TUBERCULOSIS

Diagnóstico microbiológico

Lidia WolffHospital Rawson –UNC

I Curso Trienal de Infectología

TÉCNICA DE LABORATORIO

• Fiable

• Accesible

• Oportuna

ESTUDIO BACTERIOLÓGICO

Única forma de confirmación de la TB, ya que demuestra la presencia del agente causal.

Evolución de las técnicas microbiológicas en el diagnóstico de la tuberculosis

-1882: Baciloscopía - Robert Koch

-Hasta la mitad de 1970’s: baciloscopía (baja S)

cultivo, id. bioquímica y antibiogramas (lento)

-Desde mediados de los 70’s: nueva

técnica de cultivo (método radiométrico)

-Década de los 80’s: aparición del SIDA (aumento de TB y

MNT diseminadas)

-Nueva tecnología: cultivos rápidos no radiométricos,

hemocultivos, sondas genéticas, cromatografía…

-Desde los 90’s: Técnicas de amplificación

de ácidos nucleicos (AAN) (rápidas)

- s XXI: Malditof

Técnicas microbiológicas convencionales

• BACILOSCOPÍA con Ziehl Neelsen

• CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO de Löwenstein-

Jensen

• IDENTIFICACIÓN POR TÉCNICAS BIOQUÍMICAS

• PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A FÁRMACOS por

el método de las proporciones

BACILOSCOPÍA

Es la técnica de mayor costo-beneficio y accesibilidadpara la búsqueda y detección de los casos pulmonares

infecciosos.

Los resultados de la BK dependen de:

la calidad de la muestra procesada:

expectoración,

del sitio de la lesión,

conservada adecuadamente (4ºC)

enviada en tiempo (hasta 7 días) y forma correcta

(al abrigo de la luz y en envase adecuado)

BACILOSCOPÍAConvencional (Coloración de Ziehl Neelen)

. Rápida

. Barata

. Sencilla y reproducible

. Elevada especificidad (en países de alta y media endemia)

. Detecta los casos contagiosos

VENTAJAS

DESVENTAJAS

. Baja sensibilidad (10.000 BAAR/ml de muestra) Condicionada por:

- extensión de la lesión

- calidad de la muestra

- tiempo de observación

BACILOSCOPÍA

- TBC pulmonar

ESPUTO

Analizar 2 muestras: esputo seriado

- Muestra inmediata (spot)

- Muestra matinal (overnight)

Otras muestras :

Lavado bronquial

Lavado bronquioalveolar

Biopsia de pulmón

Lavado gástrico: la baciloscopía no tiene valor diagnóstico

siempre se debe cultivar

BACILOSCOPÍA

2 muestras: 74 y 84 % de SENSIBILIDAD (1 matinal)

3 muestras: 2 a 3 % la SENSIBILIDAD pero

33 % la CARGA DE TRABAJO

En SR = tos y expectoración > 15 días

La selección de la partícula más purulentade la muestra es uno de los pasos másimportantes para aumentar la probabilidad deidentificar los casos de tuberculosis mediantela baciloscopía directa de esputo.

BACILOSCOPÍA

-TBC extrapulmonar : se debe acompañar siempre de cultivo

Pleural: líquido pleural – biopsia de pleura

Ganglionar: punción – biopsia

Meníngea: LCR

Osteoarticular: líquido articular – biopsia

Genitourinaria: orina: la baciloscopía no tiene valor diagnóstico

siempre se debe cultivar

sangre menstrual – biopsia de endometrio

semen- biopsia testicular

Abscesos: punción-aspiración

BACILOSCOPÍA

• DIAGNÓSTICO

• SEGUIMIENTO

SENCILLAECONÓMICARÁPIDA

TBC pulmonar 70 %TBC extrapulmonar 8 %y del niño

_ No se observan BAAR/100 c

+ < 1 BAAR/c 100c

++ 1-10 BAAR/c 50c

+++ >10 BAAR/c 20c

Microscopía de fluorescencia (MF)

1930

Auramina o Auramina-rodamina

Lámpara de mercurio

Ventajas:

Utiliza un objetivo de menor poder (20-40x)

Microscopista evalúa la misma área del extendido en menos tiempo (2,5 min MF vs 5 min MC)

Mejor rendimiento que la microscopía convencional (similar especificidad con mejora de la sensibilidad -10%-)

Lámparas de diodo que emiten luz: LED (Light Emitting Diodes)

- Posibilidad de adaptar los microscopios de fluorescencia convencional al uso con luz LED (2006)

VENTAJAS Es luz “fría”.

Durabilidad de 20.000 a 30.000 horas.

