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29/06/2014

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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACION Y PURIFICACION DE MACROMOLECULAS

Docente a cargo: Fernando Oliver ([email protected])

CEBI_E11_08 : Cromatografía 2

Cromatografía de afinidad

Separa proteínas en base a la interacción

reversible entre la proteína y su ligando

especifico unido a la resina.

Es una técnica adecuada para un primer paso

de capturar la proteína.

Tiene que existir un ligando especifico.

La interacción proteína-ligando puede

involucrar muchas interacciones no

covalentes (electroestáticas, interacción hidrofóbica, van der Waals, formación puentes

de hidrogeno).


Se puede en un solo paso lograr una pureza

>80% con rendimientos muy buenos.

Se logra en un solo paso lo que se lograría

con varios pasos de técnicas menos

selectivas (Int. Iónico, Int. Hidrofóbica).

Las resinas de afinidad en general son

costosas.


Características del ligando:

Debe tener una fuerza de unión moderada (KD entre 10-5 –10-8) para poder despegar la proteína en condiciones no

tan drásticas.

Debe poder unirse a una matriz cromatografía sin perder su

conformación (conserva la afinidad)

Debe estar disponible comercialmente e idealmente debe

ser económico.

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Modos de elución:

La elución es isocrática, en general no se hacen gradientes.

Se puede eluir utilizando un análogo del producto (sitio

combinación) o del ligando.

Cambiando pH, conductividad o los dos. Esto produce

cambios conformacionales de producto o ligando disociando el complejo proteina-lignado.


Ligandos que se pueden utilizar:

•Anticuerpos (purifico Ag)•Antígenos (purifico Ac)•Enzimas (purifico sustrato, inhibidor)•Inhibidores enzimas (purifico Enz.)•Receptores (purifico ligando receptor)•Lectinas (purifico glico-prot. / HC)•Proteína A, G, L (purifico Ac)

Para unir al ligando se puede hacer uso de resinas comerciales activadas (CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow, GE).

Para ligandos pequeños es necesario utilizar un brazo espaciador para evitar impedimentos estéricos en la resina.

Cromatografía de afinidad Cromatografía de afinidad

Ventajas:

•Eliminación de pasos de purificación

•Rendimientos altos

•Equipamiento mas sencillo.

•Desventajas

•Problemas regulatorios.

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Lectinas:

•Proteínas que unen reversiblemente hidratos de carbono.

•La elución es con gradientes salinos o con sustancias competidoras (ej: α-D-metilglucosido)


Lectinas mas comunes:

•Con A (concanavalina A): Une específicamente α-D-manopipiranosidos, α-D-glucopiranosidos y azucares

relacionados ( -OH en C3, C4 y C5)

•Lectina Lentil: une α-D-manose, α-D-glucosa

•Lectina de Germen de trigo: une N-acetil-glucosamina

•Lectina de Helix pomatia: une α-D-acetil-glucosamina


Cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC):

•His-tag: cola formada por 6 His que permite la unión a metales y su purificación por IMAC.

•La incorporación de la His-tag a la proteína puede hacerse de

distintas maneras:•Clonado en vector con secuencia de His-Tag.

•Agregado de His-Tag por PCR (uno de los primer incluye la secuencia para las 6 His).•Clonado de oligonucleótidos que codifica para His-Tag en vector

que contenga mi secuencia


Algunos agentes quelantes:

•IDA: Acido iminodiacetico

Posee tres sitios de coordinación.

•NTA: Acido Nitrilotriacetico

Posee cuatro sitios de coordinación.

Quedan 2 libres para unir a proteína.

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Fuerza de la unión en IMAC depende de:

•El ion utilizado: Cu2+ > Ni2+>Co2+>Zn2+

•El agente quelante utilizado: IDA3> NTA4

•La densidad de ligandos en la matriz.

•La concentración salina en la matriz.


Binding:

Se utilizan condiciones ligeramente alcalinas (pH entre 7,0 -

8.0 ) para que tanto la matriz como la His-Tag estén

correctamente cargadas y se produzca una buena interacción.

