UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS EXTENSIÓN OCOZOCOAUTLA

PRÁCTICA 2. ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS.

BIOQUIMICA

LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIOLOGO.

Catedrático: Dra. Ana Olivia cañas Urbina.Integrantes del equipo: Claudia Beatriz Gómez Núñez.Erika Estrella Pérez Sántiz.Yeseli Yanin Morales Díaz.

Norma Berenice Perez Gomez.Yadira Trujillo Cruz.

Carlos Rousell Vázquez Chame.

SEMESTRE: 4°

INTRODUCCIÓN

OCOZOCOAUTLA DE ESPINOSA; CHIAPAS a 26 de AGOSTO del 2015.

Las levaduras son hongos unicelulares no filamentos con una forma esférica u

oval típica (Tortora, 2007). Las levaduras se encuentran ampliamente distribuidas

en la naturaleza, localizada en el suelo, en la superficie de las frutas, en el néctar

de las flores y en ambientes acuáticos (García, 2005). La estructura de una

levadura es la de una célula eucariota. Las cuales se reproducen por gemación

(Arenas, 2011)

Las levaduras son organismos heterótrofos, por lo tanto, para poder obtener su

energía requieren de carbono orgánico y utilizan el carbono para la síntesis de sus

componentes celulares. El mejor requerimiento energético de las levaduras están

constituidas de azucares. Muchas pueden catabolizar la glucosa de forma aerobia

o anaeróbia; el proceso de la catabolización de forma anaerobia es comúnmente

conocida como la fermentación alcohólica, el cual da como resultado etanol y

dióxido de carbono. En condiciones aerobias, las levaduras pueden oxidar la

glucosa al utilizar el oxígeno del aire hasta convertir la glucosa hasta dióxido de

carbono y agua (García, 2005).

Las levaduras Saccharomyces cerevisiae, usar itálicas en nombres científicos

en común con otras células eucariontes, las levaduras tienen un núcleo en donde

reside la información genética de la célula, mitocondrias en donde se lleva a cabo

la síntesis de ATP y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan

de la síntesis de proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el

exterior.

Las levaduras no poseen bombas de Na+ -K+ en sus membranas plasmáticas, por

lo que el transporte de solutos hacia el interior de la célula depende de un

gradiente electroquímico de H+. Las levaduras tienen un sistema para bombear

protones o H+ al exterior lo cual es resultado de la generación de un potencial

eléctrico (Peña, 2011).

Este gradiente electroquímico es generado por H+ presentes en la membrana

plasmática que expulsa H+ de la célula y de ese modo genera un gradiente

electroquímico de protones, con una mayor concentración de H+ en el medio

extracelular que en comparación del medio intracelular, durante el proceso la

bomba de H+ crea un pH ácido en el medio extracelular de la célula.

Las levaduras generan el gradiente de H+ mediante ATPasas de la membrana plasmáticas que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para expulsar H+ hacías el exterior de la célula (Bruce & Bray, 2016), es decir, un gradiente de protones a través de membranas sirve como fuente de energía para bombear cationes de metales alcalinos en contra de sus gradientes. Este párrafo repite

lo que dice el párrafo anterior, en estos casos pueden poner las 2 fuentes juntas

separadas por punto y coma.

La H+ -ATPasa de la membrana plasmática responsable del gradiente de pH de la

membrana plasmática de la célula, es la proteína más abundante de la membrana

plasmática, muy estable y consume al menos el 20% del ATP celular.

La ATPasa de H+ en la levadura, impulsa el transporte de nutrientes al interior de

la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o

uniportadores, donde se da el transporte al interior de la célula de K+ y azucares,

aminoácidos, purinas, así como la salida de calcio, succinato, lactato (Cabedo,

2010).

Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen

otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP

sintasa, cataliza la síntesis de ATP aprovechando la energía del gradiente de

protones, mediante la fosforilación oxidativa El flujo de protones proporciona la

energía para la síntesis de ATP en estos organismos mediante el gradiente

electroquímico desde el espacio intermembranal positivo a la matriz negativa

(Devlin, 2006)

Pero la interrupción de este gradiente inhibe la generación de energía por lo tanto detiene la síntesis de ATP, lo cual podría ser posible mediante agentes químicos” desacoplantes”. El desacoplante alteran el gradiente se insertan

en la membrana mitocondrial interna, donde actúan como transportadora de H+, y proveen una vía para el flujo de H+ que evitan la acción de ATP sintasa. De esta manera desacoplan el transporte de electrones y ya no pueden producirse más ATP (Bruce & Bray, 2016). Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina. E sun párrafo bien redactado, bien

citado y relacionado con el tema pero no vamos a cubrir desacoplamiento en la

práctica. En la práctica original había este tema pero lo eliminamos porque no

tenemos los reactivos para ver desacoplamiento. Traten de no incluir en la

introducción material acerca de temas que no se vayan a cubrir. Eso hará de su

excelente trabajo un trabajo aún más fuerte.

