Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: José Luis Pérez Sáenz

María de Oña NavarroConcepción Gimeno CardonaJoaquín Mendoza Montero

INDICE

Introducción.

Objetivos generales Diagnóstico de los virus herpes simplex. Diagnóstico serológico

Virus varicela-zoster. Generalidades y necesidad del diagnóstico de laboratorio. Técnicas diagnósticas Aplicabilidad y condicionamientos prácticos de las técnicas.

Citomegalovirus. Importancia de la infección por el citomegalovirus y objetivos del diagnóstico de laboratorio. Diagnóstico de laboratorio. Interpretación de resultados y aplicabilidad de las técnicas.

Virus de Epstein-Barr. Introducción. Mononucleosis infecciosa y virus epstein-barr. Enfermedades tumorales.

Herpesvirus humanos 6 y 7. Introducción y significado clínico. Diagnósco.

PCR y herpesvirus: año 1995. Consideraciones generales. PCR y virus herpes simplex. PCR y virus varicela-zoster. PCR y citomegalovirus. PCR y virus Epstein-Barr. PCR y herpesvirus humano tipo 6.

Sensibilidad a los antivirales: protocolos prácticos. Ensayo de reducción de placas. Ensayo de captación de colorante. Ensayo rápido basado en la titulación del virus por efecto citopático (ECP) y posterior tinción vital. Ensayo de sensibilidad para CMV en muestras sin celularidad. Otros ensayos de sensibilidad.

Compuestos prácticos comentados. Supuesto Nº 1. Supuesto Nº 2. Supuesto Nº 3. Supuesto Nº 4 Supuesto Nº 5.

Bibliografía seleccionada.

8. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LAS INFECCIONES POR HERPESVIRUS1995

INTRODUCCIONLa familia Herpesviridae comprende una serie devirus con DNA (tabla 1) cuya característicabiológica más notable es su capacidad de producirlatencia. Tras la infección primaría, sintomática ono, el virus permanecerá latente en diversos tiposcelulares o tejidos que les son propios a cadamiembro de la familia. Desde aquí, y sin que seconozcan bien los mecanismos íntimos y últimosque desencadenan el fenómeno, se van a producirreactivaciones con replicación y producción denuevas partículas víricas. Además de lasinfecciones primarias y las reactivaciones, enalgunos herpesvirus se ha demostrado laposibilidad de que un individuo sea infectado poruna copa del mismo virus distinta a la que albergade forma latente. Es el fenómeno conocido comoreinfección, cuya extensión o importancia clínicano se conoce satisfactoriamente por el momento.En cualquiera de estas tres circunstancias esposible la apariencia de síntomas clínicosrelacionados con la infección.Los estudios epidemiológicos demuestran quetodos los virus de la familia Herpesviridae sonextraordinariamente ubicuos y están ampliamenteextendidos en la población general. Una sustancialproporción de adultos presentarán anticuerpos,reflejo de una primoinfección en una etapa previade su vida y manifestación de la infección latente.Esto condicionará el diagnóstico serológico y la

interpretación de los resultados de otras pruebasdiagnósticas de laboratorio.En contraste con la gran prevalencia en lapoblación general, la mayor parte de lasinfecciones, sean del tipo que sean, sonasintomáticas. Cuando lo son, oscilanclínicamente desde las benignas a las que cursancon grave compromiso de la salud o la vida delpaciente. Serán estas últimas, y no las primeras,las que motivarán el interés principal deldiagnóstico de laboratorio, máxime teniendo encuenta la inespecificidad de los signos y síntomasclínicos que se presentan.En los últimos años se ha producido una serie decircunstancias que aconsejan la recopilación yanálisis crítico de las técnicas diagnósticas, asaber:a) El impacto que las nuevas tecnologías hantenido sobre las pruebas de laboratorio, o que seprevé tendrán en un futuro próximo. Es el caso dela disponibilidad de anticuerpos monoclonales quesimplifican y generalizan el diagnóstico [herpessimple (VHS), citomegalovirus (CMV),varicelazoster (VVZ)] o ayudan en la interpretaciónde resultados (CMV). También, claro está, lastécnicas de biología molecular, y muyparticularmente la amplificación de ADN por lareacción en cadena de la polimerasa (PCR), queserá motivo de un apartado específico.

TABLA 1Virus de la familia Herpesviridae que producen infecciones en el hombre.

Sinónimo Abreviatura empleada en este númeroSubfamilia AlphaherpesvirinaeVirus herpes simple tipo 1 Herpesvirus humano tipo 1 VHS-1Virus herpes simple tipo 2 Herpesvirus humano tipo 2 VHS-2Virus varicela-zóster Herpesvirus humano tipo 3 VVZSubfamilia BetaherpesvirinaeCitomegalovirus humano Herpesvirus humano tipo 5 CMVHerpesvirus humano 6 Herpesvirus humano tipo 6 HVH-6Herpesvirus humano 7 Herpesvirus humano tipo 7 HVH-7Subfamilia gammahepersvirinaeVirus de Epstein-Barr Herpesvirus humano tipo 4 VEB

b) la descripción reciente de nuevos virus dentrode esta familia, como es el caso de los herpesvirushumanos tipos 6 y 7.c) los nuevos cuadros clínicos asociados a losmiembros, recientes o no, de la familia. Ejemplode ello serían el exantema súbito [herpesvirushumano tipo 6 (HVH-6)] o los síndromeslinfoproliferativos en inmunodeprimidos [virusEpstein-Barr (VEB)].d) la creciente proporción de pacientesinmunodeprimidos atendidos en hospitales y encentros de asistencia primaria, bien a

consecuencia del avance de la medicina(trasplantados, mayor supervivencia deneoplásticos) o por razones coyunturales(fenómeno del SIDA). Es bien sabida la relaciónexistente entre carencias inmunitarias einfecciones por herpesvirus.e) la introducción en la práctica clínica deantivirales eficaces y seguros, con la consiguienteaparición de cepas resistentes, lo que supone unnuevo reto para el laboratorio.

OBJETIVOS GENERALESEn este número trataremos de dar respuesta aalgunos de estos problemas o interrogantes. Losobjetivos concretos serán:a) Revisión crítica de las técnicas disponibles en laactualidad, tanto de las clásicas (serología) comode las más actuales (PCR, detección deantígenos, etc.). Debido a su actualidad, lastécnicas PCR se revisan en un apartadoespecífico.b) Aplicación de las mismas a las diferentessituaciones clínicas.c) Interpretación de los resultados en función decada situación concreta, completándola con casosdiagnósticos comentados que sean ilustrativos, notanto atípicos.

VIRUS HERPES SIMPLEX.Los virus Herpes simplex tipo 1 y 2 (VHS-1, VHS-2) fueron los primeros descritos y, al igual que elresto de virus del grupo afectan a un porcentajemuy elevado de la población general. La infecciónestá mundialmente extendida y entre los 20-40años prácticamente toda la población ha tenidocontacto con el virus.Son virus latentes, como el resto del grupo, y sepueden reactivar y ocasionar nuevas infecciones.Las reactivaciones por VHS-3 son 8-10 veces másfrecuentes que las producidas por VHS-1,

teniendo una media de 4 recurrencias en un añodespués de la infección primaria.La infección herpética afecta tanto a pacientesinmunocompetentes como inmunodeprimidos,aunque en estos últimos la gravedad de losprocesos es mayor. El 80% de pacientesinmunodeprimidos tienen reactivaciones por VHS,siendo las localizaciones periorales las másfrecuentes. Un 10-15% de estas infecciones tienendiseminación hematógena y pueden provocar unaafectación visceral.El espectro clínico de las infecciones por los VHSes amplio, estando implicados en lesionesmucocutáneas locales o generalidades, infeccióngenital, infección ocular, infección congénita yneonatal, afectación neurológica (encefalitis) einfección visceral. La primoinfección herpéticapuede ser asintomática, pero también producirlesiones cutáneas en forma de exantemaveliculoso (infección perioral, perigenital,neonatal). Ocasionalmente producecomplicaciones neurológicas y viscerales enespecial en pacientes inmunocomprometidos.El diagnóstico virológico se puede realizar devarias formas dependiendo en cada ocasión deque haya o no vesículas, de las características delhúesped (edad, inmunoprosucesión, etc.) y delmomento en que se realice la toma de la muestra.

TABLA 2Algunas situaciones que justifican el diagnóstico de laboratorio de los virus del herpes simple.

* Diagnóstico diferencial en las infecciones congénitas y neonatales (herpes neonatal).* Prevención del herpes neonatal (atención: estrategias no bien definidas en la actualidad).* Diagnóstico etiológico de las infecciones del sistema nervioso central (encefalítis).* Diagnóstico de las infecciones generalizadas en inmunodeprimidos.* Establecer el diagnóstico diferencial en formas de presentación clínica inhabituales.* Diagnóstico etiológico del herpes genital y diagnóstico diferencial de úlceras genitales.* Pruebas de sensibilidad a los antivirales (en centros de referencia).

DIAGNOSTICO DE LOS VIRUS HERPESSIMPLEXAtendiendo a los criterios anteriores, la estrategiadiagnóstica será:1.- En los casos donde haya lesión vesiculosala técnica de elección es el diagnóstico directo apartir de improntas tomadas de la lesión. Losportaobjetos con las improntas se fijan en acetonafría durante 15 minutos y se tiñen despues conanticuerpos monoclonales marcados,habitualmente con fluoresceína. La eficaciadiagnóstica de esta técnica está en relación con elestado de lesión, variando desde el 100% en elcaso de vésiculas a un 25% cuando las improntasse realizan a partir de las costras. El diagnósticopuede obtenerse en 30 minutos.

Igualmente debe realizarse una toma de la lesiónpara cultivo de virus, utilizando para ello unatorunda previamente humedecida en el medio detransporte de virus (solución tamponada con rojofenol, antibióticos y una fuente protéica, comoalbúmina). Lo más conveniente es inocular lamuestra inmediatamente, pero si no es posble, sepuede almacenar a 4ºC no más de 48 horas.Los cultivos rápidos rápidos (shell vial) estánindicados también para el diagnóstico precoz de lainfección por VHS-1 y 2. Se realizan inoculando200-300 µl de la muestra de la vesícula porcentrifugación (700 X g, 45 min) sobre unamonocapa de células susceptibles (MCR-5, VEROo BGM) previamente crecidas sobre uncubreobjetos circular. Después de retirar lamuestra y añadir 1 ml de medio de mantenimiento,

se incuban a 37ºC durante 24-48 horas.Posteriormente se tiñen los cubreobjetos conanticuerpos monoclonales frente a VHS-1 y VHS-2marcados con fluoresceína y se observan almicroscopio.Los cultivos convencionales son necesarios paraaislar las cepas y realizar ensayos de sensibilidad,que están indicados fundamentalmente enpacientes inmunodeprimidos. La inoculación de loscultivos convencionales se realiza por absorciónde la muestra a la monocapa celular durante unahora a 37ºC (también se puede realizar porcentrifugación). Se retira la muestra y se añademedio de mantenimiento. Los tubos se incuban a37ºC y atmósfera de 5% de CO2 durante 14 días.Estos tubos se observan periódicamente paravisualizar el efecto citopático característico deVHS. La identificación final se realiza con losanticuerpos monoclonales de tipaje por la técnicade IF directa anteriormente descrita, sobre lascélulas de la monocapa desprendidas, lavadas yfijadas con acetona fría.2.- Cuando no existen lesiones vesiculosasexternas hay que distinguir, a su vez, cuatrocircunstancias:2.a) Procesos clínicos donde se produce excreciónviral: faringitis, uretritis, cervicitis y neumonías(inmunodeprimidos). La detección del virus deberealizarse mediante cultivo rápido o convencional,siendo este último el método más sensible. Lasmuestras de elección son los exudados de la zonaafectada (faringe, uretra, endocervix y lavadosbroncoalveolares en las neumonías). En algunoscasos, como por ejemplo en los exudadosfaríngeos, el aislamiento ha descrito excreción delvirus en un 2% de individuos asintomáticos. En loslavados broncoalveolares, su implicación comoagente etiológico va ligada a la ausencia de otrospatógenos.2.b) Queratitis, esofagitis, proctitis. Las muestrasde elección en estos casos son los raspadoscorneales o biopsias respectivas. En estos casosel diagnóstico se hace mediante IF sobre lasimprontas de las biopsias, cultivo (rápido yconvencional), cocultivo y PCR. La PCR estáindicada sólo cuando los cultivos son raspados yes fundamentalmente útil en los raspadoscorneales, donde el rendimiento del cultivo esmenor. Además, se puede utilizar la secrecciónlagrimal del ojo afectado como muestra para eldiagnóstico por PCR.Para el cocultivo se ponen en contacto15x104células con el triturado de la biopsia en 1,5ml de medio de mantenimiento, suplementado con5% de suero bovino fetal. A las 24 horas y una vezformada la monocapa, se cambia el medio y seincuba a 37ºC y atmósfera de 5% de CO2 durante14 días observándolo periódicamente paravisualizar el efecto citopático.

