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MC Diana Lorena Alvarado HernándezLaboratorio de Biología Molecular

PROPUESTA DE TESIS

DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS BÁSICAS

DIRECTOR DE TESIS

Dr. Christian A. García Sepúlveda

ASESORES INTERNOS

Dr. Daniel E. Noyola Cherpitel

Dr. Roberto González Amaro

Dr. Flavio Martínez Morales

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EPIDEMIOLOGÍA

Incidencia de infección 1-2%/año: población abierta (donadores de sangre).

Prevalencia: 60-90%2

Causa más importante de infección congenita y el responsable de importantes secuelas neurológicas y auditivas1.

Tasa de infección mayor en países en vías de desarrollo (madres solteras, no-caucásicas, bajos recursos, madres jóvenes).

Incidencia de reactivación post-trasplante: 75% y pacientes con VIH/SIDA1

1Ho M. The History of cytomegalovirus and its diseases. Med. Microbiol Immunol. 2008

2 http://en.wikipedia.org/wiki/Cytomegalovirus

Alrededor del 1% de recién nacidos se infectan congénitamente por hCMV1,2

Solo entre 1 y 10% son sintomáticos1

Directamente proporcional a la prevalencia materna2

Manifestaciones clínicas: petequias, hepatoesplenomegalia, ictericia, calcificaciones intracerebrales1

Secuelas neurológicas, auditivas, visuales

31Ho M. The History of cytomegalovirus and its diseases. Med. Microbiol Immunol. 2008

2Boppana S. Infectious Disease: Congenital and Perinatal Infections: A concise Guide to Diagnosis. Cytomegalovirus. Chapter 6. Humana Press

%Madres seropositiv

as

%Infección congénita

Costa de Marfil

100 1.4

Corea del Sur 96 1.2

Reino Unido 56 0.4

Canadá 44 0.42

4http://www.paho.org/spanish/ad/fch/ca/si-desarrollo1.htm

Infección por hCMV en el Embarazo

Infección Primaria Reactivación

30-40% niños infectados

0.2 - 1% niños infectados

85-90% asintomáticos

10-15% sintomáticos

99% asintomáticos

0-1% sintomáticos

90% secuelas

20-30% muertes

10-15% secuelas 5-10% secuelas

Pacientes trasplantados 75% seropositividad después de trasplante La morbilidad depende del tipo de órgano trasplantado Neumonía es la complicación más común Trasplante de médula ósea, corazón, pulmón.

VIH Infección oportunista Infecciones más severas conocidas Daño a Sistema Nervioso Central Retinitis : pérdida de la vista

5

6

-herpesviridae, genoma dsDNA grande, replicación lenta.

Virión esférico envuelto 150-200 nm. Envoltorio Tegumento Cápside icosaédrica 115-130 nm (T=16).

Herpesvirus mas grande reconocido en humanos.

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TRL UL IRL IRS US

235 kbp

TRSAT

235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

8

TRL UL IRL IRS US TRSAT

L

235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

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TRL UL IRL IRS US TRSAT

S

235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

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TRL UL IRL IRS US TRSAT

235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

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TRL UL IRL IRS US TRSAT

235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

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235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

TRL UL IRL IRS US TRSAT

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235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

TRL UL IRL IRS US TRSAT

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235 kbp

2 dominios: L y S

Regiones únicas en cada dominio

Regiones repetitivas: T e I

Bases terminales complementarias

>200 ORFs

Mayoría de los ORFs dedicados a

inmunoevasión

TRL UL IRL IRS US TRSAT

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INMUNIDAD Y COEVOLUCION

Importante participación del Sistema Inmune Adaptativo.

Sistema Inmune Innato cada vez cobra mayor importancia.

Defectos severos del Sistema Inmune Adaptativo no necesariamente asociados a incremento de frecuencia de infecciones por CMV (SIDA=44%).