El ATP en levaduras por una lado es sintetizada en la mitocondria por medio de la

ATP sintasa y en la membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para

bombear protones al exterior de la célula, pero siempre hablamos de flujo de

electrones los cuales se dan a través de la membrana.

Para poder entender mejor es necesario comprender las siguientes preguntas:

1.- ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura?

Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras como la Saccharomyces Cerevisiae, varían desde los carbohidratos, aminoácidos y algunos péptidos .

Entre los azúcares que puede utilizar están monosacáridos como la glucosa,

fructosa, manosa y galactosa, entre otros.

¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos?

La glucolisis y la fosforilación oxidativa.están bien sus preguntas y las respuestas,

pero en la práctica eliminamos el cuestionario ya que responderlo requería haber

cubierto en la clase glucolisis y ciclo de Krebs y fermentación y en en ese

entonces todavía no lo habíamos hecho. Asi es que limitamos esta practica al

tema del potencial de membrana

OBJETIVO:

Poder identificar los cambios de pH por las levaduras y las causas de estas, y por

lo tanto poder interpretar como ocurre el bombeo de protones.

MATERIALES Y MÉTODO:

Se realizaron los cálculos necesarios para preparar una solución de glucosa al

10%, la cual se preparó con 0.512 gramos de glucosa pesados en la balanza

granataria, diluyéndola en 4.5 ml de agua destilada, obteniendo la solución 1 de

glucosa al 10% con un volumen total de 5 ml.

Se realizaron los cálculos para obtener una solución 2 de levadura con un

volumen final de 5ml, para lo cual se pesaron 1000 mg= 1g de levadura

diluyéndolo en 4 ml de agua destilada para alcanzar el volumen total antes

mencionado.

A la solución 2 de levadura se le adicionaron 40 ml de agua destilada para obtener

una solución con un volumen de 45 ml, esta solución se colocó en una parrilla

electromagnética agregándole una mosca a la solución para que estuviera en

constante movimiento. Después se procedió a medir el PH pH 2 (según las

instrucciones y su tabla de resultados, fueron 3 veces) veces cada 3 minutos.

Una vez finalizado (silepsis – la medición – finalizada) la medición del PH, se le

agrego la solución 1 de glucosa al 10 %, se colocó en la parrilla electromagnética

nuevamente y se midió el PH 4 veces cada 5 minutos, después una vez más se

midió el PH 2 veces cada 10 minutos. El PH fue medido con tiras reactivas.

Excelente trabajo. Habría nada más que citar la fuente original de la metodología.

Algo así como “LA metodología se llevó a cabo de acuerdo a lo indicado por XXX

(año) – citando el manual de la UNAM de donde se obtuvo está práctica- con

algunas modificaciones. Lean el reporte de Lariza y Ever, ellos lograron bien este

ejemplo.

RESULTADOS:

Solución 1

Soluto= 1 gramo de levadura

Solvente= 4 ml de agua destilada

Solución 2

Soluto= 0.5 gramos de glucosa

Solvente= 4.5 ml de agua destilada

Solución 3

Tomar 5 ml de solución 1

Solvente= 40 ml de agua destilada

Solución 4

Tomar 5 ml de la solución 2

Solvente= solución 3

Tiempo Tiras reactivas

pH

Solución de levadura con agua destilada(solución 1)

Primera vez 11:29

horas

1 5

+3 11:32

horas

2 5

+3 11:35

horas

3 5

Solución de levadura con la glucosa(solución 3)

Primera vez 11:37

horas

4 5

+5 11:42

horas

5 4.6

+5 11:47

horas

6 4.5

+5 11:52

horas

7 4.3

+5 11:57

horas

8 4.2

+10 12:07

horas

9 4.1

+10 12:17

horas

10 4

11:29 horas

11:32 horas

11:35 horas

11:37 horas

11:42 horas

11:47 horas

11:52 horas

11:57 horas

12:07 horas

12:17 horas

0

1

2

3

4

5

6

Resultados del pH

Tiempo

PH

Su trabajo es muy bueno, puedo ver mucha energía y ganas invertidas en este reporte. Recuerden que mi papel es reforzarlas y hacer que la energía y

Solución de levadura con agua destilada

Solución de levadura con la glucosa

Solución de levadura con la glucosa

Cada 3 minutos

Cada5 minutos

Cada10 minutos

ganas que ustedes invierten valga la pena y las ayude a mejorar. En ese sentido les comento que:

Se debe escribir un texto en resultados; no se ponen las tablas y figuras como nadando en la nada. Aunque sea un texto de 1 o 2 párrafos que indique sus principales observaciones y, dentro de ese texto, hay que citar las figuras. Es como una regla que dice “toda figura (o tabla) debe tener una cita en texto aunque no todo texto necesariamente debe citar figuras (o tablas)”

Las gráficas que involucran tiempo deben denotar la unidades (en este caso minutos) y se debe proporcionar el valor en el eje a partir de cero denotando el tiempo de transcurso de la rx, NO se usa el tiempo que denota el reloj. En este caso su eje debe comenzar en 0 y continuar con 5, 10, 15, 20, etc Como tienen 2 tipos de mediciones (cada 5 y cada 10 minutos) ustedes pueden decidir si usan una escala de 5 en 5 o una escala de 10 en 10.

