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Dr. Gabriel Pineda FloresProfesor del curso

Agosto de 2004

PRÁCTICAS DE BIOSÍNTESIS INDUSTRIAL

ÍNDICE

Práctica Título Página

1 Aislamiento y selección primaria de microorganismos productores de

compuestos de interés industrial

___________1

2 Selección secundaría de microorganismos productores de compuestos de

interés industrial

___________7

3 Tipos de cultivo microbiano empleados en biosíntesis industrial __________11

4 Producción de semilla para la obtención de hongos comestibles __________18

5 Producción de proteína unicelular __________24

6 Optimización de la producción microbiana de biomasa __________30

7 Producción de biomasa empleando un medio de cultivo de tipo industrial __________36

8 Producción de etanol __________41

9 Tratamiento de aguas residuales __________46

Evaluación del curso práctico

Laboratorio de Biosíntesis Industrial

Se realizarán tres evaluaciones parciales que estarán comprendidas por los siguientes puntos:

Criterio de evaluación puntosExamen preliminar y trabajo práctico 2Reporte de prácticas 2Exposición en seminarios de resultados 2Examen escrito 4Total 10

Dentro de la evaluación del trabajo práctico se califica lo siguiente: La habilidad individual en el desempeño del trabajo de laboratorio La exposición del protocolo de la práctica, el cual consiste en exponer el trabajo que se

realizará al inicio de la práctica La disciplina del alumno.

El examen ordinario de laboratorio es un examen escrito que incluye material de todas las prácticas realizadas, incluyendo introducción y cuestionario de cada reporte. La parte principal del examen son preguntas de aspectos prácticos. Este examen no se promedia con otra evaluación adicional como en el caso de las evaluaciones parciales.

La calificación final del laboratorio corresponderá al promedio de las tres evaluaciones parciales más el resultado del examen ordinario.

Se exentará la materia con 9.5 o 10.

La asistencia al laboratorio se registrará durante los primeros 10 minutos de inicio de la sesión, si el alumno llega después de que se pasó lista se le permitirá la entrada al laboratorio pero no se le quitará la falta. Aquellos alumnos que no cumplan con el 80% de asistencia al laboratorio no tendrán derecho a la calificación obtenida aunque sea aprobatoria.

Solo se justificarán dos faltas en el curso con comprobante médico externo a la USB

Reglamento de trabajo en el laboratorio de Biosíntesis Industrial


1. Está prohibido entrar al laboratorio sin portar la bata blanca de manga larga y abotonada. La bata no podrá ponerse ni quitarse en el interior del laboratorio.

2. Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio.

3. El alumno tiene la responsabilidad de revisar con anticipación el calendario de prácticas que está incluido en el presente manual, para enterarse de las actividades que se harán en la sesión, además de conocer el material extra que debe traer para desarrollar la práctica.

4. Para realizar el trabajo práctico del curso se formarán equipos de dos personas.

5. Los integrantes del equipo tienen la responsabilidad de pedir el material necesario para el desarrollo de la práctica con una semana de anticipación. En caso de que no se solicite a tiempo no se realizará la práctica y contará como cero para su evaluación.

6. Solo al inicio de cada práctica se aplicará un examen preliminar que contiene los puntos más importantes de su desarrollo. Este examen tendrá una duración de 10 minutos. Si el alumno llega después de haber realizado este examen no se le aplicará posteriormente y contará como cero para su evaluación.

7. Los reportes de las prácticas serán entregados al profesor en la fecha señalada en el calendario de prácticas, la cual corresponde a una semana después del término de la práctica. Por cada día de retraso de la entrega del reporte se descontará un punto de la calificación

8. Los teléfonos celulares deberán ser apagados antes de ingresar al laboratorio, alumno que conteste una llamada o abandone el laboratorio para hacerlo, se le pedirá que salga del laboratorio por esa sesión y la falta se le considerará en el rubro de disciplina.