Para disminuir unión inespecífica: imidazol hasta 20 mM, ClNahasta 500 mM.


Elución:

Se pueden distintos métodos:

•Elución por disminución del pH. Dependerá de la proteína, el pH de elución. Se utilizan pH entre 6.0 – 4.0. Se protona el nitrógeno imidazólico de las His entonces se rompe la unión de coordinación.

•Utilizar análogos de His: se utiliza imidazol en una concentración >200mM (depende de la resina utilizada).

•Utilización de quelantes (EDTA): el quelante saca el metal de la columna eluyendo la proteína. El metal queda junto con la proteína en el eluido (puedo eliminarlo por desalado en columna)

Eliminación de la His-Tag

Se puede eliminar por clivado enzimático. Para esto es necesario clonar con el sito de corte para la enzima.

Ejemplo: clivado por enterokinasa: corta en secuencia DDDDK


Otros tags que se pueden utilizar para purificar:

GST-Tag (Glutation-S-transferasa):Se utilizan resinas con glutatión.

Strep-Tag (péptido de 9 aa que se une a streptavidina )Se utilizan resinas con estreptavidina.

MBP-tag (Maltose binding protein)Se utilizan resinas con maltosa.

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Proteína A:

•Proteína asociada a la pared celular de Gram-positiva Staphylococcus aureus.

•Es el sistema de afinidad mas usado para purificar Ac (hay otros prot. G, prot. L) y uno de los primeros desarrollados.

• Prot. G no se usa en escala industrial porque es muy inestable. Se usa para IgG III porque prot. A tiene baja

afinidad.


Proteína A:


Proteína A:

Unión de proteína A a la matriz:

•Inmovilización no dirigido (nProteína A):

•Prot. A pega en mas de un sitio a la resina.•Ventajas: mayor estabilidad y menor perdida de ligando (leakage)

•Desventaja: múltiples sitios de unión a la matriz pueden interferir con

el sitio de binding de prot. A.

•Inmovilización dirigida (rProteina A):

•Se introduce un grupo Cys en C terminal (–sh) para dirigir el pegado a la resina en un único punto.

•Ventaja: aumenta la capacidad.

•Desventaja: mayor leakage.


Proteína A:

Ventajas:

•En un solo paso de purificación obtengo un grado de resolución muy grande y un rendimiento muy bueno.

Desventajas:

•Muy inestable ante sn utilizadas para hacer CIP (NaOH 0,5N). Posee Gln que se deamidan y se clivan, entonces se pierde actividad.

Importancia CIP:•Eliminación endotoxinas, virus, bacterias.•Remueve proteínas precipitadas o desnaturalizadas en resina.•Eliminación lípidos y DNA.

Se generan proteína A modificados (mutagenesis de residuos susceptibles): entonces se tiene un ligando mas estable y compatible con CIP (Asp->treonina)

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Cromatografía de afinidad Cromatografía de afinidad

Proteína A:

•Buffer de equilibración: pH neutro o ligeramente alcalino. ( 20 mMsodium phosphate, pH 7.0)

•Buffer de elución: Se utiliza pH acido (0.1 M citric acid, pH 3.0)

•Buffer neutralización: El eluido se recibe en buffer neutralizante,

para subir el pH rápido (1 M Tris-HCl, pH 9.0)

Características buscadas en resina proteina A para bioprocesos:

•Permitir trabajar a flujo alto (tiempo residencia bajo)

•Alta capacidad (menor volumen de resina)

•Estabilidad ligando (poco lekeage)•Poder sanitizar (alto numero ciclos)

Cromatografía de afinidad Cromatografía multimodal

En la cromatografía multimodal el ligando unido a la matriz

interacciona por mas de un mecanismo de acción con la

molécula.

Algunas de estas interacciones pueden ser:•Interacciones electroestáticas

•Interacciones hidrofóbicas

•Formación de puentes de hidrogeno

El ligando unido a la matriz esta formado por la unión de distintos

grupos (cada uno con un mecanismo de acción distinto).