2.c) Encefalitis: debido a la eficacia y ausencia dereacciones adversas del tratamiento con aciclovir,no suele practicarse biopsia cerebral para eldiagnóstico etiológico. Hoy día, la PCR realizada apartir del líquido cefalorraquídeo (LCR), técnicamucho menos agresiva, se ha convertido en laalternativa diagnóstica de elección. Suele utilizarseuna técnica de doble PCR (nested) o,alternativamente, una PCR simple seguida dehibridación con sonda específica radiactiva obiotinada.La PCR múltiple, en la que se utiliza una mezclade iniciadores de los diferentes herpesvirus, queposteriormente se identifican con unos segundoscebadores específicos para cada uno de ellos. Esuna técnica que ha sido desarrolladarecientemente y con resultados prometedores.2.d) Procesos con clínicos que van acompañadosde viremia (herpes neonatal, herpes generalizadosy viscerales en inmunodeprimidos), en ausenciade lesiones cutáneas. En estos casos se puededetectar antíngeno viral por IF directa o aislar elvirus mediante cultivos a partir de leucocitos desangre periférica. Para la IF directa, con objeto deevitar la contaminación con eritrocitos, la muestrase trata con NH4CI frío (5 minutos a -20º), antes deponerla en el portaobjetos.

DIAGNOSTICO SEROLOGICOSu utilidad se circunscribe al diagnóstico deprimoinfecciones y en estudios epidemiológicos.En las enfermedades del sistema nervioso centraltambién se utilizan los índices de anticuerpos IgGtotales y específicos LCR/suero, junto con elíndice de albúmina (indicativo de barrerahematoencefálica intacta o alterada) parademostrar producción intratecal de anticueposespecíficos.

VIRUS VARICELA-ZOSTERGENERALIDADES Y NECESIDAD DELDIAGNOSTICO DE LABORATORIO.

La infección primaria (varicela) es una enfermedadaltamente contagiosa, con una alta tasa de ataqueen la priemra década de la vida. Sin embargo, unaproporción variable de personas (entre el 4 y el20%) alcanzará la edad adulta siendo todavíasusceptible a la infección. La varicela cursa en elniño normal como una dolencia benigna, coninfrecuentes complicaciones y fácilmentediagnosticable clínicamente. También suelenreconocerse con facilidad por sus manifestacionesclínicas las reactivaciones del virus (herpes zóster)en el húesped normal. Por contra, el pacienteinmunodeprimido es un terreno abonado para lapresentación de formas complicadas, inclusofatales, tales como la neumonitis o la encefalitis.También el cuadro clínico en la afección cutánea

tiende a ser atípico. El VVZ es un agente bienconocido de infección materna y neonatal, aunqueinfrecuente en términos absolutos y relativos.Aunque es posible la infección intrauterina en lasprimeras etapas de la gestación, con gravesconsecuencias para el feto, esta situación esextremadamente rara, siendo más frecuentesaquellas que se producen en el período próximo alparto, desde 7 días antes hasta 4-5 días despuésdel mismo. Recientemente se ha introducido unavacuna de virus atenuados (cepa OKA) quemodifica el curso de la infección hacia formas másleves, tanto en inmunodeprimídos como enpacientes normales, si bien las indicaciones noestán bien establecidas.

De acuerdo con lo expuesto, los objetivos deldiagnóstico de laboratorio serán (Tabla 3): a)diagnóstico diferencial rápido de las infeccionesmucocutánteas en paciente inmunodeprimidos, b)diagnóstico de las formas clínicas graves y pocohabituales, como la afectación del sistemanervioso central o la neumonitis, c) conocimientodel estado inmunitario en pacientes de alto riesgopresentar complicaciones, o de sus cuidadoressanitarios, y d) evaluación de la eficacia protectorade la infección natural y de la vacuna. Los dosprimeros métodos de diagnóstico directo. Losúltimos son tributarios del diagnóstico serológico.

TABLA 3Objetivos y justificación del diagnóstico de laboratorio del virus varicela-zóster.

* Confirmación del diagnóstico clínico en formas inhabituales y/o graves de la infección (v.g., neumoníavaricelosa del adulto) * Diagnóstico diferencial de las infecciones del sistema nervioso central * Diagnóstico rápido de las infecciones diseminadas (varicela o zóster) en inmunodeprimidos. * Diagnóstico rápido diferencial de las infecciones mucocutáneas (con frecuencia atípicas) de lospacientes inmunodeprimidos. * Determinación del status inmunitario en niños inmunodeprimidos por cáncer o neoplasiashematológicas, o por deficiencias congénitas o adquiridas. * Conocimientos de la susceptibilidad a la infección en mujeres en edad fértil. * Determinación del estado inmunitario en personal sanitario al cuidado de pacientes de riesgosusceptibles. * Selección de candidatos y determinación de la eficacia de la vacuna.

TECNICAS DIAGNOSTICASMétodos serológicosDe las diversas técnicas serológicas disponiblespara el laboratorio (Tabla 4), la más clásica es laprueba de fijación de complemento. En laactualidad está siendo desplazadaprogresivamente en los laboratorios asistencialesdebido a su laboriosidad, escasa flexibilidad y,sobretodo, a su falta de sensibilidad. No es apta,en consecuencia, para estudiosseroepidemiológicos ni para la determinación delstatus inmunológico en pacientes de riesgo(ejemplo, niños con leucemia), ni tampoco paraevaluar la susceptibilidad del personal sanitario ocuidadores.Las pruebas ELISA son las más generalizadas.Existen reactivos comerciales que permiten ladetección de anticuerpos de las clases IgG e IgM.Las técnicas ELISA han demostrado una gransensibilidad, a veces comparable (98%) con elmétodo de fluorescencia antimembrana (FALMA).También son buenos marcadores desusceptibilidad a la infección, y es probablementeaquí donde tendrán sus principales aplicaciones.Suelen positivizarse a los pocos días de laaparición del cuadro de varicela. En el herpeszóster se detectan concentracciones altas deanticuerpos en fases iniciales del cuadro. La

detección de IgM no permite diferenciarnecesariamente la varicela del herpes zóster. Estadeterminación, en cambio, podría ser útil con finesdiagnósticos en la fase avanzada de las lesionescutáneas (costras). Las pruebas ELISA sonadaptables a las rutinas diagnósticas y sonparticularmente útiles para el trabajo en lotes, noson métodos flexibles. Es fundamental que cadalaboratorio realice su propio control de calidadsobre los reactivos comerciales a utilizar.Recientemente se ha comercializado una pruebade látex para detección de anticuerpos del VVZ.La sensibilidad puede ser mayor incluso que la dealgunos ELISA comerciales para determinar elestado inmunitario frente al virus. La prueba es,por definición, muy sencilla de realizar y flexible.Suele presentar fenómeno de prozona, lo queobliga a realizar diluciones que multiplican sucoste.Los métodos FAMA y de fluorescencíaanticomplemento deben considerarse comotécnicas aplicables en laboratorios de referencia.

Tinciones convencionales: prueba de TzanckLa prueba de Tzanck, esto es, la tinciónconvencional del material celular procedente delraspado de las lesiones es una prueba rápida ysencilla aplicable a las infecciones mucocutáneas.

En caso positivo se observa la presencia decélulas gigantes multinucleadas con Tzanck essensible (hasta el 85%), pero no permitediferenciar el VVZ de los VHS.

Detección directa de antígeno de VVZ enraspados de lesiones.Constituye en la actualidad el método de elecciónpara las infecciones cutáneas. Además de susencillez y flexibilidad, la sensibilidad del métodopuede alcanzar el 100% en las lesionestempranas. Puede llevarse a cabo medianteinmunofluorescencia directa (más rápida) oindirecta (recomendable). Permite confirmar unasospecha diagnóstica en 1-2 horas, con elevadaespecificidad en manos de técnicos entrenados laespecificidad cercana al 100%. Si se utilizananticuerpos monoclonales no hay reactividadcruzada con los VHS. La detección directa puedeefectuar el diagnóstico en lesiones de más de 5días de evolución, e incluso si se toman en los 3primeros días de tratamiento antiviral.

Métodos basados en el cultivoEl VVZ es un virus muy asociado a los sistemascelulares y que pierde fácilmente viabilidad.Incluso en las condiciones más optimas, la

sensibilidad del cultivo convencional en tubo nosupera el 60% si lo comparamos con la detecciónde antígeno por inmunofluorescencia. El tiempo deevolución afecta negativamente al aislamiento delvirus en cultivo (no suele aislarse en muestrasobtenidas después de los 5 días desde el inicio delcuadro), al igual que el tratamiento antiviral. Noexisten muchos sustratos celulares que soportenbien el crecimiento del VVZ. En general, lascélulas diploides de pulmón embrionario humano,como los fibroblastos MCR-5, dan resultadossatisfactorios y pueden obtenerse de fuentescomerciales. El efecto citopático característico nosuele aparecer antes de los 4 días de inoculadoslos tubos y la media se sitúa en torno a unasemana. El método de cultivo en shell vial utilizaanticuerpos monoclonales frente al VVZ paradetectar los cultivos positivos antes que el efectocitopático sea evidente. Con ello se adelanta eldiagnóstico a las 24-48 h. Aunque la sensibilidadfrente al cultivo en tubo es ligeramente mayor, nosupera a la detección directa de antígeno. En laexperiencia de los autores no muestra ventajasdefinitivas.

TABLA 4Técnicas diagnósticas disponibles para el virus varicela zóster

Técnica Ventajas Inconvenientes Aplicación

DiagnósticoserológicoFijación decomplemento Laboriosa Progresivamente en desusoMétodos habituales en

el laboratorio Poco sensibleAntígenos comerciales Poco flexible

Enzimoinmunoanalísis (ELISA) Metodología habitual Determinación de estado

inmunológico

Antígeno comercial

Contrastar la eficacia dereactivos comerciales Soporte de algunos diagnósticos

clínicosTrabajo en lotesSensibilidad

Reacciones heterotípicascon el VHS

Detección IgG e IgMAglutinación conlátex Sencillez, flexibilidad Precio comercial Susceptible a la infección

Sensibilidad Fenómeno prozona Cribaje de vacunaciónComercializado

Fluorescenciaantimembrana(FAMA)

Máxima sensibilidad Muy labioroso Encuestas serológicas dereferencia

Experiencia Susceptibilidad a la infecciónCorrelaciónsusceptibilidad a lainfección Cultivos celulares Confirmación de algunos

diagnósticosCentros de referencia

Detección deantígeno Rapidez, sencillez Cierta experiencia

Sensibilidad,especificidad Correcta toma muestras

Diagnóstico etiológico en casosatípicos (pacientes HIV, etc)

Diagnóstico enpacientes tratados Sólo infección cutánea Diagnóstico diferencial con otros

herpesvirusMétodo de cultivoCultivo en tubo Experiencia en cultivos Confirmación en casos atípicos

Deficiente sensibilidad Diagnóstico diferencial con otrosherpesvirus

Afectada por tratamientoMomento de la muestra

Especificidad

Tardanza en resultadosCultivo en shellvial Rapidez Cultivos celulares Confirmación casos atípicos

Especificidad Afectada por tratamiento Diagnóstico diferencialCorrecta toma muestrasExperiencia

AmplificaciónADN (PCR) Sensibilidad Laboriosidad

Contaminaciones

Diagnóstico de infecciones delSNC

Experiencia

APLICABILIDAD Y CONDICIONAMIENTOSPRACTICOS DE LAS TECNICASLa detección de anticuerpos puede aplicarse, enteoría, tanto al diagnóstico de las infeccionesactivas como a la determinación del estado

inmunitario de una persona frente al VVZ. Para loprimero, la serología tropieza con tres obstáculos:a) las reacciones heterotípicas que se producenpor el estímulo de los antígenos comunes del VVZy los VHS (ambos virus guardan notable similitud

biológica), b) en el retraso en la producción deanticuerpos en la infección primaria, siendonecesario obtener muestras de suero de las frasesaguda y de convalecencia (no menos de 2semanas después), y c) la respuesta serológicapuede verse alterada en los pacientesinmunodeprimidos.Recomendamos reservar las pruebas serológicassobretodo para conocer el estado inmunitariofrente al virus. Aquí son posibles variassituaciones a las que se adaptan las diversaspruebas. En las encuestas seroepidemiológicas,serán aplicables las pruebas ELISA de calidadcontrastada porque son aptas para el trabajo enlote y de lectura objetiva. Cuando se deseeconocer la susceptibilidad al virus en pacientes dealto riesgo (niños con cáncer candidatos aquimioterapia o radioterapia, por ejemplo) seoptará por una prueba ELISA o un látex, conpreferencia por esta última en caso de necesitarun resultado inmediato. A resaltar que lainmunodepresión puede enmascarar el resultado.También puede ser interesante conocer el estadoinmunitario frente al VVZ en el personal sanitario,cuidadores o familiares que atienden a lospacientes de alto riesgo y en la embarazadaexpuesta a un contacto con varicela zóster.En este sentido, es obligado recordar que laexistencia de antecedentes de haber pasado lainfección es un marcador fiable de protección, porlo que no se necesitará ninguna acción adicionalen caso afirmativo. Si no es así realizaremospruebas de ELISA o de látex, sobretodo si lagestación está en sus 2-3 últimas semanas,aunque la prueba con látex se adapta mejor aldiagnóstico individual.No está muy clara la estrategia para selección decandidatos a la vacuna. Probablemente deberáhacerse primero un despistaje de personas conantecedentes históricos de la infección. Cuando noexistan, las pruebas más idóneas serán los ELISA.El diagnóstico de las infecciones (primarias o no)localizadas en piel o mucosas debe estarrestringido a las situaciones con presentaciónclínica atípica o cuando haya que establecer undiagnóstico diferencial, como suele ocurrir en lospacientes inmunodeprimidos. La técnica deelección será aquí la detección directa de antígenoviral, pero su eficiencia dependerá en gran medidade la correcta toma de muestra. Es necesariofrotar vigorosamente la base de la lesión paraobtener material celular. La detección directatambién puede aplicarse a biopsias por punción ya cortes histológicos. Si se dispone de cultivo,deberá intentarse para cubrir la eventualidad de unmuestreo deficiente.En los pacientes inmunodeprimidos puedeobservarse la infección diseminada con afectacióndel sistema nervioso y, a veces, debe hacerse eldiagnóstico diferencial con otros neuropatógenos.