No emite luz UV.

No requiere mantenimientos.

No requiere de sala especial (oscuridad total)

Puede trabajar con baterías

Recomendación OMS (2009-2010)

• Reemplazo de la microscopía convencional de

fluorescencia utilizando lámpara de mercurio por la microscopía LED en aquellos servicios en los ya se emplea fluorescencia

• Incorporación gradual de la microscopia LED en aquellos servicios que actualmente están realizando microscopía óptica con coloración de Ziehl Neelsen.

o Programa de entrenamiento

o Validación local del método durante su introducción.

SUJETO

2010- Subsidio de la agencia nacional de investigaciones científicas

“Innovación tecnológica para el diagnóstico de tuberculosis por microscopía en laboratorios con alta carga de trabajo y escenarios de alta coinfección TB-

VIH”

Evaluar, en condiciones de terreno

• la sensibilidad, especificidad,

• y sencillez de los procedimientos

utilizando un microscopio de fluorescencia con un dispositivo LED para el

diagnóstico de tuberculosis pulmonar

• de pacientes con VIH y

• servicios con alta carga de trabajo.

OBJETIVOS

Estudio multicéntrico: H. Muñiz (CABA)H. Carrasco (Rosario)H. Rawson (Córdoba)H. Evita (Lanús) H. San Roque (S. S. de Jujuy)H. Perrando (Resistencia)INER “Emilio Coni”

VIH

experiencia

coordinación

Lectura de un frotis coloreado

Manuales antiguos de fluorescencia

• Seleccionar los extendidos positivos y colorearlos nuevamente mediante la técnica de Ziehl Neelsen.

.

Actualmente“No re-colorear los extendidos

positivos por ZN.”

Confirmación de extendidos positivos

La microscopía de fluorescencia con lámpara LED (MF-LED) es al menos 10% mássensible en relación a la microscopía de Ziehl Neelsen).

Para confirmar:utilizar el objetivo de 40x con el objetivo de inmersión de 100x luego de agregado de una gota deaceite de fluorescencia.

X

Conclusiones preliminares

• La sensibilidad de la MF es mayor que la de ZN (10%) sin pérdida de especificidad.

• Esta diferencia de sensibilidad es mayor entre los casos que viven con VIH.

• El uso de objetivos 200x para el tamizaje de las láminas es fundamental para asegurar la buena sensibilidad de la metodología.

CULTIVO

“Patrón oro” diagnóstico de certeza de TB

. Mayor sensibilidad (10 BAAR/ml de muestra)

VENTAJAS

DESVENTAJAS

. Lentitud

. Mayor costo

. Mayor complejidad de realización

COMPLEJO

COSTOSO

LENTO

CULTIVO

• DIAGNÓSTICO DE CERTEZA

Sensibilidad

Especificidad

Identificación

Antibiograma

Esto implica un incremento en el costo de cultivo paraacelerar la detección , por lo tanto una identificaciónrápida es absolutamente necesaria para no inutilizaresta inversión.

Desde 2007 la OMS recomienda el uso de medios líquidos paracultivo y prueba de sensibilidad para diagnóstico y manejo decasos de TBC. El tiempo de recuperación es reducido entre 10 y14 días.

CULTIVO

• Todo SR con 2 B (-) y Rx de tórax compatible

• TB extrapulmonar

• TB infantil

• Inmnodepresión (+++ VIH(+), diabéticos)

• B (+) en LG y LB

• Pacientes con factores de riesgo para TBMR

¿A quiénes se debe realizar?

En el momento del diagnóstico

CULTIVO

• Pacientes con baciloscopía de esputo positiva al finalizar el segundo mes de tratamiento o posteriormente

• Casos diagnosticados con baciloscopía negativa y que convierten a positiva su baciloscopía durante el tratamiento

• Con mala adherencia al tratamiento• Con intolerancia a las drogas antituberculosas

¿A quiénes se debe realizar?

Durante el control del tratamiento

IDENTIFICACIÓN

Aislamiento

Observación de la morfología de la colonia y datos del cultivo Categorización del caso según datos del paciente

Tuberculosis

Tuberculosis sin riesgo de resistenciaTuberculosis probablemente MRTuberculosis resistente ya diagnosticada

Ambiental banalMicobacteriosis

Criterios1 mtra respiratoria B (+) con sintomatología clínica2 mtras respiratorias B (-) con más 5 coloniasMuestras naturalmente estériles

Micobacteria ambiental

Algoritmo de identificación para Mycobacterium tuberculosis (Mtbc)