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INMUNIDAD Y COEVOLUCION

El sistema inmune adaptativo solamente entra en juego cuando el sistema inmune innato ha fracasado en su intento por frenar la incursión del patógeno

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CÉLULAS NK Las células Asesinas Naturales (NK) son linfocitos

citotoxicos del sistema inmune innato más grandes que los linfocitos B o T.

No rearreglan receptores antígeno-específicos como los linfocitos B (inmunoglobulinas) y Linfocitos T (TCR).

Expresan CD56, pero no CD3.

Se derivan de la médula ósea y constituyen aproximadamente el 10% de los linfocitos circulantes (aprox 64 células NK/L).

Inicialmente descubiertas por su capacidad para matar a células tumorales SIN SENSIBILIZACION PREVIA.

Tienen dos funciones efectoras principales: Citotoxicidad celular Secreción de citocinas

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RECEPTORES DE NKs Expresan tres tipos de receptores:

Receptores Inmunoglobulina-símiles (KIR) Receptores tipo lectina (CTLD) Receptores de Citotoxicidad Natural (NCR)

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RECEPTORES DE NKs KIRs:

Reconocen a moléculas de HLA Dicotomía funcional (activadores e inhibidores) Sistema complejo, multigénico y polimórfico

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RELEVANCIA FUNCIONAL

Balance de señales.

Funciones inmunes:

1.- Vigilancia y participación en respuestas anti-tumorales.

2.- Participar en reacciones contra patógenos.

3.- Influir sobre la biología de la implantación.

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RECEPTORES KIR Proteinas transmembrana tipo I de 2 o 3 dominios extracelulares

(reconocen HLA).

Colas intracitoplásmicas cortas (activadoras) o largas (inhibidoras).

Colas intracitoplásmicas poseen ITIMS o ITAMS.

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Codificados en 19q13.4 en el Complejo de Receptores Leucocitarios (LRC).

Región KIR abarca 150 kb.

MULTIGENICO: 15 genes KIR y 2 pseudogenes cada gen alrededor de 14 Kb.

POLIMORFICO: 335 alelos KIR reconocidos.

COMPLEJO: Variabilidad en numero de genes activadores (Haplotipos A y B).

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◀ Centrómero Telómero ▶

A

B

24

PROPUESTA

Estudiar el impacto y la relevancia clínica de las características genómicas humanas (KIR) y de la genómica viral sobre la incidencia de infecciones por CMV, su reactivación, incidencia y curso clínico.

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JUSTIFICACIÓN

CMV ha demostrado ser un patógeno viral importante por su incidencia y prevalencia.

Cerca del 90% de los seres humanos han sido infectados

Causa más importante de infecciones congénitas en humanos Importantes secuelas neurológicas.

Agente causal de importante comorbilidad en pacientes inmunocomprometidos.

Postrasplantados y pacientes con VIH/SIDA.

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HIPÓTESIS

La presencia de algunos genes KIR y características genómicas virales determinan la frecuencia de infección, reactivación viral y el curso clínico de las infecciones por CMV.

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OBJETIVO GENERAL

Estudiar la relevancia clínica de la diversidad genética de los receptores KIR y de la genómica de CMV en el contexto de infecciones congénitas y en pacientes con VIH/SIDA.

1.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la reactivación de la infección por CMV en mujeres embarazadas.

2.- Evaluar la incidencia de la infección congénita por CMV en recién nacidos.

3.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la incidencia de la infección por CMV en pacientes con VIH y su curso clínico.

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OBJETIVOS ESPECÍFICOS1.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la reactivación de la infección por CMV en mujeres embarazadas.

METAS

Caracterizar la diversidad de genes KIR en una población abierta de Mexicanos mestizos (CGM Abierta, n=300) para servir de referencia.

Caracterizar la diversidad de genes KIR presente en madres de recién nacidos infectados o no por CMV (n=200 piloto inicial).

Determinar la tasa de prevalencia de infección activa e infecciones previas por CMV en mujeres embarazadas (PCR y serologia).

