Bioquimia

ISSN: 0185-5751

publicacionesbioquimia@prodigy.net.mx

Sociedad Mexicana de Bioquímica A. C.

México

Majalca-Martínez, Cristina; Rivera-Cabrera, Jorge; Ochoa-Pérez, Sara A; Giono-Cerezo, Silvia

Transporte, aislamiento, identificación y conservación de cepas de Helicobacter pylori

Bioquimia, vol. 26, núm. 4, octubre-diciembre, 2001, pp. 85-89

Sociedad Mexicana de Bioquímica A. C.

Distrito Federal, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57611574003

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MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA

Transporte, aislamiento, identificación y conservación deTransporte, aislamiento, identificación y conservación deTransporte, aislamiento, identificación y conservación deTransporte, aislamiento, identificación y conservación deTransporte, aislamiento, identificación y conservación decepas de cepas de cepas de cepas de cepas de Helicobacter pylori

Cristina Majalca-Martínez, Jorge Rivera-Cabrera , Sara A Ochoa-Pérez, Silvia Giono-Cerezo

RESUMEN

Helicobacter pylori coloniza el estómago del 70-80% de la poblaciónen países en desarrollo, iniciándose a edad temprana y su presenciaincrementa el riesgo de desarrollar gastritis, úlcera péptica y/ocáncer gástrico. El diagnóstico oportuno y el cultivo de la bacteria,son de gran importancia para estudios de epidemiología clásica ymolecular. El objetivo del trabajo es describir las condicionespara transportarla viable, de cultivo y pruebas de identificación deH. pylori a partir de biopsias gástricas.

Se obtuvieron 3 biopsias por endoscopía: una para improntay prueba de ureasa rápida, otra se transportó en 500 µL de caldoBrucella con 10% de suero fetal bovino y la tercera en Stuartmodificado, éstas se maceraron y sembraron en masivo en variosmedios, todos con 7% de sangre de caballo o de carnero, condiferentes suplementos y antimicrobianos. La microaerofilia selogró en el sistema GasPack con sobres generadores de CO2(OXOID). También con tres ALKA seltzer® en 10mL de aguadentro de un frasco de mayonesa grande sellado con o sin unavela dentro del mismo, se incubaron de 3-5 días. Se seleccionaroncolonias típicas; cada colonia se identificó con pruebasconfirmatorias: ureasa rápida, catalasa y oxidasa positivos; tinciónde Gram (bacilos Gram negativos curvos). Las cepas seconservaron a –70°C en caldo Brucella, 10% suero fetal bovino,25% Glicerol y sangre de caballo (1:1), así como Caldo Brucellacon 10% de suero fetal bovino y 30% de glicerol.

La sangre de caballo permitió mejor crecimiento de H. pylori apartir de biopsias. La microaerofilia con tres ALKA seltzer® fuebuena, haciendo que el método sea económico. La ureasa rápiday la impronta en biopsia gástrica son dos pruebas muyimportantes, ya que ofrecen el diagnóstico presuntivo de infecciónpor H. pylori.

Palabras clave: Helicobacter pylori, cultivo, biopsia.

Laboratorio de Bacteriología Médica. Departamento de Microbiología.Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional

Sobretiros: Dra. Silvia Giono Cerezo. Laboratorio de BacteriologíaMédica. Departamento de Microbiología. Escuela Nacional de CienciasBiológicas del Instituto Politécnico Nacional. Carpio y Plan de Ayala s/n.Col. Sto. Tomás. C.P. 11340. México, D.F. sgiono@yahoo.com oxmajalca@hotmail.com

Trabajo apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACYT), México (30910-M) y por el Instituto Politécnico Nacional(CEGEPI), México (200473).

ABSTRACT

Helicobacter pylori colonize in the stomach of 70-80% of thepopulation in developing countries, are acquired in childhoodenhances the risk for gastritis, ulcer disease and gastric cancer. Thetimely and the culture of H. pylori in this stage are the majorimportance for study of classical and molecular epidemiology.

