actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de extractos de … · 2020-02-12 · ဈฬ᠓...
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Actividad antioxidante yantinflamatoria in vitro de
extractos de chaya (Cnidoscolusaconitifolius (Mill) IM Johnst)
In vitro antioxidant and anti-inflammatory activity of chaya
extracts (Cnidoscolusaconitifolius (Mill) IM Johnst)
1020960nh02752
OR 2752
Actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de extractos de
chaya (Cnidoscolus aconitifolius (Mill) IM Johnst)
In vitro antioxidant and anti-inflammatory activity of chaya extracts
(Cnidoscolus aconitifolius (Mill) IM Johnst)
Ulil Us-Medina1 Mariacutea del Carmen Millaacuten-Linares2 Viacutector Ermilo Arana-
Argaes3 Maira Rubi Segura-Campos1
1Facultad de Ingenieriacutea Quiacutemica Campus de Ciencias Exactas e
Ingenieriacuteas Universidad Autoacutenoma de Yucataacuten Meacuterida Yucataacuten Meacutexico2Unidad de Biologiacutea Celular Instituto de la Grasa (CSIC) Campus de la
Universidad Pablo de Olavide Sevilla Espantildea 3Facultad de Quiacutemica
Campus de Ciencias de la Salud Universidad Autoacutenoma de Yucataacuten
Meacuterida Yucataacuten Meacutexico
Recepcioacuten 20062019
Aceptacioacuten 01102019
Correspondencia Maira Segura-Campos Facultad de Ingenieriacutea
Quiacutemica Campus de Ciencias Exactas e Ingenieriacuteas Universidad
Autoacutenoma de Yucataacuten Perifeacuterico Nte Km 335 Tablaje Catastral 13615
Col Chuburnaacute de Hidalgo Inn 97203 Meacuterida Yucataacuten Meacutexico
e-mail mairaseguracorreouadymx
RESUMEN
Introduccioacuten las enfermedades croacutenicas no transmisibles (ECNT) son
la principal causa de muerte en todo el mundo Los metabolitos
secundarios provenientes de fuentes vegetales como Cnidoscolus
aconitifolius pueden usarse como coadyuvante en la prevencioacuten de las
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo y la inflamacioacuten tales
como las ECNT
Objetivo se evaluoacute la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro
de los compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C
aconitifolius
Meacutetodos se determinoacute el contenido de fenoles flavonoides flavanonas
e hidroflavonoles El potencial antioxidante se determinoacute con los ensayos
de 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo (DPPH) aacutecido 22-azinobis (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfoacutenico) (ABTS) y la actividad inhibitoria de la
enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Para la actividad
antinflamatoria se utilizaron la reaccioacuten en cadena de la polimerasa
(PCR) cuantitativa en tiempo real y el ensayo por inmunoabsorcioacuten
ligado a enzimas (ELISA) en macroacutefagos diferenciados de monocitos
THP-1 y estimulados con lipopolisacaacuterido (LPS)
Resultados el extracto acuoso registroacute el mayor contenido de fenoles
(7061 007 g100 g de extracto) y el extracto etanoacutelico registroacute el
mayor contenido de flavonoides (4776 484 g100 g de extracto)
flavanonas y dihidroflavonoles (7010 729 g100 g de extracto) El
extracto acetoacutenico registroacute la mayor inhibicioacuten del radical DPPH (4985 plusmn
530) mientras que el etanoacutelico presentoacute la mayor inhibicioacuten del radical
ABTS (4101 plusmn 381) Los extractos etanoacutelico y acuoso inhibieron la
ECA El extracto etanoacutelico tuvo la mayor actividad antinflamatoria al
reducir la expresioacuten geacutenica de TNF- en un 3978 y la de IL-6 en un
9781 y su produccioacuten en un 46 y un 4838 respectivamente
Conclusiones los extractos mostraron in vitro su potencial antioxidante
y antinflamatorio por su contenido en compuestos bioactivos
Palabras clave C aconitifolius Extractos Antioxidantes
Antinflamatorios
ABSTRACT
Introduction noncommunicable diseases (NCDs) are the main cause of
death worldwide Secondary metabolites from plant sources such as
Cnidoscolus aconitifolius may be used as adjuvants in the prevention of
diseases related to oxidative stress and inflammation such as NCDs
Objective the in vitro antioxidant and anti-inflammatory activities
associated with biologically active compounds in C aconitifolius extracts
were evaluated
Method the contents of phenols flavonoids flavonones and
hydroflavonoles were determined The potential antioxidant activity was
determined with 11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 22prime-Azino-
bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assays and
angiotensin-converting enzyme (ACE) activity For anti-inflammatory
activity quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) tests were used in macrophages derived from THP-1 monocytes
and stimulated with LPS
Results the aqueous extract recorded the highest phenolic content
(7061 007 g100 g of extract) and the ethanolic extract registered
the highest content in flavonoids (4776 484 g100 g of extract)
flavonones and dihydroflavonoles (7010 729 g100 g of extract) The
acetone extract obtained the highest DPPH inhibition (4985 plusmn 530)
while the ethanolic extract showed the highest ABTS inhibition (4101 plusmn
381) The etanolic and aqueous extracts had the highest ACE
inhibition The ethanolic extract had the highest anti-inflammatory
activity decreasing gene expression for TNF- by 3978 and for IL-6 by
9781 and their production by 46 and 4838 respectively in
macrophages stimulated with LPS
Conclusion these extracts demonstrated in vitro their antioxidant and
anti-inflammatory potential due to their content of bioactive compounds
Keywords C aconitifolius Extracts Antioxidant Anti-inflammatory
INTRODUCCIOacuteN
Las enfermedades croacutenicas no transmisibles (ECNT) como las
enfermedades cardiovasculares el caacutencer y la diabetes son la principal
causa de muerte en todo el mundo El binomio comuacuten que incrementa el
desarrollo de algunas de las ECNT son la sobreproduccioacuten de radicales
libres (RL) y la respuesta inflamatoria croacutenica (1) El aumento de los RL
que no son neutralizados por los antioxidantes endoacutegenos desencadena
actividades bioloacutegicas importantes toda vez que dichos RL reaccionan
con macromoleacuteculas constituyentes de ceacutelulas y tejidos como
carbohidratos liacutepidos proteiacutenas y ADN (23) Lo anterior provoca
necrosis diseminando residuos celulares en la sangre y produciendo
maacutes RL y en consecuencia la activacioacuten de la respuesta inflamatoria
(4)
La inflamacioacuten es una respuesta inmunitaria natural durante las
infecciones o las lesiones Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante
un tiempo prolongado se produce un aumento de las moleacuteculas de
adhesioacuten los RL y la produccioacuten de citoquinas proinflamatorias (IL-1 IL-
6 TNF-) (5) Los monocitos forman parte del sistema inmune
inespeciacutefico cuya funcioacuten es la eliminacioacuten de desechos celulares el
reconocimiento de lo ajeno al organismo la defensa inespeciacutefica del
mismo la reparacioacuten e inflamacioacuten de los tejidos y el enlace con el
sistema linfoide maacutes especiacutefico En condiciones de normalidad los
monocitos pasaraacuten de la meacutedula oacutesea a la circulacioacuten sanguiacutenea y de
esta a los tejidos donde se diferenciaraacuten en macroacutefagos intersticiales
Los macroacutefagos pueden activarse claacutesicamente liberando citoquinas
proinflamatorias y RL o alternativamente liberando moleacuteculas
antinflamatorias como la IL-10 y participando funcionalmente en la
reparacioacuten del tejido el reconocimiento antigeacutenico y la curacioacuten de
heridas (6) Por lo tanto la liacutenea celular monociacutetica THP-1 representa un
sistema modelo apropiado para el estudio de la respuesta inmune
Compuestos tales como los flavonoides fenoles flavanonas y
dihidroflavanonas provenientes de fuentes vegetales pueden disminuir
los efectos del estreacutes oxidativo y de la inflamacioacuten croacutenica (78) En este
sentido C aconitifolius (chaya) es una planta endeacutemica de la peniacutensula
de Yucataacuten Meacutexico cuyas hojas se consumen en platillos tradicionales y
se usan tambieacuten como tratamiento de enfermedades de origen
inflamatorio (910) Estudios de los extractos de la hoja han demostrado
una actividad similar a la indometacina en modelos de edema plantar y
auricular (1011) Sin embargo no existen resultados sobre el efecto de
dichos extractos sobre los biomarcadores de la inflamacioacuten como el TNF-
la IL-6 y la IL-1 Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue
evaluar la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de los
compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C aconitifolius
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Las hojas de C aconitifolius ((Mill) IM Johnst) se recolectaron en la
Quinta los Achiotes Timucuy Yucataacuten Meacutexico La identificacioacuten de la
planta se llevoacute a cabo por el Dr Joseacute Luis Tapia Muntildeoz en el herbario del
Centro de Investigaciones del Estado de Yucataacuten (CICY) con el nuacutemero
de folio 69489 Se utilizaron los reactivos de Folin-Ciocalteu carbonato
de sodio (NaCO3) aacutecido gaacutelico nitrito de sodio (NaNO2) hidroacutexido de
sodio (NaOH) cloruro de aluminio hexahidratado (AlCl36H2O) catequina
24-dinitrofenil hidracina aacutecido sulfuacuterico (H2SO4) metanol hidroacutexido de
potasio (KOH) naringenina aacutecido 22-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-
sulfoacutenico (ABTS) acetato de sodio (CH3COONa) aacutecido aceacutetico
(CH3COOH) peroacutexido de hidrogeno (H2O2) 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo
(DPPH) etanol enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Tris-Base
cloruro de sodio (NaCl) aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) bromuro de 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25-
difeniltetrazolio (MTT) forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil
sulfoacutexido (DMSO) Se utilizaron ceacutelulas de monocitos THP-1 (ATCCreg
Nuacutemero TIB-202TM) El kit de siacutentesis de ADNc iScrip cDNA se obtuvo de
BIO-RAD (Hercules CA EE UU) El Brilliant II SYBRreg Green QPCR Master
Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara CA EE UU) El
Trisure se obtuvo de Bioline Los cebadores se obtuvieron de Eurofins
Biolab SLU (Barcelona Espantildea) Los sets de TNF- IL-1 e IL-6
humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone Besanccedilon Francia)
Preparacioacuten de los extractos de hojas de C aconitifolius
Las hojas se secaron durante 24 h en un secador con flujo de aire
caliente a una temperatura de 40 ordmC y despueacutes se pulverizaron en un
molino Cyclotec adaptando una malla de 05 mm Seguidamente se
efectuaron las extracciones soacutelido-liacutequido no secuencial en una
proporcioacuten de 110 (pv) a temperatura ambiente con agua etanol
acetona acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y hexano por maceracioacuten durante
48 h Los extractos se filtraron empleando papel de filtro Nordm 5 (11) Las
soluciones filtradas se concentraron a presioacuten reducida Finalmente se
congelaron liofilizaron y almacenaron a 4 ordmC protegidas de la luz hasta
su posterior anaacutelisis