El rendimiento del cultivo sobre muestra de LCRes muy bajo. Lo recomendable en esta situaciónes realizar una amplificación por PCR (ver másadelante) en un centro que disponga de estatécnica.

CITOMEGALOVIRUSIMPORTANCIA DE LA INFECCION POR ELCITOMEGALOVIRUS Y OBJETIVOS DELDIAGNOSTICO DE LABORATORIOSe calcula que en torno al 80% de la poblaciónadulta en nuestro país está infectada por el CMV.Buena parte de estas infecciones se contraendurante la gestación, la lactancia o en la edadpreescolar o escolar. El virus puede transmitirsecon gran probabilidad por la saliva y por vía sexual(picos de incidencia en guarderías infantiles y enadultos jóvenes) y, con toda certeza, a través de lasangre, de sus derivados y de los órganostrasplantados La infección activa por el CMV, estoes, la existencia de replicación vírica, puede serreflejo de una infección primaria, de la reactivaciónde una cepa latente o de la reinfección en elhúesped normal suele ser asintomática. Cuandoexisten síntomas, se manifiesta como un síndromemononucleósico y, más raramente, bajo la formade hepatitis.La situación es muy diferente en el pacienteinmunodeprimido que tiene alteradas sus defensascelulares, como los trasplantados de órgano sólidoo de médula ósea, los neoplásicos, los que sontratados con sustancias que deprimen lainmunidad celular (corticoides, ciclosporina, etc.) ylos pacientes infectados por el VIH. En ellos lasinfecciones activas son muy frecuentes, por logeneral debidas a reactivaciones de un viruslatente. El espectro clínico variará mucho, desdelas formas asintomáticas a las que cursan congrave compromiso de la vida del paciente; encualquiera de los casos con manifestacionesclínicas inespecíficas. No todas las infeccionesactivas que se producen en estos pacientes seasociarán necesariamente a manifestacionesclínicas (enfermedad por CM\I), circunstancia queplantea retos diagnósticos adicionales.El CMV es la causa más frecuente de infeccionescongénitas y neonatales. Se calcula que entre el0,5 y el 2,5% de los recién nacidos vivos contraendurante el parto o por la lactancia materna (hastaun 40% de niños infectados durante el primer añode vida.). Por suerte, la mayor parte de infeccionescongénitas y sólo una mínima proporción de losrestantes presentará un cuadro grave deenfermedad citomegálica con afectaciónneurológica. Incluso en los casos másdesfavorables, raramente el recién nacidopresentará síntomas en el momento delnacimiento. De nuevo los síntomas son poco

específicos y obligan al diagnóstico diferencial conotras etiológias bacterianas y víricas.Las pruebas de laboratorio se justifican conarreglo a las siguientes líneas generales: a)determinación del estado inmune frente al virus, b)

diagnóstico de la infección activa, c) investigaciónde marcadores pronósticos para la enfermedadpor CMV, y d) detección de la resistencia a losantivirales en uso (Tabla 5).

TABLA 5Necesidad del diagnóstico de laboratorio del citomegalovirus humano

*Conocimiento del status inmune de la población o de ciertos grupos (encuestas seroepidemiológicas). *Determinar la susceptibilidad al virus en los pacientes de alto riesgo (trasplantados). *Determinación del estado inmunitario en donantes de órganos sólidos o médula ósea. *Diagnóstico diferencial de la infección en el neonato. *Diagnosticar las infecciones activas (primoinfecciones o reactivaciones) en los pacientes con riesgo dedesarrollar infecciones sintomáticas. *Diagnóstico diferencial de la infección sintomática (enfermedad por CMV) en los pacientes infectados. *Establecer un pronóstico en las personas de riesgo, con el fin de guiar la terapia antiviral. *Detección de la resistencia a los antivirales.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIOEn la tabla 6 se resumen las principales ventajas e inconvenientes del amplio abanico de técnicasdisponibles.

TABLA 6Técnicas aplicables al diagnóstico de la infección y la enfermedad y la enfermedad por el

citomegalovirus humano

Técnica Ventajas Inconvenientes Aplicación

DiagnósticoserológicoFijación decomplemento

Detección de aumento deltítulos de anticuerpos Laboriosa No se recomienda hoy como

técnica de partidaInsuficiente sensibilidad

Antígenos comercialesEnzimoinmunoanálisis(ELISA) Metodología familiar Controlar la eficiencia de los

reactivos comercialesDeterminación de estadoinmunológico

Diponible en el mercado Soporte de algunosdiagnósticos clínicos

Sensibilidad Poco flexibleDetección IgG e IgMProcesamiento en lotes

Aglutinación con látex Elevada sensibilidad Interpretación subjetiva Serológia pretrasplante dedonante y receptor

Sencillez, flexibilidad Fenómeno prozona Susceptibilidad a la infecciónInmunofluorescenciaindirecta (IFI) Sensibilidad Escasa especificidad en la Detección de IgM, en ciertas

condicionesDetecta IgG e IgM detección de IgG (suero absorbido)Flexibilidad

Prueba defluorescencia Sensibilidad Laboriosidad Centros de referencia

anticomplemento(ACIF) Experiencia técnica

Cultivos celularesSólo detecta IgG

Histopatología Técnicas habituales Sensibilidad insuficiente Diagnóstico de la afectaciónfocal por el CMV

Buena correlación con lasmanifestacciones clínicas

Detección deantígenoPrueba deantigenemia Mayor sensibilidad Estandarización Control en trasplantados

(extractos deleucocitos) Especificidad Experiencia propia para Diagnóstico de enfermedad

Rapidez, sencillez su interpretaciónCuantificable

En otras muestras Detección in situ Sensibilidad variable Lavado broncoalveolarInmunohistoquímica

Método de cultivoCultivo en tubo Especificidad Experiencia en cultivos Diagnóstico de la infección

congénita

Insuficiente sensibilidad Confirmación en casosatípicos

Tardanza en resultadosCultivo en shell vial Rapidez Disponer de cultivos Seguimiento de trasplantados

Especificidad celulares Diagnóstico rápido diferencial

Sensibilidad Experiencia en diferentes tipos demuestras

Amplificación ADN(PCR) Sensibilidad Dificultad técnica Infecciones del SNC

Pruebas serológicasDe las diversas técnicas serológicas para CMV,las más utilizadas son la aglutinación pasiva conlátex, la fijación de complemento (FC), las técnicasde inmunofluorescencia y los métodosinmunoenzimáticos (ELISA). Aunque estas últimasse han impuesto en la mayoría de laboratorios porrazones de tipo práctico (familiaridad con lametodología, existencia de reactivos comercialesde calidad contrastada, posibilidad de realizar eldiagnóstico en un amplio número de muestras a lavez, etc.), la elección de la técnica a empleardependerá de condicionamientos propios de cadalaboratorio.La técnica de FC es el método clásico dedeterminación de anticuerpos anti CMV. Pone demanifiesto anticuerpos de la clase IgG y se aplicaa la determinación del nivel basal, al diagnósticode seroconversión y a la demostración de títuloscrecientes de anticuerpos. La prueba FC detectasólo cantidades notables de anticuerpos y, engeneral, presenta insuficiente sensibilidad. Enalgunos estudios no alcanza el 65% comparadacon otros métodos, lo que se traduce en dificultadpara detectar seroconversión o aumento del títulode anticuerpos. Debido a su laboriosidad técnica,no es recomendable para aquellos laboratoriosque se inicien en la detección de anticuerpos anti-CMV.Las técnicas de inmunofluorescencia (IF) utilizancomo fuente de antígeno un microcultivo de CMVen fibroblastos humanos y son aptas para detectaranticuerpos de las clases IgG e IgM. Lasensibilidad es mayor que la de la prueba de FC.El mayor problema de la técnica estándarfluorescente es su baja especificidad, con falsospositivos que alcanzan hasta el 34% en ladetección de anticuerpos IgG. Ello se debe a queel CMV induce receptores Fc en el citoplasma delos fibroblastos que reacionan inespecíficamentecon inmunoglobulinas de la clase IgG. La varianteconocida como inmunofluorescencia anti-complemento (ACIF) permite eliminar muchosfalsos positivos y la especificidad puede alcanzarel 98% en la detección de IgG, pero sólo esaplicable en laboratorios de referencia.Hay en el mercado reactivos que detectananticuerpos frente a CMV mediante la aglutinaciónpasiva de partículas de látex sensibilizadas. Estatécnica es rápida (5-10 min), sencilla de realizar yde lectura fácil. La sensibilidad es elevada,superior a la inmunofluorescencia y algo menorque los métodos ELISA y su especificidad superael 95% en los distitintos estudios. Estascaracterísticas convierten a la prueba látex en unatécnica de gran utilidad en el cribaje pretrasplantede donantes y receptores, así como para conocerel estado inmune de los pacientes. La aglutinacióncon látex presenta fenómeno de prozona, lo queimplica realizar diluciones del suero problema, a la

vez que una cierta tardanza en positivizarse tras laprimoinfeccion. La variante cuantitativa no estábien evaluada.Las técnicas ELISA han supuesto también un granavance en el diagnóstico serológico de CMV. Sonrazonablemente rápidas (3-4 h), automatizables,de lectura objetiva y los reactivos estáncomercializados. El equipamiento es común aotros patógenos y familiar a los laboratoriosactuales. Pueden ser cuantitativas y detectaranticuerpos de las clases IgG e IgM. Los métodosELISA son también los más sensibles,comparables a la técnica ACIF en laboratorios dereferencia. Salvo ciertas experiencias puntualesnegativas -aunque ilustrativas- con reactivoscomerciales, la especificidad en la detección deanticuerpos IgG es muy elevada, por encima del98%. De nuevo hay que subrayar la necesidad deque cada laboratorio evalúe en su medio la utilidadreal de los sistemas comerciales ELISA.La detección de anticuerpos IgM específicos deCMV por IF o ELISA constituye un apartado departicular importancia en este virus, pues permitea priori establecer diagnósticos de infecciónreciente. Las técnicas indirectas presentan falsosnegativos por competición específica entre IgG eIgM por el antígeno viral, lo que ocurre enpresencia de títulos altos de las primeras. Losfalsos positivos se producen por la presencia defactor reumatoide que reaccionainespecíficamente con otras IgG. Para obviarestos problemas pueden seguirse diversosmétodos de absorción de las IgG o del factorreumatoide. Son muy recomendables las técnicasELISA de captura.En la práctica real, el mayor interés de losmétodos serológicos se centra sobretodo en ladetección del estado inmune de los pacientestrasplantados y sus donantes. Las pruebas deelección serán aquellas que muestren mayorsensibilidad. A falta de otras técnicas, la serologíapodría aplicarse también al diagnóstico de lasprimoinfecciones sintomáticas en el huéspednormal. Tanto la seroconversión como ladeterminación de IgM específica conducirían aldiagnóstico en este caso. Por razones prácticas,recomendamos un método ELISA de calidadcontrastada y debidamente controlado o laaglutinación pasiva con látex, de sencilla y flexiblerealización para la determinación de anticuerposIgG. Para la determinación de IgM esrecomendable utilizar un método ELISA de capturapara evitar falsos positivos.Al margen de los problemas técnicos, las pruebasserológicas muestran varias limitaciones en eldiagnóstico de la infección activa por CMV. Lospacientes inmunodeprimidos pierden capacidadpara desarrollar una respuesta inmune adecuada,lo que hace que sea difícil detectar laprimoinfección (seroconversión) o la reactivación

(aumento en el título de anticuerpos). Con todo, lamayor desventaja de la determinación deanticuerpos IgG es la tardanza en obtenerresultados, lo que les resta interés en el manejo delos pacientes de riesgo. Las pruebas que detectanIgM son más rápidas pero, además de otrosproblemas ya apuntados, pueden dar falsospositivos biológicos por el estímulo antigénicopoliclonal de los VEB y VVZ. Tampoco permitedistinguir la primoinfección de la reinfección en losinmunodeprimidos (como los trasplantados).Algunos autores han referido una adecuadasensibilidad para el diagnóstico de la infecciónactiva así, la respuesta es tardía, fuera del período<<clínicamente útil>>.

Técnicas histológicas y detección de antígenosLas tinciones convencionales pueden aplicarse aldiagnóstico de CMV en muestras de tejidos(pulmón, hígado, cerebro, biopsias del tractodigestivo, etc.), así como a preparacionesprocedentes de lavados broncoalveolares (LBA).En estos casos es posible observar la presenciade inclusiones intranucleares basófilas decromatina viral rodeadas de un halo que marginala cromatina celular al borde de la membrananuclear (imagen en <<ojo de búho>>). Aunque,siendo estrictos, las imágenes podrían confundirsecon las producidas por otros herpesvirus, el mayorproblema estriba en la insuficiente sensibilidad. Laaplicación de los anticuerpos monoclonales entécnicas de inmunohistoquímica confiere unamayor especificidad, pero no aumenta lasensibilidad. Las tinciones inmunofluorescentes oinmunoenzimáticos con monoclonales se hanaplicado con buenos resultados de sensibilidad yespecificidad al diagnóstico de la neumonitis enpacientes de alto riesgo, sobre muestras de LBA.Los monoclonales más aptos con este fin son losdirigidos frente a antígenos tardíos estructurales.

