aislamiento de cromosomas del lenguado senegalÉs (solea senegalensis, kaup 1858) mediante tÉcnicas...
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AISLAMIENTO DE CROMOSOMAS DEL
LENGUADO SENEGALÉS (SOLEA
SENEGALENSIS, KAUP 1858) M
EDIANTE
TÉCNICAS DE MICRODISECCIÓ
N LÁSER.
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Vega y colaboradores 2002
A) B)
INTRODUCCIÓN: LENGUADO SENEGALÉS
Nombre científico: Solea Senegalensis
Interés en el mercado europeo y creciente producción.
Alto valor 12-15€/kg
Desarrollo de la acuicultura
No se han implementado grandes programas de mejora genética.
Interés en investigación para desarrollarlos:
Interés en las bases genéticas del lenguado• PCR• NGS• Técnicas de citogenética tradicionales y moleculares• Microdisección láser• DOP-PCR
OBJETIVOS
Principal
Optimización de la condiciones para la microdisección láser y amplificación de los cromosomas aislados.
Objetivos parciales:
a) Obtener las mejores extensiones cromosómicas posibles en portaobjetos PET, para facilitar el aislamiento posterior de los cromosomas.
b) Lograr las mejores condiciones de corte y catapultado, para obtener el corte más fino, menos energético y efectivo ajustando las condiciones del láser y la metodología del proceso.
c) Conseguir la cantidad mínima de cromosomas y condiciones óptimas para el desarrollo de la DOP-PCR.
METODOLOGÍA DEL TRABAJO
Se mejoró la extensión de los cromosomas en las preparaciones
Se ajustó las condiciones y parámetros del láser
Se puso a punto la DOP-PCR
EXTENSIÓN PREPARACIONES CROMOSÓMICAS.
Se busca obtener la mejor extensión que permita un óptimo aislado. Preparaciones de buena calidad Buena extensión
1. Portaobjetos normales Se usaron tres protocolos distintos
2. Portaobjetos PET Se hicieron variaciones de temperatura en el protocolo anteriormente elegido
PORTAOBJETOS CONVENCIONALES
Pretratamiento Portaobjetos
Muestras
PORTAOBJETOS CONVENCIONALES
1. Homogenizado con Ácido Acético 45%
2. Los portaobjetos en una placa calefactora a 45ºC
3. Se realizó el splash
4. Fijación a 45ºC.5. Retirar ácido
acético cada 15-20
Calor
1. Los portaobjetos se someten a frío seco -20ºC.
2. Homogenizado en Carnoy.
3. Se realiza Splash4. Se dejan a 37ºC en
la placa calefactora húmeda.
5. Se gota Carnoy6. Fijación durante 1
hora a 37ºC
Zeiss
1. Los portaobjetos se someten a frío húmedo -20ºC.
2. Homogenizado en Carnoy.
3. Se realiza Splash4. Se dejan a 50ºC en
la placa calefactora húmeda.
5. Se gotea Carnoy6. Se fija durante 10
min
Jena
Tratamiento
PORTAOBJETOS CONVENCIONALES• 1 min EtOH 30% • 1 min EtOH 50% • 5 min EtOH 70% • 5 min EtOH 90% • 5 min EtOH 100% • 10 min EtOH 100%
(Temperatura ambiente)
1) Deshidratación
Una hora en la estufa a 72ºC
2) Envejecimiento
Teñir durante 15 min, con Giemsa 8% en tampón fosfato.
Lavar con agua destilada
3) Tinción Giemsa
Medida del área en píxeles de las placas metafásicas con ImageJ.
Análisis de Datos.
Post-tratamiento
RESULTADOS PORTAOBJETOS CONVENCIONALESJena4x 10x 40x
Calor
Zeiss
Jena
MATERIAL Y MÉTODOS
Pretratamiento
Tratamiento
Jen
a
50ºC
60ºC
65ºc
Post-tratamiento
Después de teñir se mantuvo 15 min a 50ºC
PORTAOBJETOS PETPost-tratamiento
Henegariu y colaboradores
RESULTADOS
50ºC 60ºC 65ºC
60ºC
AJUSTE MICRODISECTOR
Necesidad de Optimizar el corte por diversos problemas. Cromosomas de lenguado muy pequeños. Daños al realizar los cortes y dificultad de aislamiento. El láser se desenfocaba. Cortes irregulares dependiendo de la localización en la membrana.
Necesidad de ajustar parámetros y metodología mejor que a la usada anteriormente.
Parámetros
Energía
Enfoque
Ciclos
Velocidad
No corta
No corta
Desenfocado
Desenfocado
Enfoque óptimo
LáserPosición
Preparación (-) Energía (+)
Preparación
1º 2º 3º
Enfocar Aumentarenergía
RESULTADO CORTE LÁSER
Parámetro Protocolo inicial Protocolo optimizado
Energía Corte (µ J) ≈37 20 incrementando hasta 37(máx.)