Anaacutelisis de los compuestos bioactivos de extractos de C
aconitifolius con potencial antioxidante y antinflamatorio
Fenoles totales
Los fenoles totales se determinaron siguiendo la metodologiacutea modificada
de George et al (12) utilizando Folin-Ciocalteu y aacutecido gaacutelico como
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
OR 2752
Actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de extractos de
chaya (Cnidoscolus aconitifolius (Mill) IM Johnst)
In vitro antioxidant and anti-inflammatory activity of chaya extracts
(Cnidoscolus aconitifolius (Mill) IM Johnst)
Ulil Us-Medina1 Mariacutea del Carmen Millaacuten-Linares2 Viacutector Ermilo Arana-
Argaes3 Maira Rubi Segura-Campos1
1Facultad de Ingenieriacutea Quiacutemica Campus de Ciencias Exactas e
Ingenieriacuteas Universidad Autoacutenoma de Yucataacuten Meacuterida Yucataacuten Meacutexico2Unidad de Biologiacutea Celular Instituto de la Grasa (CSIC) Campus de la
Universidad Pablo de Olavide Sevilla Espantildea 3Facultad de Quiacutemica
Campus de Ciencias de la Salud Universidad Autoacutenoma de Yucataacuten
Meacuterida Yucataacuten Meacutexico
Recepcioacuten 20062019
Aceptacioacuten 01102019
Correspondencia Maira Segura-Campos Facultad de Ingenieriacutea
Quiacutemica Campus de Ciencias Exactas e Ingenieriacuteas Universidad
Autoacutenoma de Yucataacuten Perifeacuterico Nte Km 335 Tablaje Catastral 13615
Col Chuburnaacute de Hidalgo Inn 97203 Meacuterida Yucataacuten Meacutexico
e-mail mairaseguracorreouadymx
RESUMEN
Introduccioacuten las enfermedades croacutenicas no transmisibles (ECNT) son
la principal causa de muerte en todo el mundo Los metabolitos
secundarios provenientes de fuentes vegetales como Cnidoscolus
aconitifolius pueden usarse como coadyuvante en la prevencioacuten de las
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo y la inflamacioacuten tales
como las ECNT
Objetivo se evaluoacute la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro
de los compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C
aconitifolius
Meacutetodos se determinoacute el contenido de fenoles flavonoides flavanonas
e hidroflavonoles El potencial antioxidante se determinoacute con los ensayos
de 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo (DPPH) aacutecido 22-azinobis (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfoacutenico) (ABTS) y la actividad inhibitoria de la
enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Para la actividad
antinflamatoria se utilizaron la reaccioacuten en cadena de la polimerasa
(PCR) cuantitativa en tiempo real y el ensayo por inmunoabsorcioacuten
ligado a enzimas (ELISA) en macroacutefagos diferenciados de monocitos
THP-1 y estimulados con lipopolisacaacuterido (LPS)
Resultados el extracto acuoso registroacute el mayor contenido de fenoles
(7061 007 g100 g de extracto) y el extracto etanoacutelico registroacute el
mayor contenido de flavonoides (4776 484 g100 g de extracto)
flavanonas y dihidroflavonoles (7010 729 g100 g de extracto) El
extracto acetoacutenico registroacute la mayor inhibicioacuten del radical DPPH (4985 plusmn
530) mientras que el etanoacutelico presentoacute la mayor inhibicioacuten del radical
ABTS (4101 plusmn 381) Los extractos etanoacutelico y acuoso inhibieron la
ECA El extracto etanoacutelico tuvo la mayor actividad antinflamatoria al
reducir la expresioacuten geacutenica de TNF- en un 3978 y la de IL-6 en un
9781 y su produccioacuten en un 46 y un 4838 respectivamente
Conclusiones los extractos mostraron in vitro su potencial antioxidante
y antinflamatorio por su contenido en compuestos bioactivos
Palabras clave C aconitifolius Extractos Antioxidantes
Antinflamatorios
ABSTRACT
Introduction noncommunicable diseases (NCDs) are the main cause of
death worldwide Secondary metabolites from plant sources such as
Cnidoscolus aconitifolius may be used as adjuvants in the prevention of
diseases related to oxidative stress and inflammation such as NCDs
Objective the in vitro antioxidant and anti-inflammatory activities
associated with biologically active compounds in C aconitifolius extracts
were evaluated
Method the contents of phenols flavonoids flavonones and
hydroflavonoles were determined The potential antioxidant activity was
determined with 11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 22prime-Azino-
bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assays and
angiotensin-converting enzyme (ACE) activity For anti-inflammatory
activity quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) tests were used in macrophages derived from THP-1 monocytes
and stimulated with LPS
Results the aqueous extract recorded the highest phenolic content
(7061 007 g100 g of extract) and the ethanolic extract registered
the highest content in flavonoids (4776 484 g100 g of extract)
flavonones and dihydroflavonoles (7010 729 g100 g of extract) The
acetone extract obtained the highest DPPH inhibition (4985 plusmn 530)
while the ethanolic extract showed the highest ABTS inhibition (4101 plusmn
381) The etanolic and aqueous extracts had the highest ACE
inhibition The ethanolic extract had the highest anti-inflammatory
activity decreasing gene expression for TNF- by 3978 and for IL-6 by
9781 and their production by 46 and 4838 respectively in
macrophages stimulated with LPS
Conclusion these extracts demonstrated in vitro their antioxidant and
anti-inflammatory potential due to their content of bioactive compounds
Keywords C aconitifolius Extracts Antioxidant Anti-inflammatory
INTRODUCCIOacuteN
Las enfermedades croacutenicas no transmisibles (ECNT) como las
enfermedades cardiovasculares el caacutencer y la diabetes son la principal
causa de muerte en todo el mundo El binomio comuacuten que incrementa el
desarrollo de algunas de las ECNT son la sobreproduccioacuten de radicales
libres (RL) y la respuesta inflamatoria croacutenica (1) El aumento de los RL
que no son neutralizados por los antioxidantes endoacutegenos desencadena
actividades bioloacutegicas importantes toda vez que dichos RL reaccionan
con macromoleacuteculas constituyentes de ceacutelulas y tejidos como
carbohidratos liacutepidos proteiacutenas y ADN (23) Lo anterior provoca
necrosis diseminando residuos celulares en la sangre y produciendo
maacutes RL y en consecuencia la activacioacuten de la respuesta inflamatoria
(4)
La inflamacioacuten es una respuesta inmunitaria natural durante las
infecciones o las lesiones Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante
un tiempo prolongado se produce un aumento de las moleacuteculas de
adhesioacuten los RL y la produccioacuten de citoquinas proinflamatorias (IL-1 IL-
6 TNF-) (5) Los monocitos forman parte del sistema inmune
inespeciacutefico cuya funcioacuten es la eliminacioacuten de desechos celulares el
reconocimiento de lo ajeno al organismo la defensa inespeciacutefica del
mismo la reparacioacuten e inflamacioacuten de los tejidos y el enlace con el
sistema linfoide maacutes especiacutefico En condiciones de normalidad los
monocitos pasaraacuten de la meacutedula oacutesea a la circulacioacuten sanguiacutenea y de
esta a los tejidos donde se diferenciaraacuten en macroacutefagos intersticiales
Los macroacutefagos pueden activarse claacutesicamente liberando citoquinas
proinflamatorias y RL o alternativamente liberando moleacuteculas
antinflamatorias como la IL-10 y participando funcionalmente en la
reparacioacuten del tejido el reconocimiento antigeacutenico y la curacioacuten de
heridas (6) Por lo tanto la liacutenea celular monociacutetica THP-1 representa un
sistema modelo apropiado para el estudio de la respuesta inmune
Compuestos tales como los flavonoides fenoles flavanonas y
dihidroflavanonas provenientes de fuentes vegetales pueden disminuir
los efectos del estreacutes oxidativo y de la inflamacioacuten croacutenica (78) En este
sentido C aconitifolius (chaya) es una planta endeacutemica de la peniacutensula
de Yucataacuten Meacutexico cuyas hojas se consumen en platillos tradicionales y
se usan tambieacuten como tratamiento de enfermedades de origen
inflamatorio (910) Estudios de los extractos de la hoja han demostrado
una actividad similar a la indometacina en modelos de edema plantar y
auricular (1011) Sin embargo no existen resultados sobre el efecto de
dichos extractos sobre los biomarcadores de la inflamacioacuten como el TNF-
la IL-6 y la IL-1 Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue
evaluar la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de los
compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C aconitifolius
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Las hojas de C aconitifolius ((Mill) IM Johnst) se recolectaron en la
Quinta los Achiotes Timucuy Yucataacuten Meacutexico La identificacioacuten de la
planta se llevoacute a cabo por el Dr Joseacute Luis Tapia Muntildeoz en el herbario del
Centro de Investigaciones del Estado de Yucataacuten (CICY) con el nuacutemero
de folio 69489 Se utilizaron los reactivos de Folin-Ciocalteu carbonato
de sodio (NaCO3) aacutecido gaacutelico nitrito de sodio (NaNO2) hidroacutexido de
sodio (NaOH) cloruro de aluminio hexahidratado (AlCl36H2O) catequina
24-dinitrofenil hidracina aacutecido sulfuacuterico (H2SO4) metanol hidroacutexido de
potasio (KOH) naringenina aacutecido 22-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-
sulfoacutenico (ABTS) acetato de sodio (CH3COONa) aacutecido aceacutetico
(CH3COOH) peroacutexido de hidrogeno (H2O2) 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo
(DPPH) etanol enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Tris-Base
cloruro de sodio (NaCl) aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) bromuro de 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25-
difeniltetrazolio (MTT) forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil
sulfoacutexido (DMSO) Se utilizaron ceacutelulas de monocitos THP-1 (ATCCreg
Nuacutemero TIB-202TM) El kit de siacutentesis de ADNc iScrip cDNA se obtuvo de
BIO-RAD (Hercules CA EE UU) El Brilliant II SYBRreg Green QPCR Master
Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara CA EE UU) El
Trisure se obtuvo de Bioline Los cebadores se obtuvieron de Eurofins
Biolab SLU (Barcelona Espantildea) Los sets de TNF- IL-1 e IL-6
humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone Besanccedilon Francia)
Preparacioacuten de los extractos de hojas de C aconitifolius
Las hojas se secaron durante 24 h en un secador con flujo de aire
caliente a una temperatura de 40 ordmC y despueacutes se pulverizaron en un
molino Cyclotec adaptando una malla de 05 mm Seguidamente se
efectuaron las extracciones soacutelido-liacutequido no secuencial en una
proporcioacuten de 110 (pv) a temperatura ambiente con agua etanol
acetona acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y hexano por maceracioacuten durante
48 h Los extractos se filtraron empleando papel de filtro Nordm 5 (11) Las
soluciones filtradas se concentraron a presioacuten reducida Finalmente se
congelaron liofilizaron y almacenaron a 4 ordmC protegidas de la luz hasta
su posterior anaacutelisis