Biopsy specimens were collected in triplicate for endoscopy:one for imprint and rapid urease, another to transport in 500 µLof Brucella broth with 100% fetal bovine serum and the third tocarry in transport medium (Stuart´s medium). Biopsy wasmacerate and plated in a variety media, all supplement with 7%horse or sheep blood, with or without another supplementsand antimicrobials. Microaerofilic environment was made inGasPack system with CO2 envelope (OXOID). Besides with threeALKA seltzer® in 10 mL of water inside to the big mayonnaiseflask to seal, with o without a candle in the system, to incubateof 3 to 7 days. H. pylori is identified on the basis of colonymorphology (translucent, gray, dew drop colonies), forconfirmatory test: urease, catalase and oxidase positive, and Gramstain (curve rods gram-negative) was used. For long-term storageto strain are suitable at –70°C in Brucella broth with 10% fetalbovine serum and 30% glycerol plus horse blood (v/v), alsoBrucella broth with 10% fetal bovine serum and 30% glycerol.

Horse blood allow to better growth. Microaerobicenvironment with ALKA seltzer® seen to be good for growthof H. pylori, it is an economic system, then the candle was notnecessary. Rapid urease and test Gram of to the imprint biopsyare two test very important, because at present itself is enoughto reach the first diagnostic presumptive of he infection withH. pylori.

Key words: Helicobacter pylori, culture, biopsy.

INTRODUCCIÓN

H. pylori es un microorganismo Gram negativo, curvo, mideaproximadamente 3.5 x 0.5 mm, posee múltiples flagelos enuno de sus polos y es activamente móvil, es microaerofílico ycoloniza la capa de moco que cubre el epitelio gástrico1, 2, 3.

La identificación inicial y el cultivo de H. pylori a partir de biopsiasgástricas fueron hechas por Marshall y Warren, en 1984; desdeentonces esta bacteria se acepta como agente etiológico causal deenfermedades gastrointestinales como: gastritis crónica activa,úlcera péptica y carcinoma gástrico4.

Los estudios epidemiológicos han mostrado que la infecciónpor H. pylori es considerada la segunda causa de morbilidad entodo el mundo. En países desarrollados, las infecciones sepresentan en menor proporción durante la infancia, siendo la

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incidencia de esta infección aproximadamente de 0.5 a 1.0% poraño en este grupo; mientras que en adultos la incidencia se haestimado como un 50% con un promedio de edad de 60 años1, 2, 3.

En contraste, en países en desarrollo la mayoría de las personasestán infectadas con H. pylori a una edad promedio de 10 años, yparece relacionarse con un bajo nivel socio económico, en dondeprevalecen prácticas pobres de higiene y hacinamiento1, 2, 3.

Se desconoce la existencia de un reservorio no humano,aunque se ha descrito que las cepas de H. pylori aisladas de gatosy perros son idénticas a las del humano, aunque se requiere deestudios que establezcan la posible zoonosis. Se desconoce la víade transmisión en el humano se postula que sea de persona-persona, por vía oral-oral, o bien fecal-oral; aunque la vía detransmisión debe ser tan común para explicarse las altas tasas demorbilidad5.

La identificación de los reservorios y las rutas de infección hansido impedidas por la dificultad de aislar al patógeno delambiente6.

Al igual que en cualquier otra condición, el diagnóstico esesencial antes de iniciar el tratamiento. Existen variosprocedimientos diagnósticos para detectar la presencia de H. pyloride la mucosa gástrica humana7. Los métodos empleados son dealta especificidad y sensibilidad (cuadro 1). Estos métodos sedividen en 2 grupos: Métodos invasivos que necesitan endoscopía

(biopsias) y métodos no invasivos, los cuales no necesitanendoscopía8.

Las biopsias endoscópicas gástricas se utilizan para hacerestudios histológicos, para aislar a la bacteria por cultivo bacterianoo hacer la prueba rápida de ureasa5. El cultivo de las biopsiasgástricas provee la prueba de mayor especificidad aunque el éxitodepende del medio utilizado (cuadro 2)9.