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Cromatografía multimodal Cromatografía multimodal

Las condiciones de binding y elución son mas difíciles de predecir y es necesario realizar un diseño experimental

adecuado para caracterizar el comportamiento de la molécula.

Cromatografía multimodal

La condición de binding se extiende respecto de los métodos cromatograficos tradicionales.

En el ejemplo se muestra la comparación entre distintos intercambios iónicos y sus equivalentes en resinas multimodales.


Las condiciones de elución cambian respecto a los métodos tradicionales (cambia la selectividad)

Ejemplo de purificación de 5 mAbs por Int. Anionico y multimodal.

Bimodalanionico Int. Anionico

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En que situaciones es útil esta cromatografía:

•Cuando la conductividad del la muestra es muy alta para pegar en un intercambio iónico tradicional (ej: lisados en general > 15 mS/cm)

•Cuando quiero reducir el numero de pasos.

•Cuando la selectividad de las técnicas tradicionales no es suficiente para eliminar algún contaminante.

Cromatografía de lecho expandido

(EBA: Expanded Bed Adsorption)

Es una operación integradora de varias operaciones unitarias.

Permite sembrar en la columna material SIN clarificar (no hace falta centrifugar o filtrar).

Durante el proceso la columna pasa por dos estados: expandida y compacta.

Para expandir la resina se aplica un flujo ascendente.

La siembra se hace con la resina expandida y con flujo ascendente. De esta

manera se puede aplicar el material particulado y se evita que se tape la columna.

Luego de sembrar se lava la resina, se detiene la bomba, se deja sedimentar la resina, se baja el pistón y se invierte el flujo (modo compactado).

La operación en modo compactado es idéntica a las columnas tradicionales.



Modo de operación:



Dentro de la columna las partículas de resina NO tienen el

mismo tamaño y densidad.

Cuando se aplica el flujo

ascendente la columna se expande.

Las distintas partículas de resina se ubicaran en la zona en la que

encuentren el equilibrio entre la velocidad de sedimentación y flujo

ascendente.

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Equipamiento:



Ventajas:

Puedo aplicar materiales particulados (lisados, etc) sin previa

clarificación. Es un paso integrador.

Desventajas:

Es dificultoso el escalado en columnas de mas de 20cm de diámetro.

La operación es mas compleja que un sistema tradicional.

Es mas dificultosa la limpieza de las resinas.

Es una tecnología que se esta discontinuando.

Cromatografía Membranas

Membrana de celulosa con grupos funcionales pegados


Algunas membranas comerciales:

* También hay con grupos IDA (IMAC), Proteina A y Epoxy (menbrana

activada).

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Resina (bead)~ 90% ligandos dentro de la particula

Membrana(poros >3um)


La capacidad (DBC) no varia con el flujo.


Modo de operación


Ventajas:

•Puedo trabajar a flujos altos (no varia DBC), entonces el tiempo de operación baja.

•No tengo problemas de presión por trabajar a flujos altos (poro >3um).

•Filtros descartables (no tengo que validar).

•El escalado es directo (aumento la superficie, manteniendo el ancho del

filtro).

Desventajas:

•Baja capacidad comparado con resinas (puedo usarlo en cromatografía

en modo negativo)

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Usos:Al no tener tan buena capacidad como la resinas se utiliza principalmente como un método para eliminación de impurezas

trabajando en modo negativo (producto no pega, pegan contaminantes).

Puedo eliminar:Endotoxinas (Int. Anionico)DNA (Int. Anionico)

HCP (Int. Cationico/anionico)Proteina A (Int. Anionico)Impurezas con afinidad Ni (IMAC)

Escalado ideal (scale-up)

Se hace manteniendo la geometría de la columna, aumentando el

diámetro.

•Se mantiene el flujo lineal constante (cm/Hs).•Mantener la misma proporción de vol siembra/vol resina (misma carga).

