DIAGNÓSTICO e INNOVACIÓN:

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA

DNA CIRCULANTE

POLIMORFISMOS DPYD: 5-FU

José Antonio Castellano (FIR-2)

Análisis Clínicos HUGCDN

25/02/2015

José Antonio Castellano (FIR-2)

Análisis Clínicos HUGCDN

25/02/2015

I. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA

II. DNA TUMORAL CIRCULANTE (ctDNA)

III. APLICACIONES:

5-Fluoruracilo - Polimorfismos DPYD

Medicina Personalizada

Estrategias: Prevención, Diagnóstico y Tratamiento

Avances, Técnicas y Abordajes.

Desarrollo de la Farmacogenética y Farmacogenómica. (EMA)

Conocimiento del Genoma Humano para:

•Comprender bases moleculares: respuesta variable al tratamiento.•Identificar nuevas dianas terapéuticas

Un poco de historia…

www.454.com

I.EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA

• Primera etapa de la mayoría de los estudios de Biología Molecular

• Permite obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diferentes fuentes

• Esencial para realizar metodologías como:

PCR cualitativa (1ª G)PCR cuantitativa indirecta (RT-PCR) (2ª G)PCR cuantitativa absoluta (PCR digital/ BEAMing) (3ª G)Secuenciación clásica ( SANGER)PirosecuenciaciónEpigenética (Metilación del DNA)MLPAa-CGHNext Generation Sequencing (NGS)….

Bloque Tumoral

Tejido Tumoral “gold standard” (Biopsia ó Citología)Suero o plasmaSangre TotalEsputos o exudados bronquiales (poca celularidad)Orinas y otros líquidos biológicosHeces

Muestras (5 μm)

Selecciónmuestra

Desparafi-nación

Extracción ADN

Observación por A.P.

TEJIDO TUMORAL: IMPORTANCIA DE UNA BUENA SELECCIÓN DE LA MUESTRA

TIPOS DE MUESTRA:

Xileno + Etanol

56ºC 10 min aprox.

Xileno + Etanol

56ºC 10 min aprox.

Métodos de Extracción

A) MANUALES ó AUTOMATIZADOSA) MANUALES ó AUTOMATIZADOS

B) SEGÚN TIPO DE SEPARACIÓN:1. Basados en soluciones: (Método Fenol-Cloroformo,

Guanidina tiocianato)

2. Basados en columnas cromatográficas:

• Cromatografía INTERCAMBIO IÓNICO

• Cromatografía ADSORCIÓN

• Partículas MAGNÉTICAS

B) SEGÚN TIPO DE SEPARACIÓN:1. Basados en soluciones: (Método Fenol-Cloroformo,

Guanidina tiocianato)

2. Basados en columnas cromatográficas:

• Cromatografía INTERCAMBIO IÓNICO

• Cromatografía ADSORCIÓN

• Partículas MAGNÉTICAS

www.cultek.com

Sales caotrópicas (cloruro de guanidinio, urea y tiourea) Sales caotrópicas (cloruro de guanidinio, urea y tiourea)

Características cobas® DNA SP

Tamaño corte tejido

Sección de 5µm

% celulas tumorales

≥25% / 10%

Proceso aislamiento

Totalmente definido

Tiempo aislamiento

3 horas

Extracción ácidos nucleicos

Alta

Extracción ADN Alta

Co-purificación RNA

Baja

EXTRACCIÓN MANUAL DE DNA

REACTIVOS:-DNA TLB: Tampón Tris-HCl, , Triton x-100, KCl, EDTA, azida sódica. -PK (PROTEINASA-K)-DNA PBB: Tampón Tris-HCl ,Hidrocloruro de guanidina,urea, Triton x-100 .-WB I: Tampón Tris-HCl + 64% guanidina-HCl-WB II: Tampón Tris-HCl + NaCl-DNA EB: Tampón Tris-HCl + azida sódica(hiposalino), también H2O

www.cultek.com

EXTRACCIÓN AUTOMATIZADA DE DNA

MagnaPure Compact ROCHE®

Características:-Diferentes tipos de muestra: tejido, suero, sangre, plasma…-Trabajar 1-8 muestras simultáneamente.-Posibilidad de elegir volúmen de elución (100-400 uL)-Menor tiempo de extracción (35-50 min, según protocolo)-Mayor protección para el operador: (Menor toxicidad reactiva) : Filtro HEPA y descontaminación UV incorporado

BOLAS MAGNÉTICASBOLAS MAGNÉTICAS

Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría

Cociente de pureza: A260/A280 = 1,8-2,0 Interferencias: Proteínas

/DNA

Nanodrop 2000 (Thermo)

Rango dinámico2 ng/uL-15000 ng/uL

Cociente de pureza: A260/A230 = 2,2 Interf.: HC, Péptidos, Fenoles, Comp. aromáticos…