El diagnóstico oportuno y la recuperación de H. pylori medianteel cultivo de biopsias del estómago de personas colonizadas, enuna etapa temprana, permite el monitoreo de la infección. Larecuperación de la bacteria, así como las características delcrecimiento, son importantes para hacer estudios deepidemiología tanto clásica como molecular, diversidad genéticay susceptibilidad a antibióticos2, 10.

Los métodos no invasivos tienen la ventaja de evitar laendoscopía, disminuyen el costo del procesamiento de lasmuestras y/o aceleran el resultado, esto hace que estas pruebassean de gran aceptación, sobre todo en pediatría; pero se limitana estudios epidemiológicos o ayudan a la confirmación de laerradicación de la bacteria después del tratamiento específico,aunque no deben de utilizarse para el diagnóstico de los cuadrosclínicos. La característica de las pruebas existentes, es detectarglobalmente la presencia de H. pylori, evitando los falsos negativosde los métodos invasivos basados en la biopsia11.

La colonización de H. pylori desencadena una severainflamación en la mucosa gástrica, así como estimula la producciónde anticuerpos que pasan a la circulación en sangre en diferentecantidad y sobre todo es cuantificable. La sensibilidad yespecíficidad depende del antígeno utilizado, el tipo de cepautilizada para la preparación de dicho antígeno; además de larespuesta inmunológica que logre generar en el huésped. Laspruebas serológicas disponibles se basan en la ELISA que detectaniveles de IgG. El resultado rápido y la fácil realización son lasventajas de esta prueba. La variabilidad en la respuesta de cadapaciente y la heterogeneidad de las cepas constituyen unas de suslimitaciones. Su utilidad radica en el estudio epidemiológico degrupos poblacionales y en el seguimiento después del tratamiento,con una sensibilidad y especificidad cercanas al 89% enpromedio11.

La prueba del CO2 marcado en aliento, se basa también en lahidrólisis de la urea; se administra urea marcada con 13C ó 14C, sila ureasa de H. pylori está presente en la mucosa, la desdobla a

Cuadro 1. Pruebas para la detección de Helicobacter pylori

Prueba Endoscopía Costo S(%) E(%)

Cultivo Si $$$ 77-94 100Histología Si $$$ 93-99 95-99Ureasa rápida Si $ 86-97 86-98UBT-C13 No $$$ 90-100 80-99UBT-C14 No $$ 90-100 92-100Serología No $ 83-98 56-95

UBT-C13 = Prueba de aliento con urea marcada con C13; UBT-C14= Pruebade aliento con urea marcada con C14 Dunn et al, 199714. E=Especificidad,S = Sensibilidad.

Cuadro 2. Medios de cultivo útiles para el aislamiento de Helicobacter pylori

Medios sólidos con Medios sólidos con Medios sólidos sinsangre de caballo * Suero de caballo sangre de caballo *

Caldo BHI** con 10% de agar Caldo BHI Agar ColumbiaAgar Brucella Caldo Müeller Hinton HeminaAgar Müeller Hinton Caldo Brucella Rojo fenolAgar Skirrow Caldo soya tripticasa IsovitalexAgar Columbia UreaAgar Campylobacter modificado Agar ColumbiaAgar Chocolate Carbón activadoAgar base GC*** Piruvato de sodio

Hemina

*Sangre o suero de caballo al 10%, **BHI: Infusión cerebro corazón, ***GC: gonococos. Luqueño-Martínez V, et al. 199415

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CO2 y bicarbonato, el CO2 liberado es eliminado por el pulmóny el carbono presente en el aire espirado se detecta por elespectrofotómetro de masas (13C) ó contador de centelleo (14C).La prueba de menor riesgo para el paciente se realiza con 13C, noradioactivo, presente en cantidades mínimas pero variables en losalimentos en forma natural, por lo que antes de administrar laurea marcada, se debe tomar una muestra basal. Su uso principales para el seguimiento de los pacientes después del tratamiento,además de estudios epidemiológicos. Esta técnica no necesitaendoscopía, evalúa la presencia de H. pylori globalmente evitandofalsos negativos y determina la situación después de las cuatrosemanas de haber terminado el tratamiento; con todo esto puedetener ventaja sobre la serología. La desventaja es que es una pruebalimitada a pocos centros hospitalarios. Su sensibilidad yespecificidad son del 90 y 100% respectivamente11.