Aislamientos de pacientes sin riesgo de resistencia, en tratamiento

Identificación fenotípica

Técnica de identificación rápida

Inmunocromatografìade flujo lateral

Examen microscópico

Pruebas bioquímicas

Aislamientos de pacientes con factor deriesgo a los que se debe realizar prueba desensibilidad o aislamientos de pacientessin riesgo pero aun sin tratamiento

Algoritmo de identificación para Mtbc

Aislamientos de pacientes sin riesgo de resistencia en tratamiento

Identificación fenotípica

Examen microscópico

Aislamientos de pacientes con factor de riesgo a los que se debe realizar prueba de sensibilidad o aislamientos de pacientes sin riesgo pero aun sin tratamiento

Técnica de identificación rápida

Inmunocromatografíade flujo lateral

Pruebas bioquímicas

Positivo CMtbc Nitrato

Positivo Mtbc

Negativo

Genotype MTBC

APALCMTBInfraestructura edilicia adecuada: 3 ambientes separados y flujo unidireccional de trabajo

Personal entrenado en técnicas de biología molecular

Algoritmo de identificación para M tbc

Aislamientos de pacientes sin riesgo de resistencia en tratamiento

Identificación fenotípica

Examen microscópico

Aislamientos de pacientes con factor deriesgo a los que se debe realizar prueba desensibilidad o aislamientos de pacientes sinriesgo pero aun sin tratamiento

Técnica de identificación rápida

Inmunocromatografíade flujo lateral

Pruebas bioquímicas

Positivo CMtbc Nitrato Positivo Mtbc

NegativoNegativo

Genotype MTBC

APALCMTB

Pruebas molecularesPCR IS6110SondasPRA

Infraestructura edilicia adecuada: 3 ambientes separados y flujo unidireccional de trabajo

Personal entrenado en técnicas de biología molecular

Algoritmo de identificación para Mtbc

Aislamientos de pacientes sin riesgo de resistencia en tratamiento

Identificación fenotípica

Examen microscópico

Aislamientos de pacientes con factor deriesgo a los que se debe realizar prueba desensibilidad o aislamientos de pacientes sinriesgo pero aun sin tratamiento

Técnica de identificación rápida

Inmunocromatograma

Pruebas bioquímicas

Positivo CMtbc Nitrato Positivo Mtbc

NegativoNegativo

Genotype MTBC

APALCMTB

Pruebas molecularesPCR IS6110SondasPRA

Infraestructura edilicia adecuada: 3 ambientes separados y flujo unidireccional de trabajo

Personal entrenado en técnicas de biología molecular

inactivar 30 min 95°C

Lavados con tween0,5% y etanol 70%.Centrifugar y eliminar sobrenadante Acido fórmico 100%

Perlitas de Zirconio0.1mm

500 ul Tween 0,5%

Acetonitrilo100%

vortex 10 min

vortex 10 min

Centrifugar Separar el sobrenadante

1 ul sobrenadante1 ul matrix(duplicado) )

L-J

MALDI-TOF análisis-

MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight

Proteínas ribosomales, de membranas e intracelulares son hidrolizadas en pequeñospéptidos cuyas masas absolutas se determinan por espectrometría de masas.

Se debe partir de un repique con buen crecimiento

Los resultados se obtienen en el día.

Permite la identificación de una gran variedad de microorganismos.

Costos accesibles.

Espectro único (huella digital) paracada microorganismo

MALDI-TOF: Interpretación de resultados

Muestra A:1( ++ ) Mycobacterium xenopi DSM 43995T DSM b 2.116 127428137 2( ++ ) Mycobacterium xenopi DSM 44169 DSM b 2.093 127428137 3( + ) Mycobacterium xenopi 8153134 MVD b 1.902 127428137 4( + ) Mycobacterium xenopi E3 2014 1.857 127349133 5( + ) Mycobacterium xenopi DSM 44168 DSM b 1.826 127428137 6( + ) Mycobacterium xenopi RV423_B_I_2010 MVD b 1.826 127428137 7( + ) Mycobacterium xenopi 0690 BSI 1.818 1789 8( + ) Mycobacterium xenopi 02 TWF 1.766 1789 9( + ) Mycobacterium xenopi 0932 BSI 1.757 1789 10( - ) Mycobacterium xenopi 22 PGM 1.651 1789

El espectro proteico obtenido se compara con la base de datos del equipo y el software nos da diez resultados ordenados por score.