Prueba de antigenemia CMVEsta técnica ha demostrado ser un avancesignificativo en el diagnóstico y seguímiento depacientes de riesgo. Consiste en detectar lapresencia de antígenos del virus en los leucocitosextraídos de sangre periférica, por tinciónfluorescente o inmunoenzimática. La antigenemiapresenta una serie de ventajas teóricas como sonla sencillez de realización, la accesibilidad amuchos laboratorios, la familiaridad con lametodología y la rapidez en obtener resultados: esposible detectar la presencia del CMV en al sangreen 4-5 horas. Es factible cuantificar la presenciade células que expresan el antígeno, lo queposibilita a priori utilizar la prueba como marcadordiagnóstico, pronóstico y en el control deltratamiento.La sensibilidad de la antigenemia, tomando comoreferencia los métodos de cultivo en condiciones

óptimas, puede alcanzar el 120%. Al rebajar elumbral de detección del virus en sangre permiteadelantarse en una media de siete días aldiagnóstico por cultivo. La mayor sensibilidad nose traduce en inespecificidad tras un mínimoadiestramiento. Para conseguir la mayor fiabilidady reproductividad es preciso realizar la técnica encondiciones al lector a revisiones documentadas.En síntesis, el antígeno viral más idóneo para ladetección es, por el momento, la fostoproteína dematriz pp65. Existen en nuestro país diversosanticuerpos monoclonales frente a esta proteínade calidad constrastada. La fijación de laspreparaciones con acetona. El antígeno muestralabilidad, por lo que el procesamiento de lamuestra de sangre no se demorará más allá de las18 horas, preferiblemente en las 4 primeras horas.

Cultivo convencional y método shell vialEl CMV humano es un virus con gran especificidadde especie y sólo las células diploides humanasson capaces de soportar su crecimiento in vitro.Existen diversas líneas de este tipo que puedenadquirirse comercialmente; de ellas, losfibroblastos de pulmón embrionario humano MCR-5 o WI-38 son las más utilizadas. En nuestro paíspueden ser suministradas en tubos o viales listospara su inoculación, lo que facilita el acceso aestas técnicas por parte de laboratorios conlimitaciones estructurales. La forma más habitualde cultivar el virus es mediante tubos y lapositividad se detecta por la presencia de unefecto citopático característico. El CMV es uno delos herpesvirus con tiempo más largo dereplicación, lo que se traduce en la tardanza dedesarrollar el efecto citopático (y en confirmar eldiagnóstico). En la práctica, éste se observa, portérmino medio, al cabo de 10 días, plazoincompatible con la terapeútica específica. En lainfección congénita, los neonatos suelen excretarel virus en orina y otras secreciones enconcentraciones muy elevadas, lo que se traduceen el desarrollo de un efecto citopático muyprecoz, incluso a los dos días de incubación,siendo el cultivo de orina el método de referencia.Otro problema del cultivo es la labilidad del virusque restringe la posibilidad de remitir las muestrasa centros de referencia. En ciertos tipos demuestras (LCR, etc.) la sensibilidad del cultivoresulta insuficiente.El método de cultivo conocido como técnica shellvial (SV) ha permitido obviar algunos de losinconvenientes del cultivo en tubo y supuso en sudía un avance significativo en el diagnóstico delCMV. Detecta los antígenos inmediato-tempranosvirales producidos en el cultivo medianteanticuerpos monoclonales. La sensibilidad seincrementa por centrifugación de la muestra sobremonocapas de fibroblastos formadas sobrecubreobjetos redondos de vidrio colocados en el

fondo de un vial redondo (de ahí el nombre de latécnica). En la práctica, el método SV permiterealizar diagnósticos tras incubación durante 24-48horas. Se puede adquirir el material desuministradores comerciales. Para la detección enSV se emplean tinciones fluorescentes oenzimáticas. Existen diversos monoclonales omezclas de varios comercializados en nuestropaís. Aunque la elección dependerá de lascondiciones individuales de cada laboratorio, hayque señalar que, al menos, deben contener unanticuerpo dirigido contra un antígeno inmediato-temprano. No son aptos los reactivos contraantígenos tardíos, como los utilizados en laspruebas de detección directa. La técnica SV hademostrado tener una buena sensibilidad,permitiendo ampliar el diagnóstico en un 15-20%respecto al cultivo convencional en tubo. Existeunanimidad entre los diferentes laboratorioscuando se trata de muestras de orina,orofaríngeas y respiratorias. Algunos laboratoriosrefieren menor sensibilidad que el cultivo con lasmuestras de sangre, pero no es ésta laexperiencia de todos los autores. Salvo errores detipo técnico, la especificidad es casi completa.

INTERPRETACION DE RESULTADOS YAPLICABILIDAD DE LAS TECNICASDebido a las particularidades biológicas del CMV,la interpretación de los resultados de laboratoriopresenta dificultades. Con ánimo simplificador,consideraremos a las pruebas serológicas comolos métodos idóneos para documentar unainfección pasada (determinación del estadoinmune frente al virus) y a las técnicas de cultivo odetección de antígeno como las más apropiadaspara establecer una infección actual.

Problemas diagnósticos y pronósticos en elembarazoEl diagnóstico en la mujer gestante y su utilidadpráctica representa un reto no resuelto por lastécnicas de laboratorio, y ello por varias razones:a) el riesgo de complicaciones significativas parael recién nacido es muy bajo en caso de unareactivación materna o de una primoinfecciónfuera del primer trimestre de embarazo; b) no esposible identificar los casos concretos con riesgode presentar complicaciones graves en elnacimiento, ni siquiera dentro de las queadquieren la infección durante el primer trimestre;c) es díficil, en la práctica, determinar el momentopreciso de adquisición de la infección primaria enla madre;d) probablemente, muchos fetosgravemente afectados por el virus conducen aaborto espontáneo. En consecuencia, las pruebasde laboratorio actuales son incapaces de orientaractuaciones terapéuticas definidas, razón por laque no se recomienda el cribaje sistemático deanticuerpos anti-CMV en la embarazada. Si es

recomendable, con carácter general, conservar unsuero obtenido durante el embarazo, con el fin deayudar en el diagnóstico diferencial de unahipotética infección congénita clínicamentemanifiesta en el recién nacido.

Diagnóstico de la infección congénitaEl aspecto más importante para la prueba delaboratorio en este contexto es establecer undiagnóstico inequívoco. En estos caso los cultivosde orina o saliva (que suelen ser positivos y conun eleveado inóculo viral), conducen a undiagnóstico de confirmación rápido que puede serfacilitado por la técnica shell vial. También puedellegarse por detección de anticuerpos IgMmediante un ELISA de captura o con absorción defactor reumatoideo. La detección de IgG carece deinterés en estos supuestos. Lo más habitual esque la necesidad de un diagnóstico diferencial sepresente más allá de los tres meses de vida. Enese momento, la positividad de un cultivo o de unadeterminación de IgM no conduce a diferenciar sise trata de una infección congénita o perinatal (lomás frecuente y con escasas repercusiones, porotra parte). Si se dispone de sueros maternosobtenidos durante la gestación y tras el parto, esposible que nos aclaren la situación, pero sólo sidemuestra seroconversión o presencia de IgM enla gestación (confirma la adquisición congénita) ola seronegatividad tras el parto (la excluye).

Diagnóstico en el paciente inmunodeprimidoYa nos hemos referido en apartados anteriores alescaso interés de las pruebas serológicas paraeldiagnóstico y pronóstico de las infecciones eneste tipo de pacientes, lo que es particularmentecierto en los pacientes con SIDA. Los métodosrecomendados aquí serán el cultivo (o el shell vial)y la detección de antígeno. Un aspecto importantees el tipo de muestra a analizar. El seguimiento detrasplantados suele incluir muestras seriadas desangre, saliva y orina en los 2-3 primeros mesespostrasplante, el período de mayor riesgo decomplicaciones significativas. Estudios recientesdemuestran el mayor interés de la detección ensangre, por varias razones: a) con los métodosactuales, la sangre es un marcador de infeccióntan sensible o más que la orina o saliva, b) ladetección en sangre suele preceder en el tiempo alas otras muestras y, más importante, c) ladetección en sangre se asocia con mayor riesgode presentar infección sintomática (enfermedadpor CMV). A favor del cultivo de orina está el seruna buena fuente de inóculo viral para realizarpruebas de sensibilidad. Así, en ciertascondiciones, poría suprimirse el seguimiento enorina y saliva de los trasplantados, centrándose enlas determinaciones en sangre. La recomendaciónde no utilizar la saliva o la orina para el diagnóstico

de los pacientes infectados con el VIH es casidefinitiva.El valor de la detección del virus o sus antígenosen muestras procedentes del lugar de la infección,como las biopsias, se asocia con gran probabilidadde que el cuadro esté causado por el CMV,sobretodo si se acompaña de histopatologíacompatible. Un caso particular es el lavadobroncoalveolar. En los pacientes con SIDA tienebajo o nulo valor predictivo. En los trasplantadosde pulmón, por contra, tiene una gransignificación. En los trasplantados de médula óseala detección de CMV no establece necesariamenteel diagnóstico actual de neumonitis, pero es unclaro factor de riesgo para su desarrollo futuro.El mayor reto de las pruebas diagnósticas en lospacientes inmunodeprimidos es diagnosticar lainfección sintomática. Más interesante aún seríadisponer de marcadores pronósticos queidentificasen aquellos pacientes con riesgo depresentar complicaciones graves. Las técnicas conalta sensibilidad para detectar la infección activa -como la prueba de antigenemia cualitativa y laPCR- tendrán menor valor predictivo positivo parala enfermedad. Sin embargo, como las infeccionessintomáticas se asocian con una mayor cargaviral, la cuantificación de la antigenemia ayudamucho en el diagnóstico diferencial en un contextode manifestaciones clínicas inespecíficas. Laexperiencia demuestra que la presencia de cifrasaltas de antigenemia se asocia con los síntomas.No está del todo definido el valor pronóstico deesta prueba.La técnica PCR es excesivamente sensible y supositividad no se correlaciona con lasintomatología clínica. Por ahora, las variantescuantitativas no están al alcance de loslaboratorios diagnósticos. Mientras nodispongamos de ellas -o de otras equivalentes- larecomendación de la PCR queda restringida aldiagnóstico sobre muestras de LCR de lasinfecciones del sistema nervioso central en losinmunodeprimidos.

VIRUS DE EPSTEIN-BARRINTRODUCCIONComo los demás miembros del grupo herpes, elvirus de Epstein-Barr (VEB) produce una infecciónque persiste durante la vida del individuo. Lainfección primaria es habitualmente asintomáticaen la infancia, mientras que se manifiesta comomononucleosis infecciosa en dos terceras partesde los adolescentes. Además, el VEB se implicacada vez más en la patogénesis de las diferentesneoplasias, como son la forma endémica dellinfoma de Burkitt, el carcinoma nasofaríngeo y lossíndromes linfoproliferativos postrasplante.También se han relacionado con el VEB loslinfomas tipo Hodgkin y no-Hodgkin del sistema

nervioso central en SIDA. Recientemente se le haimplicado en la patogénesis de tumores demúsculo liso en inmunodeprimidos y en carcinomagástrico.La infección se adquiere por transmisión oral -saliva- y, tras una fase de multiplicación en lascélulas de la orofaringe, se produce la infección delos linfocitos tipo B, en los que se inica una fase delatencia. En los ciclos líticos se producereplicación, síntesis protéica y génesis de nuevosvirus, mientras que en fase de latencia seproducen sólo algunas proteínas y no sedesarrollan viriones. Al contrario que el resto delos herpesvirus, probablemente el VEB es máspeligroso en la fase de latencia, pues en esteestadio inmortaliza a las células que infecta, lo quepodría intervenir en la patogenésis de algunostumores. El ADN viral es lineal en las partículasvirales, pero existe en las células infectadas.En cualquiera de los dos ciclos virales -el lítico y eltrasformante- se produce una notable variedad deproteínas cuyo conocimiento es fundamental nosólo para la patogénesis, sino para comprenderlas pruebas diagnósticas. Se conocen dos ARNnucleares (EBER) que se expresan a muy altosniveles en todas las células tumorales infectadaspor el VEB. Entre los antígenos que se expresanen las células infectadas de forma latente figuranlos seis del tipo EBNA, las tres proteína latentesde membrana detectable en linfocitos (LYDMA).Entre los que son producidos en las fases líticas,además de los anteriores, figuraran los precoces(EA) y el antígeno de la cápside (VCA). Losantígenos EA pueden aparecer como difusos(EAd) con un patrón de tinción citoplasmático ynuclear o restringídos (EAr) con patrón de tincióncitoplasmático perinuclear.