Anaacutelisis de los compuestos bioactivos de extractos de C
aconitifolius con potencial antioxidante y antinflamatorio
Fenoles totales
Los fenoles totales se determinaron siguiendo la metodologiacutea modificada
de George et al (12) utilizando Folin-Ciocalteu y aacutecido gaacutelico como
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
aconitifolius pueden usarse como coadyuvante en la prevencioacuten de las
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo y la inflamacioacuten tales
como las ECNT
Objetivo se evaluoacute la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro
de los compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C
aconitifolius
Meacutetodos se determinoacute el contenido de fenoles flavonoides flavanonas
e hidroflavonoles El potencial antioxidante se determinoacute con los ensayos
de 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo (DPPH) aacutecido 22-azinobis (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfoacutenico) (ABTS) y la actividad inhibitoria de la
enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Para la actividad
antinflamatoria se utilizaron la reaccioacuten en cadena de la polimerasa
(PCR) cuantitativa en tiempo real y el ensayo por inmunoabsorcioacuten
ligado a enzimas (ELISA) en macroacutefagos diferenciados de monocitos
THP-1 y estimulados con lipopolisacaacuterido (LPS)
Resultados el extracto acuoso registroacute el mayor contenido de fenoles
(7061 007 g100 g de extracto) y el extracto etanoacutelico registroacute el
mayor contenido de flavonoides (4776 484 g100 g de extracto)
flavanonas y dihidroflavonoles (7010 729 g100 g de extracto) El
extracto acetoacutenico registroacute la mayor inhibicioacuten del radical DPPH (4985 plusmn
530) mientras que el etanoacutelico presentoacute la mayor inhibicioacuten del radical
ABTS (4101 plusmn 381) Los extractos etanoacutelico y acuoso inhibieron la
ECA El extracto etanoacutelico tuvo la mayor actividad antinflamatoria al
reducir la expresioacuten geacutenica de TNF- en un 3978 y la de IL-6 en un
9781 y su produccioacuten en un 46 y un 4838 respectivamente
Conclusiones los extractos mostraron in vitro su potencial antioxidante
y antinflamatorio por su contenido en compuestos bioactivos
Palabras clave C aconitifolius Extractos Antioxidantes
Antinflamatorios
ABSTRACT
Introduction noncommunicable diseases (NCDs) are the main cause of
death worldwide Secondary metabolites from plant sources such as
Cnidoscolus aconitifolius may be used as adjuvants in the prevention of
diseases related to oxidative stress and inflammation such as NCDs
Objective the in vitro antioxidant and anti-inflammatory activities
associated with biologically active compounds in C aconitifolius extracts
were evaluated
Method the contents of phenols flavonoids flavonones and
hydroflavonoles were determined The potential antioxidant activity was
determined with 11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 22prime-Azino-
bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assays and
angiotensin-converting enzyme (ACE) activity For anti-inflammatory
activity quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) tests were used in macrophages derived from THP-1 monocytes
and stimulated with LPS
Results the aqueous extract recorded the highest phenolic content
(7061 007 g100 g of extract) and the ethanolic extract registered
the highest content in flavonoids (4776 484 g100 g of extract)
flavonones and dihydroflavonoles (7010 729 g100 g of extract) The
acetone extract obtained the highest DPPH inhibition (4985 plusmn 530)
while the ethanolic extract showed the highest ABTS inhibition (4101 plusmn
381) The etanolic and aqueous extracts had the highest ACE
inhibition The ethanolic extract had the highest anti-inflammatory
activity decreasing gene expression for TNF- by 3978 and for IL-6 by
9781 and their production by 46 and 4838 respectively in
macrophages stimulated with LPS
Conclusion these extracts demonstrated in vitro their antioxidant and
anti-inflammatory potential due to their content of bioactive compounds
Keywords C aconitifolius Extracts Antioxidant Anti-inflammatory
INTRODUCCIOacuteN
Las enfermedades croacutenicas no transmisibles (ECNT) como las
enfermedades cardiovasculares el caacutencer y la diabetes son la principal
causa de muerte en todo el mundo El binomio comuacuten que incrementa el
desarrollo de algunas de las ECNT son la sobreproduccioacuten de radicales
libres (RL) y la respuesta inflamatoria croacutenica (1) El aumento de los RL
que no son neutralizados por los antioxidantes endoacutegenos desencadena
actividades bioloacutegicas importantes toda vez que dichos RL reaccionan
con macromoleacuteculas constituyentes de ceacutelulas y tejidos como
carbohidratos liacutepidos proteiacutenas y ADN (23) Lo anterior provoca
necrosis diseminando residuos celulares en la sangre y produciendo
maacutes RL y en consecuencia la activacioacuten de la respuesta inflamatoria
(4)
La inflamacioacuten es una respuesta inmunitaria natural durante las
infecciones o las lesiones Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante
un tiempo prolongado se produce un aumento de las moleacuteculas de
adhesioacuten los RL y la produccioacuten de citoquinas proinflamatorias (IL-1 IL-
6 TNF-) (5) Los monocitos forman parte del sistema inmune
inespeciacutefico cuya funcioacuten es la eliminacioacuten de desechos celulares el
reconocimiento de lo ajeno al organismo la defensa inespeciacutefica del
mismo la reparacioacuten e inflamacioacuten de los tejidos y el enlace con el
sistema linfoide maacutes especiacutefico En condiciones de normalidad los
monocitos pasaraacuten de la meacutedula oacutesea a la circulacioacuten sanguiacutenea y de
esta a los tejidos donde se diferenciaraacuten en macroacutefagos intersticiales
Los macroacutefagos pueden activarse claacutesicamente liberando citoquinas
proinflamatorias y RL o alternativamente liberando moleacuteculas
antinflamatorias como la IL-10 y participando funcionalmente en la
reparacioacuten del tejido el reconocimiento antigeacutenico y la curacioacuten de
heridas (6) Por lo tanto la liacutenea celular monociacutetica THP-1 representa un
sistema modelo apropiado para el estudio de la respuesta inmune
Compuestos tales como los flavonoides fenoles flavanonas y
dihidroflavanonas provenientes de fuentes vegetales pueden disminuir
los efectos del estreacutes oxidativo y de la inflamacioacuten croacutenica (78) En este
sentido C aconitifolius (chaya) es una planta endeacutemica de la peniacutensula
de Yucataacuten Meacutexico cuyas hojas se consumen en platillos tradicionales y
se usan tambieacuten como tratamiento de enfermedades de origen
inflamatorio (910) Estudios de los extractos de la hoja han demostrado
una actividad similar a la indometacina en modelos de edema plantar y
auricular (1011) Sin embargo no existen resultados sobre el efecto de
dichos extractos sobre los biomarcadores de la inflamacioacuten como el TNF-
la IL-6 y la IL-1 Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue
evaluar la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de los
compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C aconitifolius
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Las hojas de C aconitifolius ((Mill) IM Johnst) se recolectaron en la
Quinta los Achiotes Timucuy Yucataacuten Meacutexico La identificacioacuten de la
planta se llevoacute a cabo por el Dr Joseacute Luis Tapia Muntildeoz en el herbario del
Centro de Investigaciones del Estado de Yucataacuten (CICY) con el nuacutemero
de folio 69489 Se utilizaron los reactivos de Folin-Ciocalteu carbonato
de sodio (NaCO3) aacutecido gaacutelico nitrito de sodio (NaNO2) hidroacutexido de
sodio (NaOH) cloruro de aluminio hexahidratado (AlCl36H2O) catequina
24-dinitrofenil hidracina aacutecido sulfuacuterico (H2SO4) metanol hidroacutexido de
potasio (KOH) naringenina aacutecido 22-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-
sulfoacutenico (ABTS) acetato de sodio (CH3COONa) aacutecido aceacutetico
(CH3COOH) peroacutexido de hidrogeno (H2O2) 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo
(DPPH) etanol enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Tris-Base
cloruro de sodio (NaCl) aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) bromuro de 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25-
difeniltetrazolio (MTT) forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil
sulfoacutexido (DMSO) Se utilizaron ceacutelulas de monocitos THP-1 (ATCCreg
Nuacutemero TIB-202TM) El kit de siacutentesis de ADNc iScrip cDNA se obtuvo de
BIO-RAD (Hercules CA EE UU) El Brilliant II SYBRreg Green QPCR Master
Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara CA EE UU) El
Trisure se obtuvo de Bioline Los cebadores se obtuvieron de Eurofins
Biolab SLU (Barcelona Espantildea) Los sets de TNF- IL-1 e IL-6
humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone Besanccedilon Francia)
Preparacioacuten de los extractos de hojas de C aconitifolius
Las hojas se secaron durante 24 h en un secador con flujo de aire
caliente a una temperatura de 40 ordmC y despueacutes se pulverizaron en un
molino Cyclotec adaptando una malla de 05 mm Seguidamente se
efectuaron las extracciones soacutelido-liacutequido no secuencial en una
proporcioacuten de 110 (pv) a temperatura ambiente con agua etanol
acetona acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y hexano por maceracioacuten durante
48 h Los extractos se filtraron empleando papel de filtro Nordm 5 (11) Las
soluciones filtradas se concentraron a presioacuten reducida Finalmente se
congelaron liofilizaron y almacenaron a 4 ordmC protegidas de la luz hasta
su posterior anaacutelisis
Anaacutelisis de los compuestos bioactivos de extractos de C
aconitifolius con potencial antioxidante y antinflamatorio
Fenoles totales
Los fenoles totales se determinaron siguiendo la metodologiacutea modificada
de George et al (12) utilizando Folin-Ciocalteu y aacutecido gaacutelico como
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
ABSTRACT
Introduction noncommunicable diseases (NCDs) are the main cause of
death worldwide Secondary metabolites from plant sources such as
Cnidoscolus aconitifolius may be used as adjuvants in the prevention of
diseases related to oxidative stress and inflammation such as NCDs
Objective the in vitro antioxidant and anti-inflammatory activities
associated with biologically active compounds in C aconitifolius extracts
were evaluated
Method the contents of phenols flavonoids flavonones and
hydroflavonoles were determined The potential antioxidant activity was
determined with 11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 22prime-Azino-
bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assays and
angiotensin-converting enzyme (ACE) activity For anti-inflammatory
activity quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) tests were used in macrophages derived from THP-1 monocytes
and stimulated with LPS
Results the aqueous extract recorded the highest phenolic content
(7061 007 g100 g of extract) and the ethanolic extract registered
