciones, inversiones, translocaciones,inserciones o amplificaciones1.

La leucemia es un cáncer de la sangre que se caracteriza por el aumentopermanente, anormal y desordenado del número de leucocitos que da lugar a unainvasión de la médula ósea e impide, a su vez, el desarrollo normal de las célulasprogenitoras de la sangre2.

Según el tipo de células clonadas se pueden distinguir diversos tipos deleucemias2:

– Leucemia linfoblástica aguda.– Leucemia mieloblástica aguda.– Leucemia mieloide crónica.– Leucemia linfática crónica.

Las leucemias agudas se caracterizan por la sustitución de la médula ósea normalpor células blásticas de una clona originada en la transformación maligna de unacélula madre hematopoyética2.

La leucemia mieloblástica aguda (LMA) está caracterizada por una acumulaciónexcesiva de células inmaduras precursoras de la línea no linfática en la médulaósea debido al bloqueo de la maduración celular. La LMA tiene una menorincidencia que la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y un amplio espectro deincidencia con respecto a la edad. En los Estados Unidos de Norteamérica sepresentan 2.5 casos por cada 100,000 habitantes al año, con una predominancia

3

en el sexo masculino. Este tipo de leucemia es más común en los adultos y sepresenta con mayor frecuencia entre los 55 y 60 años de edad3.

Las alteraciones cromosómicas que se han encontrado en casos con LMA han sidovariadas. Entre ellas se han visto alteraciones numéricas (hiper o hipodiploidías), yestructurales entre las que destacan las inversiones (especialmente en elcromosoma 16) y las translocaciones [v. gr. t(8;21), t(9;11), t(15;17)]1.

La leucemia mieloide crónica (LMC) representa aproximadamente del 15 al 20% detodos los casos de leucemia y es más común en el intervalo de los 40 a los 50años de edad1.

Dado que todos los linajes hematopoyéticos están involucrados en el proceso de laenfermedad, se piensa que el evento neoplásico inicia a nivel de las célulastroncales pluripotentes4. Posteriormente se incrementa el número de célulasinmaduras en la médula ósea y en la sangre periférica y generalmente se presentaanemia, trombocitopenia, acumulación extramedular de las células blásticas y unareducida respuesta al tratamiento que esté recibiendo el paciente1.

La LMC fue la primera neoplasia en ser asociada con una anormalidadcromosómica específica y recurrente. Más del 90% de los pacientes con estaenfermedad presentan la translocación t(9;22)1.

Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es un término general usado para describir ungrupo heterogéneo de neoplasias de origen linfoide, que se manifiesta porsíntomas hematológicos, debido principalmente a la proliferación clonal, laacumulación y la infiltración de las células hematopoyéticas5-7.

Aunque un número no despreciable de casos ocurre en adultos, se presenta conmayor frecuencia entre los niños, en los que es el tipo de neoplasia más frecuente,registrándose la mayor incidencia entre los 2 y los 6 años de edad; sin embargo,se ha demostrado que la enfermedad tiene una distribución bimodal, con unsegundo pico de incidencia alrededor de los 50 años, que tiende a disminuirconstantemente conforme se avanza hacia la vejez5,6,8.

Hay una mayor predominancia de la enfermedad en los varones después delprimer año de edad y se ha reportado una mayor incidencia en los niñosamericanos blancos que en los negros. Así, aproximadamente 3,000 nuevos casosde LLA infantil se reportan al año en los Estados Unidos de Norteamérica (EUA) yel riesgo de que un niño blanco desarrolle LLA durante los primeros 10 años devida es de 1 en 2,8805,6,9.

La etiología de las leucemias no es del todo conocida pero se ha sugerido que seade naturaleza multifactorial. Entre los factores que predisponen al individuo a sufrir

4

alguna de estas hemopatías se encuentran los ambientales, como la radiaciónionizante. Un claro ejemplo de esto lo constituyó la mayor frecuencia de leucemiasagudas registradas después de las explosiones atómicas de Hiroshima y Nagasaki,o tras accidentes nucleares como el ocurrido en Chernobyl2,5,9.

También la exposición a diversos agentes químicos se ha implicado en la génesisde estos trastornos. Entre ellos están el benceno y sus derivados, el cloranfenicol,agentes alquilantes, pesticidas y algunos fármacos inmunodepresores2,5,9.

Igualmente se ha asociado con enfermedades genéticas como el síndrome deDown, de Turner, de Bloom, la Anemia de Fanconi y otras alteraciones derivadasdel huésped como la difusión de las células de la médula ósea y síndromes deinmunodeficiencia, entre los que destacan la Ataxia Telangiectasia y laAgammaglobulinemia2,5,9.

Finalmente, las leucemias se han asociado con agentes biológicos como el contactoprevio con algunos virus como el HTLV-I y HTVL-II2,5,9 .

Los mecanismos celulares que se encuentran detrás de la inducción de la LLA sonsimilares en todos los casos. Entre ellos se encuentran las alteraciones numéricastales como las hipo e hiperdiploidías y la expresión alterada de los proto-oncogenes; las translocaciones cromosómicas que dan origen a genes de fusiónque codifican para cinasas activas y factores de transcripción alterados. Estasalteraciones genéticas contribuyen a la transformación leucémica de las célulasmadre hematopoyéticas, o de sus progenitoras comprometidas, alterando lasfunciones celulares. Entre estas últimas se encuentra el mantenimiento o aumentode la capacidad ilimitada de auto-renovación, alterando los controles de laproliferación normal, bloqueando la diferenciación y promoviendo la resistencia alas señales apoptóticas10.