ETAPAS: 35 ciclos1.Desnaturalización (94-96ºC) 1-5 minutos2.Hibridación (45-72ºC) Unión de cebadores. Si aumentamos Tª, aumenta Especificidad de unión. También modificar el tiempo mejora la Sensibilidad/Especificidad.3.Extensión (72ºC) 2-5 minutos aprox. Depende del tamaño a amplificar (Act. Polimerasa)

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR MIX

Buffer

Primers

DNA molde

dNTP’s (dATP,dGTP,dCTP,dTTP)

Taq polimerasa

MgCl2 (Cofactor Taq polimerasa)

PCR MIX

Buffer

Primers

DNA molde

dNTP’s (dATP,dGTP,dCTP,dTTP)

Taq polimerasa

MgCl2 (Cofactor Taq polimerasa)

1ª G. 2ª G.

3ª G..

Muestra con “Azul de Bromofenol”Muestra con “Azul de Bromofenol”

Agarosa 1-3 %

Tampón TBEX

Bromuro de Etidio

Agarosa 1-3 %

Tampón TBEX

Bromuro de Etidio

II. DNA Tumoral Circulante ctDNA

>75% ctDNA detectable en Ca AVANZADO : (Páncreas,ovario,CCR,vejiga,gastroesofágico,mama,melanoma, hepatocelular y de cabeza y cuello)

50%-70% ctDNA detectable en tumores LOCALIZADOS: (CCR,gastroesofágico,páncreas ymama)

< 50% ctDNA detectable en tumores PRIMARIOS: (cerebro, renal, próstata o tiroides)

OTRAS UTILIDADES DEL DNA CIRCULANTE:

DPNI: Diagnóstico

Prenatal No Invasivo

EN 1997 SE PRODUCE UN HITO EN EL USO DEL DNA CIRCULANTE, ES EL COMIENZO DE LA UTILIZACIÓN DE ADN FETAL EN EL DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO (Dennis Lo y cols, The Lancet,vol 350,issue 9076; 16 Agosto 1997, pp:485-487)

A partir de sangre periférica materna posibilidad de realizar diagnósticos:-Sexo (gen SRY y DYS14)-Aneuploidías ( cromosomas X,Y,21,18, 13)-RH (exones 5,7 y ocasionalmente exón 10 del gen RhD)-Enfermedades monogénicas (Huntington, Distrofia Miotónica, FQ, b-Talasemia…)

III. APLICACIONES: 5-Fluoruacilo-DPYD

.

Tumores sólidos: Colon, mama, piel (uso

tópico) ,esofágico, estómago,hepatocarcinoma, cabeza y cuello

Mecanismo de acción:Antimetabolito antagonista de pirimidinas (Fase S de la síntesis de DNA). Otros: Gemcitabina, Citarabina, Tegafur, Hidroxiurea, Procarbazina…

Conocer la variación genética implica poder predecir la actividad enzimática y poder evitar efectos secundarios en el paciente tratado.

ADMINISTRACIÓN ORAL 5 FU (PROFÁRMACO)

FOLFOX-4: 5-FU + Leucovorin + Oxaliplatino (2 días consecutivos)FOLFOX-4: 5-FU + Leucovorin + Oxaliplatino (2 días consecutivos)

FOLFIRI: 5-FU + Leucovorin + IrinotecanFOLFIRI: 5-FU + Leucovorin + Irinotecan

Regimen de dosis: Irinotecan [180 mg/m2 IV 90min] + Leucovorin [400 mg/m2

IV 120 min] + 5 FU [ bolus 400-500 mg/m2] y 5 FU [2400-3000 mg/m2 IV 46 h]Regimen de dosis: Irinotecan [180 mg/m2 IV 90min] + Leucovorin [400 mg/m2

IV 120 min] + 5 FU [ bolus 400-500 mg/m2] y 5 FU [2400-3000 mg/m2 IV 46 h]

Otras combinaciones:Otras combinaciones:

XELIRI: Capecitabina + Irinotecan + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 80%)XELIRI: Capecitabina + Irinotecan + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 80%)

XELOX: Capecitabina + Oxaliplatino + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 74%)XELOX: Capecitabina + Oxaliplatino + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 74%)

PRESENTACIONES IV DE 5 FU:

Metabolismo

1. DPD= Dihidropirimidina Dehidrogenasa . 80-85% 5-FU administrado se degrada con DPD 2. TS= Timidilato Sintasa 3. MTHFR= Metilentetrahidrofolato Reductasa

MTHFRMTHFR

Reacciones adversasReacciones adversasReacciones adversasReacciones adversas

RespondedoresRespondedoresRespondedoresRespondedores

No respondedoresNo respondedoresNo respondedoresNo respondedores

POBLACIÓN TRATADA CON 5-FU

EFECTOS SECUNDARIOS 5-FU

•DIARREA

•Náuseas y vómitos ocasionales

•Pérdida de apetito, gusto metálico, llagas.