the highest content in flavonoids (4776 484 g100 g of extract)
flavonones and dihydroflavonoles (7010 729 g100 g of extract) The
acetone extract obtained the highest DPPH inhibition (4985 plusmn 530)
while the ethanolic extract showed the highest ABTS inhibition (4101 plusmn
381) The etanolic and aqueous extracts had the highest ACE
inhibition The ethanolic extract had the highest anti-inflammatory
activity decreasing gene expression for TNF- by 3978 and for IL-6 by
9781 and their production by 46 and 4838 respectively in
macrophages stimulated with LPS
Conclusion these extracts demonstrated in vitro their antioxidant and
anti-inflammatory potential due to their content of bioactive compounds
Keywords C aconitifolius Extracts Antioxidant Anti-inflammatory
INTRODUCCIOacuteN
Las enfermedades croacutenicas no transmisibles (ECNT) como las
enfermedades cardiovasculares el caacutencer y la diabetes son la principal
causa de muerte en todo el mundo El binomio comuacuten que incrementa el
desarrollo de algunas de las ECNT son la sobreproduccioacuten de radicales
libres (RL) y la respuesta inflamatoria croacutenica (1) El aumento de los RL
que no son neutralizados por los antioxidantes endoacutegenos desencadena
actividades bioloacutegicas importantes toda vez que dichos RL reaccionan
con macromoleacuteculas constituyentes de ceacutelulas y tejidos como
carbohidratos liacutepidos proteiacutenas y ADN (23) Lo anterior provoca
necrosis diseminando residuos celulares en la sangre y produciendo
maacutes RL y en consecuencia la activacioacuten de la respuesta inflamatoria
(4)
La inflamacioacuten es una respuesta inmunitaria natural durante las
infecciones o las lesiones Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante
un tiempo prolongado se produce un aumento de las moleacuteculas de
adhesioacuten los RL y la produccioacuten de citoquinas proinflamatorias (IL-1 IL-
6 TNF-) (5) Los monocitos forman parte del sistema inmune
inespeciacutefico cuya funcioacuten es la eliminacioacuten de desechos celulares el
reconocimiento de lo ajeno al organismo la defensa inespeciacutefica del
mismo la reparacioacuten e inflamacioacuten de los tejidos y el enlace con el
sistema linfoide maacutes especiacutefico En condiciones de normalidad los
monocitos pasaraacuten de la meacutedula oacutesea a la circulacioacuten sanguiacutenea y de
esta a los tejidos donde se diferenciaraacuten en macroacutefagos intersticiales
Los macroacutefagos pueden activarse claacutesicamente liberando citoquinas
proinflamatorias y RL o alternativamente liberando moleacuteculas
antinflamatorias como la IL-10 y participando funcionalmente en la
reparacioacuten del tejido el reconocimiento antigeacutenico y la curacioacuten de
heridas (6) Por lo tanto la liacutenea celular monociacutetica THP-1 representa un
sistema modelo apropiado para el estudio de la respuesta inmune
Compuestos tales como los flavonoides fenoles flavanonas y
dihidroflavanonas provenientes de fuentes vegetales pueden disminuir
los efectos del estreacutes oxidativo y de la inflamacioacuten croacutenica (78) En este
sentido C aconitifolius (chaya) es una planta endeacutemica de la peniacutensula
de Yucataacuten Meacutexico cuyas hojas se consumen en platillos tradicionales y
se usan tambieacuten como tratamiento de enfermedades de origen
inflamatorio (910) Estudios de los extractos de la hoja han demostrado
una actividad similar a la indometacina en modelos de edema plantar y
auricular (1011) Sin embargo no existen resultados sobre el efecto de
dichos extractos sobre los biomarcadores de la inflamacioacuten como el TNF-
la IL-6 y la IL-1 Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue
evaluar la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de los
compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C aconitifolius
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Las hojas de C aconitifolius ((Mill) IM Johnst) se recolectaron en la
Quinta los Achiotes Timucuy Yucataacuten Meacutexico La identificacioacuten de la
planta se llevoacute a cabo por el Dr Joseacute Luis Tapia Muntildeoz en el herbario del
Centro de Investigaciones del Estado de Yucataacuten (CICY) con el nuacutemero
de folio 69489 Se utilizaron los reactivos de Folin-Ciocalteu carbonato
de sodio (NaCO3) aacutecido gaacutelico nitrito de sodio (NaNO2) hidroacutexido de
sodio (NaOH) cloruro de aluminio hexahidratado (AlCl36H2O) catequina
24-dinitrofenil hidracina aacutecido sulfuacuterico (H2SO4) metanol hidroacutexido de
potasio (KOH) naringenina aacutecido 22-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-
sulfoacutenico (ABTS) acetato de sodio (CH3COONa) aacutecido aceacutetico
(CH3COOH) peroacutexido de hidrogeno (H2O2) 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo
(DPPH) etanol enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Tris-Base
cloruro de sodio (NaCl) aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) bromuro de 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25-
difeniltetrazolio (MTT) forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil
sulfoacutexido (DMSO) Se utilizaron ceacutelulas de monocitos THP-1 (ATCCreg
Nuacutemero TIB-202TM) El kit de siacutentesis de ADNc iScrip cDNA se obtuvo de
BIO-RAD (Hercules CA EE UU) El Brilliant II SYBRreg Green QPCR Master
Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara CA EE UU) El
Trisure se obtuvo de Bioline Los cebadores se obtuvieron de Eurofins
Biolab SLU (Barcelona Espantildea) Los sets de TNF- IL-1 e IL-6
humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone Besanccedilon Francia)
Preparacioacuten de los extractos de hojas de C aconitifolius
Las hojas se secaron durante 24 h en un secador con flujo de aire
caliente a una temperatura de 40 ordmC y despueacutes se pulverizaron en un
molino Cyclotec adaptando una malla de 05 mm Seguidamente se
efectuaron las extracciones soacutelido-liacutequido no secuencial en una
proporcioacuten de 110 (pv) a temperatura ambiente con agua etanol
acetona acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y hexano por maceracioacuten durante
48 h Los extractos se filtraron empleando papel de filtro Nordm 5 (11) Las
soluciones filtradas se concentraron a presioacuten reducida Finalmente se
congelaron liofilizaron y almacenaron a 4 ordmC protegidas de la luz hasta
su posterior anaacutelisis
Anaacutelisis de los compuestos bioactivos de extractos de C
aconitifolius con potencial antioxidante y antinflamatorio
Fenoles totales
Los fenoles totales se determinaron siguiendo la metodologiacutea modificada
de George et al (12) utilizando Folin-Ciocalteu y aacutecido gaacutelico como
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Conclusion these extracts demonstrated in vitro their antioxidant and
anti-inflammatory potential due to their content of bioactive compounds
Keywords C aconitifolius Extracts Antioxidant Anti-inflammatory
INTRODUCCIOacuteN
Las enfermedades croacutenicas no transmisibles (ECNT) como las
enfermedades cardiovasculares el caacutencer y la diabetes son la principal
causa de muerte en todo el mundo El binomio comuacuten que incrementa el
desarrollo de algunas de las ECNT son la sobreproduccioacuten de radicales
libres (RL) y la respuesta inflamatoria croacutenica (1) El aumento de los RL
que no son neutralizados por los antioxidantes endoacutegenos desencadena
actividades bioloacutegicas importantes toda vez que dichos RL reaccionan
con macromoleacuteculas constituyentes de ceacutelulas y tejidos como
carbohidratos liacutepidos proteiacutenas y ADN (23) Lo anterior provoca
necrosis diseminando residuos celulares en la sangre y produciendo
maacutes RL y en consecuencia la activacioacuten de la respuesta inflamatoria
(4)
La inflamacioacuten es una respuesta inmunitaria natural durante las
infecciones o las lesiones Cuando la inflamacioacuten se mantiene durante
un tiempo prolongado se produce un aumento de las moleacuteculas de
adhesioacuten los RL y la produccioacuten de citoquinas proinflamatorias (IL-1 IL-
6 TNF-) (5) Los monocitos forman parte del sistema inmune
inespeciacutefico cuya funcioacuten es la eliminacioacuten de desechos celulares el
reconocimiento de lo ajeno al organismo la defensa inespeciacutefica del
mismo la reparacioacuten e inflamacioacuten de los tejidos y el enlace con el
sistema linfoide maacutes especiacutefico En condiciones de normalidad los
monocitos pasaraacuten de la meacutedula oacutesea a la circulacioacuten sanguiacutenea y de
esta a los tejidos donde se diferenciaraacuten en macroacutefagos intersticiales
Los macroacutefagos pueden activarse claacutesicamente liberando citoquinas
proinflamatorias y RL o alternativamente liberando moleacuteculas
antinflamatorias como la IL-10 y participando funcionalmente en la
reparacioacuten del tejido el reconocimiento antigeacutenico y la curacioacuten de
heridas (6) Por lo tanto la liacutenea celular monociacutetica THP-1 representa un
sistema modelo apropiado para el estudio de la respuesta inmune
Compuestos tales como los flavonoides fenoles flavanonas y
dihidroflavanonas provenientes de fuentes vegetales pueden disminuir
los efectos del estreacutes oxidativo y de la inflamacioacuten croacutenica (78) En este
sentido C aconitifolius (chaya) es una planta endeacutemica de la peniacutensula
de Yucataacuten Meacutexico cuyas hojas se consumen en platillos tradicionales y
se usan tambieacuten como tratamiento de enfermedades de origen
inflamatorio (910) Estudios de los extractos de la hoja han demostrado
una actividad similar a la indometacina en modelos de edema plantar y
auricular (1011) Sin embargo no existen resultados sobre el efecto de
dichos extractos sobre los biomarcadores de la inflamacioacuten como el TNF-
la IL-6 y la IL-1 Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue
evaluar la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de los
compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C aconitifolius
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Las hojas de C aconitifolius ((Mill) IM Johnst) se recolectaron en la
Quinta los Achiotes Timucuy Yucataacuten Meacutexico La identificacioacuten de la
planta se llevoacute a cabo por el Dr Joseacute Luis Tapia Muntildeoz en el herbario del
Centro de Investigaciones del Estado de Yucataacuten (CICY) con el nuacutemero
de folio 69489 Se utilizaron los reactivos de Folin-Ciocalteu carbonato
de sodio (NaCO3) aacutecido gaacutelico nitrito de sodio (NaNO2) hidroacutexido de
sodio (NaOH) cloruro de aluminio hexahidratado (AlCl36H2O) catequina
24-dinitrofenil hidracina aacutecido sulfuacuterico (H2SO4) metanol hidroacutexido de
potasio (KOH) naringenina aacutecido 22-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-
sulfoacutenico (ABTS) acetato de sodio (CH3COONa) aacutecido aceacutetico
(CH3COOH) peroacutexido de hidrogeno (H2O2) 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo
(DPPH) etanol enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Tris-Base
cloruro de sodio (NaCl) aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) bromuro de 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25-
difeniltetrazolio (MTT) forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil
sulfoacutexido (DMSO) Se utilizaron ceacutelulas de monocitos THP-1 (ATCCreg
Nuacutemero TIB-202TM) El kit de siacutentesis de ADNc iScrip cDNA se obtuvo de
BIO-RAD (Hercules CA EE UU) El Brilliant II SYBRreg Green QPCR Master
Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara CA EE UU) El
Trisure se obtuvo de Bioline Los cebadores se obtuvieron de Eurofins
Biolab SLU (Barcelona Espantildea) Los sets de TNF- IL-1 e IL-6
humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone Besanccedilon Francia)
Preparacioacuten de los extractos de hojas de C aconitifolius
Las hojas se secaron durante 24 h en un secador con flujo de aire
caliente a una temperatura de 40 ordmC y despueacutes se pulverizaron en un
molino Cyclotec adaptando una malla de 05 mm Seguidamente se
efectuaron las extracciones soacutelido-liacutequido no secuencial en una
proporcioacuten de 110 (pv) a temperatura ambiente con agua etanol
acetona acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y hexano por maceracioacuten durante
48 h Los extractos se filtraron empleando papel de filtro Nordm 5 (11) Las
soluciones filtradas se concentraron a presioacuten reducida Finalmente se
congelaron liofilizaron y almacenaron a 4 ordmC protegidas de la luz hasta
su posterior anaacutelisis
Anaacutelisis de los compuestos bioactivos de extractos de C
aconitifolius con potencial antioxidante y antinflamatorio
Fenoles totales
Los fenoles totales se determinaron siguiendo la metodologiacutea modificada
de George et al (12) utilizando Folin-Ciocalteu y aacutecido gaacutelico como
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Los macroacutefagos pueden activarse claacutesicamente liberando citoquinas
proinflamatorias y RL o alternativamente liberando moleacuteculas
antinflamatorias como la IL-10 y participando funcionalmente en la
reparacioacuten del tejido el reconocimiento antigeacutenico y la curacioacuten de
heridas (6) Por lo tanto la liacutenea celular monociacutetica THP-1 representa un
sistema modelo apropiado para el estudio de la respuesta inmune
Compuestos tales como los flavonoides fenoles flavanonas y
dihidroflavanonas provenientes de fuentes vegetales pueden disminuir
los efectos del estreacutes oxidativo y de la inflamacioacuten croacutenica (78) En este
sentido C aconitifolius (chaya) es una planta endeacutemica de la peniacutensula
de Yucataacuten Meacutexico cuyas hojas se consumen en platillos tradicionales y
se usan tambieacuten como tratamiento de enfermedades de origen
inflamatorio (910) Estudios de los extractos de la hoja han demostrado
una actividad similar a la indometacina en modelos de edema plantar y
auricular (1011) Sin embargo no existen resultados sobre el efecto de
dichos extractos sobre los biomarcadores de la inflamacioacuten como el TNF-
la IL-6 y la IL-1 Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue
evaluar la actividad antioxidante y antinflamatoria in vitro de los
compuestos bioloacutegicamente activos de extractos de C aconitifolius
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Las hojas de C aconitifolius ((Mill) IM Johnst) se recolectaron en la
Quinta los Achiotes Timucuy Yucataacuten Meacutexico La identificacioacuten de la
planta se llevoacute a cabo por el Dr Joseacute Luis Tapia Muntildeoz en el herbario del
Centro de Investigaciones del Estado de Yucataacuten (CICY) con el nuacutemero
de folio 69489 Se utilizaron los reactivos de Folin-Ciocalteu carbonato
de sodio (NaCO3) aacutecido gaacutelico nitrito de sodio (NaNO2) hidroacutexido de
sodio (NaOH) cloruro de aluminio hexahidratado (AlCl36H2O) catequina
24-dinitrofenil hidracina aacutecido sulfuacuterico (H2SO4) metanol hidroacutexido de
potasio (KOH) naringenina aacutecido 22-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-
sulfoacutenico (ABTS) acetato de sodio (CH3COONa) aacutecido aceacutetico
(CH3COOH) peroacutexido de hidrogeno (H2O2) 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo
(DPPH) etanol enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Tris-Base
cloruro de sodio (NaCl) aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) bromuro de 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25-
difeniltetrazolio (MTT) forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil
sulfoacutexido (DMSO) Se utilizaron ceacutelulas de monocitos THP-1 (ATCCreg
Nuacutemero TIB-202TM) El kit de siacutentesis de ADNc iScrip cDNA se obtuvo de
BIO-RAD (Hercules CA EE UU) El Brilliant II SYBRreg Green QPCR Master
Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara CA EE UU) El
Trisure se obtuvo de Bioline Los cebadores se obtuvieron de Eurofins
Biolab SLU (Barcelona Espantildea) Los sets de TNF- IL-1 e IL-6
humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone Besanccedilon Francia)
Preparacioacuten de los extractos de hojas de C aconitifolius
Las hojas se secaron durante 24 h en un secador con flujo de aire
caliente a una temperatura de 40 ordmC y despueacutes se pulverizaron en un
molino Cyclotec adaptando una malla de 05 mm Seguidamente se
efectuaron las extracciones soacutelido-liacutequido no secuencial en una
proporcioacuten de 110 (pv) a temperatura ambiente con agua etanol
acetona acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y hexano por maceracioacuten durante
48 h Los extractos se filtraron empleando papel de filtro Nordm 5 (11) Las
soluciones filtradas se concentraron a presioacuten reducida Finalmente se
congelaron liofilizaron y almacenaron a 4 ordmC protegidas de la luz hasta
su posterior anaacutelisis
Anaacutelisis de los compuestos bioactivos de extractos de C
aconitifolius con potencial antioxidante y antinflamatorio
Fenoles totales
Los fenoles totales se determinaron siguiendo la metodologiacutea modificada
de George et al (12) utilizando Folin-Ciocalteu y aacutecido gaacutelico como
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
(CH3COOH) peroacutexido de hidrogeno (H2O2) 11‐difenil‐2‐picrilhidrazilo
(DPPH) etanol enzima convertidora de la angiotensina (ACE) Tris-Base
cloruro de sodio (NaCl) aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanil-L-prolina
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) bromuro de 3-(45-dimetiltiazol-2-il)-25-
difeniltetrazolio (MTT) forbol-12 miristato 13-acetato (PMA) y dimetil
sulfoacutexido (DMSO) Se utilizaron ceacutelulas de monocitos THP-1 (ATCCreg
Nuacutemero TIB-202TM) El kit de siacutentesis de ADNc iScrip cDNA se obtuvo de
BIO-RAD (Hercules CA EE UU) El Brilliant II SYBRreg Green QPCR Master
Mix se obtuvo de Agilent Technologies (Santa Clara CA EE UU) El
Trisure se obtuvo de Bioline Los cebadores se obtuvieron de Eurofins
Biolab SLU (Barcelona Espantildea) Los sets de TNF- IL-1 e IL-6
humanos se obtuvieron de Diaclone (Diaclone Besanccedilon Francia)
Preparacioacuten de los extractos de hojas de C aconitifolius
Las hojas se secaron durante 24 h en un secador con flujo de aire
caliente a una temperatura de 40 ordmC y despueacutes se pulverizaron en un
molino Cyclotec adaptando una malla de 05 mm Seguidamente se
efectuaron las extracciones soacutelido-liacutequido no secuencial en una
proporcioacuten de 110 (pv) a temperatura ambiente con agua etanol
acetona acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y hexano por maceracioacuten durante
48 h Los extractos se filtraron empleando papel de filtro Nordm 5 (11) Las
soluciones filtradas se concentraron a presioacuten reducida Finalmente se
congelaron liofilizaron y almacenaron a 4 ordmC protegidas de la luz hasta
su posterior anaacutelisis
Anaacutelisis de los compuestos bioactivos de extractos de C
aconitifolius con potencial antioxidante y antinflamatorio
Fenoles totales
Los fenoles totales se determinaron siguiendo la metodologiacutea modificada
de George et al (12) utilizando Folin-Ciocalteu y aacutecido gaacutelico como
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
estaacutendar Brevemente 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con
500 microL de Folin (110) durante 2 min a temperatura ambiente
Seguidamente se antildeadieron 400 microL de Na2CO3 (75 gl) a una
temperatura de 50 ordmC durante 15 min Por uacuteltimo se dejoacute enfriar a
temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
de 760 nm Los resultados se expresaron como promedios de tres datos
independientes en unidades de gramos de fenoles equivalentes a aacutecido
gaacutelico por cada 100 g de extracto liofilizado
Flavonoides totales
Los flavonoides totales se determinaron con una modificacioacuten de la
metodologiacutea reportada por Lee et al (13) usando catequina como
estaacutendar Para ello 100 microL de muestra o estaacutendar se mezclaron con 30
microL de NaNO2 (5 pv) en 400 microL de agua destilada durante 5 min
Seguidamente se agregaron 30 microL de AlCl36H2O se dejoacute reaccionar
durante 6 min y se antildeadieron 200 microL de NaOH (1M) Finalmente se
antildeadieron 240 microL de agua destilada y se midioacute la absorbancia a una
longitud de onda de 510 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavonoides equivalentes a catequina por 100 g de extracto liofilizado
Flavanonas y dihidroflavonoles
Las flavanonas y dihidroflavonoles se cuantificaron con meacutetodo
modificado de Popova et al (14) Brevemente 250 microL de extracto o
estaacutendar se mezclaron con 500 microL de 24-dinitrofenil-hidracina (1 g de
24-dinitrofenil-hidracina 2 ml de H2SO4 al 96 en 100 ml de metanol) a
una temperatura de 50 ordmC durante 50 min Seguidamente se enfriaron
durante 10 min y se agregaron 25 ml de KOH en metanol al 10 (pv)
Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de la mezcla se antildeadioacute 1 ml de metanol y
se centrifugoacute a 2500 rpm durante 10 min La absorbancia se midioacute a una
longitud de onda de 486 nm Los resultados se expresaron como gramos
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
de flavanonas y dihidroflavonoles equivalentes a naringenina por 100 g
de extracto liofilizado
EFECTO BIOLOacuteGICO IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE C
ACONIFIFOLIUS
Actividad antioxidante
ABTS
El meacutetodo ABTS se basa en la capacidad de los antioxidantes de donar
electrones y neutralizar los radicales ABTS+ (15) Previamente se liberoacute
el radical con una mezcla de tampoacuten de acetato 30 mM a pH de 36
durante 24 h para ello se disolvieron 0246 g de CH3COONa en 100 ml
de agua destilada (reactivo A) luego se tomaron 017 mL de CH3COOH y
se disolvieron en 100 ml de agua destilada (reactivo B) Seguidamente
se mezclaron 75 ml de reactivo A en 925 ml de reactivo B y se ajustoacute el
pH a 36 Posteriormente se preparoacute una solucioacuten de peroacutexido de
hidroacutegeno tomando una aliacutecuota de 278 microL y disolvieacutendola en tampoacuten
de acetato a pH de 36 El radical ABTS+ se liberoacute al disolver 2745 mg
de ABTS en 50 ml de tampoacuten con peroacutexido en condiciones de oscuridad
y refrigeracioacuten durante 24 h Posteriormente se preparoacute una solucioacuten
tampoacuten de acetato de sodio 04 M a pH de 58 y aacutecido aceacutetico para ello
se disolvieron 31 g de CH3COONa en 100 ml de agua destilada (reactivo