MONONUCLEOSIS INFECCIOSA Y VIRUSEPSTEIN-BARRLa mononucleosis infecciosa es una de laspatologías más comunes y que a la vez alarmanmás al paciente y al médico que lo atiende. Es, portanto, muy importante aplicar técnicas que den undiagnóstico certero en el menor tiempo posible. Elestudio serológico de las infecciones por VEB esde gran utilidad en el laboratorio de Microbiologíapues permite el diagnóstico de la enfermedad enfase aguda sin tener que esperar, como ocurre enotras infecciones, a la recuperación del enfermopara realizar el diagnóstico. La mononucleosisinfecciosa se diagnóstico. La mononucleosisinfecciosa se diagnostica serológicamente pueslas técnicas de cultivo celular, por su dificultad ylentitud, no tienen apenas aplicación en uncontexto clínico. Tampoco pensamos que lastécnicas de amplificación de ácidos nucléicos, cmola PCR, tengan ninguna utilidad en el diagnósticode la mononucleosis infecciosa.

Al inicio de la infección aparecen anticuerpos tipoIgM contra el VCA que se mantienenaproximadamente unos tres meses en el suero;simultáneamente con la IgM, aparecen IgG que sedetectan durante toda la vida, e IgG contra el EAden un 90% de los individuos, persistiendo duranteunos tres meses, aunque en un 4-20%, estosanticuerpos son positivos por tiempos másprolongados. Los anticuerpos IgG frente al EAraparecen en la convalecencia, fundamentalmentetras la infección crónica y en el linfoma de Burkitt.Aunque los EBNA son las primeras proteínas quese expresan en las células infectadas, losanticuerpos frente a estas proteínas no aparecenen la infección primaria sino unos meses mástarde y se detectan de por vida (Figura 11).La determinación de anticuerpos heterófilos esprecoz, sensible y específica de la mononucleosispor VEB, pero tiene el inconveniente de sernegativa al menos en un 50% de los niñosmenores de 5 años. Los anticuerpos heterófilosaparecen en el 90% de los enfermos adultos conmononucleosis por VEB. La prueba Paul-Bunnell-Davidsohn mide anticuerpos heterófilos queaparecen en otras enfermedades por serabsorbidos por hematíes de buey, pero no porcélulas de riñon de cobaya. Frecuentemente, laprueba se realiza en forma de técnica spot deforma cuantitativa pero, alternativamente, puedecuantificarse fácilmente utilizando diluciones enmicroplaca. No se recomienda utilizar la pruebasin realizar absorción o empleando para ladetección de anticuerpos heterófilos otro tipo dehematíes diferentes a los de caballo. Ladeterminación de anticuerpos heterófilos puedehacerse con látex sensibilizado con antígenos dehematíes altamente purificado, lo que haceinnecesario la absorción de anticuerpos tipoForssman.Las pruebas serológicas que miden anticuerposespecíficos frente al VEB son esenciales en loscasos de mononucleosis infecciosa conanticuerpos heterófilos negativos, también en loscasos con anticuerpos heterófilos positivos y quepresentan síntomas clínicos poco característicos.

Gracias a su gran sensibilidad y especificidad, laspruebas de inmunofluorescencia son el método deelección en la detección de anticuerpos frente alVEB. De las diferenes determinaciones deanticuerpos frente a este virus, sin lugar a duda lamás util en el diagnóstico de la mononucleosisinfecciosa es la detección de IgM anti-VCA, pueses positiva al menos en el 90% de los enfermos.La infección aguda se caracteriza por la presenciade anticuerpos IgG e IgM contra el VCA y laausencia de anticuerpos dirigidos frente alcomplejo EBNA, fundamentalmente frente aEBNA-1. Sin embargo, es necesario tener encuenta que la IgM puede no aparecer o persistirdurante meses o incluso años y, por otro lado, larespuesta inmune al antígeno EBNA-1 puede noaparecer nunca o volverse negativa en el caso deinmunodepresión. No puede deducirse en modoalguno que estamos en presencia de una infecciónreciente por muy alto que sea el título de IgG anti-VCA obteniendo. Los obtenidos a partir de célulasinfectadas dan sensibilidades y especificidades nomuy altas, lo que ha impedido su generalización.Para la detección de anticuerpos de ELISA danunos buenos resultados empleando antígenosrecombinantes (tabla 7 y 8).Mientras que en la mayor parte de lasdeterminaciones virales se estudian dos sueros yse comparan títulos para realizar el diagnóstico, enla infección por el VEB habitualmente sólo seutiliza una sola muestra de suero, pues ya en lafase aguda de la enfermedad es posible detectarIgM a títulos altos y generalmente no es posibledetectar seroconversión IgG cuando se emplea unsuero convaleciente. La determinación de IgManti-VCA debe realizarse tras separar la fracciónIgM del suero anti-IgG que elimine este tipo deinmunoglobulinas, puesto que de otra formacondicirá a una falta de sensibilidad (competenciacon las IgM) y de especificidad en presencia defactor reumatoideo. Un inconveniente de ladetermninación de IgM de VCA es que puede serpositiva en enfermos con infección por CMV, porestímulo parcial.

ENFERMEDADES TUMORALESEn las neoplasias asociadas al VEB pueden serútiles las pruebas serológicas, las técnicas deinmunohistoquímica y los métodos de biologíamolecular. Todas ellas tropiezan con la dificultadde la alta prevalencia de la infección y con lanecesidad de cofactores externos para desarrollar

su capacidad transformante. Más aún, lospacientes que sufren estos procesos, o soninmunodeprimidos o lo estarán comoconsecuencia, cabe esperar en estos pacientesuna respuesta serológica anómada. Por ejemplo,los anticuerpos anti-EBNA no siempre aparecen,la respuesta de IgM y a EA tampoco es clara; por

lo que la mayor parte de de los autores miden lainfección por cambios en la IgG anti-VCA. Enestos pacientes la IgM anti-VCA sólo aparece enel 50% de las infecciones primarias y puedeincluso presentarse en las reactivaciones. Cuandose trata de una primoinfección en este grupo laserología (cambios en la IgG) es útil, pero en lasreactivaciones es mucho más complejo sudiagnóstico serológico; en estas circunstancias seutilizan fundamentalmente los cambios en lostítulos de anticuerpos frente al EA. En cualquiercaso es necesario tener en cuenta que, en las

determinaciones de anticuerpos específicos, existeuna gran variabilidad de títulos en la población, enfunción de la edad o de la funcionalidad de susistema inmune. En el linfoma de Burkitt, elcarcinoma nasofaríngeo y en inmunodeprimidosse encuentran títulos altos frente al VCA y el EA.La respuesta frente al EA está dirigida al EAr en ellinfoma de Burkitt y en los inmunodeprimidos yfrente al EAd en el carcicoma de nasofaringe(tabla 7).

TABLA 7Marcadores serológicos en la infección por el virus Epstein-Barr(abreviaturas en el texto).

Anticuerpos Anticuerpos anti-VCAHeterófilos IgG IgM IgA Anti-Ead Anti-EAr Anti-EBNA

Mononucleosis + + ++ ± + - -InfecciosaInfección antígua ± + - - - - +Infección crónica - +++ - ± + ++ ±activaProcesosLinfotoproliferativos - ++ - ± + + ±Linfoma de Burkit - +++ - - ± ++ +Carcicomanasofaríngeo - +++ - ++ ++ ± +

TABLA 8Técnicas de inmunofluorescencia para medir anticuerpos dirigidos contra proteínas del virus

Epstein-Barr (ver abreviaturas en el texto).

Antígeno Tipo de células Procedimiento defijación Técnica

VCA P³HR¹ Acetona IFIEAr Raji Acetona IFIEAd Raji Metanol-acetona IFI

EBNA Raji Metanol-acetona IFI anti C-3

La detección de niveles anormales elevados aalgunas de las proteína del VEB tiene impacto enel diagnóstico precoz de algunos de los tumoresasociados a este virus y en su tratamiento. Lamayor parte de enfermos con carcinomanasofaríngeo desarrollan respuesta de IgA adiferentes proteínas del VEB. Las preubasserológicas más utilizadas en el carcinoma denasofaringe son la determinación de IgA frente aVCA y EA, presentando la primera unasensibilidad cercana al 100% y la segunda una

especificidad también cercana al 100%. Elcarcicoma nasofaríngeo es uno de los tumoresmás fácilmente tratables si se realiza undiagnóstico precoz por lo que, dada la fiabilidad delas determinaciones serológicas, se estárealizando detección en masa en las zonasendémicas de este tumor. Estas pruebas puedentener valor también en el seguimiento de losenfermos, pues se ha demostrado que los títulosestables o descendentes se correlacionan con unbuen pronóstico. Se ha utilizado un ELISA para

detectar anticuerpos anti-EBNA 1, encontrándoseresultados positivos en el 91% de los enfermos decarcinoma de nasofaringe. Los títulos elevados aVCA y EAr tienen valor pronóstico en el linfoma deBurkitt.El otro tipo de técnicas que tiene aplicación -fundamentalmente en laboratorios deinvestigación- en los carcinomas asociados al VEBson la determinación de antígenos virales en lostejidos y la detección del ADN del virus. Losantígenos se expresan en tan poca cantidad en lascélulas que hay que recurrir a técnicas deinmunofluorescencia anticomplemento para poderdemostrar su presencia. La determinación deantígenos como el EBNA o las LMP requiere quela conservación y la preparación de la muestra seamuy buena. Para demostrar el ADN en tejidos seha empleado el southern blot, el dot blot, la PCR yla hibridación in situ. Debido a la contaminación dela muestra con linfocitos, las técnicas southernblot, dot blot y PCR son menos específicas que lahidratación in situ, que es, sin embargo,menossensible. En cualquier caso no es necesarioremarcar de nuevo que estas técnicas no debenemplearse en rutina debido a su complejidad yfalta de estandarización. Aunque la presencia delvirus puede ser secundaria al proceso tumoral, elADN viral no se encuentra en los tejidos linfoidesde enfermos con neoplasias no asociadas al VEBcuando se emplean técnicas de hibridación. Lautilización de sondas dirigidas a los EBERincrementa la sensibilidad de las técnicas dedemostración de ADN.En algunos individuos la infección quedacrónicamente activa, con títulos elevados a lasproteínas de la fase replicativa del ciclo. Aparecensíntomas persistentes, tales como esplenomegaliay se produce un patrón recurrente que dura meseso años, que se manifiesta, por ejemplo, conpancitopenia. Aunque la patogenia esdesconocida, aparecen anormalidades del sistemainmune, como inversión del cociente CD4/CD8,hipergammaglobulinemia y baja tasa de célulasnatural Killer. En estos enfermos suelen detectarsetítulos elevados de anticuerpos anti-VCA y anti-EAsin presencia concomitante de anti-EBNA.

HERPES VIRUS HUMANOS 6 y 7INTRODUCCION Y SIGNIFICADO CLINICOEl HVH-6 fue aislado por primera a partir delinfocitos de sangre periférica en seis pacientescon síndromes linfoproliferativos, dos de elloscoinfectados con el VIH. Recientemente se handiferenciado dos subespecies o variantesdenominadas, respectivamente, A y B. El HVH-6es un virus linfotropo y citopático que ha sidoimplicado en numerosos cuadros clínicos ytambién como cofactor en la progresión de SIDA.Actualmente, se le considera el agente etiológico

del exantema súbito (roseola linfantum), lamanifestación clínica de la infección primaria.También es responsable de hepatitis activa enpacientes con un cuadro semejante a lamononucleosis, en algunos casos es el únicoagente encontrado en una mononucleosisinfecciosa. No está clara su implicación en otroscuadros como el síndrome de fatiga-crónica,diversos síndromes lifoproliferativos, encefalitis,etc.Tampoco lo están los mecanismos de transmisión.Tras la infección primaria (en la primera infancia),el HVH-6 persiste en diversas células y tejidos,como las glándulas salivales. Es muy probableque la saliva ocupa un papel central en latransmisión. La consecuencia final es la elevadaseroprevalencia en los adultos, por encima del70%.El HVH-7 es el más reciente de los herpesvirusque afectan al hombre. Se aisló en 1989 a partirde linfocitos de sangre periférica, en condicionesde activación de células T, células para las quepresenta tropismo. A destacar que presentahomología con el HVH-6, lo que determinareacciones cruzadas entre ambos virus, pero noprotección de uno frente al otro. Laseroprevalencia es muy elevada, del orden del80% o superior en adultos. El HVH-7 se ha aisladode saliva en un porcentaje elevado de adultossanos seropositivos, lo que indica que es unhabitante frecuente en esta localización y permitedelinear sus mecanismos de transmisión aunquerepresenta una dificultad añadida a la hora deconocer su significación clínica. Se le haimplicado, de nuevo, en el síndrome de fatigacrónica, así como en algunos procesos febriles yen cuadros exantemáticos infantiles.