Energía Catapultado (µ J) 10 10-20
Velocidad de corte µm/s 5 5
Numero de ciclos de corte 120,Aunque se realizar los necesarios hasta que
completar el corte
DOP-PCR
PCR con primers degenerados.
A partir de cromosomas microdiseccionados.
Se usaron dos protocolos con distintas polimerasas
o Termolábil (Secuenasa)
o Termoestable ( Roche)
Se mantuvo la esterilidad para evitar contaminaciones Puntas con filtro Tratamiento UV Cabina de flujo Cuidado en el manejo de reactivos
DOP-PCR
ADN molde
200pb
800pb
ADN moldePrimers DOP
• Degenerados(5′-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3′)
Unión inespecífica
Fragmentos de diferentes tamaños
Tamaños de fragmentos aleatorios
Smear
2ª PCR)
1ª PCR)
POLIMERASA SECUENASA (TERMOLÁBIL)Programa ciclos a baja temperatura.
Paso TemperaturaTiempo (min)
Observaciones
1 92ºC 5:00
2 25ºC 2:00Adicionar 0.24 µL de Secuenasa
3 34ºC 2:00 4 90ºC 1:00 5 Ir a 2, repetir 6 veces 6 30ºC 2:20 Programa ciclos a alta temperatura.
7 94ºC 2:00Calentamiento inicial para Platinium polymerase
8 92ºC 1:00 9 56ºC 2:20 10 70ºC 2:00 11 Ir a 8, repetir 31 veces 12 70ºC 10:00 13 4ºC ∞ 14 Final
POLIMERASA ROCHE (TERMOESTABLE)
Paso Temperatura Tiempo en minutos
1 94ºC 9:002 94ºC 1:003 30ºC 2:304 72ºC 3:005 Ir de 2 a 4, repetir 9 veces6 94ºC 1:007 62ºC 1:308 72ºC 2:309 Ir de 6 a 8, repetir 30 veces10 70ºC 8:0011 4ºC ∞12 Final
RESULTADOS DOP
RESULTADOS DOP
OPTIMIZACIÓN DEL TIEMPO: DIAGRAMA DE GANTT
Limpiar portas PETEnfriar PET al congelador
Extracción (SV) larvasHomogenizado
SplashPlaca calefactora
DeshidrataciónEnvejecido
TeñirSecado
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Diseccionar cromosomas
Añadir H20
Resuspender H20
24 29 34 39 44
Resuspender en agua
Preparar material para la campana
Exposición UV en campana
Preparar PCR
DOP PCR (programa Termociclador)
Preparar Geles
Cargar Gel
Electroforesis
48 50 52 54 56 58 60 62
22%
CONCLUSIONES
1. Se consiguió optimizar el proceso completo y las condiciones de microdisección láser y amplificación mediante DOP-PCR.
2. Se mejoraron las preparaciones cromosómicas, y se confirmó que el mejor protocolo fue el de Jena. Asimismo un incremento de la temperatura de la placa calefactora en el protocolo de Jena hasta los 60ºC, en comparación a los 50ºC iniciales, favoreció la extensión de los cromosomas en los portaobjetos PET.
3. Se perfeccionó significativamente el aislamiento cromosómico por microdisección láser. El nuevo método implementado, con el que se inicia el corte con una energía de láser mínima de 20 J, para enfocar el láser y μposteriormente aumentar la energía progresivamente hasta cortar la muestra consiguió ser útil para minimizar los daños a los cromosomas.
CONCLUSIONES
4. Se constató que el uso de la polimerasa termoestable de roche era válida para la realización de la DOP-PCR. El uso de una polimerasa termoestable facilitó la DOP-PCR con respecto al uso de la polimerasa termolábil (Secuenasa). Se simplificó la preparación de reactivos, necesitando una sola mezcla de reacción, en vez de dos. Además no hay que añadir polimerasa en cada ciclo de desnaturalización en la etapa de amplificación a baja temperatura, como sucedía con la Secuenasa. Traduciéndose estos cambios en un menor trabajo de laboratorio y una mayor dificultad de contaminación de las muestras, ya que estas se manipulan menos.
5. Se obtuvo que la cantidad mínima de cromosomas microdiseccionados en Solea senegalensis que generaban productos en la DOP-PCR está cercana a los 7 cromosomas.
PERSPECTIVAS FUTURAS
Permitirá aislar cromosomas y brazos cromosómicos específicos mediante microdisección láser.
Las muestras aisladas serán amplificadas por DOP-PCR, que serán de utilidad para:Secuenciación. Generar sondas para el pintado cromosómico.
Con ello se podrá continuar y completar los estudios en Solea senegalensis.
TFG FUTURO
Muchísimas gracias por su tiempo y atención.
Y especialmente al laboratorio de genética, a mi familia y amigos.