Los estudios citogenéticos en pacientes con leucemia han permitido identificaranormalidades cromosómicas numéricas y estructurales relacionadas con lascaracterísticas patofisiológicas de este cáncer. Las alteraciones numéricas, puedenclasificarse en tres grandes grupos5,11-15:

a) La pseudodiploidía, anormalidad en la que el número total de cromosomasque conforman cada metafase es de 46, pero con alteraciones, ya seanuméricas (ausencia y duplicación de cromosomas de diferente par, porejemplo), o bien, alteraciones estructurales.

b) La hiperdiploidía, caracterizada por presentar 47 cromosomas o más, yc) La hipodiploidía, determinada por poseer 45 cromosomas o menos.

Entre las anormalidades estructurales más frecuentes están:

5

a) Translocaciones. Definidas como el intercambio de material genético entrecromosomas. Existen varios tipos de ellas pero las más comunes son lasrecíprocas, en las que dos segmentos de DNA determinados intercambiansus posiciones entre cromosomas distintos.

b) Inversiones. En las que una secuencia determinada gira 180° dentro delmismo cromosoma.

c) Duplicaciones. Determinadas por la replicación repetida de una secuencia,dentro del mismo cromosoma.

d) Deleciones. Caracterizadas por la ausencia de algún segmento que formaparte de un cromosoma.

La frecuencia de estas alteraciones varía de acuerdo con la región geográfica en laque se realice el estudio. Entre los niños americanos la pseudodiploidía es laanormalidad numérica más frecuente seguida por la hiperdiploidía y lahipodiploidía, mientras que entre los niños de la India la hipodiploidía registra unamayor incidencia que la hiperdiploidía10,16.

Las translocaciones tienen su origen en la presencia de sitios frágiles, constituidospor secuencias altamente repetitivas que resultan vulnerables a agentesmutagénicos. Por medio de ellas se originan genes de fusión al combinarsesecuencias codificadoras diferentes, creándose con ello proteínas con funcionestotalmente distintas a las originales. Este tipo de alteraciones cromosómicasocurren hasta en un 50% de los casos de LLA infantil17.

En la formación del cromosoma Filadelfia se encuentran involucrados puntos deruptura de los cromosomas 9 y 22 [t(9;22) (q34:q11)]18 que dan origen a unaproteína fusionada. El proto-oncogen ABL, ubicado en el cromosoma 9, codificapara una cinasa específica de tirosina cuya actividad se encuentra altamenteregulada en el ambiente celular normal. En contraste, la proteína BCR/ABL,producto de la fusión génica, es una cinasa constitutiva que altera las vías deseñalización que controlan la proliferación, sobrevivencia y la auto-renovación delas células madre hematopoyéticas19.

La translocación t(12;21) crea un gen de fusión que incluye la porción 5’ de TEL(gen del cromosoma 12), que codifica para un factor transcripcional para ladiferenciación de células madre de médula ósea, y prácticamente toda la regióncodificante del gen AML-1, que codifica para el factor de transcripción de unasubunidad del corazón del complejo enzimático de unión al DNA, el reguladormaestro de la formación de las células hematopoyéticas troncales definitivas20, 21.El efecto principal de la proteína de fusión TEL/AML-1 es la inhibición de laactividad transcripcional que inicia normalmente cuando AML-1 se une al DNA22.

Por otro lado, las translocaciones de MLL resultan en proteínas quiméricas quecontienen la porción N-terminal de MLL, unida a la porción carbono terminal de

6

una de las 40 posibilidades que se han encontrado para este rearreglo23,24. Lasproteínas MLL fusionadas, tienden a tener una ganancia de función, queincrementa su actividad transcripcional. Esta alteración provoca un cambio en elpatrón normal de expresión de varios genes, contribuyendo al procesoneoplásico25,26.

Las figuras A y B representan los dos mecanismos sugeridos para la formación degenes de fusión. El esquema A representa cómo algunos factores de transcripciónde proto-oncogenes que se encuentran silenciados o se expresan con una tasabaja en las células progenitoras de un linaje particular, pueden ser activadoscuando se encuentran bajo la regulación de incrementadores potentes que formanparte de genes que se expresan con una tasa alta27.

La figura B representa la ruptura de los genes dentro de los intrones, en donde seven involucradas las secuencias codificadoras de cada uno de dos genes quecodifican para factores de transcripción en diferentes cromosomas, produciendo ungen de fusión que codifica para un factor de transcripción quimérico con funcionesalteradas27.

Gracias a la biología molecular se han clonado los puntos de ruptura de lastranslocaciones, inversiones y deleciones, además de caracterizar algunos de losgenes involucrados en estos rearreaglos. Las sondas de DNA se derivan de lospuntos de ruptura clonados y constituyen una herramienta muy útil para el

7

diagnóstico dado que, en muestras problema, pueden identificar a los genesinvolucrados sin los requerimientos de la citogenética clásica. Así, por medio de lahibridación in situ con fluorescencia (FISH), las sondas marcadas con diversosfluorocromos pueden detectar distintos rearreglos cromosómicos tanto en núcleosinterfásicos como en metafases. Como resultado, la cantidad de muestra delpaciente que puede ser analizada para su diagnóstico, se incrementasustancialmente11,24,28.

Actualmente todas las anormalidades cromosómicas son consideradas cruciales,tanto para el diagnóstico como para tomar decisiones terapéuticas en pacientescon leucemia u otro tipo de cáncer6. En algunos protocolos las decisiones deltratamiento están basadas en el cariotipo de células malignas, por lo que laidentificación en el laboratorio de citogenética o por análisis moleculares esconsiderada crucial tanto para el diagnóstico como para tomar decisionesterapéuticas11,14-16,29,30.