Hasta la fecha no está disponible un “estándar de oro”aceptado universalmente, para hacer el diagnóstico de la infecciónpor H. pylori y por lo tanto la elección de las pruebas depende dela situación clínica específica y permite dar respuesta a las preguntasque sean necesarias contestar4.

El objetivo del presente trabajo es, describir tanto lascondiciones de traslado de cultivo, como las pruebas deidentificación y conservación de cepas de H. pylori a partir debiopsias gástricas.

METODOLOGIA

Las biopsias se obtuvieron por procedimiento endoscópico bajoanestesia general. Se tomaron 3 muestras:

La primera se utilizó para la realización impronta y la pruebade ureasa rápida (agar bacteriológico, urea 1% y rojo de fenol0.002%, que es considerada como negativa a las 4 h). La segundamuestra se transportó en 500 µL de caldo Brucella (BBL, BectonDickinson) con 10% de suero de caballo y la tercera se transportóen medio Stuart modificado (con 2% de Suero fetal bovino.BBL, Becton Dickinson). Ambas biopsias se maceraron en unaplaca de porcelana estéril y sembraron en masivo en placas degelosa sangre.

Se probaron los siguientes medios: Base de GC (gelosachocolate) con 2% de hemoglobina liofilizada, agar Campylobacter,agar de Casman, agar de Columbia, infusión cerebro-corazón,agar Brucella, agar Müeller-Hinton y agar tripticasa soya, todos

adicionados con 7-10% de sangre de caballo o de carnero,suplementados con antimicrobiano de Skirrow (Difco) y con o sinNAD (nicotinamida adenina) a una concentración de 15 µg/mL.

El ambiente microaerofílico (5% O2 y 10% CO2) se logróutilizando sobres generadores de CO2 (OXOID), se utilizaronjarras de anaerobiosis.

También se probó generando el ambiente con tres ALKAseltzer® en 10mL de agua dentro de un frasco grandeperfectamente sellado con parafilm, con o sin una vela dentro delmismo frasco.

El tiempo de incubación fue de 3-5 días. Se seleccionaroncolonias típicas, pequeñas grisáceas de 1 mm de diámetro,translúcidas como “gotas de rocío”; a cada colonia se le realizaronlas pruebas confirmatorias de ureasa rápida en cultivo puro (dapositivo de 5-30 min.); tinción de Gram del cultivo puro (seobservaron bacilos Gram negativos curvos pleomórficos); catalasapositivos, oxidasa positivos resistencia a ácido nalidíxico ysusceptibles a cefalotina12.

Las Cepas perfectamente identificadas se conservaron a –70°Cen 2 sistemas diferentes: Caldo Brucella con 10% suero de caballo(GIBCO), 25% Glicerol y sangre de caballo v/v. Así como CaldoBrucella adicionado con 10% de suero fetal bovino (GIBCO) y30% de glicerol.

RESULTADOS

El caldo Brucella con 10% de suero de caballo es un buen mediode transporte que permite mantener viable a la bacteria en menosde 4 h. Mientras que el medio de Stuart modificado sirvió degran ayuda cuando las muestras iban a durar más de 4 h para serprocesadas y hasta las 24 h después de haberse tomado.