DIAGNOSTICONo es dificil adivinar que el diagnóstico de ambosvirus es complejo. Por lo que respecta al HVH-6,hay que diferenciar los pacientesinmunocompetentes de los que no lo son. En losprimeros, el cuadro clínico más frecuente es elexantema súbito en niños y, muy raramente, lamononucleosis infecciosa y la hepatitis. Enmuchos casos, la confirmación diagnóstica esinnecesaria. Cuando no es así, se lleva a cabo porserología, mediante técnicas de IF y de ELISAcomerciales. La aparición de IgM se asocia a lafase aguda de la infección. Las IgG aparecen algodespués, siendo diagnósticas la seroconversión ola presencia de títulos elevados en una solamuestra. Deben destacarse simultáneamenteotros agentes etiológicos de mononucleosis yhepatitis. También tendremos muy en cuenta laexistencia de reacciones cruzadas con el HVH-7,por lo que es conveniente absorber los suerosantígeno de este virus. Este caso no se lleva acabo con los métodos comerciales actuales, por lo

que no pueden descartarse esos falsos positivos.El aislamiento del virus a partir de saliva esteóricamente posible durante la infección activa ytambién durante la fase de latencia. Este hecho,unido a la dificultad metodológica, hace que no serecomiende en el diagnóstico de rutina. Lasinfecciones por HVH-6 en inmunodeprimidos(neumonitis, encefalitis) pueden diagnosticarseserológicamente en ciertos casos, siguiendo loscriterios anteriores. A causa de la escasarespuesta de anticuerpos que puede presentarseen estos pacienes, es posible que debamosrecurrir a otras técnicas, como la amplificación porPCR sobre suero, plasma o LCR. Se recomiendaderivar estas muestras a centros de referencia.Por lo que respecta al HVH-7, al no estar biendefinida su significación clínica, no serecomienda su investigación rutinaria. Eldiagnóstico deberá estar restringido a fines deinvestigación en centros especializados.

PCR Y HERPESVIRUS: AÑO 1995CONSIDERACIONES GENERALESLa detección de genoma tras amplificaciónmediada por la creacción en cadena de lapolimerasa (PCR) ha sido una alternativa valiosapara el diagnóstico de algunas infecciones en lasque los métodos disponibles eran ineficaces.Además, está sirviendo para conocer la patogeniade las misma, que había sido imposible antes dedisponer de esta metodología. Los herpesvirus nohan sido una excepción. Sin embargo, todavia nose conoce su <<lugar>>, debiendo usarse sólocuando se agoten las posibilidades de las técnicasconvencionales.La característica fundamental de la PCR es suelevada sensibilidad. En algunos cuadros clínicosasociados a herpesvirus ha llegado a ser el godstandard y es aquí donde se encuentran susaplicaciones más definidas. La sensibilidad puedeverse afectada por diversos factores: tipo deiniciadores, el método de extracción y por lassustancias inhibidoras de la Taqpolimerasapresentes en la muestra clínica. La extremasensibilidad es también un arma de doble filo,pues nos puede plantear problemas deinterpretación de los resultados, algunosherpesvirus constituyen un ejemplo paradigmático.La especificidad es también muy elevada,

dependiendo de la adecuada selección de losiniciadores y del uso de una técnica depurada queevite contaminaciones de amplificados (carryover). Está fuera del ámbito de este protocolo ladescripción detallada de los aspectos técnicos quecondicionan la calidad de los resultados,remitiendo a lector a manuales específicos.Como norma general aplicable a los herpesvirus,la introducción de una técnica de PCR en undeterminado laboratorio con fines diagnósticosdebe llevar aparejada una puesta a punto previamuy rigurosa. Deben incluirse numerososcontroles y, sobretodo, el microbiólogo deberáestar seguro del significado de sus posiblesresultados. Estas son las razones que limitan hoyen día la aplicación de las técnicas de PCR en elcampo que nos ocupa. En la tabla 9 resumimosalgunas aplicaciones definidas y otras situacionesen las que no debe emplearse la PCR. Hacemosla observación de que los avances técnicosobligan a revisar conceptos de forma continua: deahí el titulo del presente apartado.

PCR Y VIRUS HERPES SIMPLEXDe las diversas aplicaciones de la técnica PCR enlas infecciones por los VMS, es el diagnóstico delas encefalitis la única aceptada de formaunanime. Como norma general, la PCR es mássensible que el cultivo, sobretodo en aquelloscasos en los que hay pocas partículas víricas en lamuestra (menor umbral de detección). Esto ocurresólo en determinadas ocasiones con los VMS y esuna consideración fundamental a la hora deaplicar la PCR.Existen en la literatura numerosos protocolos deamplificación del ADN de los VHS. Se hanutilizado multitud de iniciadores, algunos comunesa los dos tipos, otros específicos de cada virus. Latendencia actual es la de utilizar iniciadores queamplifiquen los dos tipos a la vez y que permitansu detección específica, bien por la longitud delamplificado o tras restricción del mismo conendonucleasas. Suelen amplificarse secuenciasde los genes de la ADN polimerasa viral, así comode las glucoproteínas B y G.

*Sindromes neurológicosRepresentan la indicación más aceptada. tanto enlas encefalitis (VHS-l, sobretodo)

TABLA 9Recomendaciones de la PCR en el diagnóstico de infecciones por herpesvirus (año 1995)

Virusa Aplicable No recomendable

VHS Encefalitis y meningitis (sobre LCR*) Infección cutánea en pacientes normalesHerpes neonatal sin lesiones cutáneas (LCR Cribado pre-parto de embarazadas

Cribado de implantes corneales

VVZ Infecciones cutáneas en inmunodeprimidosb Infección cutánea en inmunocompetentesSíndromes neurológicos eninmunodeprimidos (LCR)Neumonitisb

Diagnóstico diferencial de retinitis en SIDACMV Infecciones del SNCaen pacientes Otras infecciones en pacientes con SIDAb

con SIDA (LCR) Infección congénitaInfecciones en trasplante, salvo SNC

VEB Afectación del SNC, sobre LCR, en SIDA Mononucleosis infecciosaInvestigación de la patogenéstis

HVH-6 Con fines de investigación Infección cutánea en pacientes normales

aSNC:Sistema nervioso central; resto de abreviaturas, en el textob posibilidad de aplicación condicionada a casos en los que las técnicas habituales sean insuficientes

como en la meningitis (VHS-2,predominantemente) en algunas ocasiones esteúltimo cuadro se asocia con lesiones genitales,pero no siempre. En ambos casos, es posibledetectar los VHS en muestra de LCR en estadiosiniciales de la enfermedad, lo que permiteinstaurar una terapéutica precoz que tiene granimportancia en el pronóstico. Por supuesto,pueden detectarse los virus en tejido cerebral,pero la práctica de biopsia con estos fines haquedado en desuso ante la eficácia del aciclovir.

* Infecciones congénitas y neonatales por losVHSEl herpes neonatal se presenta como a) un cuadroque afecta a piel, b) encefalitis, y c) infeccióndiseminada. Se asocia sobretodo al VHS-2 y, aveces, estos cuadros están superpuestos. Cuandoexisten lesiones cutáneas, no está indicada laPCR; hasta el cultivo a la deteccicin directa deantígeno. No es infrecuente la afectaciónneurológica del neonato en ausencia de lesionesdermicas. En este caso, la PCR sabre LCR es elmétodo de elección porque no suele detectarsegenoma en la sangre o suero del paciente.Debido a su rapidez y su sensibilidad algunosautores han propuesto a la PCR como método dedespistaje de VHS en embarazadas en momentoscercanos al parto. Como la técnica puede detectarexcreción asintomática, no es posible adoptarmedidas activas (v.g. parto por cesárea). Par lotanto, no se recomienda la PCR con estos fines.

* Lesiones dermicas y cornealesLa técnica de PCR tampoco es recomendablecomo método diagnóstico de las infeccionescutáneas. Aquí el cultivo y la detección de untigeno ofrecen resultados razonablemente rápidosy son mas sencillos de realizar. Sólo cuando fallenestos métodos y en casos muy concretos depacientes inmunodeprimidos debemos plantearnosutilizar la PCR.En las lesiones corneales, puede fallar el cultivo acausa de la dificultad en obtener la muestra; laPCR parece una opción razonable. Por otra parte,

se ha implicado a los VHS en el rechazo a malprendimiento de trasplantes de córnea. Sinembargo, los estudios no son concluyentes por loque no recomendamos la puesta a punto de laPCR como técnica previa al trasplante de cornea.

PCR Y VIRUS VARICELA-ZOSTERLa PCR es mucho más sensible que el aislamientoen cultivo del VVZ, sobretodo debido a la labilidaddel mismo y a que, en ocasiones, la carga viral esmuy escasa en determinadas muestras.Actualmente se reconoce su mayor sensibilidad yrapidez diagnóstica en líquidos de vesículas,costras, muestras respiratorias, líquido articular ycefalorraquídeo, humos vítreo, etc. A pesar deello, las aplicaciones concretas en el diagnósticodeben matizarse.Desde el punto de vista de investigación, la PCRha permitido avances notables en el conocimientode la patogenia de la infección primaria y en lasrecurrencias (fases de viremia, afectación desistema nervioso central, mecanismos detransmisión, etc.). También permite distinguir entrelas infecciones naturales y las producidas por elvirus atenuado (cepa OKA) de la vacuna actual.Técnicamente, la PCR puede llevarse a cabo porvarios métodos, pero es recomendable seguir unprotocolo de doble (nested) PCR o deamplificación seguida de hidratación con sonda(hasta ahora con ³²P) ya que las principalesindicaciones se centran en muestras con bajocontenido de ADN viral. Existen diversosiniciadores descritos en la literatura, presentandotodos ellos buena sensibilidad y extremaespecificidad, por lo general. Así pues, podemosconsiderar actualmente a la PCR útil en eldiagnóstico de los siguientes procesos causadospar el VVZ:

* Infección primaria o reactivaciones eninmunodeprimidos, donde es necesario eldiagnóstico diferencial con las infeccionesdiseminadas causadas por las VHS debido a susemejanza clínica y a la diferente sensibilidad a

los antivíricos que muestra cada virus. Es posiblesu detección en líquido vesicular y en leucocitosde sangre periférica. La PCR se utilizará sólocuando sean insuficientes otras técnicas mássencillas como la detección de antígenos o elcultivo como, por ejemplo, cuando las lesionesestán muy evolucianadas, cuando media eltratamiento o cuando la muestra deba remitirse aotro laboratario para cultivo (labilidad del virus).En los pacientes inmunocompetentes,definitivamente, no esta indicado el uso de la PCRpara el diagnóstico de las infecciones cutáneaspuesto que los cuadros clínicos son típicos ypresentan un curso benigno y autoalimitado.* Complicaciones neurológicas (encefalitis,meningoencefalitis, meningitis, mielitis, etc). Esuna recomendación indiscutible en estassituaciones, puesto que el cultivo carece derentabilidad diagnóstica. La PCR, llevada a cabosobre LCR permite el diagnóstico de estasinfecciones y la instauración de la terapiaadecuada.

* Complicaciones respiratorias (neumonitis), apartir de lavado broncoalveolar u otras muestrasrespiratorias profundas, limitada a pacientesinmunodeprimidos y cuando no sean viables otrosmétodos, como la detección de antígeno enlesiones cutaneas o el diagnóstico serológico.

* Complicaciones retinianas en pacientes conSIDA, cuando deba establecerse diagnósticodiferencial con el CMV que conduzca a terapiaantiviral específica. Se han descrito casos sinpresencia de lesiones cutáneas. La muestraadecuada es el humor vitreo.

PCR Y CITOMEGALOVIRUSLas técnicas de PCR actuales encuentran unobstaculo adicional en el diagnóstico de lasinfecciones por el CMV: la facilidad con que elvirus reactiva y se replica sin dar lugar aenfermedad dificulta su valoración. Con caráctergeneral sólo debe aplicarse a casos en los que esnecesario disponer de métodos con la máximasensibilidad. Aunque, en teoría puede utilizarse enel diagnóstico de múltiples infecciones por CMV eninmunodeprimidos, debemos realizar lasconsideraciones siguientes:

* Infecciones del sistema nervioso central(encefalitis, polirradiculitis, mielitis, etc.) Este tipode afectación suele aparecen en pacientes conSIDA. La detección de genoma en LCR es elmétodo de elección. Se correlaciona con losestudios histopatológicos y con lasmanifestaciones clínicas. Es mucho más sensibleque el cultivo, a la vez que rápido y no invasivo.

* Otras infecciones por CMV en pacientes conSIDA (retinitis, esofagitis, duodenitis, colitis, etc.).De ellas, la más frecuente es la retinitis, que suelediagnosticarse por exploración oftalmológica. Enalgunos casos seleccionados, cabe la necesidadde un diagnóstico diferencial (v.g, con el VVZ). Enestos casos, la confirmación se llevará a cabosobre humor vítreo. No debe aplicarse sobre otrasmuestras, como orina, sangre. etc., que noconfirmarían el diagnóstico etiológico de retinitispor CMV. El resto de cuadros se diagnostica porcultivo o shell viall. La PCR es aquí una técnicaalternativa cuando estos se muestreninsuficientes. El valor de la PCR sobre suero enpacientes con SIDA y afectación visceral no estapor completo establecido, por lo que sólo serecomienda con fines de investigación.

* Infecciones congénitas y neonatales.Puede detectarse ADN de CMV en suero y LCRde neonatos con infección congénita. Sinembargo, no se recomienda realizarla, ya que lainfección congénita grave se diagnósticafácilmente por cultivo. Recientemente se hadescrito que los infectados con detección degenoma en LCR se correlacionan con retraso en eldesarrollo neurosensorial. Si se confirman estosdatos, podría constituir una aplicación de la PCRen un futuro próximo.