Existen muy pocos trabajos que reporten la frecuencia de la enfermedad en lapoblación infantil de América Latina31; sin embargo, en un estudio realizado porMejía y colaboradores32 se encontró una incidencia de la LLA del 50.6%, durante elperíodo 1996 – 2000, en una muestra poblacional de 209 niños mexicanosatendidos en el Hospital General del Instituto Mexicano del Seguro Social, en laCiudad de México. En virtud de lo anterior, el estudio de las anormalidadescitogenéticas presentes en la población mexicana es de suma importancia.

OBJETIVO

Identificar el tipo y la frecuencia de alteraciones cromosómicas en un grupo deniños mexicanos con leucemia linfoblástica aguda, mediante las técnicas de bandasGTG y FISH.

HIPÓTESIS

Se esperaría encontrar alteraciones cromosómicas reportadas en la literatura paraotros grupos poblacionales aunque, posiblemente, con frecuencias distintas debidoa las diferencias étnicas.

MATERIAL Y MÉTODO

Se trabajó con las preparaciones celulares de 49 pacientes pediátricos quieneshabían sido diagnosticados con diferentes tipos de leucemia: LLA, LMA, LMC. Estediagnóstico se realizó con base en el Sistema de Clasificación Citomorfológica

8

Franco-Americo-Británico (FAB) por el Servicio de Hematología del Hospital dePediatría del CMNSXXI. Posteriormente fueron canalizadas al laboratorio deCitogenética del mismo Hospital, entre el 9 de abril de 2002 y el 15 de abril de2003.

La muestra de pacientes estuvo constituida por 19 mujeres y 30 varones, cuyasedades oscilaron entre los 5 meses y los 17 años (media de 9 años).

Las muestras celulares fueron recibidas en jeringas previamente heparinizadas (0.2mL de heparina) y, para obtener metafases, se emplearon dos métodos desiembra: el directo y el indirecto. Para el primero se utilizaron frascos de cultivocon 10 mL de medio RPMI (Gibco), a los cuales se les agregaron aproximadamente0.8 mL de la muestra de médula ósea y 125 µL de colchicina (Sigma); sehomogenizaron y se dejaron incubar por 40 minutos a 37°C.

Para el proceso indirecto, se emplearon frascos de cultivo con 7 mL de medio RPMI(Gibco), a los cuales se les agregó la misma cantidad de muestra antesmencionada; se mezclaron mediante una leve agitación y se incubaron durante 72horas a 37°C. Finalizada la incubación, se agregó la misma cantidad de colchicinaque en el método directo y se dejó actuar por 40 minutos a 37°C.

El proceso de la cosecha fue llevado a cabo de acuerdo con el métodoconvencional33. Una vez que hubo actuado la colchicina, las muestras fueroncentrifugadas, se eliminó el sobrenadante, y los botones fueron resuspendidos ensolución hipotónica (KCl 0.075 M) (Merck) a 37°C; se homogenizaron y seincubaron durante 30 minutos a 37°C. Finalmente, las muestras fueron lavadas yfijadas con solución Carnoy (metanol (Merck) y ácido acético (Merck) en relación3:1).

Las preparaciones de cada paciente fueron divididas en dos lotes: A) para análisisde Bandas GTG, y B) para análisis con FISH.

En el análisis del cariotipo de las muestras, se empleó la técnica de bandas GTG34,y se clasificaron según el Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética(ISCN)35.

La generación de bandas GTG se logró colocando en vasos de Coplin, 50 mL desolución proteolítica, constituida por fosfato de potasio (KH2PO4 0.025 M) (Merck),fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4 0.025 M) (Merck) y tripsina (Gibco). La mezclafue incubada a 37 °C, al menos 30 minutos antes de realizar las bandas.

Se introdujeron las laminillas durante 10 segundos en la solución con tripsina.Inmediatamente después se transfirieron a una solución de cloruro de sodio(Merck) al 0.9% con el objetivo de detener la acción enzimática, y se tiñeron con

9

los colorantes de Wright (Sigma) y de Giemsa (Sigma). Por último, las laminillasfueron enjuagadas para eliminar el exceso de colorante.

Se analizaron en promedio de 15 a 20 metafases por cada caso y se empleó lanomenclatura estándar35

Para detectar alteraciones estructurales específicas se empleó la Hibridación in situcon Fluorescencia (FISH). Las células de médula ósea fijadas previamente seprocesaron de acuerdo con las instrucciones de la manufactura de las sondasempleadas36. El DNA de las preparaciones celulares fue desnaturalizado enformamida al 70% y fijado en una serie de etanol en diferentes concentraciones(70, 85 y 100%). Se agregó la sonda correspondiente, se colocó un cubreobjetos,se selló y se dejó hibridar durante dos noches. Las preparaciones fueron lavadascon formamida al 50% y contrateñidas con DAPI para poder ser analizadas en elmicroscopio de fluorescencia28.

Dado que en algunos grupos poblacionales10,16 determinadas alteracionesestructurales se presentan frecuentemente asociadas con la leucemia, adquierenun gran valor diagnóstico y pronóstico, de este modo las sondas utilizadas fueron:

1) LSI BCR/ABL Dual Color, Single Fusion Translocation Probe (Vysis), paradetectar la translocación t(9;22),2) LSI TEL/AML 1 ES Dual Color Translocation Probe (Vysis) para detectar latranslocación t(12;21), y3) LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Vysis), para detectarrearreglos de 11q2336.

Una vez realizadas las hibridaciones se procedió a leer en su totalidad las regioneshibridadas, tomando en cuenta para el resultado final solamente aquellos núcleosbien definidos, separados y con las señales nítidas.