En gráficas de tiempo es mejor no usar area debajo de la curva. Aunque no pasa nada si la usan, es más recomendables usar una forma lineal.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Las levaduras tienen estructura, constitución y funciones semejantes a las de otras

células. Su membrana juega un papel importante en la regulación del flujo de

todos los materiales tanto hacia el interior como hacia el exterior de la célula

(Pompa, 2015). Según Mora (2007), la proteína ATPasa presente en la membrana

plasmática de la levadura, consume aproximadamente del 10 al 15% del ATP que

produce la levadura durante su crecimiento, por cada molecula de ATP que

degrada a ADP, se transporta al medio externo un protón (H+), lo que genera un

gradiente electroquímico. Por lo que dado el ingreso del NADH y FADH2 además

del paso de electrones por la cadena respiratoria; se producen moléculas de ATP

altamente energéticas y en algunos puntos, la energía generada es utilizada para

el transporte de protones de la matriz hacia el espacio intermembranal de la

mitocondria, lo que genera una diferencia de pH entre estos dos espacios. Por

consiguiente la adición de glucosa a las levaduras produjo el incremento de la

actividad de la ATPasa en la membrana plasmática que consigue al paso del

tiempo la disminución del pH del medio extracelular. Entiendo lo que quieren decir,

están tratando de contrastar lo que se dice con lo que obtuvieron. Muy bien hecho,

eso es una discusión de resultados. Como sugerencia, comiencen por lo que

obtuvieron y después digan algo asi como “esto concuerda con” o “de acuerdo a

xxx lo anterior se debe a …”

El cambio de pH fue notorio en el uso de tiras reactivas, pero debido a este

método analítico no se pudieron estimar parámetros con valores fraccionarios, si

no con una escala de números enteros del 1 al 14, estimados según la coloración

establecida por el fabricante del material, aun con esto se dedujo la reducción de

0.1 en la escala de pH con cada valoración en los diferentes intervalos de tiempo,

no llegando a ser menor de 4, pues como señala García (s.f.), la levadura es un

ser vivo, tiene requerimientos biológicos como cualquier otro y mismo

mantenimiento, por lo tanto su nivel de acidez no varía entre 3.8 a 8. Excelente!

Este párrafo les quedó muy, muy bien reflexionado y redactado, los felicito!

CONCLUSIÓN:

En la práctica realizada se observo como los microorganismos hacen un

intercambio de protones, tal y como lo fue en esta práctica, en el caso de la

levadura al estar en un entorno diferente con respecto a su gradiente de

concentración.

Al hacer un intercambio de protones este hace que el medio cada vez poco

a poco se vaya haciendo más acido.

Llega el momento en el que, tanto el interior como el exterior se saturan y

ya no haya ese intercambio de protones, lo cual hace que el medio se

estabilize estabilice en un valor de pH.

Perfecto, esta es una conclusión, en primer lugar responde a lo planteado

en el objetivo y en segundo lugar se sustenta o soporta únicamente en los

datos obtenidos en la práctica,. No hay nada que mejorar aquí excepto una

observación que hasta ahora es grupal y mencionaré en una sección

general para todos los equipos.

REFERENCIAS:

Arenas, R. (2011). Micología Médica Ilustrada. México: Mc Graw Hill.Bruce, A., & Bray, D. (2016). Introducción a la biología celular. Buenos Aires:

Panamericana.Cabedo, M. (2010). Caracterización de la regulación de la protón ATPasa.

Valencia. Obtenido de https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/18485/TFC%20Marc%20cabedo.pdf?sequence=1

Devlin, T. (2006). Bioquímica:libro de texto con aplicaciones clínicas. España: REVERTÉ.

García, V. (2005). Introducción a la microbiología. EUNED.Peña, A. (2011). Las membranas de las células . México: Fondo de Cultura

Economica .Tortora, G. (2007). Introducción a la Microbiología. Buenos Aires: Panamericana.

Garcia, V. (s.f. ). Introduccion a la Microbiologia . EUNED .Mora, S. Q. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Costa

Rica : EUNED.Pompa, A. G. (19 de Agosto de 2015). Biología. Obtenido de

http://laslevaduras.mex.tl/788048_MORFOLOG-A.html

Fornaguera, J. & Gómez, G. (2006) Bioquímica: la ciencia de la vida. Estados Unidos: EUNED

Koolma & Rohm. (2004) (3ª Ed) Bioquímica. Madrid: Médica Panamericana

Manual de practicas de laboratorio. Bioquímica. Facultad de medicina.UNAM. URL:

http://www.facmed.unam.mx/fm/pa/2010/practicas/practicas bioquimica. Pdf

sus referencias están muy bien en estilo APA (excepto la última – traten de ubicar al autor-) pero no entiendo por qué no están en orden alfabético, se supone que el capturador que usan (pestaña referencias de word, bibme, endnote) las ordena automáticamente. Traten de cuidar este aspecto.