* Infecciones en trasplantados. Aunque se haestudiado profundamente en estos pacientes laPCR no tiene por ahora un lugar en el diagnósticoen este tipo de pacientes. La PCR es muy sensibley puede predecir precozmente el riesgo dereactivación, lo que no quiere decir enfernedad.No se recomienda llevarla a cabo sobre leucocitosde sangre periférica o muestras de orina o saliva.No obstante, aunque no estén bien definidas susaplicaciones quizá los trasplantados de médulaósea o pulmonares sean los grupos conindicaciones futuras más precisas.Algunos estudios han mostrado que en detecciónen suero o plasma o la PCR cuantitativa sobreleucocitos se correlacionan bien con la apariciónde síntomas asociados al CMV y con la evoluciónfavorable del tratamiento antiviral. Lo mísmopuede decirse con la amplificación de ARNm enleucocitos o plasma. Por ahora, la información deque disponemos es limitada y no permiteestablecer una recomendación definitiva.

PCR V VIRUS DE EPSTEIN-BARRLa PCR para detectar el VEB es actualmente laque menos aplicación diagnóstica tiene en lapráctica diaria. Se ha utilizado para lainvestigación de la implicación patogénica endeterminados procesos linfoproliferativos y porconfirmar su papel en otros ya conocidos, asícomo para diferenciar los subtipos virales. No

tiene utilidad diagnóstica en los síndromes agudosproducidos por el VEB, como la mononucleosisinfecciosa, puesto que hay métodos serológicosmás probados y confirmados actualmente. Esposible detectar genoma viral en los linfocitos depacientes seropositivos sin enfermedad por elVEB. Aunque hay asocia ción entre síntomas ycantidad de genoma presente en la muestra, lautilidad de las técnicas cuantitativas de PCR no haquedado establecida por el momento. Tambiénestá pendiente de confirmación el empleo de laPCR como marcador precoz en los síndromeslinfoproliferativos asociados al VEB. En estosmomentos, la aplicación queda técnicamenteestablecida en el diagnóstico de la afectación delsistema nervioso central en pacientes con SIDA, apartir de muestra de LCR.PCR Y HERPESVIRUS HUMANO TIPO 6Las principales aplicaciones de la PCR en el HVH6 se han centrado en la investigación de lapatogenia de este virus. En el exantema súbito sedetecta genoma en linfocitos, suero y plasmadurante la fase aguda, persistiendo en aquellosdurante la fase de convalecencia. También puededetectarse en saliva, con preferencia en la faseconvaleciente, no tanto en la fase aguda. Conposterioridad es posible poner de manifiesto elvirus de forma intermitente. No parece justificadoutilizar una técnica como PCR para diagnosticaruna enfermedad benigna.En el resto de cuadros asociados al HVH-6(síndromes linfoproliferativos, hepatitis, etc.) elconocimiento de su importancia patógena no estasuficientemente aclarado. Para resumir no serecomienda la PCR como técnica diagnóstica porel momento. Tal vez esta técnica encuentre suaplicación, caso de confirmarse la implicación delvirus en cuadros de encefalitis en niños.

SENSIBILIDAD A LOS ANTIVIRALES:PROTOCOLOS PRACTICOSActualmente disponemos de terapia eficaz frente aalgunos herpesyirus: aciclovir para los VHS y elVVZ, ganciclovir para CMV. El foscarnet estáindicado principalmente en infecciones por CMV,aunque también se utiliza en infecciones por VHSy VVZ cuando no hay respuesta al aciclovir. Apesar de su eficacia, ya se han descritoresistencias a los antivirales de elección. Elfenómeno es excepcional en los pacientesinmunocompetentes (no alcanza el 1%). Es máspreocupante en los inmunodeprimidos, sometidosa tratamientos intermitentes y prolongados, en losporcentajes de resistencia oscilan entre 15-40%.Aunque se han descrito recidivas por cepasresistentes. La relación entre resistencia yrecurrencia no está aún demostrada. La profilaxisantiviral no parece seleccionar cepas resistentes.

El incremento de numerosas drogas efectivas y laaparición de cepas resistentes crea la necesidadde disponer de ensayos rápidos y sencillos para ladetección de la sensibilidad a los antivirales.Aunque se hacen notables avances, todos losmétodos son laboriosos y complejos. Por esarazón, las pruebas de sensibilidad deben estarrestringidas a casos con sospecha fundada.La técnica estándar para determinar la sensiblidadde los virus citopagénicos a las drogas en elensayo de reducción de placas, pero estánsurgiendo métodos más rápidos y sencillos, queestan desplazando a los ensayos clásicos paraevaluar la sensibilidad de los aislamientos.

ENSAYO DE REDUCCION DE PLACASSe basa en la capacidad de inhibir la formación deplacas en presencia de la droga, partiendo de unacantidad de virus conocido. Previo al ensayo setítula el inóculo en unidades formadores de placaspor µl (UFP/µl), que produce el virus en unamonocapa celular permisiva.- Se inocula una dilución de virus conocida (100-200 UFP en 500 µl) en 5 pocillos de una placa de24 con monocapa de células susceptible (Vero,BGM o MRC-5 para VHS; MRC-5 para CMV yVVZ).-Después de una incubación de 1 hora parapermitir la absorción del virus, se retira el inóculo yse añade 1 ml medio de mantenimiento (MEM conL-glutamina y antibióticos) y al que se añade un0,6% de agar o 1-2% de meticelulosa (o bienantisuero específico frente al virus que se estudie)y distintas concentraciones de la droga,dependiendo del antiviral. Un pocillo sirve comocontrol y no lleva antiviral. La adición demeticulosa, agar o antisueros impide la liberaciónal medio del virus, provocando la formación deplacas por contacto. En el caso de que estosreactivos inhiban el crecimiento viral, se puedeañadir al medio sulfato de protamina.-Los cultivos se incuban 72 horas a 37ºC y unaatmósfera de 5% de CO2 , en el caso de los VHS.Cuando se ensayan cepas de CMV y VVZ, debidoa que su crecimiento es mas lento, es necesarioincubar durante 7 días. También se requiere laextracelularidad de la cepa a ensayar, que seconsigue con 6-7 pases del cultivo convencionaldel CMV o VVZ.- Posteriormente, se tiñen los pocillos con cristalvioleta (1% de cristal violeta, 10% formalina, 5%acido acético, 60% metanol, 25% agua ) y seincuban una hora a temperatura ambiente, selavan con agua y se cuentan las placas en cadapocillo con y sin droga, hallando el porcentaje dereducción de cada dilución de la droga conrespecto al pocillo control y extrapolando la dosisinhibitoria al 50% (ID50)

El ensayo es sencillo cuando se manejan pocasmuestras, pero resulta tedioso, consume muchotiempo, se necesita gran cantidad de virus, célulasy droga y es difícil de automatizar. Por otra parte,el número de placas que se puede contar estálimitado por el tamaño de la placa de cultivousada, por la distribución del virus en la placa ypor las características biológicas del sistemavirus/célula. Una modificación rápida del ensayoes utilizar (3 µg/ml para aciclovir y VHS) comodilución límite. La reducción de más de del 50% seconsidera cepa sensible, la reducción de menosdel 10% se considera resistente, y la reducciónentre el 10-50% se considera indeterminado.

ENSAYO DE CAPTACION DE COLORANTEDesarrollado originalmente para medir la actividadde interferón, se basa en la captación de uncolorante, como el rojo neutro, por células vivas.Así es posible conocer, por espectrofotometría, elporcentaje de células vivas en un sistema celularinoculado con un determinado virus y al que se leañade antiviral, a la vez que la inhibición delantiviral. Para ello se utiliza una aislado viral detítulo conocido previamente, aunque se puederealizar la titulación a la par que el ensayoantiviral. Se procede como sigue:- Se inocula una cantidad conocida de virus (100TCID50) diluida en 100 µl de medio demantenimiento en 24 pocillos de una placa de 96.Otros 24 pocillos se dejan como control a los quese añade 100 µl de medio de mantenimiento. Entodos los pocillo se añaden 25000 células Vero en100 µl de medio de mantenimiento suplementadocon 5% de suero fetal bovino.A cada 8 pocillos, 4 con dilución viral y otros 4 sindilución viral, se añaden 50 µl de las distintasdiluciones de la droga en concentración 5 veces larequerida. Se dejan 8 pocillos de control sinantiviral: 4 con suspensión viral y 4 como controlde células, todos con 50 µl de medio demantenimiento.-Las placas se incuban durante 72 horas a 37ºC yatmósfera de 5% de C02. Pasando ese tiempo seañaden 50 µl de una solución de rojo neutro al0,15% en tampón fosfato monobásico de sodio 0,1M (pH 6) y se incuban a 37ºC durante 45 min enCO2.-Posteriormente, se invierte la placa y se rellenacon PBS, para lavar. Se retira el medio y seañaden 150 µl de tampón de elución (fosfatomonobásico de sodio 0.1 M y etanol al 95% apartes iguales). Se determina la densidad ópticade la solución 550 nm en un espectrómetro.- Se asigna el valor 0 a la media de la densidadóptica de los 4 pocillos con los controles de célulasy elvalor 100 a la media de la densidad óptica delos 4 pocillos con virus y sin antiviral. Se aplica lasiguiente fórmula para conocer el concentraciónde la droga y de ahí deducir la reducción:

% crecimiento= ((CCac- Xac) / (CC-Y) x 100CCac: Densidad óptica media (DOM) del control decélulas con la dilución de la drogacorrespondiente.XXac: DOM de los pocillos con virus a esa diluciónde la drogaCC: DOM de control de células sin droga.Y: DOM de densidad óptica de los pocillos convirus sin antiviral.A partir de aqui, se puede calcular mediante unarecta de regresión la ID50 de la droga ensayada.Este método permite una automatización delsistema. Además permite detectar pequeñascantidades de virus residentes a aciclovir en unapoblación viral heterogénea.Como en el método anterior, cuando se ensayancepas de CMV o VVZ, el tiempo de incubación esde 7 días variando también las concentraciones delas drogas, así como el sustrato (células MRC-5).

ENSAYO RAPIDO BASADO EN LA TITULACIONDEL VIRUS POR EFECTO CITOPATICO (ECP) YPOSTERIOR TINCION VITAL.Este método consiste en valorar la diferencia detítulo viral obteniendo mediante la visualización delECP y complementando con tinción de rojo neutro,cuando se inocula la cepa del virus a ensayar enmonocapas celulares tratadaso no con antiviral.Para ello se utiliza una dilución única de la droga(4,4 µM de aciclovir en el caso de HSV-1, 8,8 µMde aciclovir en el caso de HSV-2, 11,1 µM paraganciclovir y 300 µM para foscarnet). A partir deuna cepa aislada y con ECP que afecte al 70-90%de la monocapa celular donde crece, se realiza elensayo de titulación del virus como sigue:-Se realizan 6 diluciones seriadas en base 10 delsobrenadante del cultivo (en el caso de HSV) o enbase 4 y células tripsinadas (para CMV).-Se inoculan 100 µl de cada dilución viral en 8pocillos de una placa de 96 pocillos, sobre los quepreviamente se haya formado una monocapa decélulas permisivas. Se dejan 8 pocillos comocontrol de células a los que se les añaden 100 µlde medio de mantenimiento. Se centrifuga la placadurante 45 minutos a 1800 rpm.- Se retira el inóculo y se añaden 200 µl de mediode cultivo a 4 de los 8 pocillos de cada diluciónviral y a 4 de los 8 pocillos control. A los 4 pocillosrestantes con cada dilución viral y a los otros 4pocillos control se les añade 200 µl de medio conla concentración de la droga que se le ensaya.-Las placas se observan a los 2 los 4 días en losensayos con HSV y hasta 7 días en el caso deCMV, y se determina el título de la cepa sin y conantiviral por la fórmula de Kärber.Se considera que la cepa estudiada es sensible ala droga ensayada cuando la diferenciaencontrada en los títulos es igual o mayor a 2unidades (diluciones en base 10), o 3,3 veces endiluciones en base 4. En estas condiciones, la ID50

del antiviral ensayado será menor que la diferenciaes inferior a 2 (o 3,3), se realiza una tinción conrojo neutro como en el ensayo anterior. Seconsidera una cepa sensible si a la dilución delvirus que se emplean 100 TCIDac, aplicando lafórmula anteriormente citada, el crecimiento nosupera el 50%. En cualquier caso, es aconsejableque cepas comprendidas entre el 40-60% decrecimiento se ensayen de nuevo con todas lasdiluciones de la droga para conocer su ID50Este método es rápido, sencillo y económico quecombina la titulación del virus, la formación deECP y la tinción de células vivas para una correctaevaluación de la sensibilidad de unas cepas. Elinconveniente evidente y de relativa trascendenciaes el desconocimiento de la ID50

ENSAYO DE SENSIBILIDAD PARA CMV ENMUESTRAS SIN CELULARIDADEl ensayo permite una detección rápida de cepassensibles o resistentes a ganciclovir o foscarnet.Se realiza a partir de 300 µl de orina, previamentecentrifugada, e inoculada en un Shell vial. Cuandoa las 17 horas este se tiñe con anticuerposmonoclonales frente al antígeno temprano (E13)del CMV y se observa al menos 1 unidadformadora de antígeno (una célula positiva)(UFA/µl, se realiza el estudio de sensibilidad comosigue:-Se ajusta la concentración viral de la muestra a 1-3 UFA/µL, inoculando posteriormente 300 µl porcentrifugación en seis viales con células MRC-5por cada antiviral ensayado.-Se retira la muestra y se añade 1 ml de medio demantenimiento con concentraciones crecientes deganciclovir y de foscarnet. Se inocula también uncontrol sin antiviral.-A las 96 horas se fijan los viales con acetona fría,y se realiza una inmunofluorescencia indirectapara detectar antígeno tardío de CMV, ydeterminar la reducción del 50% de UFA , asícomo la ID50.El método es rápido y sencillo, pero requiere deuna liberación grande de virus en la orina, yresulta caro al utilizar anticuerpos monoclonalespara su identificación final.