De los 49 pacientes incluidos inicialmente en el estudio se analizaron en promedio4 laminillas de cada individuo para detectar alteraciones numéricas y estructurales,y 3 preparaciones para seleccionar regiones en donde hubiera un alto número denúcleos (5 – 20 aprox. por campo de 100X) y la mayor limpieza posible (ausenciade residuos citoplasmáticos).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De los 49 pacientes iniciales, 37 casos fueron excluidos del análisis de bandas Gpor carecer de metafases de calidad adecuada que permitiera la identificación dealteraciones numéricas o estructurales y sólo 19 casos cubrieron los requisitosnecesarios para ser analizados con FISH.

10

Se identificaron tres casos pseudodiploides, es decir, el 27% de los 11 pacientesdiagnosticados con LLA.

Aunque en estos casos el número cromosómico pareciera ser normal, la bajacalidad de las figuras mitóticas con cromosomas encimados no permitió precisar sunúmero; además, la morfología alterada de cada uno de ellos sugirió la presenciade alteraciones estructurales. De este modo, si las figuras mitóticas estuvieranconstituidas por un número cromosómico distinto a 2n = 46, corresponderían ahipo o hiperdiploidías y si, además, existieran alteraciones estructurales entre loscromosomas, esas metafases serían doblemente anormales (Fig. 1).

Figura 1Metafase pseudodiploide.

La flecha señala cromosomas encimadosy el No. cromosómico parece ser 2n = 46.

Muestra de médula ósea de paciente con LLA teñida con Giemsa y Wright. 100X.

En uno de los tres casos pseudodiploides se identificó la deleción de la parteterminal del brazo largo del cromosoma 22. Esta alteración fue confirmada por dosespecialistas altamente calificadas del Laboratorio de Citogenética en donde serealizó este estudio. Ambas coincidieron en la posible formación del cromosoma“Filadelfia” como resultado de una translocación recíproca entre segmentosdistales de los brazos largos de los cromosomas 9 y 22: t(9;22) (q34;q11)37

(Fig. 2).

El hecho de haber observado una alteración estructural específica (22q-) sólo enun caso de los 49 analizados corrobora la dificultad que constituye el trabajar conmuestras de médula ósea con LLA, ya que los cromosomas tienden a serirregulares y poco nítidos, como lo han encontrado también Pérez-Vera et al15,Williams et al33, Secker-Walker et al38 y Nordgren39.

11

Figura 2Mitosis en las que se identificó la deleción del brazo largo del

cromosoma 22 (22 q-).Las flechas oscuras señalan al cromosoma 22 delecionado;

las flechas delgadas, a su homólogo (normal)Muestras de médula ósea de paciente con LLA teñidas con Giemsa y Wright. 100X.

En dos individuos diferentes, se identificaron hiperdiploidías con un númerocromosómico superior a 50, lo que representó el 18% del total de las alteracionesnuméricas (Fig. 3). El número exacto de cromosomas en cada caso no pudo serprecisado debido a la baja calidad de las metafases y a la presencia constante decúmulos de cromatina, mismos que podían ser interpretados como una solaestructura, una fusión de distintos cromosomas, o bien, como varios de elloscondensados de forma independiente pero apilados en el mismo lugar.

Figura 3Metafase hiperdiploide.

No. cromosómico 2n superior a 50.Muestra de médula ósea de paciente con LLA, teñida con Giemsa y Wright. 100X.

12

El haber observado una mayor cantidad de cromosomas a la normal sugiere laposibilidad de aneuploidías y, para identificar los cromosomas en exceso serequeriría contar con el patrón de bandas GTG bien definido.

Las anormalidades cromosómicas observadas, y la dificultad del análisis delcariotipo mediante bandas GTG en las muestras trabajadas confirman algunas delas características que se encuentran en las leucemias, de acuerdo con loreportado en la literatura40. Cabe mencionar que en un caso extra, diagnosticadocon Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA), también se identificó este tipo deanormalidades además de metafases hiperdiploides (2n>50).

Asimismo, se identificaron metafases hipodiploides en otros 5 pacientes con LLA,representando el 55% del total de las alteraciones numéricas y, con ello, laalteración más frecuente de este tipo en la muestra poblacional estudiada. Enestas figuras mitóticas con 2n<46 se observaron alteraciones similares a lasdescritas en las hiperdiploidías, por lo que tampoco fue posible precisar el númerocromosómico (figura 4).

Figura 4Metafase hipodiploide.

No. cromosómico 2n inferior a 46.Muestra de médula ósea de paciente con LLA teñida con Giemsa y Wright. 100X.

En la muestra poblacional estudiada se observa que la hipodiploidía es laanormalidad más común mientras que la pseudodiploidía es la alteracióncromosómica más frecuente en varios grupos poblacionales extranjeros (Gráfica1). Este dato representa grandes desventajas para la población mexicana dado elmal pronóstico asociado con un número cromosómico menor a 4617.

13

0

10

20

30

40

50

60

70

80

%

Americanos Mexicanos Indios Españoles

Gráfica 1Frecuencias de alteraciones numéricas en diferentes poblaciones humanas10,16,41.

Al comparar las frecuencias encontradas de este tipo de alteraciones con otrosgrupos poblacionales se observa una notable semejanza con los indios, en cuantoa que en ambas poblaciones la hipodiploidía se presenta en más del 30% de losindividuos estudiados16, mientras que tanto entre la población americana10 comoentre la española41 esta anormalidad es la menos frecuente.

Dentro de todos los grupos extranjeros la pseudodiploidía es el tipo deanormalidad más frecuente10,16,41, dato que no concuerda con la frecuencia queesta anormalidad presentó dentro de la muestra poblacional estudiada (Gráfica 1).