C) y 228 ml de CH3COOH en 100 ml de agua destilada (reactivo D) y
posteriormente se mezclaron 94 ml de reactivo C con 6 ml de reactivo
B ajustando el pH a 58 Por uacuteltimo se tomaron 200 microL de tampoacuten de
CH3COONa a pH de 58 y se agregaron a cada pocillo de una placa de 96
pocillos 20 microL del extracto y 20 microL de ABTS+ Los resultados se
expresaron como porcentajes de inhibicioacuten de los radicales ABTS+ en
tres repeticiones independientes
InhibicioacutendelABTS( )=100lowastAtminusAm
A t
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Donde
At = absorbancia del ABTS en el tiempo cero
Am = absorbancia de la muestra con ABTS despueacutes de 10 min de
reaccioacuten
DPPH
El meacutetodo del DPPH se basa en la medicioacuten de la capacidad de los
antioxidantes para reducir el radical DPPH Se agregaron 25 L de
muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se antildeadieron 175 L
de una solucioacuten de DPPH 634 M (16) El decremento de la absorbancia
del DPPH se detectoacute a una longitud de onda de 490 nm Los resultados
se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de radicales libres en tres
repeticiones independientes
Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de la
angiotensina
La actividad inhibitoria de la ECA se determinoacute en los extractos
obtenidos de las hojas de C aconitifolius El anaacutelogo de la angiotensina I
(Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) es hidrolizado por la enzima ECA hasta un
residuo fluorescente (o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly)) que se detecta
por medio de la fluorometriacutea (17) Previamente se prepararon las
muestras de los 6 extractos a las concentraciones de 150 300 450
600 750 y 900 gml La solucioacuten de enzima ECA se preparoacute con una
solucioacuten de glicerol al 50 en tampoacuten Tris-base 300 mM y a pH de 83
Luego se disolvioacute en solucioacuten tampoacuten Tris-base 150 mM y a pH de 83 El
sustrato se preparoacute a una concentracioacuten 045 mM en solucioacuten tampoacuten
Tris-base 150 mM y a pH de 83 con 1125 M de cloruro de sodio Se
mezclaron 40 L de muestra con 40 L de enzima y posteriormente se
antildeadieron 160 L de sustrato Como blanco se utilizoacute agua Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
resultados se expresaron como porcentaje de inhibicioacuten de la ECA en
tres muestras independientes
inhibicioacuten ( )=100x(BaminusBb)minus(MaminusMb)
(BaminusBb)
Donde
Ba = blanco con la enzima
Bb = blanco sin la enzima
Ma = muestra con la enzima
Mb = muestra sin la enzima
Actividad antiinflamatoria de los extractos de C aconitifolius en
monocitos THP-1
Cultivo celular y tratamientos
La liacutenea celular monociacutetica humana THP-1 se cultivoacute en suspensioacuten
utilizando como medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640
suplementado con un 1 de penicilinaestreptomicina (PS vv) y un
10 de suero fetal bovino (SFB vv) inactivado por calor Los monocitos
se diferenciaron y polarizaron claacutesicamente en macroacutefagos M1 por
incubacioacuten con PMA (100 nmoll) durante 4 diacuteas Las ceacutelulas THP-1
estimuladas con PMA (denominadas macroacutefagos derivados de THP-1) se
expusieron al medio RPMI (suplementado con un 1 de SFB vv)
durante 24 h y despueacutes se trataron con los extractos acuosos y
etanoacutelicos elegidos a una concentracioacuten de 25 50 y 100 gml en medio
RPMI (1 de SFB vv) durante 24 h
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinoacute en macroacutefagos derivados de
monocitos THP-1 tratados con los extractos etanoacutelicos y acuosos de C
aconitifolius mediante el ensayo de MTT Para ello se diferenciaron 5 x
104 monocitos THP-1 en macroacutefagos con PMA (100 nM) durante 4 diacuteas
Luego los macroacutefagos se incubaron a 37 ordmC con los extractos etanoacutelicos
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
y acuosos a una concentracioacuten final de 10 25 50 100 250 y 500 gml
durante 24 h Seguidamente se antildeadieron 100 L de MTT (5 mgml) en
cada pocillo y se incubaron las ceacutelulas a 37 ordmC durante 3 h Las ceacutelulas
viables redujeron el MTT a cristales de formazaacuten por efecto de la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa Para detectar y cuantificar el
formazaacuten a una longitud de onda de 540 nm se eliminoacute el medio de los
pocillos y se disolvioacute en DMSO (100 L)
Extraccioacuten de mRNA y anaacutelisis mediante qPCR-RT
Los niveles de mRNA de los genes especiacuteficos se determinaron usando
un sistema de PCR en tiempo real El mRNA total se extrajo de los
macroacutefagos derivados de THP-1 usando el reactivo Trisure (Bioline a
Meridiam Life Science Company) seguacuten las instrucciones del fabricante
La calidad del mRNA se midioacute con la relacioacuten A260A280 determinada en un
espectrofotoacutemetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific Madrid
Espantildea)
Se sometioacute 1 g de mRNA a transcripcioacuten inversa para obtener el cDNA
de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de siacutentesis de cDNA
(BIO-RAD) Por cada reaccioacuten en cadena de la polimerasa cuantitativa
(QPCR) se mezclaron 10 ng de cDNA de molde con Master Mix Brilliant
SYBR Green QPCR los oligonucleoacutetidos de los genes que codifican el
TNF- la IL-6 y la IL-1β y el gen de la hipoxantina-fosforribosil-
transferasa (HPRT) usado como gen constitutivo (Tabla I) Las reacciones
de amplificacioacuten se realizaron por triplicado La cuantificacioacuten de los
cambios de expresioacuten del mRNA de los genes en estudio se calculoacute
usando el meacutetodo estaacutendar Los resultados de la expresioacuten geacutenica se
normalizaron con el gen de referencia (HPRT)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Cuantificacioacuten de biomarcadores de la inflamacioacuten
Las concentraciones de citoquinas (TNF- IL-6 e IL-1) en los
sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron con el kit comercial
(Diaclone) del ensayo de inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas (ELISA)
siguiendo las instrucciones del fabricante La concentracioacuten de
citoquinas se expresoacute en pgml y se calculoacute a partir de las curvas de
calibracioacuten de la dilucioacuten en serie de estaacutendares recombinantes
humanos en cada ensayo
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Los resultados del contenido total de fenoles se analizaron con un
ANOVA de una sola viacutea y una prueba de Tukey a posteriori con un nivel
de significacioacuten de p lt 005 Los resultados de la actividad antioxidante
y antinflamatoria se obtuvieron mediante un anaacutelisis de la varianza
multifactorial Para diferenciar las medias de los tratamientos entre la
media del control se utilizoacute un anaacutelisis de Dunnett a posteriori mientras
que para la diferencia entre tratamientos se utilizoacute una prueba de Tukey
a posteriori con un nivel de significacioacuten de p lt 005 El anaacutelisis
estadiacutestico se llevoacute a cabo con el software Statgraphics Centurioacuten XV
RESULTADOS
Composicioacuten bioactiva de los extractos de C aconitifolius con
potencial antioxidante y antinflamatorio
El contenido de fenoles de los extractos obtenidos por maceracioacuten con
diferentes solventes se registroacute en un rango de 1044 454 a 7061
007 g100 g de extracto en base seca para los extractos con eacuteter
dietiacutelico y agua respectivamente Los resultados presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el extracto
acuoso el etanoacutelico y el grupo homogeacuteneo (acetoacutenico acetato de etilo
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
eacuteter dietiacutelico y hexano) El contenido de flavonoides fue de 445 047 a
4776 484 g100 g de extracto obtenido con agua y etanol
respectivamente Los resultados mostraron diferencias estadiacutesticamente
significativas (p lt 005) entre el extracto acuoso el etanoacutelico y el
acetoacutenico En los extractos obtenidos con acetato de etilo eacuteter dietiacutelico y
hexano no se detectaron flavonoides El contenido de flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos se registroacute entre 5279 421 y 7010
729 g100 g de extracto obtenido con hexano y etanol
respectivamente (Tabla II) Los resultados presentaron diferencias
estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre el etanol el grupo
homogeacuteneo conformado por acetona acetato de etilo y eacuteter dietiacutelico y el
grupo homogeacuteneo conformado por agua y hexano
Evaluacioacuten de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius
Los extractos de C aconitifolius registraron actividad antioxidante a las
concentraciones de 150 a 900 gml seguacuten lo determinado por el
ensayo DPPH La maacutexima actividad antioxidante se obtuvo con el
extracto de acetona con un 4985 53 de inhibicioacuten En el anaacutelisis de
la varianza multifactorial se encontraron evidencias de una diferencia
estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en la interaccioacuten de los
extractos con las concentraciones evaluadas (Fig 1a)
La capacidad antioxidante de los extractos de C aconitifolius
determinada por el ensayo ABTS mostroacute una relacioacuten dosis-dependencia
con respecto a las concentraciones evaluadas la maacutexima actividad
antioxidante se obtuvo con el extracto etanoacutelico con un 4102 318
de inhibicioacuten En el anaacutelisis de la varianza multifactorial se encontroacute
evidencia de una diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) en
la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones evaluadas (Fig
1b)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Los extractos de C aconitifolius tuvieron efecto sobre la actividad de la
ECA en un rango de concentracioacuten de 150 a 900 gml (Fig 2) Los
resultados mostraron inhibiciones del 1622 029 y 7279 436
para los extractos acetoacutenicos y acuosos respectivamente Asiacute los
valores de concentracioacuten miacutenima inhibitoria del 50 (IC50) de dichos
extractos se encontraron en un rango situado entre 37518 y 85067
gml correspondientes al extracto acuoso y hexaacutenico respectivamente
Los resultados mostraron una diferencia estadiacutesticamente significativa (p
lt 005) en la interaccioacuten de los extractos con las concentraciones
probadas siendo el extracto acuoso el que registroacute la mayor actividad
bioloacutegica
Evaluacioacuten de la actividad antiinflamatoria de los extractos de
C aconitifolius sobre los macroacutefagos THP-1
La viabilidad celular de los macroacutefagos diferenciados de monocitos THP-
1 tratados con los extractos acuosos y etanoacutelicos mostroacute una diferencia
estadiacutestica significativa (p lt 005) entre los extractos y las
concentraciones evaluadas (Fig 3) El extracto acuoso mostroacute una
viabilidad celular menor del 80 a excepcioacuten de la obtenida a las
concentraciones maacutes bajas de 10 y 25 gml registraacutendose una
diferencia estadiacutesticamente significativa entre los tratamientos con una
p lt 005 Por otro lado los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en
el extracto etanoacutelico fueron superiores a los registrados con el extracto