En el cuadro 3, se muestran los resultados obtenidos con lautilización de varios medios de cultivos, así como las diferentescondiciones de enriquecimiento, el medio en donde se observómejor crecimiento de H. pylori fue el agar base de Casman seguidopor el agar Columbia, el agar Brucella y el agar tripticasa soya,todos al 7% de sangre de caballo, con NAD 15 µg/mL ysuplemento de Skirrow.

La recuperación de las cepas en ambos medios de soportepara la conservación fue buena, pero el caldo Brucella con 10% desuero de caballo (GIBCO), 20% de glicerol y sangre, necesitasiempre que se cosechen como mínimo 2 placas con crecimiento

Cuadro 3. Crecimiento de Helicobacter pylori en losdiferentes medios de cultivo

7% de sangreMedio de cultivo Caballo Carnero

Skirrow Sin Skirrow SinSkirrow Skirrow

Agar Müeller-Hinton +/- +/- - -Agar Brucella + ++ +/- -Agar casman +++ +++ + +Agar Columbia ++ ++ +/- +/-Agar Infusión + ++ - -Cerebro-corazónAgar tripticasa soya ++ ++ - +/-

+= positivo, -= negativo

Cuadro 4. Crecimiento de Helicobacter pylori en losdiferentes sistemas para la generación de microaerofilia

Medios de cultivo Sobre generadores 3 ALKA® seltzerde O2 y jarra de y frascos dulcerosanaerobiosis

Agar Müeller-Hinton - -Agar Brucella ++ +Agar Casman ++++ +++Agar Columbia +++ ++Agar Infusión + +Cerebro-corazónAgar tripticasa soya + +

+= positivo, -= negativo

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confluente en 500 µL; mientras que el Caldo Brucella con 30% deglicerol y 2% de suero fetal bovino (GIBCO), sólo se necesitó lamitad del crecimiento contenida en 1 placa con crecimientoconfluente.

Las condiciones microaerofílicas logradas con tres ALKAseltzer® fueron buenas (cuadro 4), el crecimiento de H. pylori fueabundante en este sistema, cuando este mismo contenía una velaen el interior del frasco de microaerofilia, no se mejoró elcrecimiento. El sistema de generación de anaerobiosis comercialdesde luego fue el mejor sistema, pero es de muy alto costo.

DISCUSION

Existen pocos reportes de medios de transporte y condicionesde aislamiento de H. pylori de biopsias gástricas, sobre todo cuandoéstas deben de transportarse para un largo trayecto7.

La estabilidad de H. pylori en la biopsia durante el transportees un factor limitante para la recuperación de ésta. Se ha reportadoque la estabilidad y los resultados del cultivo de biopsias frescasen diferentes medios, varía considerablemente7.

Los resultados obtenidos en este estudio nos demuestran,que el caldo Brucella con 10% de suero de caballo es un buenmedio de transporte que permite mantener viable a la bacteria enmenos de 4 h. Mientras que el medio de Stuart modificado (BBL,Becton Dickinson) es de gran ayuda cuando las muestras tardanmás de 4 h para ser procesadas, hasta las 24 h de haberse tomado.

La precisión en el diagnóstico de H. pylori es un aspectoimportante en el manejo de pacientes con síntomas gastro-intestinales, se utiliza una combinación de diferentes pruebas enla práctica clínica rutinaria13. El fracaso para recuperar a H. pylori dela contaminación ambiental es una desventaja y aumentada porel transporte en medios muy enriquecidos, como sería el utilizadopara las biopsias, por lo que se sugiere suplementar el medio conantibióticos y así inhibir a los otros organismos y mantener laviabilidad de H. pylori 14.H. pylori es una bacteria de crecimiento lento y fastidioso, ademásla competencia ambiental limita su crecimiento, por lo que elcultivo requiere medios enriquecidos, suero y un ambientemicroaerofílico. Bajo las mejores condiciones, un medio noselectivo, necesita generalmente de 2 a 3 días para permitir laformación de colonias pequeñas6, 14.

Si la carga bacteriana inicial de H. pylori es pequeña, da comoresultado una fase lag muy larga dentro de la curva de crecimiento,por lo que es necesario la búsqueda del medio enriquecido idealpara asegurar el desarrollo adecuado de la bacteria en cultivo6.