Con respecto a las hiperdiploidías, este tipo de alteración se encontró con la menorfrecuencia dentro de la muestra de estudio, colocándose por arriba de laobservada en la población de la India y por debajo de las encontradas en laspoblaciones americana y española.

Se sugiere que las diferencias en las frecuencias de las distintas alteracionescromosómicas observadas dentro de las diferentes poblaciones puedan derivarsede variaciones ambientales o en el lote génico.

En virtud de que la pseudodiploidía se ha reportado como la alteración numéricamás frecuente y que el tamaño de la muestra fue reducido, se consideraconveniente incrementar el número de pacientes para corroborar la tendenciaencontrada en este estudio. Asimismo, sería positivo incluir pacientes de diferentesregiones del país pues se ha detectado que existen diferencias en la susceptibilidadal desarrollo de cáncer que están relacionadas con las características propias del

Pseudodiploidías Hiperdiploidías Hipodiploidías

14

hábitat y los agentes mutagénicos a los que está expuesto el individuo,encontrándose una mayor recurrencia de casos con Leucemia en regiones con unmayor desarrollo industrial42.

De igual manera, es indispensable contar con una muestra poblacional constituidapor igual número de pacientes masculinos que femeninos o, al menos, losuficientemente grande para que las variaciones numéricas entre ambos grupos norepresente diferencias significativas, y se pueda establecer una relación directa deltipo y la frecuencia de alteraciones cromosómicas con el sexo de los individuos.

Las laminillas del lote B, destinadas al análisis con FISH se mantuvieronalmacenadas a –20 °C. En ellas se observaron varias alteraciones que impidieronsu inclusión y, en consecuencia, se registró una disminución del número total depreparaciones. Entre otras anormalidades observadas, llamó la atención la grancantidad de cúmulos de núcleos y residuos citoplasmáticos que impidieron unacorrecta hibridación y cuantificación adecuada (Fig. 5).

Figura 5Muestra en la que el gran número de cúmulos de núcleos impidió

una hibridación correcta de la sonda empleadaNúcleos interfásicos de médula ósea con LLA teñidos con DAPI. 100X

En los 19 casos diagnosticados con LLA viables para el análisis con FISH, se aplicóal menos una de las tres sondas específicas de este estudio ya que en varios casosno hubo laminillas suficientes para realizar la hibridación con las sondasdisponibles. En los casos en los que sí fue posible, se analizaron todas las sondasde referencia. Los detalles del diagnóstico y de la sonda aplicada en cada caso, asícomo el resultado obtenido se especifican en la Tabla 1.

15

Tabla 1.- Resultado obtenido de FISH con las sondas aplicadas a las muestras decada paciente.

Pac

ien

te

Sexo DiagnósticoHematología

Sondaempleada Resultado

Pac

ien

te

Sexo DiagnósticoHematología

Sondaempleada Resultado

BCR/ABL - MLL -1 M LLAMLL N.H.

12 F LLATEL-AML1 +

BCR/ABL N.H. BCR/ABL +2 M LLA

MLL +13 M LLA

MLL -3 F LLA BCR/ABL - MLL N.H.

MLL -14 M LLA

TEL-AML1 +4 M LLA

TEL-AML1 - BCR/ABL -5 F LLA MLL +

15 M LLATEL-AML1 -

6 M LLA MLL + 16 M LMA BCR/ABL N.H7 F LLA TEL-AML1 - BCR/ABL -8 M LLA BCR/ABL + MLL +

BCR/ABL +17 M LMA

TEL-AML1 -MLL + BCR/ABL +9 M LLA

TEL-AML1 +18 F LMA

MLL +BCR/ABL - BCR/ABL -

10 F LLATEL-AML1 - MLL +

11 F LLA MLL N.H.19 M LMC

TEL-AML1 -

+= Positivo para la alteración.- = Negativo para la alteración.N.H.= No ocurrió la hibridación.

En esa tabla se observa que, de los ocho casos con LLA procesados con BCR/ABL,tres resultaron positivos para la fusión producto de la translocación t(9;22), lo cualrepresenta el 13% del total de las alteraciones encontradas en la muestraestudiada.

Cabe mencionar que esta sonda fue aplicada a un total de doce casos, de los ochocasos con LLA, cinco fueron negativos para esta fusión; otros tres fuerondiagnosticados con LMA, uno resultó positivo, otro negativo para la fusión BCR/ABLy, en la muestra restante no ocurrió la hibridación. El último caso al que se leaplicó la misma sonda perteneció a la LMC y resultó negativo para esta alteración.

En las figuras 6 y 7 se muestra el patrón de señales observado tanto en las célulasdonde los genes BCR y ABL se encontraban íntegros (señales separadas, verdespara BCR y rojas para ABL), como para aquellas en donde ocurrió la fusión entreestos dos genes (señal amarilla). El número promedio de núcleos hibridados quese encontró en las muestras procesadas con esta sonda fue de 3,150.

16

Figura 6 Figura 7Núcleo normal, sin fusión génica. Núcleo con fusión génica.

Núcleo profásico de médula ósea con LLA.Sonda BCR/ABL. 100X

Núcleo interfásico de médula ósea con LLA.Sonda BCR/ABL. 100X

Para determinar la frecuencia de la fusión TEL/AML-1 [t(12;21)], se aplicó la sondacorrespondiente a las muestras de siete pacientes con LLA, encontrándose trescasos positivos para la fusión, que representan el 8% de las alteracionesencontradas en este estudio; los otros cuatro casos resultaron negativos para estaanormalidad. En un caso con LMA y otro con LMC en los que se empleó estamisma sonda, no se obtuvieron resultados positivos, es decir, no se detectó fusióngénica. La figura 8 presenta el patrón de señales que se observó en los núcleosdonde los genes se encontraban íntegros dando como resultado señales verdes(TEL) y rojas (AML-1) por separado. En la figura 9 se muestra el patrón de señalesque se observó al presentarse la fusión correspondiente. El color amarillorepresenta la fusión de un gen TEL con un segmento de un gen AML-1. La señalroja barrida representa el residuo del gen AML-1 fusionado, mientras que lasseñales verdes y rojas nítidas indican la presencia de los otros dos genes íntegros.En los casos tratados con esta sonda se contaron 4,161 núcleos, en promedio.