acuoso llegando a ser superiores en la mayoriacutea de los casos al 90
excepto a 500 gml donde la viabilidad parece que desciende
ligeramente a valores inferiores al 75 A este respecto los valores maacutes
bajos de viabilidad celular del extracto acuoso podriacutean atribuirse a la
presencia de compuestos citotoacutexicos tales como el copaeno y el aacutecido
cianhiacutedrico (HCN) este uacuteltimo de mayor solubilidad en agua (7)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Las ceacutelulas tratadas con los extractos etanoacutelicos y acuosos presentaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) en la expresioacuten de
los genes que codifican las interleucinas Asimismo se observaron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) entre los extractos
a las concentraciones evaluadas (25 50 y 100 gml) (Fig 4) Las ceacutelulas
tratadas con el extracto acuoso fueron las que registraron la mayor
expresioacuten del mRNA que codifica el TNF- con respecto a las ceacutelulas
estimuladas con LPS El extracto etanoacutelico presentoacute una disminucioacuten
significativa de la expresioacuten de mRNA con relacioacuten dosis-respuesta
alcanzaacutendose una disminucioacuten de maacutes de un 40 con respecto a la
expresioacuten de las ceacutelulas estimuladas (Fig 4a) Las ceacutelulas tratadas con
los extractos acuosos parecen inducir la represioacuten geacutenica de IL-1
aunque no lo hicieron de forma significativa El extracto etanoacutelico obtuvo
una disminucioacuten significativa de la expresioacuten geacutenica existiendo una
relacioacuten concentracioacuten-respuesta que llegoacute al 7371 con la
concentracioacuten de 100 gml (Fig 4b) La expresioacuten del mRNA que
codifica la IL-6 se redujo significativamente tanto para el extracto acuoso
como para el etanoacutelico encontraacutendose tambieacuten una diferencia
estadiacutesticamente significativa entre las distintas concentraciones del
estudio (Fig 4c) Las ceacutelulas tratadas con el extracto acuoso redujeron
hasta un 8392 la expresioacuten geacutenica de la IL-6 con respecto a las ceacutelulas
tratadas con LPS Por otro lado las ceacutelulas tratadas con 100 microgml de
extracto etanoacutelico redujeron en maacutes de un 97 la expresioacuten de IL-6 con
respecto a las ceacutelulas tratadas con LPS
Las ceacutelulas tratadas con extractos acuosos y etanoacutelicos de C
aconitifolius registraron diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt
005) en la concentracioacuten de citoquinas proinflamatorias liberadas en
comparacioacuten con las ceacutelulas tratadas con LPS Ademaacutes se encontroacute una
diferencia estadiacutesticamente significativa (p lt 005) entre los
tratamientos a las diferentes concentraciones evaluadas Ambos
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
extractos redujeron significativamente el TNF- (Fig 5a) El extracto
acuoso mostroacute una disminucioacuten del 48 a una concentracioacuten de 100
gml mientas que el extracto etanoacutelico registroacute una disminucioacuten del 46
a la misma concentracioacuten Respecto a la IL-1 las ceacutelulas tratadas con
extractos acuosos de C aconitolius registraron una concentracioacuten de
dicha interleucina mayor que la de las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5b)
Sin embargo las ceacutelulas tratadas con el extracto etanoacutelico no mostraron
diferencias estadiacutesticamente significativas (p lt 005) con respecto a las
tratadas con LPS a todas las concentraciones del estudio En lo referente
a la IL-6 el extracto etanoacutelico registroacute porcentajes de disminucioacuten de
hasta un 4838 con respecto al LPS mientras que el extracto acuoso
no mostroacute diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) con respecto
a las ceacutelulas tratadas con LPS (Fig 5c)
DISCUSIOacuteN
El contenido de fenoles flavonoides flavanonas y dihidroflavonoles en
los vegetales contribuye a las propiedades medicinales de estos debido
a su capacidad antioxidante y reductora del estreacutes oxidativo implicado
en diversas patologiacuteas de origen inflamatorio (18) Dichos compuestos
polifenoacutelicos estaacuten constituidos por uno o maacutes anillos aromaacuteticos con
uno o maacutes grupos OH de estos grupos OH se pueden neutralizar los
radicales libres por transferencia de electrones o por hidroacutegenos (19)
Por otro lado los terpenoides como el caroteno la amirina y la
moretenona pueden tener grupos OH y dobles enlaces capaces de
neutralizar los radicales libres (20)
La inhibicioacuten del radical DPPH registrada en este estudio fue mayor que
la reportada con extractos de tallos de C aconitifolius (1539) a una
concentracioacuten de 1000 gml (21) En otro estudio realizado sobre
extractos metanoacutelicos de las hojas a una concentracioacuten de 5000 gml
se reportoacute una actividad antioxidante del 455 y 94 de inhibicioacuten del
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
radical DPPH y ABTS respectivamente (16) La evaluacioacuten de la
actividad antioxidante del extracto acuoso de hojas frescas de C
aconitifolius registroacute un 50 de inhibicioacuten del DPPH (22) Por otra parte
en el estudio de la actividad antioxidante de los extractos de C
aconitifolius obtenidos con etanol acetato de etilo y hexano en las
partes aeacutereas estos inhibieron el 55 de los radicales DPPH a una
concentracioacuten de 1000 gml (23) Lo anterior pone de manifiesto que
las diferencias de actividad pueden atribuirse a factores tales como el
origen de la materia prima la estacioacuten del antildeo en que se recolecta el
contenido de metabolitos secundarios etc
La ECA es una metalopeptidasa que contiene zinc en su sitio activo y
convierte el decapeacuteptido antiotensina I en un octapeacuteptido denominado
angiotensina II en el sistema renina-angiotensina-aldosterona (24) Dicho
octapeacuteptido aumenta la presioacuten arterial y promueve la retencioacuten de
sodio y agua en el cuerpo (42526) Los extractos de C aconitifolius
inhibieron la actividad de dicha enzima de una manera similar a la
reportada con extractos obtenidos de la planta Ipomoea reniformis (IC50
de 422 gml) esto puede atribuirse a la capacidad quelante de los
grupos hidroxilos de los fenoles presentes en los extractos (2527) Por
otra parte diversos estudios ponen de manifiesto que los compuestos
terpenoides presentes en los extractos no polares de hojas de chaya
pueden inhibir la actividad de la ECA (28) A este respecto los
compuestos fenoacutelicos y terpenoides obtenidos de fuentes vegetales
inhiben de forma competitiva la actividad de la ECA (27)
Estudios realizados por Velaacutesquez y cols (29) determinaron el efecto
citotoacutexico de los extractos acuosos y etanoacutelicos de hojas de C
aconitifolius en larvas de Artemia salina y observaron que no hubo
efecto citotoacutexico al no superarse la dosis letal media (DL50) a una
concentracioacuten de 1000 gml Asiacute el efecto citotoacutexico del extracto
acuoso de C aconitifolius del presente estudio podriacutea deberse a
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
remanentes de aacutecido cianogeacutenico durante el proceso de secado de las
hojas ya que las mismas pueden contener incluso despueacutes de dicho
procesamiento hasta 425 mg de HCN100 g de hoja seca En este
sentido la FDA establece que es a partir de la ingestioacuten de cantidades
iguales o mayores de 20 mg100 g de hoja seca cuando se pueden
registrar efectos toacutexicos en los seres humanos (30)
La disminucioacuten de la expresioacuten de los genes que codifican el TNF- la IL-
1 y la IL-6 es un factor clave en la reduccioacuten de la siacutentesis y liberacioacuten
de citoquinas Diversos autores han reportado que moleacuteculas tales como
eupafolina hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona
acetato de lupeol cariofileno y campesterol tienen actividad
antinflamatoria al disminuir la expresioacuten de los genes que codifican el
TNF- la IL-1 y la IL-6 (31-33) De la misma manera se ha reportado un
efecto sobre la siacutentesis y liberacioacuten de dichas citoquinas Los polifenoles
y esteroles inhiben la actividad del heterodiacutemero NF-kB (34) El NF-kB
estaacute constituido por las proteiacutenas p53 y p65 y se ubica en el citosol
formando un complejo con la proteiacutena IkB en su forma inactiva en su
forma activa los homodiacutemeros se traslocan al nuacutecleo y se unen al los
promotores de los genes proinflamatorios (35) Los polifenoles y los
esteroles evitan la fosforilacioacuten del IkB asiacute como la traslocacioacuten del NF-
kB al nuacutecleo evitando la transcripcioacuten del mRNA que codifica el TNF- la
IL-1 IL-6 y la IL-10 (1832) Estos resultados concuerdan con lo
reportado previamente dejando de manifiesto que las ceacutelulas reducen la
siacutentesis de TNF- e IL-6 a medida que disminuye la expresioacuten geacutenica Sin
embargo diversos autores ponen de manifiesto que durante la
generacioacuten de citoquinas en el marco del proceso inflamatorio la IL-1
responde a la liberacioacuten de TNF- (36) Lo anterior podriacutea explicar la
razoacuten por la que la represioacuten geacutenica de la IL-1 no ha podido visualizarse
en el extracto acuoso Sin embargo el extracto etanoacutelico muestra una
disminucioacuten de la expresioacuten geacutenica de IL-1 a partir de 50 gml En
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
extractos de C aconitifolius se ha reportado la presencia de eupafolina
hispidulina -amirenona acetato de -amirina moretenona acetato de
lupeol cariofileno y campesterol compuestos a los que podriacutea atribuirse
la actividad antinflamatoria registrada en el presente estudio (1037)
CONCLUSIONES
Los extractos de C aconitifolius presentaron actividad antioxidante al
disminuir los radicales DPPH y ABTS Los extractos etanoacutelicos y acuosos
registraron efectos antinflamatorios al disminuir la expresioacuten geacutenica de
las citoquinas siendo el extracto etanoacutelico el que presentoacute la mayor
represioacuten de los genes que codifican el TNF- (40) la IL-6 (97) y la IL-
1 (7371) Por lo tanto la disminucioacuten de la transcripcioacuten de los genes
que codifican estas citoquinas redujo la produccioacuten y liberacioacuten de
citoquinas proinflamatorias gracias a la presencia de los compuestos
bioactivos de los extractos Asiacute los resultados sugieren que los extractos
de C aconitifolius pueden utilizarse como coadyuvantes en el
tratamiento de las enfermedades de origen antiinflamatorio
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Poprac P Jomova K Simunkova M Kollar V Rhodes CJ Valko M
Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases
Vol 38 Trends in Pharmacological Sciences 2017 p 592-607
DOI 101016jtips201704005
2 Asmat U Abad K Ismail K Diabetes mellitus and oxidative stressmdash
A concise review Saudi Pharm J 201624(5)547-53 DOI
101016jjsps201503013
3 Huang YJ Nan GX Oxidative stress-induced angiogenesis J Clin
Neurosci 20196313-6 DOI 101016jjocn201902019
4 Irondi E Agboola S Oboh G Boligon A Athayde M Shode F Guava
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated
in gout and hypertension in vitro J Intercult Ethnopharmacol
