CAPITULO 6

CRECIMIENTO MICROBIANO

CRECIMIENTO CELULAR •Es el aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras celulares. •Es el resultado tanto del cambio en el tamaño celular como de la reproducción celular. •Los microorganismos en un medio de cultivo apropiado, se reproducen empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para producir nuevos microorganismos.

•Hay tres aspectos determinantes del crecimiento microbiano: – Los factores del crecimiento. – La estequiometria del crecimiento. que depende de la composición del medio de cultivo – La cinética, que indica la velocidad del proceso.

1.1.- REQUERIMIENTOS FISICOS

Temperatura

pH

Actividad de Agua

Presión Osmótica

1.- FACTORES DEL

CRECIMIENTO MICROBIANO

1.a.- Temperatura •Cada microorganismo prefiere una Tº de desarrollo.

•Temperatura mínima, por debajo de ella no hay crecimiento

•Temperatura óptima a la que la velocidad es máxima.

•La falta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a:

–Reducción en la velocidad de reacción, según leyes cinéticas)

–Cambio de estado de los lípidos. (aumento de viscocidad).

El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se

debe al incremento de la velocidad de las reacciones enzimáticas.

Tipos microbianos

•Sicrófilos: -5 ª 20°C, óptimo < 15oC

–organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis

(nieve rosada), bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium

–membrana con alto % de ác. grasos insaturados

•Mesófilos 15-45° C, óptimo: 30-40°C

–Mayoría de los m.o (del suelo, aguas, patógenos)

•Termófilos 40-70°C, óptimo de 55-65oC

–Tienen membrana con alto % de ácidos grasos saturados,

y enzimas estables al calor

–Bacillus stearothermophilus, (compostaje)

•Hipertermófilos 80-113°C, óptimo > 90o

–Pyrococcus, Pyrodictium (aguas termales)

–Altas temperaturas desactivan las enzimas y producen

daño celular.

1.b.- pH •El pH interno en mayoría de m.o está entre 6.0 a 7.0. •Los rangos de pH tolerables son distintos. •Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y alcalófilos que toleran pH=10.0 •Por efecto del metabolismo, el pH del medio suele bajar.

•Si la única fuente de nitrógeno es amonio, se produce liberación de iones H, bajando el pH. •Si la fuente de nitrógeno es solo nitrato, se deben tomar iones H del medio para formar amonio, subiendo el pH. •La bajada del pH que producen ciertos microorganismos les confiere ventaja selectiva frente a otros competidores. •Ejplo. Bacterias lácticas. Reducen el pH del medio a 4.5. •La evolución del CO2, también hace variar el pH.

•Los microorganismos necesitan presencia de agua, en forma disponible, para crecer y llevar a cabo sus funciones metabólicas. •La disponibilidad de agua se mide como actividad de agua (aw). aw: Es la relación entre la presión de vapor de agua del medio (P) y la presión de vapor del agua pura (Po). Algunas moléculas del agua se orientan en torno a las moléculas del soluto y otras quedan absorbidas por componentes insolubles de las soluciones. En ambos casos, el agua queda en una forma menos reactiva.

1.c.- Disponibilidad del agua

Actividad del agua (aw)y Presión osmótica •La presión osmótica π está relacionada con aw por la expresión •V . π = R.T.Ln.aw •Donde: R= constante de los gases, T= temperatura absoluta, π la presión osmótica, y V el volumen molar parcial del agua •π: Puede definirse como la presión que se debe aplicar a una solución para detener el flujo neto de disolvente a través de una membrana semipermeable. •π alta, causa pérdida de agua y plasmólisis celular. (hipertónico)

•Valores mínimos: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. •La utilización de almíbares, salmueras y salazones reducen la actividad de agua de los alimentos, y permite su conservación. (ejemplo mermeladas, leche condensada, etc)

Halófitos. •El agua de mar tiene una concentración del 3%. Los m.o. halófilos: requieren condiciones salinas: •Discretamente halófilo (1-6%), •Moderadamente halófilo (6-15%), •Halófilos extremos (15-30%) •La principal estrategia de los m.o halófilos para adaptarse al estrés osmótico es la acumulación de compuestos en el citoplasma para compensar la presión osmótica externa. (Gonzales Hernandez y Peña) •La salinidad promedio del agua de los océanos está entre 3,1–3,8%, en Mar muerto es 28%. •Allí solo viven microorganismos halófilos: un protozoo ciliado, algunas algas y bacterias de los géneros Flavobacterium, Halococcus y Halobacterium, y las artemias. •Debido a la elevada densidad de sus aguas (1240 kg/m³) una persona puede flotar, en el mar (1 027 kg/m³).

1.d.- Concentracion de oxigeno. •El oxigeno se introduce al caldo de cultivo normalmente esparciéndolo en el medio. •La transferencia del oxigeno desde las burbujas de gas, hasta las células esta limitada por la transferencia de oxigeno a través de la película liquida que rodea las burbujas de gas

2.- FORMAS DE CULTIVO •Las fermentaciones, pueden clasificarse en: continua,

semicontinua o intermitente.

•2. a.- PROCESO INTERMITENTE. Fermentación Batch.

•Se refiere al crecimiento de células en sistema cerrado.

•En el inicio del cultivo, el medio estéril se inocula con un

volumen adecuado de microorganismos y se permite que se

lleve a cabo la fermentación en condiciones óptimas. A lo

largo del proceso no se añade nutriente nuevo, por lo que se

produce su agotamiento.

•Esto ocasiona cambios fisicoquimicos en el medio que dan

origen a fases típicas de un Ciclo de crecimiento

microbiano.

Crecimiento microbiano en medio líquido

•Fase lag. Adaptación al nuevo ambiente. •Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares. •Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0. vc=vm (vel. crecimiento = vel de muerte), por nutrientes limitantes, acumulación de desechos, inhibición del crecimiento •Fase de muerte. velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

Fase de latencia

•Cuando se introduce un inoculo en medio fresco, el

crecimiento usualmente no comienza de inmediato sino

después de un tiempo llamado de latencia o

acostumbramiento.