Determinar la existencia de asociaciones genómicas KIR y virales que actúen como factores de susceptibilidad/protección a infecciones maternas por CMV.

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OBJETIVOS ESPECÍFICOS1.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la reactivación de la infección por CMV en mujeres embarazadas.

ACTIVIDADES

Optimizar de técnica genotipificación KIR por PCR-SSP.

Optimizar técnica de detección de CMV en sangre para incluir ctrl interno.

Optimizar técnica de evaluación serológica de anticuerpos contra CMV.

Desarrollar y optimizar técnica de detección de polimorfismos virales de interés por medio de PCR-SSP.

Recopilar información clínica y demográfica, así como desarrollar base de datos para el seguimiento clínico de la cohorte de mujeres embarazadas.

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OBJETIVOS ESPECÍFICOS2.- Evaluar la incidencia de la infección congénita por CMV en recién nacidos.

METAS

Determinar la tasa de prevalencia de infecciones congñenitas por CMV en recién nacidos a partir de las tarjeta de Guthrie tomadas para el tamiz neonatal.

ACTIVIDADES

Evaluación y optimización de técnica de extracción de DNA genómico humano y viral a partir de tarjetas Guthrie.

Optimizar técnica de detección de CMV en tarjetas Guthrie de tamiz neonatal por PCR anidada.

Determinar la tasa de incidencia de infección congénita por CMV en recién nacidos a través del tamizaje de tarjetas Guthrie de tamiz neonatal (n=1500).

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OBJETIVOS ESPECÍFICOS3.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la incidencia de la infección por CMV en pacientes con VIH y su curso clínico.

METAS

Determinar la tasa de incidencia de la infección activa por CMV en pacientes con VIH (n=300).

Determinar la existencia de asociaciones genómicas KIR y virales que actúen como factores de susceptibilidad/protección a infecciones por CMV en pacientes con VIH/SIDA.

Determinar la manera en que la diversidad genómica KIR modifica el curso clínico de las infecciones por CMV (duración y evolución) en pacientes con VIH/SIDA.

Determinar la manera en que las propiedades genómicas virales modifican el curso clínico de las infecciones por CMV (duración y evolución) en pacientes con VIH/SIDA.

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OBJETIVOS ESPECÍFICOS3.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la incidencia de la infección por CMV en pacientes con VIH y su curso clínico.

ACTIVIDADES

Tamizar Colección Genómica de VIH para detección de CMV por PCR anidada.

Caracterizar polimorfismos virales de interés (CMV) presentes en pacientes de la Colección Genómica de VIH.

Desarrollo de hoja de seguimiento clínico y base de datos para cohorte de pacientes con VIH .

Seguimiento trimestral de incidencia de infecciones por CMV en pacientes con VIH/SIDA.

Seguimiento clínico del curso de las infecciones por CMV en pacientes con VIH/SIDA.

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Análisis

Análisis de resultados

1. Inferencia de haplotipos y genotipos KIR para las cohortes de estudio y pacientes sometidos a caracterización KIR en base a contenido de genes.

2. Evaluación de asociaciones genéticas (humanas y virales) y parámetros clínicos como tasa de incidencia de infecciones activas por CMV en madres, tasa de incidencia de infecciones por CMV entre neonatos, tasa de infección por CMV en pacientes con VIH así como curso de la enfermedades en esta última cohorte basada en el paquete estadístico SPSS V14 para Mac OSX empleando pruebas estadísticas correspondientes.

1. Chi cuadrada y Fisher’s exact para análisis de parámetros genéticos (contenido de genes KIR, haplotipos, genotipos virales, etc).

2. Curvas de sobrevivencia de Kaplan-Maier con regresión logística para análisis del impacto de parámetros temporales (tiempo de duración de infección por CMV, tiempo a la muerte, tiempo libre de enfermedad, etc).

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Gracias