•Si hay gradientes, se mantiene la misma pendiente (gradiente en misma

cantidad de VC).

h = 10 cmd = 1,6 cm

VC = 20 mL

h = 10 cmd = 5 cm

VC = 200 mL

h = 10 cmd = 14 cm

VC = 1540 mL

10x 8x

Escalado no ideal

Si la columna que dispongo para el escalado no es la mas

adecuada puedo mantener el tiempo de residencia dentro de la

columna como criterio de escalado.

h = 10 cmd = 5 cm

VC = 100 mL

h = 5 cmd = 20 cm

VC = 1540 mL

h = 10 cmd = 14 cm

VC = 1540 mL

h = 19,6 cmd = 10 cm

VC = 1540 mL

Ideal, mantengo flujo lineal

No Ideal, mantengo tiempo residencia

No Ideal, mantengo tiempo residencia.

OJO la presión, puede ser que tenga que terminar bajando el

flujo.

15x

Se hace el trabajo inverso: se mantiene geometría y se disminuye

el diámetro.

•Algunas situaciones para las cuales haría un scale-down:

•Validación de proceso, obtención de rangos operativos y puntos críticos.

•Generación de Ac contra contaminantes: hago la corrida con el mismo material pero sin producto (uso el mismo sistema

host-vector pero sin proteína clonada)

•Investigación de OOS.

•Optimización de procesos.

Disminución escala (scale-down)

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El test de control de eficiencia (validación del empaque):

•Consiste en el análisis del cromatograma producido por una sustancia trazadora.

•La sustancia trazadora no debe interaccionar con la columna, las condiciones de buffer y corrida deben ser seleccionadas con esta

finalidad.

Control de la eficiencia

Se realiza sembrando un pulso del trazador en la columna.

Luego se analiza el pico de trazador y se calculan los parámetros.


Sustancia trazadora:

PM lo suficientemente bajo para penetrar en la partícula porosa completamente.

No tiene que interaccionar con la matriz.

Se usa acetona o sales.

EjemplosTrazador: 1% acetona en agua (veo señal en UV)FM: agua

Trazador: 0,8M NaCl (veo señal en el conductimetro)FM: 0,4M NaCl

Volumen de inyección: 1% del VC


La eficiencia se define con dos parámetros:

•Ensanchamiento de picos: Numero de platos teóricos (N), este parámetro refleja el numero de equilibrios que se producen en la columna.

La altura del plato teórico reducida (h) es independiente de la altura de la columna y del diámetro de partícula, sirve para comparar eficiencia empaques entre columnas.

•Factor de asimetría (As):Me da una idea de cómo esta el empacado. El As teórico ideal es 1.Desviaciones pueden indicar problemas en el empacado.También pueden generarse desviaciones por problemas en la frita, el pistón.

Valores esperados para una columna con empaque optimo

h ≤ 3As 0.8 < As < 1.8


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El test de control de eficiencia (validación del empaque):

•Permiten calificar y controlar la performance del empacado.

•Se puede usar entre corridas para chequear la integridad del

lecho.

•También sirve para verificar escalado de una columna.

Control de la eficienciaColumnas descartables

Columnas pre-empacadas (Ready toprocess)

Están diseñadas para purificar productos farmacéuticos en fase clinica (no puedo

perder tiempo validando, limpiando, calificando, etc…)

El empaque esta validado.

Son descartables, no tengo que limpiar.

Existen con todos los rellenos conocidos.

Son costosas y solo se justifican si el

tiempo que se ahorra es mas importante que el costo.

Equipamiento Bibliografía

•Handbook Gel Filtration, GE Healthcare•Handbook Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing, GE Healthcare•Handbook Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography, GE

Healthcare•Affinity Chromatography• Methods in Enzymology Volume 541 (2014), Laboratory Methods in Enzymology: Protein Part C•Methods in Enzymology, Volume 463 (2009), Guide to Protein Purification•Gokana, A., J. J. Winchenne, A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J. P. Cartron, and P. Lambin. 1997. “Chromatographic Separation of Recombinant Human Erythropoietin

Isoforms.” Journal of Chromatography A 791 (1): 109–18.

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