•En este periodo de transición los microorganismos,

reorganizan sus contituyentes celulares, producen las

enzimas necesarias para aprovechar un nuevo medio

ambiente, e inhiben otras que no necesitan. Estos cambios

suceden según los mecanismos de regulación de los

procesos bioquímicos, vistos anteriormente.

•En esta fase no hay incremento en el número de células,

pero hay actividad metabólica, aumento en el tamaño

individual de las células, en el contenido proteico, ADN y

peso seco de las células.

Factores que afectan la fase de latencia

•Generalmente la fase de latencia aumenta con la edad del inoculo. •Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad.

•Se puede producir una pseudo fase de latencia, cuando el inoculo es pequeño o con baja porción de células viables.

•Si se desea minimizar la fase de latencia es recomendable: •- Las células deben estar adaptadas a las condiciones del medio donde crecerá. •- Las células debe ser jóvenes (en fase exponencial) •- El tamaño del inoculo debe ser entre el 5% y 10% v/v.

Fases de latencia múltiples. •El crecimiento diaúxico es un tipo de crecimiento microbiano que tiene lugar cuando hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono. •En este caso se observa una curva de crecimiento bifásica debido a la utilización secuencial de distintas fuentes de carbono. •El metabolismo del organismo es selectivo para uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono que permite un crecimiento más rápido) y cuando la agota, comienza a metabolizar el otro. •En bacterias lácticas, por ejemplo, la presencia de glucosa que es fácilmente asimilable, induce un efecto de represión por catabolito sobre el operón lac que es necesario para el metabolismo de la lactosa, un disacarido de más difícil asimilación. Como consecuencia se produce un crecimiento diaúxico en medios de cultivo que contienen una mezcla de glucosa y lactosa.

Fase exponencial o fase logarítmica

•Es el período en el cual, cada vez que pasa un tiempo de generación la población microbiana se duplica. •En esta fase la concentración de nutrientes es alta, y la tasa de crecimiento celular es independiente de la concentración de nutrientes. •Es un periodo de crecimiento balanceado, en el cual todos los componentes celulares se incrementan en la misma proporción.

•Fase de desaceleración. •En esta fase el crecimiento desacelera debido a la escases de algún nutriente esencial o de la acumulación de algún producto toxico, resultado del crecimiento previo. •Estos factores ocasionan un crecimiento desbalanceado, ocasionando cambios en las estructuras celulares, para aumentar sus perspectivas de crecimiento en un medio hostil. •Un ejemplo de producto inhibitorio es el etanol producido por las levaduras alcohólicas. •Si de algún modo se remueve el producto toxico, puede haber una nueva fase de crecimiento.

•Fase estacionaria •En esta fase la velocidad de muerte celular se iguala a la velocidad de reproducción de las sobrevivientes. •En esta fase las células sobrevivientes, producen metabolitos secundarios (como los antibióticos). •Las limitaciones del crecimiento ocurren por: agotamiento de algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos, o por una combinación de las causas anteriores.

Fase de muerte

•Ocurre una disminución progresiva en el número de

células viables.

•velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

•Cuando la concentración de sustrato es mínima, la célula

se ve forzada a metabolizar su propio protoplasma (se

conoce como metabolismo endógeno)

•Manejo industrial.

•La fase de latencia, no es deseable, por que se pierde

tiempo y acarrea pérdidas económicas

•Para minimizar esta fase, se hace crecer el inóculo aparte,

en un medio de cultivo igual al que se va a emplear en el

bioproceso (cultivo o fermentación) y luego se procede a

transferirlo cuando las células ya se encuentran en la fase

exponencial (inoculación).

Ventajas y Desventajas del proceso batch.

•Su mayor ventaja es la sencillez.

•Desventajas: alto requerimiento de mano de obra, y

demasiados tiempos muertos.

•Tiempos muertos: Fase de adaptación, fase de

decaimiento, periodo de descarga, y renovación de la carga

del reactor para un nuevo batch.

2,b.- Proceso semicontinuo •Se operan de forma similar a los batch, pero sólo se cosechan parcialmente a intervalos regulares, reponiendo con medio fresco. •Es como repetir un cultivo batch indefinidamente, pero ahorrando la mayor parte del tiempo de servicio entre lotes.

•Los parámetros a controlar: volumen y tiempo de adición, se calculan de modo que el cultivo se mantenga en fase logarítmica. •Si el volumen extraído es muy grande puede diluirse el medio, tanto que la masa microbiana puede volver a la fase de acostumbramiento. •Si el volumen extraído es muy pequeño para igual tiempo el cultivo puede agotarse y pasar a la fase estacionaria. •Si el tiempo de renovación es muy grande el cultivo puede alcanzar la fase estacionaria y si es muy pequeño el cultivo puede regresar a la fase de acostumbramiento.

2.c.- Proceso en cultivo continuo •Constantemente se suministra nuevo medio de cultivo al bioreactor, con agitación, y se retira producto y células. •Cuando el sistema alcanza estado estacionario, la concentración de células, productos y sustrato permanecen constantes. •Se usa, cuando el producto de interés se sintetiza en la fase logarítmica. Por tanto, interesa que las bacterias estén en esa fase el mayor tiempo posible, para lo que requieren más medio.

•Sistemas de control: quimiostato y turbidostato

Control por quimiostato •El elemento de control es la concentración de un nutriente limitante (C o N). •Los demás nutrientes en el medio se encuentran en exceso. •Los parámetros a tener en cuenta son: •F (m3/h); •volumen del reactor (m3); •densidad celular (x); •factor de dilución (D): Es la relación entre el caudal de alimentación, y el volumen de cultivo. D=F/V (h -1)

• D indica las veces que se renueva el

volumen del biorreactor por unidad de

tiempo.

•D= 0.25 h-1 indica que en una hora se

renovó 25 % del volumen de cultivo, o bien

que cada 4 h se renueva el volumen de

cultivo.

•Si la tasa de crecimiento se hace igual al factor de dilución

(D), entonces dx/dt=0. Por tanto, la cc de las células se hace

constante (x=x) y el cultivo se encuentra en estado

dinámico de equilibrio.