Score >2 identificación precisa en género y especieScore >1.7 precisión en género pero no especieScore <1.7 no identificado

AMPLIFICACIÓN GENÉTICA (ADN-ARN)

VENTAJAS

DESVENTAJAS

• Rapidez (menos de un día)• Elevada sensibilidad y especificidad

muestras BK (+) mayor al 98 % %

Muestras BK (-) Sensibilidad 50-80 % • Elevado costo• Falsos positivos (1-5 %)• Falsos negativos

Un resultado (+) no asegura TB

Un resultado (-) no descarta TB

El resultado debe ser interpretado en cada caso a la luz de los datosclínicos

Amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para el diagnóstico de tuberculosis

Baciloscopía positiva

2-3 % resultados falsos positivos

Sensibilidad 50-80%

respiratoria

Muestra

Baciloscopía negativa

Se repite con otra muestratomada y procesada otro día

2 PCR (+)

diagnostica tuberculosis

extrapulmonar

No validada

Sensibilidad > 98 %

ESTUDIO DE SENSIBILIDADMétodo patrón: método de las proporciones

DESVENTAJA

• Permite la monitorización periódica del nivel de resistencia

• Permite detectar cepas resistentes y multirresistentes

• Información muy tardía

VENTAJAS

TUBERCULOSIS (TB)DEFINICIONES DE RESISTENCIA

• TB monorresistente: es la provocada por cepas de M. tuberculosis resistente a una sola droga de primera línea (H, R, P, E, S).

• TB polirresistente: resistente a un mínimo de 2 fármacos sin incluir simultáneamente H y R.

• TB multirresistente (TBMDR): resistente a H+R como mínimo.

• TB extensamente resistente (TBXDR): resistente a H+R como mínimo + un inyectable de segunda línea (Km-Am-Cm )

+ una fluorquinolona anti TB.

• TB totalmente resistente (TBTDR): resistente a todas las drogas de primera y segunda línea.

World Health Organization, Guidelines for the management of drug-resistant tuberculosis. Emergency update 2008, WHO/HTM/TB/2008.402

TBC multirresistente en Argentina

Encuesta de Multirresistencia. 2005

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

po

rce

nta

jes

% resistencia 2,2 15,4 4,4

Nuevos Retratamientos Total

El problema de la TB MDR

Plan de manejo de tuberculosis MDR en Argentina (2011-2015)

Se aprobó un plan de vigilancia que consistirá en:

• Concentrar los esfuerzos para establecer un sistema de vigilancia continua entre los grupos de mayor riesgo y no repetir una encuesta entre casos nuevos, dado que no se prevé un cambio significativo en el nivel de MR en este grupo.

• Ofrecer pruebas de sensibilidad rápida a los casos con riesgo elevado de resistencia según las recomendaciones ya revisadas y siguiendo un algoritmo de uso que se detalla a continuación.

• Emplear un nuevo formulario de solicitud de estudios bacteriológicos ya evaluado en la red

PRUEBA DE SENSIBILIDAD

• Con antecedentes de tratamiento (recaídas, fracasos , abandonos),

• Contactos de pacientes resistentes a las drogas (contactos domiciliarios, internados o trabajadores de instituciones de salud o de prisiones donde se registran casos con tuberculosis multirresistente)

• Pacientes que han residido en países con alto nivel de resistencia (Ecuador, Perú, países asiáticos y Europa del Este)

• Adictos al alcohol y/o otras drogas

• Pacientes inmunocomprometidos (VIH positivos y diabéticos)

• Niños

¿A quiénes se debe realizar?

PRUEBA DE SENSIBILIDAD¿A quiénes se debe realizar?

• Pacientes con baciloscopía de esputo positiva al finalizar el segundo mes de tratamiento o posteriormente

• Casos diagnosticados con baciloscopíanegativa y que convierten a positiva su baciloscopía durante el tratamiento

• Con mala adherencia al tratamiento

• Con intolerancia a las drogas antituberculosas

¿Qué son los métodos rápidos para la detección de resistencia a R y H?

Los métodos convencionales de detección de resistencia en medio sólido pueden producir resultados entre los 20-40 días de la inoculación de la PS.

¿Cuáles son los métodos rápidos?– FENOTÍPICOS

• MGIT automatizado y manual• no comerciales

– Nitrato reductasa– Resarzurina o MTT

– GENOTÍPICOS

– comerciales (Line probe assays y Xpert)

Nitrato Reductasa Indirecto

Cultivo M. tuberculosis 3 – 4 semanas

Recoger biomasa

Macerar

Dilución 1:10Tubo 1 escala MacFarland

Controles de crecimiento (CC)

INH RIF 7 10 14 días

ReveladoCC INH RIF

MGIT 960

FUNDAMENTO: Sensor fluorescente que responde a la concentración de Oxígeno

Prueba sensibilidad a SIREInóculo a partir de medio sólido o líquido MGITResultados tardan entre 4 y 13 días

