1 cu-zn sod sometida a diferentes concentraciones de sds. 1 h rmn, en a sin sds y en b con 5% de...
TRANSCRIPT
1
Cu-Zn SOD sometida a diferentes concentraciones de SDS. 1H RMN, en a sin SDS y en b con 5% de SDS. Los espectros muestran las regiones de protones aromáticos y de amida (6.5 - 9 ppm), y de protones de carbono alfa y metínicos (< 5.8 ppm). Int. J. Biol Macromol (2001) 29; 99-105
Desnaturalización de proteína
2
1H RMN de insulina. Región de los protones de residuos aromáticos con diferentes concentraciones de ion cinc agregado. Los números indican las veces en exceso que se encuentra el Zn2+.
Unión de ligando a proteína
3
Zhuang, Z, et al (2002) Biochemistry, 41, 11152-11160
NMR de 4-Hidroxibenzoil-CoA tioesterasa
Unión de ligando a proteína
4
1H RMN de la proteína nucleocápside HIV-1 (Bombarda, E. et al (2001) J Mol Biol 310, 659). Los diferentes puntos representan los protones del C de la Cys36 (▲), Cys39 (● y ♦) y Cys49 (■)
Propiedades de aminoácidos en proteínas
5
H2PO4- HPO4
2- + H+
pKa = 6.8
Determinación de pH intracelular
6
buffer
Metabolismo de glucosa en E. coli
FDP = fructosa 1,6-bisfosfatoL = lactatoA = acetatoE = etanolS = succinatoB = buffer
Glucosa 13C-1 50 mM a t = 0
7
Cinética enzimática en mitocondrias intactas
fosfato inorgánico (1), fosfocreatina (2), fosfatos , y (3-5) del ATP y fosfatos y del ADP (6-7).
Creatina + ATP creatina fosfocinasa fosfocreatina + ADP Creatina + ADP creatina fosfocinasa fosfocreatina + AMP
8PNAS, 92: 4748
Calbindina
9
Obtención de estructuras de proteínas por RMN
Requisitos
[Proteína] ~ 1 mM0.5 mLestable por al menos 24 h a temperatura ambientemonoméricac < 10 ns
secuencia de aminoácidosMasa molecular... a confirmar
10
Distribución de pesos moleculares de
proteínas resueltas hasta 1997
11
20 40 1400
200
400
600
800
1000
1200
1400N
úm
. de
est
ruct
ura
s
Masa molecular (kDa)
152 kDa a abril de 2010PDB ID: 2P80
Distribución de pesos moleculares de proteínas resueltas hasta 2010
12
Ribonucleasa
a 40 mHz
JACS (1957) 79:3289
El inicio de la historia
13
Ribonucleasa
a 56.4 mHz
JBC (1962) 237:1807
14
Ribonucleasa
a 60 mHz
Science (1967) 157:257
15
Espectros de 1H RMN de:
nucleasa de estafilococo (156 aminoácidos)
Inhibidor pancreático básico de tripsina (58 aminoácidos)
Magainina 2 (23 aminoácidos)
16
Lisozima
17
18
Asignación de resonancias para grupos laterales
19
Magainina 2 con asignación de señales para una valina
20
Acoplamiento entre protones de amida y protones de C
21
Ec. de Karplus J() = Acos2() - Bcos() + C
3JH,HN() = 6.4cos2(-60º) - 1.4cos(-60º) + 1.9
C
C
N
C
C
N
C
R H
O
O
H
HR
HR
H
hélice ( = -57º), 3JH,HN = 3.9 Hz hélice 310 ( = -60º), 3JH,HN = 4.2 Hz hoja antiparalela ( = -139º), 3JH,HN = 8.9 Hz hoja paralela ( = -119º), 3JH,HN = 9.7 Hz
i i + 1
φ
Medida de acoplamientos y estructura secundaria
22
Los núcleos intercambian constantemente su magnetización a velocidades que dependen de la sexta potencia de su distancia. Si se miden las velocidades del intercambio de magnetización se obtiene un conjunto de distancias internucleares. Este intercambio de magnetización se conoce como efecto nuclear Overhauser (NOE).
Efecto nuclear Overhauser
23
Correlación a través del espacio
24
Correlación a través del espacio
25
NOESYregión NN
Hélice entre los residuos
89 y 101
26
Contactos lejanos y estructura terciaria
sin asignación de secuencia
con asignación de secuencia
27
El resultado…
Lisozima (1E8L)
28
Los resultados…
Lisozima (1E8L)
29
Bibliografía