•Con altas tasas de dilución el cultivo puede drenarse

totalmente (DC: dilución crítica). Es decir, el cultivo se “lava”

porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa de

dilución.

•A muy bajas diluciones (D) el quimiostato no funciona si el

nutriente limitante es la fuente de energía. Ello se debe a que

en esas condiciones, la fuente de energía sólo se usa para

reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero

no queda para el crecimiento.

Aplicaciones:

Procesos industriales de fermentación (producción de

bebidas alcohólicas, de aminoácidos, etc)

Su aplicación más conocida es para la depuración de

aguas residuales, por procesos aeróbicos o anaeróbicos.

El “medio de cultivo fresco” es el agua residual que

entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO

que luego se retiran por decantación

… •Turbidostato: elemento de control, la turbidez. •La alimentación se regula mediante el monitoreo de la densidad óptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la turbidez supera un límite prefijado. •Se usa menos que el quimiostato

3.- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION CELULAR

•Existen diversos métodos, con diferentes propuestas de clasificación. •Se pueden agrupar en dos: –métodos directos y –métodos indirectos.

•Directos obtienen una medida de la masa celular por: –Técnicas de conteo, –Medida de concentración de masa celular: peso celular, absorbancia. •Indirectos miden la concentración de algún componente celular (ADN, proteínas, etc).

a. Conteo celular •Se cuentan directamente las células. •En este método la suspensión de la muestra se coloca en una cámara de recuento, que tiene una micro-cavidad cuadriculada de dimensiones conocidas, y se tapa con el cubre objetos. Como se conoce el área de las cuadrículas y la altura de la cámara, el volumen ocupado por la suspensión en cada cuadrículas queda determinado.

• Existen cámaras especificas como: Cámaras de Neubauer, de Petroff-Hausser, de Sedgewick Rafter, etc. •Para obtener el número de células/ml de suspensión, se cuenta el número de células en varias cuadriculas, se calcula el promedio y se multiplica por el factor correspondiente. •Estos métodos presentan algunas limitaciones: -La precisión es difícil de lograr -El método no es adecuado para suspensiones con menos de 107 células/mL.

Cámara de Neubauer •Cuadrado de 3 x 3 mm. •El área sombreada y marcada L es 1 mm2. •La depresión tiene 0.1 mm de profundidad. •El volumen de la superficie L, bajo el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1 microlitro) •Los cuadrados L están subdivididos en 16 cuadraditos de 0,0025 mm2 cada uno. •El cuadrado del centro es usado para conteo de bacterias, y se divide en 5 cuadrados por lado con una longitud lateral de 0,2 mm, y superficie de 0,04 mm2. •Al contar las cuatro áreas sombreadas (L), si hay un total de X células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: = 10000 (X/4) células/mL

Técnica de conteo •Para que las células, no se cuenten dos veces, se siguen las siguientes reglas: -Se cuentan las células dentro de la zona definida. - También se cuentan las células, que se apoyan o tocan en dos caras, por ejemplo, en la línea de medida izquierda y superior.

•Otras recomendaciones de conteo. – Efectuar conteo en forma de meandro – El diafragma del condensador en el microscopio deberá estar cerrado en gran parte. - El valor medio de los conteos se aplica luego en una fórmula de cálculo o se multiplica por el factor correspondiente.

Cámara Petroff-Hausser •El retículo, está dividido en 25 cuadrados grandes •Cada cuadrado grande tiene 16 cuadraditos •Volumen de la cámara= 0,02 mm3

•Área de la cámara 1 mm2

•Calculo: •Se observan 12 células/cuadrado. •12 x 25 = 300 (número de células en 0,02 mm3).

•300 x 50= 15000 (número de células en 1 mm3) •15000 x 1000 = 1,5 x 107 (número de células en 1 mL)

Cámara de conteo SEDGEWICK RAFTER

•Es una cámara graduada de 50 x 20 x 1 mm. El área total

es de 1000 mm2 y el volumen de 1000 mm3 o 1 ml.

•Tiene grabados 1000 cuadrados, cubierto por un

cubreobjetos.

•Se usa para contar plancton en un microscopio

compuesto o en microscopio invertido. (Moreno et al, 2012)

b) Equipos automáticos •"Cell Coulter" de Beckman-Coulter •Mide los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. •El contador consta de dos cámaras separadas por un material no conductor, en el que hay un orificio de tamaño similar al de las células. •Ventajas y desventajas: •Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo. •Las limitaciones de este método son: - Se cuentan células vivas y muertas. - Las suspensiones deben estar libres de partículas diferentes a los microorganismos, por que el aparato no puede distinguir entre una u otra.

c.- Conteo de celulas viables

•En los métodos anteriores se determina el número de

células totales, pero en muchos casos únicamente interesa

contar células viables. (célula que es capaz de dividirse y

forma una progenie)

•Se puede hacer por:

•- recuento en placa (UFC).

•- numero mas probable (NMP)

c.1.- Conteo en placas.

•En este procedimiento se

realizan diluciones

seriadas de la muestra

•Se inoculan pequeños

volúmenes conocidos, de

cada dilución, en placas

de Petri con un medio

sólido adecuado y se

extiende con una varilla

de vidrio

•Luego las placas se

incuban en las

condiciones optimas

hasta que aparezcan las

colonias.

•Se asume que cada colonia ha sido formada por una única

célula del medio de cultivo original. Esta suposición puede

subestimar la densidad de población.

•Las células son entonces medidas como unidades

formadoras de colonia – UFC.

•Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la

que contengan entre 25 y 250 colonias.

Ejemplo.

•En un recuento en placa, se hacen diluciones seriadas con factor

de dilución 100, para ello se toma 1 mL del caldo bacteriano, y se

añade a un frasco de dilución que contiene 99 mL del diluente

adecuado. Se agita y se toma de esta dilución 1 mL y se transfiere

a un segundo frasco con 99 mL del diluente, se agita y se toma de

esta segunda dilución 1 mL y se transfiere a un tercer frasco de

dilución que contiene 99 mL del diluente.

•De cada dilución se siembran por triplicado muestras de 1 mL, se

incuban por 24 horas y se cuentan las colonias.