Cada sonda que hibrida emite señal fluorescente captada y evidenciada mediante un sensor y un software que dibuja en una curva la señal cuantificada mostrando el progreso de la reacción en tiempo real

Resultados

Inválido

http://www.stoptb.org/wg/gli/TrainingPackage_XPERT_MTB_RIF.asp

Positivo M tuberculosis sensible

PositivoM tuberculosis resistenteNegativo

Laboratorio Regional de Bacteriología de la Tuberculosis

Hospital Tránsito Cáceres de Allende

SOLICITUD DE ESTUDIOS BACTERIOLOGICOS

DE TUBERCULOSIS

Establecimiento ……………………….. Localidad ……………………...……

Apellido y Nombres: ......................................... H.C.Nº: ...................

Documento (tipo y número): .............. Edad: ...... Género: F M

Domicilio: ............................ Localidad: ...............Teléfono: ….…….

Residencia anterior: ………..…………………………………….….………….…..

Muestra ……………………...……………………..…Fecha..………………….……..Lab. Regional de Tuberculosis Hosp.

Tránsito C. de Allende-Bioq. M.C.Cosiansi

SOLICITUD DE BACILOSCOPIA ……….

Para Diagnóstico …… muestra: 1ª 2ª 3ª

Para control de tratamiento …... mes de tratamiento ……

Para control de foco …... Nombre del foco ……

SOLICITUD DE CULTIVO ……….

Sintomático respiratorio con 2 ó más muestras de esputo con

baciloscopia negativa …….

Enfermedad extrapulmonar …… Enfermedad infantil ……

Otro (describa) …………………………………………………………

Lab. Regional de Tuberculosis Hosp. Tránsito C. de Allende-Bioq. M.C.Cosiansi

SOLICITUD DE CULTIVO Y PRUEBA DE SENSIBILIDAD ...

(marcar con una cruz)

Retratamiento Privado de la libertad

Abandono Contacto de paciente con TB resistente a drogas

Fracaso Inmunocomprometido

Recaída Diabético

Niño Adicto al alcohol

Personal de salud Adicto a drogas

Baciloscopía de esputo positiva finalizando el 2do mes de tratamiento

Otro (describa): ……………………………..………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Nombre del solicitante:…………………. Firma: ......................

Lab. Regional de Tuberculosis Hosp. Tránsito C. de Allende-Bioq. M.C.Cosiansi

PS de referencia SIRECAK

una FQN en el Laboratorio de referencia

Caso con indicación de prueba de sensibilidad (con riesgo)

Prueba rápida de resistencia a R e I

Resistente a R y/o Ino se detecta resistencia (*)

Monitoreo con baciloscopÍa

y cultivo

(*) si se trata de un caso HIV positivo o fracaso de tratamiento o contacto de TB MR y fue investigado por un método molecular o nitratasa repetir la prueba a R e I por método de las proporciones o MGIT960 para descartar posibles errores y/o falta de sensibilidad (métodos moleculares)

Aunque dilucidemos los mecanismos de resistencia y encontremos los mejores métodos diagnósticos (en cuanto a celeridad y eficiencia) para su detección …..

La clave para el control de la multiresistencia o resistencia extrema la tiene el médico junto al equipo de salud.

Haciendo un diagnóstico precoz de tuberculosis sensible para no tener posibilidad de generar mutantes naturales

Instaurando y supervisando el tratamiento adecuado para que no se seleccionen las mutantes resistentes

Haciendo un estricto control de los contactos con pacientes con TB

para que evitar la transmisión de los bacilos resistentes

ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO

Obtención, conservación y modo de envío.Siempre dos fragmentos del material

1- Para anatomía patológica: conservar en frascoestéril con solución de formaldehido al 4%, (diluir1 en 10 la presentación comercial de formol). Lamuestra debe cubrirse totalmente con estasolución.

2- Para bacteriología se debe enviar en frasco estérilcon el agregado de solución fisiológica estéril.

BIBLIOGRAFÍA

• Programa Nacional de Control de la Tuberculosis-Normas técnicas 2013. Argentina

• Manual para el diagnóstico bacteriológico de tuberculosis-Parte 1: Baciloscopía. INER “Dr. Emilio Coni”. Argentina. 2012

• Manual para el diagnóstico bacteriológico de tuberculosis-Parte 2: Cultivo. OPS . 2008

• Palmero, D: Tuberculosis en Infectología y enfermedades infecciosas. Cecchini E, GonzalezAyala, S. Bs. As. 2008. Ediciones Journal.