La densidad bacteriana, condiciones de transporte, medios decultivo y condiciones microerofílicas, además del transporteprolongado e inadecuado, influyen en la supervivencia de H. pylori13.

Se ha determinado que algunos suplementos como sangrecompleta, extracto de levadura, eritrocitos humanos lisados,isovitalex, hemina, ciclodextrina y colesterol, favorecen elcrecimiento de la bacteria; también el NAD favorece el crecimientode H. pylori, sin embargo no es indispensable, por lo que sepuede prescindir de él6. También se ha utilizado el carbón activadoobteniendo resultados aceptables2.

La sangre de caballo permitió mejor crecimiento a diferenciade la de carnero, donde se observó poca recuperación de H. pyloria partir de biopsias, esto es gracias a la mayor cantidad de grasas ycolesterol presente en la sangre de caballo.

Algunos investigadores sugieren que los medios suplemen-tados con mucina crean un ambiente favorable para H. pylori,

porque está degrada enzimáticamente a la mucina y ésta puedeservir como un nutriente para el crecimiento de la bacteria6, dichocomponente no ha sido probado en este grupo de trabajo.

Las bacterias microaerofílicas como H. pylori, son más sensiblesque las bacterias aerobias, a las formas tóxicas derivadas deloxígeno, como el peróxido de hidrógeno y iones superóxidoentre otros. Una combinación de sulfato ferroso, metabisulfitode sodio y piruvato de sodio ha sido favorable para el crecimientoy aerotolerancia de Campylobacter, por la naturaleza de los efectostóxicos del oxígeno. Sin embargo, el metabisulfito es inhibitoriopara el crecimiento de H. pylori 6.

Las condiciones microaerofílicas logradas con tres ALKAseltzer® fueron buenas, haciendo que el método sea muyeconómico, el caso de la vela dentro del sistema no es muyimportante, pero la utilización de la vela solamente, no esrecomendable para la generación del ambiente microaerofíliconecesario para el desarrollo de H. pylori.

La ureasa rápida y la impronta en biopsia gástrica son dospruebas excelentes que se recomiendan hacer, ya que ofrecen elprimer paso para el diagnóstico presuntivo de la infección porH. pylori, así mismo se puede realizar el aislamiento de la bacteriaa partir la biopsia colocada en el tubo para la prueba de ureasa, loque facilita el cultivo en caso de niños menores de 1 año, endonde no es recomendable tomar más de 3 biopsias.

La temperatura de almacenaje también es importante paramantener la viabilidad de las bacterias. H. pylori es capaz desobrevivir a 15°C por 6 h11. La congelación y la adición de glicerolpermite el almacenaje de las muestras y las cepas por pocas semanasa –20°C y varios meses a 70°C 7.

Los métodos de conservación empleados dieron buenosresultados, no se observaron diferencias en la viabilidad yrecuperación de las cepas, sin embargo el medio de caldo Brucellaadicionado con glicerol y suero fetal bovino, es un sistema máseconómico que el otro (caldo Brucella adicionado con suero decaballo, glicerol y sangre de caballo).

CONCLUSIONES

• El transporte de la biopsia en el medio correcto y elprocesamiento rápido de la muestra, son puntos clave paraasegurar la recuperación de H. pylori, siendo el medio ideal:Caldo Brucella con 2% de Suero fetal bovino, con un tiempode procesamiento menor de 4 hrs.

• El ambiente microaerofílico favorable para el crecimiento deH. pylori se puede alcanzar con tres ALKA seltzer®.

• El medio de cultivo que permitió la mejor recuperación deH. pylori fue el agar Casman con 7% de sangre de caballo,incubando por 5 a 7 días a 37°C.

• El medio de conservación conveniente es Caldo Brucellacon 2% de suero fetal bovino y 20% de glicerol, guardadoa –70°C por varios meses.

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