•Fotofobia

•Inflamación, Dolor. (lugar de punción)

•Dermatitis, Alopecia

•Leucopenia

•Anemia y/o hemorragias (rectales)

•Sequedad, agrietamiento, descamación de la piel

•Eritrodisestesia palmo-plantar (EPP): Erupción cutánea, hinchazón, enrojecimiento, dolor y descamación

•Dolor torácico (casos graves)

•DIARREA

•Náuseas y vómitos ocasionales

•Pérdida de apetito, gusto metálico, llagas.

•Fotofobia

•Inflamación, Dolor. (lugar de punción)

•Dermatitis, Alopecia

•Leucopenia

•Anemia y/o hemorragias (rectales)

•Sequedad, agrietamiento, descamación de la piel

•Eritrodisestesia palmo-plantar (EPP): Erupción cutánea, hinchazón, enrojecimiento, dolor y descamación

•Dolor torácico (casos graves)

POLIMORFISMOS DPYD

Nombre SNPs Mecanismo Implicaciones Observaciones

DPYD*2A

(IVS14+1G>A, rs3918290)

Transición de G>A que provoca la delección del exón 14

“SPLICING”

Toxicidad letal

(4 veces) en pacientes con dosis habituales de 5 FU

Constituye 50% alelos no funcionales conocidos

Evidencia científica 1A

DPYD*13

(rs55886062)

Transición de:

A >T (Ile560Asn)

A >C (Ile560Ser)

Exón 13

Aumenta toxicidad en: heterocigóticos (*1/*13)

Toxicidad muy grave: Heterocigóticos(*2/*13)

Homocigóticos(*13/*13)

Evidencia científica 1A

Mutación missense

rs67376798 A (T funcional)

(D*949V, 2846A>T)

Transición de T>A

(Asp949Val)

Exón 22

Toxicidad grave en pacientes con este alelo mutado

Evidencia científica 1A

Mutación missense

GEN DPYD (OMIM 612779): Gen con 4399 nucleótidos repartidos en 23 exones de codificación para la DPD que abarca 950 kb en el cromosoma 1p22. Existen al menos 30 mutaciones donde 20 son funcionales para el gen DPYD

GEN DPYD (OMIM 612779): Gen con 4399 nucleótidos repartidos en 23 exones de codificación para la DPD que abarca 950 kb en el cromosoma 1p22. Existen al menos 30 mutaciones donde 20 son funcionales para el gen DPYD

www.pharmgkb.orgwww.pharmgkb.org

Otras: DPYD*9A *9B(T85C), rs1801158, rs1801159, rs1801160, DPYD*5 hasta un total 11 mutaciones del gen DPYD.Otras: DPYD*9A *9B(T85C), rs1801158, rs1801159, rs1801160, DPYD*5 hasta un total 11 mutaciones del gen DPYD.

¿Existen diferencias en los Polimorfismos DPYD según la raza?¿Existen diferencias en los Polimorfismos DPYD según la raza?

5 grupos étnicos (N=288): Koreanos, Japoneses, Chinos, Afroamericanos y americanos de origen europeo.

5 grupos étnicos (N=288): Koreanos, Japoneses, Chinos, Afroamericanos y americanos de origen europeo.

Se observaron similitudes entre la población asiática y diferencias en los SNPs respecto a los Afroamericanos y Europeos:

-DPYD*9 (raro en asiáticos)

-DPYD*2A (mayor en Africanos)

Se observaron similitudes entre la población asiática y diferencias en los SNPs respecto a los Afroamericanos y Europeos:

-DPYD*9 (raro en asiáticos)

-DPYD*2A (mayor en Africanos)

¿Qué hacemos?- RT-PCR sondas Fluorescentes (TaqMan,SYBR Green)

- 3 polimorfismos-SNPs:

DPYD*2A, DPYD*13 y rs 67376798

¿Qué hacemos?- RT-PCR sondas Fluorescentes (TaqMan,SYBR Green)

- 3 polimorfismos-SNPs:

DPYD*2A, DPYD*13 y rs 67376798

Wild typeWild type

Heterocigótico (3%)Heterocigótico (3%)

Homocigótico mutado (0.1%)Homocigótico mutado (0.1%)

¿Y cómo sería el informe de los resultados?

Medicina Personalizada: Guía de actuación clínica

CONCLUSIONES

•Conocer la variación genética implica poder predecir la actividad

enzimática

• Existen muchas variantes, en especial SNPs, “single nucleotide

polymorphisms” que nos obligan a ser precisos en el diagnóstico.

•La aparicón de nuevas tecnologías nos ayuda a disminuir el tiempo de

respuesta en los resultados, realizar varios pacientes y polimorfismos

simultáneamente y una importante reducción en los costes.

•Evitamos la administración de terapia ineficaz o que se produzcan

efectos secundarios en el paciente (medicina personalizada)

GRACIAS POR SU ATENCIÓN