OTROS ENSAYOS DE SENSIBILIDADEn el caso de HSV también se estudia lacapacidad de fosforilar productos como el aciclovirpor cepas de HSV aisladas de un cultivoconvencional, por métodos radiactivos, en unmedio celular carente de TK (células 143 B).También se puede estudiar la cinética enzimáticade la TK en sobrenadantes de aislados viralescrecidos en las células anteriormentemencionadas con un sustrato radiactivo a fosforilarEn cualquiera de los dos métodos el inconvenienteprimordial es la utilización de material radiactivo y

deben considerarse como técnicas deinvestigación.Otros ensayos que están en proceso de estudioson los métodos moleculares, por medio) dehibridación con sondas especmcas y posteriorcuantificación de los duplex, o por medio de laamplificación genómica (PCR), con el estudio delos mutantes que provocan la resistencia, como enel caso del VIH. Sin embargo, estos estudiosnecesitan mayor elaboración, son más caros y aúnno están al alcance de todos los laboratorios.

SUPUESTOS PRACTICOS COMENTADOSSUPUESTO Nº 1Una mujer de 34 años acude al Servicio deUrgencias de Ginecología por presentar lesionesulcerosas y dolorosas en labio menor. Elfacultativo avisa al laboratorio para que realice unatoma de muestra tratamiento antiviral si procede.Las vesículas, además de estar rotas, estánlocalizadas en un zona de difícil acceso pararealizar una impronta directa con el porta, por loque se toma la muestra con una torunda, haciendoa continuación varias improntas perpendiculares alporta (no por extensión). Se tiñeron porinmunofluorescencia directa con monoclonalesfrente a VHS-1 y VHS-2, con resultados negativospara ambas.Comentario.Los VHS deben ser considerados enel diagnóstico diferencial de las úlceras genitales,junto con otros patógenos bacterianos(Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi) ovíricos (VVZ, enterovirus). La negatividad de latécnica directa de detección de antígeno de losVHS no descarta esta etiología, sobretodo siexiste dificultad en obtener una buena muestra,como es el caso. Por ello es necesario realizar uncultivo. La torunda se introducirá en un medio detrasporte específico para virus. Se aconseja nodemorar la inoculación más de 24 horas, si seenvía a un laboratorio de referencia. El cultivopuede llevarse a cabo por la técnica rápida(método shell vial) aunque las ventajas frente alcultivo en tubo no son tan claras como en otrosherpesvirus. En el caso presente, tanto el vialteñidocon anticuerpos anti-VHS-2 como el cultivopusieron de manifiesto la presencia de este virus.

SUPUESTO Nº 2Una mujer embarazada se ve expuesta a uno desus hijos que presenta varicela. ¿Cómo procederen los siguientes supuestos?: a) los padres de laembarazada recuerdan que sufrió la varicelasiendo niña; b) no lo recuerdan, y la mujer seencuentra en segundo trimestre de la gestación; c)no hay antecedentes y se encuentra en las dosúltimas semanas de embarazo.

Comentario. En el supuesto a) no habrá quehacer nada. Los antecedentes históricos sonsuficientemente fiables y la paciente estaráprotegida frente a la infección con granprobabilidad. En el caso b) será apropiado realizaruna determinación serológica, por ejemplomediante un ELISA fiable. El resultado ayudará atranquilizar a la paciente pues en la myor parte delas ocasiones presentará anticuerpos a causa deuna infección no advertida, pero no condicionaráninguna actitud preventiva. Por último, en elsupuesto c) es posible adoptar medidas caso deser susceptible. Entre ellas la vigilancia y elaislamiento de la gestante de posibles pacientesde riesgo (prematuros, inmunodeprimidos),también la administración profiláctica deinmunoglobulina anti-VVZ al recién nacido si lamadre desarrolla la varicela en la semana anterioral parto. Para conocer el estado inmunitario de lamadre es recomendable realizar una pruebaELISA o un látex para VVZ, ofreciendo esta últimaun resultado inmediato.

SUPUESTO Nº 3Un paciente con SIDA presenta unas lesionesvesiculosas en disposición metamérica en regiónvecina al glúteo, de 48 horas de evolución. ¿Cómorealizar el diagnóstico diferencial?Comentario.La presentación de las lesionessugieren herpes zóster, pero convendría hacer eldiagnóstico diferencial con otros herpesvirus,sobretodo en los pacientes inmunodeprimidos quepueden presentar formas atípicas, como es elcaso. La prueba más indicada será aquí ladetección directa de antígeno de VVZ en raspadosde la lesión. Si está al alcance, habrá quecomplementarla con el cultivo viral. Hay queasegurarnos que se hace una buena toma demuestras, a ser posible por parte del personal dellaboratorio. En estas condiciones, si es positiva,confirma el diagnóstico de zóster y, si es negativa,lo excluye con mucha probabilidad. El supuestoaquí presentado está adaptado de un caso real enel que se aisló un VHS tipo 2 en cultivo, siendo ladetección directa de antígeno de VVZ negativa.

SUPUESTO Nº 4Un recién nacido de quince días de edaddesarrolla, tras una gestación y un parto normal,un cuadro de ictericia con hepatoesplenomegalia yalteraciones neurológicas, sin manifestacionescutáneas. Se le cursa una serología de CMV queresulta positiva para IgG. Se desconoce el estadoinmunitario de la madre durante el embarazo. Enestas condiciones, ¿queda establecido eldiagnóstico de infección congénita? Si no es así,¿qué pruebas serían recomendables para llegar aun diagnóstico tipo definitivo?.Comentario. La detección de anticuerpos anti-CMV de la clase IgG no demuesra la presencia de

una infección congénita, pues buena parte de losrecién nacidos presentan serología positiva aconsecuencia de la transferencia pasiva deanticuerpos maternos. El cuadro podría ser debidoa diversos agentes etiológicos, víricos ybacterianos. Para llegar al diagnóstico esconveniente realizar cultivos bacterianosconvencionales y practicar otras pruebas en elsuero existente. Si se tiene acceso, es muyrecomendable remitir cultivos para virus de orina ysaliva. El aislamiento del CMV en cualquiera deestas muestras confirma el diagnóstico deinfección congénita y no plantea especialesdificultades técnicas. Una prueba de IgM anti-CMVpositiva también lo confirmaría, siempre que selleve a cabo por una técnica que controle lapresencia de factor reumatoideo.

SUPUESTO Nº 5Se trata de un varón de 4 años de edad quepresenta un cuadro clínico y analítico compatiblecon el diagnóstico de mononucleosis infecciosa.Se solicita al laboratorio serología demononucleosis infecciosa y se remiten tresmuestras de orina para el cultivo de CMV. En ellaboratorio se realiza una determinación deanticuerpos heterófilos mediante una prueba spoty esta resulta negativa. Se lleva a cabo tambiénuna determinación de IgM contra VCA, sintratamiento previo del suero para retirar las IgG yse obtiene también un resultado negativo.Después de tratar al suero de enfermo con unaanti-IgG, se repite la prueba y se detecta IgM anti-VCA. Las tres muestras de orina son negativaspara CMV utilizando la técnica rápida de shell vialComentario. En el diagnóstico de lamononucleosis infecciosa es muy importanteconocer la edad del enfermo, pues si es un niñopequeño debemos realizar serología específicapequeño debemos realizar serología específica delVEB y, si es una persona mayor de 25 años, lomás probable es que sufra una infección por elCMV. Aunque casí el 90% de los casos demononucleosis infecciosa están causados por elVEB, existen un porcentaje pequeños atribuible aotras etiológias, como el CMV (5-7%), Toxoplasmagondii (1%), VIH, adenovirus; algunos casos sonde etiología desconocida. En el diagnósticoserológico de la infección se emplea la detecciónde anticuerpos heterófilos y las determinacioensde anticuerpos dirigidos contra los antígenos VCA,EA y EBNA, ya que éstos presentan patronesdiferentes según el momento de evolución de lainfección, permitiendo determinar serológicamenteel estadio de ésta. Dentro de las pruebasespecíficas, la determinación de IgM anti-VCA esclaramente la prueba recomendada.Es muy importante el tratamiento del suero paraseparar IgG que puede competir con la IgM yoriginar un resultado falsamente negativo. La

presencia de factor reumatoideo es también fuentede error, pues puede determinar la obtención deun resultado positivo falso. Existe una importantereacción cruzada entre el VEB y el CMV, lo quelleva, en ocasiones a considerar como infeccionespor VEB las causas por el segundo. Paradiferenciar estas situaciones, es útil mediranticuerpos a EBNA y tener en cuenta que losanticuerpos heterófilos no aparecen en la infecciónpor CMV.

AGRADECIMIENTOSDeseamos hacer patente el agradecimiento a losDres. Santiago Melón y Jordi Niubó por susaportaciones en la obtención de algunos datosnecesarios para la elaboración del presente texto.También por sus opiniones respecto a laorientación y contenidos de la monografía.

BIBLIOGRAFIA SELECCIONADA1. Connolly MG Jr, Baughman RP, Dohn MN,Unnemann CC Jr. Recovery of viruses other thancytomegalovirus from bronchoalveolar lavage fluid.ChesL 1994; 105: 1775-1781.

2. Gershon AA, Steinberg Sr, Schmidt NJ.Varicella-Zoster virus. En: Ballows A. flausler WJ,Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds.Manual of clinical microbiology (5~ ed).Washington DC, American Society forMicrobiology, 1991; 838-846.

3. Sterner G, Forsgren M, Enocksson E, Gran-dienM, Granstrorn G. Varicella-zoster infections in latepregnancy. En: Sterner G, (ed.). Guidelines formanagement of pregnant women and withinfections at delivery, and care of their newborns.Scand J Infect Dis 1990; (sup 71): 30-35.

4. Shehab Z, Brunnell P. Enzyme-linkedimmunosorbent assay for susceptibility to varicella.J Infect Dis 1983; 148: 472-476.

5. Schirm J, Meulenberg JJM, Pastoor GW, VanVoorst Vader PC, Schrbder UP. Rapid detection ofvaricella-zoster virus in clinical specimens usingmonoclonal antibodies on shell vials and smears. JMed Virol 1989; 28:1-6.

6. Stagno S, Britt WJ, Pass RF. CytomegMovirus.En: Schmidt NJ, Emmons RW, eds. Diagnosticprocedures for viral, rickettsial and chlamydialinfections. Washington DC, American PublicHealth Association, 1989; 321- 378.

7. Gleaves CA, Smith TF, Shuster EA, Pear-sonCR. Rapid detection of cytomegalovirus in MRC-5cells inoculated with urine specimens by using low-speed centrifugation and monoclonal antibody to

an early antigen. J Clin Microbiol 1984; 19: 917-919.

8. Grimths PD. Cytomegalovirus. En: Zucker-manAJ, Banatv ala JE, Pattison JR, eds. Principles andpractice of clinical virology (2a ed). Chichester,John Wiley and Sons, l990; 69- 102.

9. The TH, Van der Ploeg M, Van den Berg AP,Vlieger AM, Van der Giessen M, Van Son WJ.Direct detection of cytomegalovirus In peripheralblood leukocytes. A review of the antigenemiaassay and polymerase chain reaction.Transplantation 1992; 54:193-198.

10. Klevjer-Anderson P. Diagnostic significance ofCMV serology. Clin Microbiol Newslet-ter 1987; 9:36-38.

11. Crawford PH. Epstein-Barr virus. En:Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR, eds.Principles and practice of clinical virology (3a ed).West Sussex, John Wiley and Sons, 1995; 109-134.

12. Liebowitz P. Epstein-Barr virus. An old dogwith new tricks. N Eng J Med 1995: 332: 55-57.

13. Okano M, Thiele GM, Davis JR, Grierson HL,Purtilo DT. Epstein-Barr virus and humandiseases: recent advances in diagnosis. ClinMicrobiol Rev 1988; 1: 300-312.

14. Straus SE, Cohen JI, Tosato C, Meier J.Epstein-Barr virus infections: biology,pathogenesis, and management. Ann Intern Med1993; 118:45-58.

15. Sumaya CV, Jenson RB. Epstein-Barr virus.En: Rose NR, Conway de Macarlo F, Fahey JL,Friedman H, Penn GM, eds. Manual of clinicallaboratory immunology (4d ed). Washing-ton,American Society for Microbiology, 1992: 568-575.

16. Pepin JM, Simon F, Dussault A, Collin C, DazaMC, Brun-Vezinet F. Rapid determination ofhuman cytomegalovirus susceptibility to ganciclovirdirectly from clinical specimen primocuitures. J ClinMicrobiol 1992; 30: 2917-2920.

17. Safrin S, Elbeik T, Phan I, Robinson P, Rush J,Elbaggari A. Correlation between response toacyclovir and foscarnet therapy and in vitrosusceptibility result for isolates of herpes simplexvirus from human immunodeficiency virus-infectedpatients. Antimicrob Agents Chemother 1994;38:1246-1250.