Figura 8 Figura 9Núcleo normal, sin fusión génica. Núcleo con fusión génica.

Núcleo interfásico de médula ósea con LLA.Sonda TEL/AML-1. 100X

Núcleo interfásico de médula ósea con LLA.Sonda TEL/AML-1. 100X

ABL

BCR

AML-1 residual

AML-1

TELTEL/AML-1

ABL

BCR

BCR/ABL

AML-1

TEL

17

La sonda MLL fue empleada en 13 muestras. Entre los diez casos con LLAprocesados con ella se encontraron cuatro positivos para el rearreglo 11q23, querepresentan el 17% de las alteraciones cromosómicas detectadas en la muestra deestudio; tres de los casos procesados fueron negativos para la alteración y enotros tres no ocurrió la hibridación.

Dos muestras más, correspondientes a pacientes con LMA y otra diagnosticada conLMC resultaron positivas para este rearreglo.

En la figura 10 se presenta el patrón de señales esperado para núcleos en dondela región cromosómica se encuentra íntegra y, por lo tanto, resulta negativa parasus rearreglos. En la figura 11 se aprecian dos señales verdes y dos señales rojas,por separado, lo cual indica la ruptura de la región a la que va dirigida la sonda(núcleo positivo para el rearreglo). En las laminillas procesadas con esta sonda2,286 núcleos, en promedio, hibridaron correctamente.

Figura 10 Figura 11Núcleo normal, sin rearreglos de MLL. Núcleo con rearreglo de MLL (11q23).

Núcleo interfásico de médula ósea con LLA.Sonda MLL. 100X

Núcleo interfásico de médula ósea con LLA.Sonda MLL. 100X

En la gráfica 2 se comparan las frecuencias de las alteraciones estructurales,detectadas con estas sondas específicas, en la muestra estudiada con lasreportadas para la población americana10 y la española41; nótese que la frecuenciade la fusión TEL/AML-1 para este último grupo no ha sido reportada aún.

MLL

Rearreglode MLL

18

0

5

10

15

20

25

%

Americanos Mexicanos Españoles

Gráfica 2.Frecuencias de alteraciones estructurales presentes en la muestra

estudiada, así como en la población americana10 y española41.

Al analizar las frecuencias de las alteraciones estructurales obtenidas por FISH sepudo observar que, contrario de lo reportado para otros grupos10, los rearreglosque involucran a la región 11q23, del cromosoma que da nombre a esta alteración,constituyeron la anormalidad presente en mayor proporción en la muestra deestudio, constituyendo el 17% del total de las alteraciones cromosómicasdetectadas (Gráfica 2), lo que significaría desventajas para la población mexicanadebido al mal pronóstico que representa esta anormalidad44.

La fusión BCR/ABL se presentó en el 13% de los casos con alteracionescromosómicas constituyendo la segunda alteración estructural más común dentrode los pacientes afectados. Cabe resaltar que la frecuencia que observó estaanormalidad dentro del grupo de estudio fue sensiblemente más alta que lareportada para los otros dos grupos poblacionales10,41.

La t(12;21), detectada por la sonda TEL/AML-1, resultó ser la menos frecuentedentro del grupo de pacientes estudiados, constituyendo un 8% del total de lasanormalidades citogenéticas registradas; sin embargo, no fue posible hacer unacomparación con la población española41 dado que para ella no se encontraronregistros acerca de la frecuencia de la misma alteración.

El alto número de núcleos analizados mediante FISH confirma la gran sensibilidadde esta herramienta misma que constituye una ventaja para el análisis de

MMLLLLBBCCRR//AABBLL TTEELL//AAMMLL--11

19

muestras con LLA dado que, de no ser por ella, un gran número de alteracionessubmicroscópicas pasarían inadvertidas tanto en metafases como en núcleosinterfásicos; esta idea está de acuerdo con Pérez-Vera et al.15 y Anastasi et al.43.Sin embargo, gracias a la citogenética clásica es posible hacer un análisis previocompleto del cariotipo y obtener, mediante la observación de los cromosomas,indicios acerca de las sondas específicas a emplear con el FISH. De otra manera labúsqueda de alteraciones particulares de forma azarosa resultaría sumamente caray poco viable. Además el análisis de la ploidía resulta más económico mediantetécnicas de bandas GTG.

Al igual que con las alteraciones numéricas, y teniendo en cuenta las dificultadesencontradas en el desarrollo del FISH, se sugiere el aumento de la muestra deestudio, con la finalidad de afinar las tendencias que se encuentran dentro de lapoblación mexicana.

También sería muy útil crear un banco de datos, en el cual todos los laboratoriosde investigación descargaran la información obtenida de sus estudios, para estaren posibilidad de incrementar paulatinamente la información general acerca de lasalteraciones cromosómicas presentes en la población mexicana y que loshospitales hicieran el seguimiento detallado de la respuesta al tratamiento aplicadoa los pacientes. Esto permitiría tener una visión más clara acerca de lascaracterísticas propias del banco genético de los mexicanos y de sucomportamiento ante diversos factores exógenos que predisponen odesencadenan el proceso neoplásico, así como la respuesta a diversos fármacos.