9. Cada equipo deberá traer un rollo de cinta adhesiva para etiquetar su material de trabajo. La etiqueta deberá incluir la fecha, número de equipo, número de la práctica y las siglas de la materia (BI). No está permitido marcar el material con plumón indeleble ni con algún material auto-adherible diferente a la cinta adhesiva.

10.Todo el material de desecho que resulte de una práctica deberá ser eliminado adecuadamente por los integrantes del equipo, en un tiempo menor de 7 días después de finalizada la práctica.

11.Cada tres retardos se cuentan como una falta. Por cada dos registros de indisciplina se descontará un punto sobre la calificación del parcial. Por las faltas desarrolladas como incumplimiento en el etiquetado del material, eliminación incorrecta de los desechos entre otras serán sancionadas con un punto menos en la práctica respectiva.

12.En caso de sufrir un accidente conserve la calma y avise de inmediato al profesor.

Formato para los reportes de las prácticas


Por cada práctica realizada se deberá entregar un reporte escrito, el cual contendrá los siguientes puntos:

Introducción: con una extensión máxima de una cuartilla.

Diagrama de flujo de la práctica.

Materiales y métodos: redactados en forma impersonal en texto seguido.

Resultados: se presentarán en forma de tablas, gráficas, esquemas y deben describirse en forma impersonal.

Discusión: junto con los resultados son la parte más importante del reporte, deben estar redactados de manera clara y sencilla, haciendo referencia a sus tablas, gráficas y dibujos. En caso de que los resultados obtenidos no sean los esperados debe darse una explicación bien argumentada sobre las posibles causas.

Para poder hacer una buena discusión es indispensable leer las referencias relacionadas con el tema de la práctica, de manera que se tenga una mayor información. Es muy importante que las referencias que se consulten sean citadas en el texto como sigue:“de acuerdo a Pineda y col. (2004)” ó “según lo reportado por otros autores (Pineda et al. 2004)”.

Conclusiones: las obtenidas directamente de los resultados de la práctica.

Cuestionario resuelto.

Bibliografía: utilizando el siguiente formato

Para libros:Apellido del primer autor, iniciales, iniciales del segundo autor, Apellido del segundo autor (año). Titulo del libro, número de edición (en caso de ser de la segunda en adelante), editorial, ciudad o país de impresión, páginas consultadas.

Para revistas:Apellido del primer autor, iniciales, iniciales del segundo autor, Apellido del segundo autor (año). Titulo del artículo, iniciales del título de la revista, Volumen: página inicial del artículo-página final.

Para referencias de internet:Dirección completa y fecha de consulta.Las referencias de internet no serán tomadas en cuenta para la evaluación del reporte si se trata de información copiada y pegada de la referencia.

Reportes idénticos serán calificados con cero, no importando que equipo trabajó en realidad.PRÁCTICA 1

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN PRIMARIA DE MICROORGANISMOSPRODUCTORES DE COMPUESTOS DE INTERÉS INDUSTRIAL


OBJETIVO:

1. Aplicar las técnicas de selección primaria de microorganismos para obtener productores potenciales de proteasas y amilasas

INTRODUCCIÓN

La obtención de productos a partir de la actividad metabólica de los microorganismos es un proceso de gran interés para la industria biotecnológica.

La obtención y comercialización de estos metabolitos genera anualmente ganancias millonarias para este tipo de industrias.

Algunos compuestos obtenidos a partir de microorganismos se muestran en la tabla I.

Tabla I. Productos de interés industrial obtenidos de microorganismos

Microorganismo Producto

Saccharomyces ellipsoideus Vino

Clostridium acetobutilicum Butanol

Aspergillus niger Ácido cítrico

Blakeslea trispora b-caroteno

Bacillus sp. Amilasa

La aplicación de estos productos se realiza en diferentes procesos como son la producción de alimentos, vitaminas, tratamiento de aguas residuales entre otros.

La base de la obtención del producto se centra en la actividad metabólica de interés y por lo tanto en el microorganismo productor.