•Si el promedio de las placas de la segunda dilución, es de 32

colonias. Determine la concentración celular en la muestra.

•Solucion.

•Ci = X

•Primera dilucion: 1:100 ó 10-2

•Segunda dilucion: 1:10.000 ó 10-4

•Tercera dilucion : 1:1.000.000 ó 10-6

•Respuesta: 32x10,000 = 3.2x105 UFC

Ventajas y desventajas

•Ventajas.

•Se usa frecuentemente, para estimar poblaciones

bacterianas en leche, agua, y otros productos.

•Es fácil de realizar y se adapta a la medición de

poblaciones de cualquier densidad.

•Desventajas:

•Tiempo largo, (requieren 24 horas)

•Exigen muy buenas técnicas de esterilización

•Puede dar errores cuando se trata de células agregadas

Placas petrifilm (3M)

•Son placas prefabricadas con el medio de cultivo adecuado para el microorganismo que se desea contar. •Las placas Petrifilm de 3M para Coliformes dan resultados en 24 h. •Tres etapas: •1) Sembrar. Levantar la película y añadir la muestra •2) Incubar. El diseño de las placas ahorra espacio en la estufa •3) Contar. Las colonias rojas asociadas a burbujas de gas.

c.2.- Número mas probable (NMP) •Llamada técnica de dilución en tubo, da una estimación estadística de la densidad celular. •Al aumentar la dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos no contienen ningun microorganismo. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística. •Se usan las tablas de Cochran. •El NMP es una afirmación que existe 95% de probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto. •Este método es útil cuando las bacterias a contar no crecen en medios sólidos, o cuando la bacteria puede crecer en un medio líquido diferencial, como sucede con las bacterias coliformes, que usan selectivamente lactosa. •La precisión del método del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan; cinco tubos por dilución se considera como una relación adecuada entre precisión y economía.

Número mas probable (NMP) para 6 tubos, lectura 6,3,1

10 mL de inóculo

1 mL de inóculo

0,1 mL de inóculo

6 tubos positivos

(com crescimento

bacteriano)

3 tubos positivos

1 tubos positivos

Tabla: NMP de bacterias por 100 g

(ml) de material analizado

empleando cinco tubos inoculados

con 10, 1 y 0.1 ml o g de material

•Tomada de: Enumeration of coliforms, faecal coliforms and of e. Coli in foods using the MPN methoD MFHPB-19 April 2002 por Donna Christensen Crawford y Rick Szabo

Uso de la tabla •Consideremos positivos los siguientes cultivos: • (1) 5 tubos inoculados con 10 ml de dilución (1/10) del material : los cinco (5) son postivos •(2) 5 tubos inoculados con 1 ml de dilución (1/10) del material: solo uno (1)es positivo •(3) 5 tubos inoculados con 1 ml de dilución (1/100) del material: ninguno (0) es positivo •Cada uno de los cinco tubos de las tres diluciones representan respectivamente a 1, 0.1 y 0.01 g (ml), del material analizado. •La lectura se toma en la ubicación de la Tabla correspondiente a la lectura 5-1-0 (NMP de 33) si se hubiesen utilizado 10, 1 y 0.1 g (ml) de material. •Como se usaron cantidades 10 veces menores (1/10) de aquellas con las que se construyó la tabla, el valor de 33 debe multiplicarse por 10, lo que proporciona un valor de 330 organismos por 100 ml de material. •Como usualmente se expresa por g (ml) de material, este valor (330) debe dividirse por 100. El recuento obtenido por el NMP es en este caso de 3,3 organismos por ml de material analizado.

c.3.- Membranas Filtrantes •En poblaciones con menos de una célula por mililitro (agua de piscina), no son aplicables los métodos UFC o NMP. La muestra debe concentrarse antes del recuento, por filtracion. •Se hace pasar la muestra que contiene los microorganismos a través de una membrana de acetato de celulosa (0.45μm). •Los microorganismos quedan retenidos en la membrana filtrante, la cual se retira y se coloca en una placa de Petri con un medio de cultivo adecuado. •Después de incubar, aparecen sobre la membrana las colonias de los microorganismos.

d. Peso seco. •Secar volúmenes conocidos de medio con las células en crecimiento, hasta obtener un peso constante. •Es útil para grandes volúmenes. •Para levadura se puede usar una centrífuga con velocidades de 4-6x103rpm. Se obtiene una masa húmeda de células, luego esta masa se lava y seca a 80ºC por 24 horas, y se pesa. •En células bacterianas, se usan filtros de membranas para obtener la masa celular húmeda, y luego se seca. (1 mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9 bacterias) •Puede ser usada cuando el medio no contiene sólidos en suspensión. •Desventajas: •Los componentes volátiles de la célula pueden perderse. •La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado. •Requiere muestras muy grandes y son lentos.

e. Absorción de luz.

•Consiste en hacer incidir una luz monocromática a la suspensión de microorganismos, y medir la luz transmitida a través de la suspensión, que es inversamente proporcional a la concentración de biomasa, según la ley de Beer. •Usar, turbidímetro o espectrofotómetro 600- 700 nm. •Se necesitan de 10 millones a 100 millones de células por mililitro para hacer una suspensión suficientemente turbia para ser leída.

•Previo se hace una curva de calibración que relacione medidas directas (recuento en placa o microscopía) con las indirectas de turbidez •Teniendo esta curva, se podrá determinar las ufc/ml de otras muestras luego de leer la absorbancia de las mismas. •Valores altos de OD (mayores a 0.3) afectarán la linealidad en la respuesta. •El principal inconveniente es que no distingue células vivas de muertas, o entre células y otras particulas. Sin embargo, es una técnica que puede ser utilizada on-line para mediciones continuas

f. Masa de un componente celular.

•Medida de algún componente celular que sea parte constante del peso seco total de las células. •Pueden ser: proteínas, nitrógeno, ADN, RNA, y ATP celulares, los cuales están presentes en cantidades mas o menos constantes por especie. •Se detecta la presencia de ATP, por bioluminiscencia usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.

e. Efectos físicos. •Se puede medir la

variación de algún

factor externo por

efecto del

crecimiento celular,

tales como; el calor

generado por el

crecimiento, o el

oxígeno captado

por el medio, y que

deja un vacío

medible.