Sería muy útil incluir en los expedientes de los pacientes información quepermitiera correlacionar el tipo de enfermedad con las características del hábitat enel que desarrollan sus actividades y otras variables, como los hábitos culturales yalimenticios.

Estos datos permitirían mejorar los tratamientos a emplear asegurando con ello lapronta y segura recuperación de los pacientes. Además de que servirían comobase para el desarrollo de nuevos fármacos que permitieran el abatimiento decostos y la mejora en la respuesta generada por los individuos, con la final debeneficiar a un mayor sector poblacional.

Esto implicaría, a su vez, el conocimiento de los mecanismos molecularesinvolucrados en las alteraciones cromosómicas y los procesos celulares que se venafectados en función de la expresión génica, tales como la fosforilación excesiva ysin regulación de proteínas involucradas en la progresión y diferenciación celular.En este ámbito la técnica de “micro arreglos” tiene una amplia aplicación, dada sualta sensibilidad para determinar los perfiles de expresión de diversos genes.

20

La información generada por esta técnica resulta muy útil para el entendimientodel proceso neoplásico por lo que se están integrando los datos generados de éstey otros proyectos realizados en el Laboratorio de Citogenética para determinar, encolaboración con el Laboratorio de Biología Molecular, dentro de la misma Unidadde Investigación del Hospital de Pediatría, la tasa o perfiles de expresión de losgenes de fusión más frecuentes e importantes en el desarrollo de las leucemiasdentro de la población mexicana.

CONCLUSIÓN

En la muestra de estudio se encontraron algunas de las alteraciones cromosómicasasociadas con las leucemias ya reportadas para otros grupos poblacionales; sinembargo, a diferencia de los norteamericanos, españoles e indios, la hipodiploidíaresultó ser la anormalidad numérica más frecuente mientras que, dentro de lasalteraciones estructurales, los rearreglos de la región 11q23 (gen MLL) presentaronla mayor frecuencia de las tres alteraciones del mismo tipo analizadas en estetrabajo.

Con base en las frecuencias que presentaron los diferentes tipos de alteraciones eneste estudio, así como en aquellas reportadas para las distintas poblacionesextranjeras se puede concluir que el pronóstico de vida, de los pacientes infantilescon LLA de la muestra estudiada tiende a ser desfavorable, en virtud del alto índicede aparición tanto de las hipodiploidías como de los rearreglos que involucran a laregión 23 del brazo largo del cromosoma 11.

Las diferencias encontradas entre la muestra analizada y las poblaciones decomparación, podrían atribuirse a variaciones en la carga genética de los diversosgrupos aquí analizados, así como a las características ambientales propias de cadaregión y la respuesta que cada grupo observa a los diferentes tratamientosaplicados.

BIBLIOGRAFÍA

1) Gersen S. L., Keagle M. B. 1999. The Principles of Clinical Cytogenetics. Ed.Humana Press. USA. pp 345-420.

2) Lozano J. A. Leucemias Agudas. Oncología 2002; 21:117.

3) Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T., Flandrin G., Galton D.A.G., GralnickH.R., and Sultan C. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloidleukemia. Ann. Intern. Med. 1985; 103: 626.

21

4) Schuh A.C., Sutherland D.R., Horsfall W., Mills G.B., Dubé I., Baker M.A.,Siminovich K., Bailey D., and Keating A. Chronic myeloid leukemia arising in aprogenitor common to T cells and myeloid cells. Leukemia 1990; 4: 631.

5) Bick R. L. 1993. Hematology: Clinical and Laboratory Practice. Mosby. U.S.A.775-780.

6) Stefan F., Hagop M, Kantarjian., Talpaz M., and Estrov Z. Clinical Significance ofCytogenetic Abnormalities in Adult Acute Lymphoblastic Leukemia. J Am SocHematol 1998; 91: 3995.

7) Behm F: Morphologic and cytochemical characteristics of childhoodlymphoblastic leukemia. Hematol Oncol Clinic of North Am 1990; 4: 715-32,.

8) Young JL Jr, Ries LG, Silvergerg E, Horm JW, Miller RW: Cancer incidence,survival and mortality for children younger than age 15 years. Cancer 1986;58:589.

9) Dunn N, Russell C, Maurer H: An update in pediatric Oncology. Pediatr Dent1990; 12: 10-19.

10) Pui C.H., Relling M.V., Pharm D. and Downing J.R. Acute LymphoblasticLeukemia. N Engl J Med 2004; 350;15: 1535.

11) Rowley J. D. Cytogenetic Analysis in Leukemia and Lymphoma: AnIntroduction. Semin Hematol 2000; 37: 315.

12) Armstrong S. A., Golub T. R. and Korsmeyer S. MLL-Rearranged Leukemias:Insights From Gene Expression Profiling. Semin Hematol 2003; 40: 268.

13) Grimwade D., Walker H., Oliver F. et al: The importance of diagnosiscytogeneitcs on outcome in AML: Analisis of 1612 patients entered into the MRCAML 10 trial. En: Rowley J. D. Cytogenetic Analysis in Leukemia and Lymphoma:An Introduction. Semin Hematol 2000; 37: 315.

14) Pui C. H., Evans E. W., Pharma D. Acute lymphoblastic leukemia. N Engl JMed 1998; 339:605.

15) Pérez-Vera P., Frías S., Carnevale A. et al. A Strategy to Detect ChromosomalAbnormalities in Children With Acute Lymphoblastic Leukemia. J Pediatr HematolOncol 2004; 26 (5): 294.