La selección primaria de microorganismos de interés industrial se basa en escoger las cepas adecuadas de un conjunto de microorganismos en función de su capacidad cualitativa de producción. Para lograr esto, las técnicas tradicionalmente empleadas son el acondicionamiento de la muestra, el cultivo de enriquecimiento y el empleo de medios de cultivo selectivos y diferenciales.


Las cepas obtenidas de esta manera se deben someter a un proceso de selección secundaria, con el fin de confirmar la capacidad productora del microorganismo.

MATERIAL

Por equipo: 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml con 90 ml de solución salina estéril 14 tubos de ensaye de 16x150 mm con 9 ml de solución salina estéril 4 pipetas de 1 ml estériles 1 pipeta de 10 ml estéril 12 cajas de Petri con agar peptona libres de contaminación 2 tubos de ensaye con 7 ml de medio inclinado de agar peptona libres de contaminación 12 cajas de Petri con agar almidón libres de contaminación 2 tubos de ensaye con 7 ml de medio inclinado de agar almidón libres de contaminación 1 mortero de porcelana con pistilo estériles 2 varillas acodadas 1 caja de Petri de vidrio limpia 2 Mecheros Fisher 100 ml de etanol frasco con lugol frasco con HgCl2 al 12% Muestra sólida para el aislamiento de microorganismos productores de enzimas Muestra líquida para el aislamiento de microorganismos productores de enzimas

MÉTODO

Acondicionamiento de la muestra

1. Las muestras traídas por los equipos que presenten alta probabilidad de contener microorganismos con actividad proteolítica y amilolítica, se someten a un periodo no menor de dos días en las condiciones descritas en la tabla II, para favorecer el crecimiento y aumentar el número de microorganismos presentes.

Tabla II. Temperatura para el acondicionamiento de las muestras

Equipo Condición para acondicionamiento1 Intemperie2 37 ºC3 28 ºC4 Escoger alguna condición5 Intemperie6 37 ºC7 28 ºC


8 Escoger alguna condición

Aislamiento de microorganismos productores

1. Pesar 10 g de las muestras de tipo sólido.

2. En condiciones asépticas, colocar la muestra en el mortero y con ayuda del pistilo macerar completamente el contenido.

3. Introducir el macerado a un matraz Erlenmeyer que contenga solución salina estéril.

4. Para la muestra líquida, medir 10 ml en condiciones asépticas y colocar la alícuota en el segundo matraz Erlenmeyer con solución salina.

5. realizar diluciones decimales hasta 10-8 o hasta diluciones menores en caso de que la carga microbiana sea menor para ambos matraces. (Seguir las indicaciones del profesor)

6. Sembrar por distribución con varilla de vidrio estéril las últimas tres diluciones por duplicado en los medios agar peptona y agar almidón.

7. Incubar las cajas durante 48 horas a 37 ºC.

Determinación de la actividad proteolítica y amilolítica de las cepas aisladas

1. Identificar y etiquetar con números a las diferentes cepas aisladas en sus cajas.

2. A una serie de cajas con agar peptona adicionarles gotas de HgCl2 al 12% hasta cubrir toda la superficie del agar.

3. Seleccionar dos colonias que presenten un halo transparente de gran tamaño y sembrarlas por estría abierta en tubos con medio inclinado de agar peptona.

4. A una serie de cajas con agar almidón adicionarles gotas de lugol hasta cubrir la superficie de la caja.

5. Seleccionar dos colonias que presenten un halo claro de gran tamaño y sembrarlas por estría abierta en tubos con medio inclinado de agar almidón.

6. Incubar los tubos a 37 ºC durante 48 horas.

7. De las colonias que fueron sembradas por estría abierta, reportar su morfología microscópica.


RESULTADOS

En la siguiente tabla reportar la fuente de aislamiento para cada cepa. En el informe deberá presentar el fundamento del por que de cada elección.

Equipo Fuente de aislamiento de las cepasAmilolíticas Celulolíticas

1

2

3

4

5

6

7

8

En la siguiente tabla escriba los resultados correspondientes al aislamiento de las cepas de todos los equipos.