•Para CO2. •CO2 + 2NaOH → Na2CO3 + H2O •Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2NaCl •NaOH (residual) + HCl → NaCl + H2O •1.Muestra de suelo, 2.Recipiente con agua •3.Solución de NaOH 0.5 N •4.Aguja #20 (Venocat calibre 17) •5.Jeringa desechable de 20mL •6.Tubo de plástico flexible de 1-2 mm de diámetro •7.Plastilina

4.- ESTEQUIOMETRIA

•Estudia el grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nuevas células (biomasa) y productos. •El crecimiento de poblaciones microbianas es en realidad, el resultado de miles de reacciones intracelulares. •En un medio nutricional adecuado, los microorganismos, extraen nutrientes del medio y los convierten en componentes celulares.

•4.1.- Conceptos importantes: C-mol de biomasa, grado de reducción, y calor de reacción.

4.1.a.- C-Mol de biomasa. •Es la cantidad de biomasa que contiene 1 átomo gramo de C. •se puede definir la composición de un “microorganismo promedio” como: (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, el 5 % restante son sales. •Teniendo en cuenta esto, se escribe una “fórmula mínima” del «m.o. promedio» como: C H1,79O0,5N0,2 (que representa el 95% p/p de la biomasa) •Por tanto, se tiene: •

• De forma análoga, se puede definir: • 1 C-mol de sustrato (fuente de carbono y energía, FCE),

•Ejemplo, 1 C-mol de glucosa (C6H12O6), se representa por CH2O y pesa 30 g, y 1 C-mol de etanol (C2H60) se representa por CH3O0.5 y pesa 23 g. •En general para un compuesto de la forma CnHlOqNm, 1 C-mol esta representado por: C Hl/n Oq/n Nm/n.

4.1.b.- Grado de reducción

•Es útil para plantear los balances de materia y energía.

•En las siguientes reacciones de oxidación, se tiene:

• C + O2. CO2 = 4

•CH4 + 2O2 CO2 + 2H2O = 8

•CO + 0,5 O2 CO2 = 2

•CH2O + O2 CO2 + H2O = 4

•CH3O0,5 + 1,5 O2 CO2 + 1,5 H2O = 6

• se expresa, como n de e- disponibles/C-mol, y representa el

número de electrones transferidos del compuesto a oxidar al

oxígeno

•Para calcular el valor de de un compuesto se toman los grados

de reducción: 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N.

•En el caso del CO2, H2O y NH3 no hay e- disponibles, y CO2 =

H2O = NH3 = 0.

•En general para un compuesto CHaObNc, su grado de

reducción está dado por:

• = 4 + a - 2b - 3c

• un compuesto con fórmula Ch Hi Oj Nk, se lleva a la forma

•

•Para el m.o. promedio su x (donde x indica biomasa) será:

•

•Este valor, junto al peso C-mol = 25,8 gr., son datos

regulares, y pueden emplearse en balances de materia y

energía, cuando se desconoce la composición de biomasa.

•el valor de γ es una medida de la energía contenida en un

compuesto.

•En general para calcular el grado de reducción de un

compuesto se plantea la ecuación de oxidación del mismo

a CO2 y H2O, y el valor de γ se obtiene multiplicando por 4

el coeficiente estequiométrico del O2.

C H O Ni

h

j

h

k

h

x

= 4 ,1 9 e d isp .

C - m o l

-

4.1.c.- Calor de reacción. (q) •q: es la cantidad de calor liberado en una reacción.

•qo: es el calor de reacción por mol de e- transferidos al O2 en Kcal/mol

e- disponibles. qo= q/

•De la tabla surge que: La cantidad de calor liberado por mol de

electrones transferidos al oxígeno (q/γ), es prácticamente constante,

con un valor medio de qo = 27.5 k cal/mol electrones transferidos al O2

4.2.- Relaciones estequiometricas

•Se puede establecer las relaciones estequiometricas a

través de: balance de materiales, y los coeficientes de

rendimiento.

4.2.1.- Coeficientes de rendimiento •a.- Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato •Es la relación entre la variación de biomasa y la variación del sustrato. Yx/s= -X/S •Yx/s= Yx (Masa de células formadas/masa de sustrato consumidos), es el “rendimiento global”.

•El signo negativo, indica que x y s varían en sentido contrario •Si para obtener 30 gl-1 de levadura para panificación, se consumen 60 gl-1 de fuente carbonada, el rendimiento será Yx/s= 0.5 gr de levadura/gr de sustrato.

•Para organismos aerobios que crecen en glucosa se tiene que los

Yx/s típicos son: para levaduras y bacterias varía entre 0.4 y 0.6 g/g.

En condiciones anaerobias el valor de Yx/s es menor.

• yx (especifico). El yx se calcula conociendo el rendimiento global

Yx y los valores de Peso C-mol de X por:

•

b.- Coeficiente de Rendimiento biomasa-

oxígeno.

•Esta dado por la relación de biomasa producida y el

consumo de O2 del medio.(Yx/o2, qo)

•Yx/o2= -X/O2

•Yx/O2 para bacterias y levaduras aerobias que crecen en

glucosa es de 0.9 a 1.4 g/g

•Un cambio en el sustrato ocasionará variaciones en el

valor del coeficiente.

•Los mismos m.o, en las mismas condiciones, pero en

metano tendrán un Yx/O2 de alrededor de 0.2 g/g.