20165(2)122 DOI 105455jice20160321115402
5 Du L Li J Zhang X Wang L Zhang W Yang M et al Pomegranate
peel polyphenols inhibits inflammation in LPS-induced RAW2647
macrophages via the suppression of TLR4NF-κB pathway
activation Food Nutr Res 201963(3)3392
6 Chen X Lu PH Liu L Fang ZM Duan W Liu ZL et al TIGIT
negatively regulates inflammation by altering macrophage
phenotype Immunobiology 2016221(1)48-55 DOI
101016jimbio201508003
7 Otitolaiye CA Asokan C GC-MS Analysis of Cnidoscolus
aconitifolius Leaf Aqueous Extracts Int J Sci Res 20166(7)8376-
81
8 Sunday A Sunday Dele O Olayemi A Investigation on the
medicinal and nutritional potentials of some vegetables consumed
in Ekiti state Nigeria Int Res J Nat Sci 20163(1)16-30
9 Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Gutieacuterrez-Rebolledo GA Yeacutepez-Mulia L Rojas-
Tomeacute IS Luna-Herrera J Jimeacutenez-Arellanes MA Antiprotozoal
antimycobacterial and anti-inflammatory evaluation of
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) extract and the isolated
compounds Biomed Pharmacother 20178989-97 DOI
101016jbiopha201702021
10Peacuterez-Gonzaacutelez MZ Siordia-Reyes AG Damiaacuten-Nava P Hernaacutendez-
Ortega S Maciacuteas-Rubalcava ML Jimeacutenez-Arellanes MA
Hepatoprotective and Anti-Inflammatory Activities of the
Cnidoscolus chayamansa (Mc Vaugh) Leaf Extract in Chronic
Models Evidence-Based Complement Altern Med 201820181-12
DOI 10115520183896517
11Garciacutea-Rodriacuteguez RV Gutieacuterrez-Rebolledo GA Meacutendez-Bolaina E
Saacutenchez-Medina A Maldonado-Saavedra O Domiacutenguez-Ortiz MAacute
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
et al Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh an important
antioxidant anti-inflammatory and cardioprotective plant used in
Mexico J Ethnopharmacol 2014151(2)937-43 DOI
101016jjep201312004
12Georgeacute S Brat P Alter P Amiot MJ Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products J Agric Food
Chem 200553(5)1370-3 DOI 101021jf048396b
13Lee KW Kim YJ Lee HJ Lee CY Cocoa has more phenolic
phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and
red wine J Agric Food Chem 200351(25)7292-5 DOI
101021jf0344385
14Popova M Silici S Kaftanoglu O Bankova V Antibacterial activity
of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical
composition Phytomedicine 200512(3)221-8 DOI
101016jphymed200309007
15Ristow M Zarse K Oberbach A Kloting N Birringer M Kiehntopf M
et al Antioxidants prevent health-promoting effects of physical
exercise in humans Proc Natl Acad Sci 2009106(21)8665-70
DOI 101073pnas0903485106
16Loarca-Pintildea G Mendoza S Ramos-Goacutemez M Reynoso R
Antioxidant Antimutagenic and Antidiabetic Activities of Edible
Leaves from Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh J Food Sci
201075(2)H68-72 DOI 101111j1750-3841200901505x
17Aacutengel Sentandreu M Toldraacute F A fluorescence-based protocol for
quantifying angiotensin-converting enzyme activity Nat Protoc
20061(5)2423-7 DOI 101038nprot2006349
18Zhu F Du B Xu B Anti-inflammatory effects of phytochemicals
from fruits vegetables and food legumes A review Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(8)1260-70 DOI
1010801040839820161251390
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
19Pelle F Della Compagnone D Nanomaterial-Based Sensing and
Biosensing of Phenolic Compounds and Related Antioxidant
Capacity in Food Sensors 201818(2)462 DOI
103390s18020462
20Latief U Husain H Ahmad R β-Carotene supplementation
ameliorates experimental liver fibrogenesis via restoring
antioxidant status and hepatic stellate cells activity J Funct Foods
201849(5)168-80 DOI 101016jjff201808027
21 Adeniran OI Olajide OO Igwemmar NC Orishadipe AT
Phytochemical constituents antimicrobial and antioxidant
potentials of tree spinach [ Cnidoscolus aconitifolius ( Miller ) I M
Johnston ] J Med plants Res 20137(19)1317-22
22Adefegha SA Oboh G Enhancement of total phenolics and
antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables by
steam cooking J Food Process Preserv 201135(5)615-22 DOI
101111j1745-4549201000509x
23 Hamid AA Oguntoye SO Negi AS Ajao A Owolabi NO
Chemical constituents antibacterial antifungal and antioxidant
activities of the aerial parts of Cnidoscolus aconitifolius Ife J Sci
201618(2)561-71
24Paiva L Lima E Neto AI Baptista J Angiotensin I-converting
enzyme (ACE) inhibitory activity antioxidant properties phenolic
content and amino acid profiles of fucus spiralis L Protein
hydrolysate fractions Mar Drugs 201715(10)1DUMMY DOI
103390md15100311
25 Jabeen Q Aslam N Hypotensive angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitory and diuretic activities of the aqueous-
methanol extract of Ipomoea reniformis Iran J Pharm Res
201312(4)769-76
26Vargas-Leoacuten EA Diacuteaz-Batalla L Gonzaacutelez-Cruz L Bernardino-
Nicanor A Castro-Rosas J Reynoso-Camacho R et al Effects of
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
acid hydrolysis on the free radical scavenging capacity and
inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme of
phenolic compounds of two varieties of jamaica (Hibiscus
sabdariffa) Ind Crops Prod 2018116201-8 DOI
101016jindcrop201802044
27Komolafe K Akinmoladun AC Komolafe TR Olaleye MT Boligon
AA Akindahunsi AA et al Angiotensin-1-converting enzyme
inhibition antioxidant activity and modulation of cerebral Na+K+
ATPase by free phenolics of African locust bean (Parkia biglobosa)
Heal Sci Reports 20181(1)e17 DOI 101002hsr217
28Roy D Ferdiousi N Khatun T Moral M Phytochemical screening
nutritional profile and anti-diabetic effect of ethanolic leaf extract
of Cnidoscolus aconitifolius in streptozotocin induce diabetic mice
Int J Basic Clin Pharmacol 20165(5)2244-50 DOI 10182032319-
2003ijbcp20163269
29 Velaacutesquez M Gonzaacutelez N Arzave R Utilizacioacuten de un meacutetodo
in vitro para evaluar la toxicidad de chaya una planta nutritiva
utilizada en medicina tradicional para la disminucioacuten del colesterol
20161(1)546-50
30Gonzaacutelez-Laredo RF Flores De La Hoya ME Quintero-Ramos MJ
Karchesy JJ Flavonoid and cyanogenic contents of chaya (spinach
tree) Plant Foods Hum Nutr 200358(3)1-8 DOI
101023BQUAL00000411424872607
31Khajuria V Gupta S Sharma N Tiwari H Bhardwaj S Dutt P et al
Kaempferol-3-o-β- d -glucuronate exhibit potential anti-
inflammatory effect in LPS stimulated RAW 2647 cells and mice
model Int Immunopharmacol 201857(1)62-71 DOI
101016jintimp201801041
32Askari VR Fereydouni N Baradaran Rahimi V Askari N Sahebkar
AH Rahmanian-Devin P et al β-Amyrin the cannabinoid receptors
agonist abrogates mice brain microglial cells inflammation
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
induced by lipopolysaccharideinterferon-γ and regulates Mφ1Mφ2
balances Biomed Pharmacother 2018101(2)438-46 DOI
101016jbiopha201802098
33 Park J Yoo H Kim C Shim S-Y Lee M Hispidulin-7-O-
neohesperidoside from Cirsium japonicum var ussuriense
attenuates the production of inflammatory mediators in LPS-
induced raw 2647 cells and HT-29 cells Pharmacogn Mag
201713(52)707
34 Chen CC Lin MW Liang CJ Wang SH The anti-inflammatory
effects and mechanisms of eupafolin in lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW2647 Macrophages PLoS One
201611(7)1-15
35Chen L Teng H Xie Z Cao H Cheang WS Skalicka-Woniak K et al
M improved bioactivity An update on structurendashactivity
relationshipodifications of dietary flavonoids towards Crit Rev Food
Sci Nutr 201858(4)513-27 DOI
1010801040839820161196334
36Yokose K Sato S Asano T Yashiro M Kobayashi H Watanabe H et
al TNF-α potentiates uric acid-induced interleukin-1β (IL-1β)
secretion in human neutrophils Mod Rheumatol 201828(3)513-7
DOI 1010801439759520171369924
37 Iwuji S Nwafor A Phytochemical Identification in the Chloroform
Fraction of Aqueous-Methanol Extract of Cnidoscolus aconitifolius
Leaves Br J Pharm Res 20155(6)437-41 DOI
109734BJPR201513264
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Tabla I Secuencias de cebadores de RT-PCR para el anaacutelisis de la
expresioacuten geacutenica
Interleuquina Sentido AntisentidoTNF-
(NM_0005943)
5prime-
TCCTTCAGACACCCTCAACC-
3prime
5prime-
AGGCCCCAGTTTGAATTCTT
-3primeIL-6
(NM_0010019
28)
5prime-
GTTTGAGGGGGTAACAGCA
A-3prime
5prime-
GCTAACTGCAGAGGGTGAG
G-3primeIL-1β
(NM_138712)
5prime-
GCTGTGCAGGAGATCACAG
A-3prime
5prime-
GGGCTCCATAAAGTCACCA
A-3primeHPRT
(NM_000194
2)
5acute-
ACCCCACGAAGTGTTGGATA
- 3acute
5acute-
AAGCAGATGGCCACAGAAC
T-3acute
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Tabla II Contenido de fenoles flavonoides flavanonas y
dihidroflavonoles en los extractos de hojas de C aconitifolius (g100 g de
extracto liofilizado)
Extracto Fenoles Flavonoides Flavanonas y
dihidroflavonole
sAgua 7061 007a 445 047b 5570 654ab
Etanol 3513 159b 4776 484a 7010 729a
Acetona 1975 111c 3725 649a 6517 389ab
Acetato de etilo 1493 323c ND 6632 454ab
Eacuteter dietiacutelico 1044 454c ND 6884 713a
Hexano 1398 882c ND 5279 421b
Medias de tres datos independientes Las letras diferentes en una misma
columna indican diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005)
obtenidas con un post-hock de Tukey ND no detectado
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Fig 1 Interaccioacuten de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] con
las concentraciones (150 a 900 gml) mediante intervalos Tukey p lt
005 a) Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales DPPH b)
Efecto de los extractos en la inhibicioacuten de los radicales ABTS
a)
b)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Fig 2 Efectos de los extractos [(agua (H2O) etanol (ETOH) acetona
(An) acetato de etilo (AcOET) eacuteter dietiacutelico (Et2O) y hexano (Hex)] en la
actividad de la ECA La interaccioacuten con las concentraciones (150 a 900
gml) se determinoacute mediante intervalos Tukey p lt 005
H2O ETOHAnAcOETEt2OHex
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Fig 3 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la viabilidad de los macroacutefagos derivados de monocitos
THP-1 El indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre
los tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett
Las letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Fig 4 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la expresioacuten de mRNA a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas indican
diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005) con la prueba de
muacuteltiples rangos de Tukey
a)b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)
Fig 5 Efecto del extracto acuoso (H2O) y etanoacutelico (ETOH) de C
aconitifolius en la produccioacuten de citoquinas a) TNF-α b) IL-1 y c) IL-6 El
indica diferencias estadiacutesticas significativas (p lt 005) entre los
tratamientos y el control determinado con el estadiacutestico de Dunnett Las
letras minuacutesculas diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre las
concentraciones de un mismo extracto y las letras mayuacutesculas
diferentes indican diferencias estadiacutesticas entre los extractos (p lt 005)
con la prueba de muacuteltiples rangos de Tukey
a) b)
c)