16) Amare P., Gladstone B., Varghese C., Pai Suresh and Advani S. ClinicalSignificance of Cytogenetic Findings at Diagnosis and in Remission in Childhood

22

and Adult Acute Lymphoblastic Leukemia: Experience from India. Cancer GenetCytogenet 1999; 110:44.

17) Pui C. H., Crist M. W., Look T. Biology and clinical significance of cytogeneticabnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1990; 76:1449.

18) Bentz M., Cabot G., Moos M., Speicher M. R., Ganser A., Lichter P. and DöhnerH. Detection of Chimeric BCR-ABL Genes on Bone Marrow Samples and BloodSmears in Chronic Myeloid and Acute Lymphoblastic Leukemia by In SituHybridization. Blood 1994; 83: 1922.

19) Aricò M, Valsecchi MG, Camitta B, et al. Outcome of treatment in children withPhiladelphia chromosome–positive acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med2000; 342:998.

20) Loh ML. and Rubnitz JE. TEL/AML1-positive pediatric leukemia: prognosticsignificance and therapeutic approaches. Curr Opin Hematol 2002;9:345-52.

21) Speck NA. and Gilliland DG. Core-binding factors in haematopoiesis andleukaemia. Nat Rev Cancer 2002;2:502-13.

22) Hiebert SW., Sun W., Davis JN., et al. The t(12;21) translocation convertsAML-1B from an activator to a repressor of transcription. Mol Cell Biol1996;16:1349-55.

23) Rowley J. D. The role of chromosome translocationes in leukemogenesis.Semin Hematol 1999; 36: 59. (suppl 7).

24) Gozzetti A. and Le Beau M. M. Fluorescence In Situ Hybridization: Uses andLimitations. Semin Hematol 2000; 37: 320.

25) Corral J, Lavenir I, Impey H, et al. An MII-AF9 fusion gene made byhomologous recombination causes acute leukemia in chimeric mice: a method tocreate fusion oncogenes.Cell 1996;85:853-61.

26) Dobson CL, Warren AJ, Pannell R, et al. The mll-AF9 gene fusion in micecontrols myeloproliferation and specifies acute myeloid leukaemogenesis. EMBO J1999;18: 3564-74.

27) Look T. A. Oncogenic Transcription Factors in the Human Acute Leukemias.Science 1997; 278: 1059.

23

28) Gole Leena. Fluorescence in situ Hybridization. Encyclopedia of Life Sciences.2001. Nature Publishing Group/www.els.net.

29) Walters R., Kantarjian H. M., Koating M. J., Estoy E. H., Trujillo J., Cork A.,MaCrodlo K. B. Freireiah. The importance of cytogenetic studies in adult acutelymphoblastic leukemia. Am J Med 1990; 89: 579.

30) Shikha B., Deininger M., Gora-Tybor G., Goldman J. M. and Melo J. V. ThePresence of Typical and Atypical BCR-ABL Fusion Genes in Leukocytes of NormalIndividuals: Biologic Significance and Implications for the Assessment of MinimalResidual Disease. Blood 1998; 92: 3362.

31) Arana TRM., Cervantes PA., Rozen E., Kassack JJ., Gutiérrez M., KofmanAS., Estudio citogenético en 22 adultos y tres niños con leucemia linfoblásticaaguda. Rev Invest Clin 1993: 45.

32) Mejía A., Bonilla M., Lorenzana R. et al. Incidence of Leukemias in ChildrenYounger than 12 years in El Salvador and México City Between 1996 and 2000.Abstracts of the 37th Annual Meeting Salt Lake City, Utah. American Journal ofEpidemiology 2004; 159 (11): S10.

33) Williams D., Harris A., Williams K., Brosius M. and Lemonds W: A direct bonemarrow chromosome technique for acute lymphoblastic leukemia. Cancer GenetCytogenet 1984; 13:239.

34) Verma RS. and Babu A. Banding technique. In: Verma RS, editor. Humanchromosomes, Manual of techniques. New York: Pergamon Press: 1989. p. 47.

35) ISCN (1995): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature.F. Mitelman, ed. S. Karger, Basel.

36) Vysis Product Catalog, Inc., 2004.

37) Greaves F. M. and Wiemels J. Origins of Chromosome Translocations inChildhood Leukaemia. Nature Reviews Cancer. 2003; 3: 1.

38) Secker-Walker LM. Cytogenetic techniques, terminology and classification inALL. En: Pérez-Vera P., Frías S., Carnevale A. et al. A Strategy to DetectChromosomal Abnormalities in Children With Acute Lymphoblastic Leukemia. JPediatr Hematol Oncol 2004; 26 (5): 294.

39) Nordgren A. Hidden aberrations diagnosed by interphase fluorescence in sitygybridisation and spectral karyotyping in childhood acute lymphoblastic leukaemia.Leuk Lymphoma 2003; 44: 2039.

24

40) Pizzo P. A. & Poplack D. G. 2002. Principles and Practice of Pediatric Oncology.4th ed. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. USA. pp. 495, 501-506.

41) Martín R. M.L., Fernández M. F.J. y Barreiro M. E. Alteraciones cromosómicasen la leucemia linfoblástica aguda. Anales Españoles de Pediatría 2001; 55 (1): 45.

42) Flores R. G., y Aguilar S. M. A. 2004. Carcinogénesis. In: Albert, L.A. (Ed)Toxicología Ambiental. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Chihuahua, Méx.99-130.

43) Anastasi J., Le Beau M. M., Vardiman J. W. And Westbrook C. A. Detection ofNumerical Chromosomal Abnormalities in Neoplastic Hematopoietic Cells by In SituHybridization with a Chromosome-Specific Probe. Am J Pathol 1990; 136: 131.

44) Rowley J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. SemHematol 1999; 36: 59.