Coeficientes para m.o aerobios

Organismo Sustrato Yx/s Yx/o2

g/g g/mol g/g-C g/g

Enterobacteraerógenes Maltosa 0.46 149.2 1.03 1.50

Manitol 0.52 95.2 1.32 1.18

Fructosa 0.42 76.1 1.05 1.46

Glucosa 0.40 72.7 1.01 1.11

Candida utilis Glucosa 0.51 91.8 1.28 1.32

Penicillium chrysogenum glucosa 0.43 77.4 1.08 1.35

Pseudomonas fluorescens glucosa 0.38 68.4 0.95 0.85

Rhodopseudomonas spheroides glucosa 0.45 81.0 1.12 1.46

Saccharomyces cerevisiae Glucosa 0.50 90.0 1.25 0.97

Enterobacter aerógenes Ribosa 0.35 53.2 0.88 0.98

Succinato 0.25 29.7 0.62 0.62

Glycerol 0.45 41.8 1.16 0.97

Lactato 0.18 16.6 0.46 0.37

Piruvato 0.20 17.9 0.49 0.48

Acetato 0.18 10.5 0.43 0.31

Coeficientes para m.o aerobios

Organismo Sustrato Yx/s Yx/o2

g/g g/mol g/g g/mol

Cándida utilis Acetato 0.36 21.0 0.90 0.70

Pseudomonas fluorescens Acetato 0.28 16.8 0.70 0.46

Cándida utilis Etanol 0.68 31.2 1.30 0.61

Pseudomonas fluorescens Etanol 0.49 22.5 0.93 0.42

Klesbiella sp. Metanol 0.38 12.2 1.01 0.56

Metylomonas sp. Metanol 0.48 15.4 1.28 0.53

Pseudomonas sp. Metanol 0.41 13.1 1.09 0.44

Metyloccocus sp. Metano 1.01 16.2 1.34 0.29

Pseudomonas sp. Metano 0.80 12.8 1.06 0.20

Metanol 0.60 9.60 0.80 0.19

Pseudomonas metánica Metano 0.56 9.00 0.75 0.17

c.- Coeficiente de formación de producto (qr, qp),

o Yp/s.

•Yp/s = - P/S

•Se puede calcular los valores de yp conociendo el

respectivo rendimientos global Yp y los valores de Peso C-

mol de P por:

•Si en el proceso hay producción de CO2, también se

puede calcular el coeficiente global YCO2

•De igual manera, se puede calcular los valores de yco2,

por:

e.- Coeficiente de mantenimiento (m, qm, Ym)

•Es la velocidad específica de consumo de sustrato para energía

de mantenimiento.

•Esta energía es necesaria para mantener la membrana celular

activa en el transporte de nutrientes, para funciones metabólicas

esenciales, la movilidad y la reparación de estructuras dañadas.

•Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento se hará a costa

de pérdida de masa celular (metabolismo endógeno).

•También pueden ser útiles

•- El coeficiente de consumo de ATP. YX/ATP

•- El coeficiente respiratorio (RQ).

•RQ= Moles de CO2 producido

• Moles de O2 consumido.

4.2.2.- Balances

•Se plantean balances de materia y energía, para lo cual

se trata al cultivo de un m.o. como una reacción simple.

•

•

•Donde X significa “biomasa”, o masa celular.

•Los coeficientes estequiométricos están referidos a 1 C-

mol de fuente de C y energía, como:

•

• lo mismo para yp e yCO2.

•

• a). El balance de carbono para esta reacción de

formación de biomasa y producto será:

•

•Si FCE es la fuente de carbono y energía.

2

r = v e lo c id a d d e

re a c c io n

2 2 21 + + + y + + ( )

X P C OC m o l S a m o l F N b O y X y p ro d C O w H O q c a lo r

yC m o l d e X

C m o l d e fte d e C y Ex

-

- .

y y yx p C O

2 + + 1

Balance del consumo de sustrato

•El sustrato es utilizado por las células como fuente de

energía y como materia prima para la síntesis de

macromoléculas constitutivas.

•En un tiempo cualquiera, el consumo de sustrato (ΔS) es:

•Donde:

•Sx = Fracción de sustrato utilizado en formar biomasa

•Sp = Fracción de sustrato utilizado en formar producto

•SE = Fracción de sustrato utilizado para obtener energía

•despejando:

•SE = S - Sx - Sp

• SE = S + X

•Según el balance de sustrato, no puede haber entre los

productos más carbono del que 1 C-mol de sustrato puede

aportar y según el balance del grado de reduccion, los

electrones disponibles del sustrato van obligadamente a los

distintos productos.

s = sx + sp + sE

Ejemplo 1:

•Se cultiva levadura Candida utilis en un medio con glucosa,

SO4(NH4)2 y sales. La concentración inicial de

microorganismos es 0.53 gL-1, y la glucosa 15.2 gL-1. Al

cabo de 9.5 horas, se consumió totalmente la glucosa, y

0.123 mol de O2 L-1, se produjeron 0.179 mol de CO2 L

-1 y la

biomasa alcanzó un valor de 6.07 gL-1. Se desea averiguar

si, además de biomasa, se formó algún producto.

•Datos:

•Xo = 0.53g/L , So= 15.2 g/L

•t= 9.5 hr.

•Sf= 0, Xf= 6.07 g/L

•consumo: O2= 0.123 mol/L

•Productos: CO2= 0.179 mol/L .

•Solución: se usa formula de microorganismo promedio, y

el valor de C-mol.

•Ecuacion de reacción:

•CH2O + O2 + SO4(NH4)2 ---Yx/s(CH1.79O0.5N0.2) +yp/sP

•Biomasa formada = (6.07 -0.53)/25.8 = 0.215 C-mol/L de

biomasa

•Glucosa consumida = 15.2/30= 0.506 C-mol/L de glucosa

•Rendimiento:

•yx/s = 0.215/0.506 = 0.425

•yco2/s = 0.179/0.506= 0.354.

•Puesto que la suma de yx/s y yco2/s es inferior a 1, es

obvio que se ha formado algún producto:

•yp/s= 1-(0.425 + 0.354) = 0.22

5.- CINETICA DEL CRECIMIENTO

•La velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de células en la unidad de tiempo. •Es una consecuencia del hecho de que cada célula se divide dando dos células hijas, las cuales se dividen luego, cada una en otras dos, de modo que en cada período de división la población se duplica.

•Parametros: •Tiempo de duplicación. •Tasa de crecimiento.μ

Cinetica… •Velocidades del bioproceso:

• rx = velocidad de crecimiento microbiano: C-molbiomasa/L.hr

•del mismo modo:

• rs = = velocidad de consumo de sustrato

•

•rp = = velocidad de formación de producto.

•

•r = velocidad de consumo de O2

•

•r = velocidad de producción de CO2

•Tambien se conocen como tasa de crecimiento.

•Si las velocidades se expresan en g/L.hr, para diferenciarlo del

anterior, se denotan con R. Por ej.:

• Rx = dX/dt : Gr de biomasa/L.hr

• La conversión entre rx y Rx esta dada por:

•Rx = 25,8.rx

d x

d t;

d s C m o l F C E

d t L . h

d p C m o l d e p ro d u c to

d t L . h

2

2

O 2

O

d m o l O

d t L . h

2

2

C O 2

C O

d m o l C O

d t L . h

5.1.- Tiempo de duplicación. g

•Es el tiempo necesario para duplicar una biomasa. •Xo ----g--- 2Xo •Al tiempo 0: X = Xo •Después de: 1 generación X= 2.Xo. •En 2 generaciones X = 2(2Xo.) =22 Xo •En 3 generaciones X = 2(22 Xo)= 23Xo •En n generaciones X = 2nXo , Y =2n.Xo •El número de generaciones en un tiempo t será: n = t/g •Aplicando logaritmos: Log X = log Xo + n log 2 • despejando: n = (LogX-LogXo)/log2 •Sustituyendo log 2= 0.3010, se tiene que 1/0.3010 = 3.3 •n = 3.3(logX – logXo): n = 3.3 log (X/Xo) •Reempazando en g: g= 0.3t/log(X/Xo) •En ln: n= (LnX-LnXo)/Ln2 •O también LnX=nLn2+LnXo •(ln2=0.69), y remplazando n =t/g se tiene: •g =0.693 t/(lnX-lnXo)

Tiempos de generación en bacterias

Bacteria Medio Tiempo de generacion (min)

E. Coli Glucosa-sal 17

Bacillus megaterium Sacarosa-sal 25

Streptococcus lactis Leche 26

Staphylococcus aureum Caldo infusion de corazon 27-30

Streptococcus lactis Caldo lactosa 48

Lactobacillus acidófulus Leche 66-87

Rhizobium japonicum Leche 344-461

Mycobacterium tuberculosis

Sintético 792-932

Ejemplo.2

•Se tienen 1000 bacterias en un medio de cultivo óptimo y después de 4 horas de incubación, creciendo exponencialmente, se obtienen 100 000 bacterias. Calcule el tiempo de generación. •Xo = 1000 •X = 100 000 •t= 4 horas •g =? g = t/n

•Calculo de n de la ec (3): •n = 3.3 log X/Xo , n = 3.3 log 100000/1000 = 6.6 generaciones •Reemplazando en: g =t / n •g = 240/6.6 = 36,36 minutos •Otra forma: con g =0.693 t/(lnX-lnXo) •g= (0.693x4)/(ln100) = 0.602 hr = 36.12 min

Ejemplo 3.

•En un cultivo se tiene inicialmente 5x107 bacterias y

después de 6 horas se tiene 5x108

•Calcule el tiempo de generación

•Ecuaciones:

•n=t/g, : n= (LnX-LnXo)/Ln2

•Reemplazando:

•n = (20-17.7)/0.693

•n = 3.3

•g = t/3.3 = 6/3.3

•Td = 1,8 h

Ejemplo 4.

•En un proceso de fermentación microbiana, se toman datos del conteo celular, obteniéndose los siguientes:

•Calcule el tiempo de generación.

•Solucion por correlación: •La ecuación de la recta es: LnX=1.3863t + 0.00001 •De la Ec. LnX=nLn2+LnXo. •LnX=Ln2(t/g) + LnXo •Se observa que: Pendiente: m = 1.386 = Ln2/g = 0.693/g •g = o.5 h

t (hr) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 X 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 16382

t (hr) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7

X 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 16382

lnX 0 0.7 1.4 2.1 3 3.47 4.16 4.9 5.5 6.2 6.93 7.62 8.32 9.01 9.704

Solución Grafica: (criterio)

La pendiente de la línea de ajuste corresponde a la variación del doble del valor de X en la ordenada y de un valor g en la absisa.

Por tanto: m=Ln2/g

•Se observa que: Pendiente: •m = 1.386 = 0.693/g •g = o.5 h

5.2.- Velocidades específicas: •Las velocidades anteriormente definidas pero referidas a la

unidad de biomasa, seran:

• = ; velocidad específica de crecimiento.

•

• = qs ; velocidad específica de consumo de sustrato

• ; velocidad específica de consumo de O2.

• ; velocidad específica de formación de producto.

• Las velocidades específicas dan información sobre el

metabolismo microbiano, ya que al estar referidos a la unidad de

biomasa, una modificación en el valor de , qs, etc. indica que

"algo" está ocurriendo en el metabolismo de un microorganismo.

•Es frecuente que las velocidades específicas varíen durante el

cultivo.

r

x

x

r

x

s

r

x q

O

O

2

2

r

x q

p

p

6.- CRECIMIENTO EN PROCESOS BATCH

•Al transcurrir el tiempo de cultivo, S va disminuyendo, y por tanto rx, hasta que finalmente S = 0 (fase estacionaria), y rx = 0 • lo que implica: X = cte = Xf • Xf = concentración final de biomasa.

•Variacion de µ con el tiempo

•

6.1.- MODELOS CINETICOS

•Varios modelos conceptuales y matemáticos se han

formulado con el objeto de explicar el comportamiento que

muestran los sistemas biológicos.

•Estos modelos se han clasificado según las

consideraciones asumidas respecto a la estructura de las

células o a la distribución de la población celular.

•La clasificación más general incluye modelos no-

estructurados, y estructurados.

a.- Modelos No-Estructurados • También llamados modelos deterministas, son del tipo de caja negra. Son los modelos más simples para crecimiento microbiano. •Se asume que las células son una entidad en solución. No interesa la estructura celular, ni la diversidad de la población. •Son estrictamente válidos para la fase exponencial en batch. •Desde el punto de vista de límite de sustrato, la relación de tasa específica de crecimiento y concentración de sustrato a menudo adquiere la forma de saturación cinética. Esta concepción cinética es similar a la cinética de Langmuir (Shuler & Kargi, 1992).

•Los mas usados son: Modelo de Monod, Modelo de Contois, Modelo de Mosser, etc.

Modelo de Monod •Monod en 1942 desarrolló una ecuación cinética simple.

•Parte de suponer que sólo una enzima con cinética

Michaeliana es la responsable del consumo de S.

•El modelo asume también que la producción de biomasa

depende exclusivamente de la concentración de un

sustrato limitante. Representación:

Linearizacion del modelo

•La solución empírica del modelo requiere hacer la

linealizacion de Lineweaber-Burk.

•Si la tasa de crecimiento celular esta dada por:

•Le ecuación de Monod, se expresa en función de

velocidad:

•El descenso en la concentración de sustrato esta dado por:

•Considerando la velocidad de muerte se tiene:

•Donde:

•Kd, es la constante de decaimiento endógeno (t-1)

Otros modelos no estructurados

Modelo de Contois.

Muestra una

dependencia de la

tasa específica de

crecimiento, con

respecto a la

concentración de

organismos activos

presentes.

][ SxK

S

sx

m

Ejemplo 5 •Un cultivo BATCH de microorganismos en crecimiento, en sustrato de glucosa, dio los siguientes datos.

TIEMPO

(h)

CONC. CELULAS (X)

(g/l)

ln X CONC. GLUCOSA

(g/l)

0 1.25 0.2231 100.00

9 2.45 0.8961 97.00

16 5.10 1.6292 90.40

23 10.50 2.3514 76.90

30 22.00 3.0910 48.10

34 33.00 3.4965 20.60

36 37.50 3.6243 9.38

40 41.00 3.7136 0.63

•a) Calcular la tasa máxima de crecimiento. •b) Calcular el coeficiente biomasa-sustrato •c) Cuál es la concentración celular máxima que podría esperarse si 150g de glucosa fueron usados con la misma cantidad de inoculo.

•Desarrollo: a . Tasa máxima de crecimiento

Modelo logistico •Los modelos anteriores representan el comportamiento de los m.o, sólo en la fase log de un cultivo batch (donde es constante) •Si se quiere representar todo el proceso, es necesario recurrir al modelo logístico. •Se obtiene combinando la ecuación de Monod con la expresión de μ y la de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).

dX = m(Yx/s.So + Xo – X) . X dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)2

•Esta ecuación describe una curva de crecimiento sigmoidal que tiene la forma de la curva real de crecimiento en cultivos batch, donde el valor de X se acerca asintoticamente a Xo+Yx/s.S

Modelos Estructurados •Estos modelos consideran a la célula como un sistema de

componentes múltiples (ribosomas, enzimas, membranas, etc.).

Por ello dividen a la célula en sus componentes y consideran las

reacciones y cambios metabólicos que tienen lugar en cada zona de

la célula, como respuesta a cambios en el medio.

•Estos modelos consideran: las concentraciones intrínsecas,

(cantidad de un componente por unidad de masa celular) (Ci/X), y

las concentraciones extrínsecas o cantidad de un componente por

unidad de volumen del reactor.

d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt)

dt X.dt X. X

•Al construir el modelo se debe decidir cuantos componentes

celulares se tomaran en cuenta. (de 2 a 40). Un resultado aceptable

se produce usando al menos 3 componentes celulares.

•Con mas componentes el modelo será mas preciso, pero también

mas complejo. •Ci, es la concentración de cada componente.

•Con más de un substrato limitante se pueden usar modelos

multiplicativos, modelos aditivos y modelos nominativos

Modelos segregados

•Los modelos segregados tienen en cuenta que la población celular es heterogénea, por lo que resultan aun mas complejos. •Estos modelos pueden reconocer como diferentes a las "células más viejas" de las "células más jóvenes". (Paz Astudillo) •Tienen en cuenta que el medio no es homogéneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoquímicas del medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). •En el caso de microorganismos filamentosos, el modelo tiene en cuenta los cambios morfológicos que allí se producen, y es, un modelo segregado.(Reyes, 2006)

CRECIMIENTO EN CULTIVO CONTINUO

•Por sus características especiales permite controlar el proceso

a una tasa específica de crecimiento () prefijado.

•Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza

previamente un cultivo batch y en un momento dado,

normalmente antes que se agote el substrato limitante, se

comienza a alimentar con medio de cultivo fresco a un caudal F

•El volumen del cultivo se

mantiene constante. El líquido

que sale del biorreactor, a un

caudal F tendrá células, y una

concentración de nutrientes

menor que en el caudal de

entrada.

Balance de Biomasa •En quimostato, las células crecen y son, simultáneamente, lavadas. El

aumento neto de biomasa estará determinado por los valores relativos

de µ y D en cada proceso.

•Aumento neto de biomasa = Crecimiento -Lavado

•Vdx = Vµ.Xdt -FXdt

•dividiendo por Vdt

•sustituyendo F por D (tasa de dilución, en hr-1 ),

• (8)

•sustituyendo µ por su valor, esta ecuación se convierte en:

• (9)

•Si u > D, entonces dx/dt será positivo y la concentración de

microorganismos en el fermentador aumenta con el tiempo. Si u < D,

dx/dt será negativo, y la concentración de microorganismos disminuirá

con el tiempo, por el efecto de "lavado" del fermentador.

•Balances de materia:

•De acuerdo al esquema, se puede plantear los siguientes

balances de materia.

•

•

•

•

•

• Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P ya no

varían con el tiempo, lo que equivale a igualar a cero estas

Ecuaciones:

•

• y

•donde X, S y P representan las respectivas

concentraciones en estado estacionario.

XFx

rVdt

dXV ...

srVSF

RSF

dt

dSV .

~ . . .

PFP

rVdt

dPV ...

XDX

r~

.

)~

( . SR

SDS

r PD

Pr

~ .

Referencias •Sanz J.L. Microbiología ambiental.

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modelización matemática de procesos. Valencia.

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•Reyes Ocampo Inés. “Difusión y Crecimiento Microbiano de

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Maestra en Ciencias. México, 2006.