Equipo Cepas proteolíticas Cepas amilolíticasMorfología microscópica Gram Morfología microscópica Gram

1 1.

2.

1.

2.2 1.

2.

1.

2.3 1.

2.

1.

2.4 1.

2.

1.

2.5 1.

2.

1.

2.


6 1.

2.

1.

2.7 1.

2.

1.

2.8 1.

2.

1.

2.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones utilizadas para poner de manifiesto la actividad proteolítica y amilolítica de los microorganismos aislados?

2. Escriba el nombre científico de tres microorganismos productores de proteasas y tres productores de amilasas

3. ¿Cuál es la aplicación industrial de las enzimas proteasas y amilasas?, reporte dos ejemplos para daca una de ellas.

4. Describa el procedimiento aplicado para asilar una bacteria que produzca una proteasa que tengan funcionalidad a temperatura de 90 ºC y a pH de 3.0.

REFERENCIAS

Pelczar M.J., E.C.S. Chan and N.R. Krieg (1993). Microbiology concepts and applications, Mc Graw Hill, USA. Steele, D.B. and D.M. Stowers (1991). Techniques for selection of industrially important microorganisms, Annu. Rev. Microbiol., 45:89-106.

APÉNDICE

Lugol

Yoduro de potasio 2gYodo metálico 1gAgua destilada 100 ml

Agar peptona.


Preparación:Disolver el yoduro en 20 ml de agua destilada,

posteriormente disolver el yodo, completar el volumen a

100 ml

Solución A:Proteosa de peptona 10 gExtracto de levadura 3 gAgar bacteriológico 10 gAgua destilada 500 ml

Solución B:Peptona de caseína 10 gAgua destilada 250 ml

Solución C:Agar bacteriológico 10 gAgua destilada 250 ml

Agar almidón.

Almidón soluble 10 gAgar nutritivo 23 gAgua destilada 1000 ml

Cloruro de mercurio al 12%HgCl2 12 gHCl concentrado 16 mlAgua destilada 80 ml

PRÁCTICA 2SELECCIÓN SECUNDARIA DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES

DE COMPUESTOS DE INTERÉS INDUSTRIAL

OBJETIVO:


Preparación:Disolver los ingredientes por separado en el agua

destilada dejándolos hidratar 15 minutos.

Hervirlos hasta disolución total y esterilizarlos a 121 °C durante 15 minutos.En condiciones asépticas mezclar las tres soluciones y vaciar en cajas Petri estériles.

Preparación:Disolver todos los ingredientes y fundir el

medio antes de esterilizarlo.

Esterilizarlo a 121 °C durante 15 minutos.En condiciones asépticas vaciar en cajas Petri estériles.

Preparación:Se adiciona el cloruro mercúrico en el agua y posteriormente se agrega lentamente el ácido clorhídrico. Se agita hasta su disolución completa.

2. Aplicar un método espectrofotométrico como herramienta para seleccionar de manera secundaria, a cepas productoras de proteasas y amilasas.

INTRODUCCIÓN

La selección secundaria de microorganismos es un proceso de laboratorio que tiene la finalidad principal de confirmar y cuantificar la actividad biosintética de interés.

En este proceso, es importante identificar a la cepa productora además de obtener información adicional sobre algunas características del proceso como es la composición del medio de cultivo, las condiciones de incubación, estabilidad genética del microorganismo, toxicidad potencial de otros productos del metabolismo entre otros.

En la selección secundaria del microorganismo se utiliza con gran éxito la técnica del cultivo sumergido, la cual consiste en utilizar medios de cultivo líquidos inoculados con la cepa de interés.

Actualmente el cultivo sumergido es una técnica de uso muy general, sin embargo es el resultado de un avance tecnológico muy importante en su año de creación (aproximadamente en 1930), ya que el método de cultivo sobre sustrato sólido era el empleado de manera rutinaria en los laboratorios de microbiología industrial y tenía como limitante la separación de la biomasa y el producto.

Las técnicas analíticas utilizadas para determinar la cantidad de producto obtenido son tan diversas como los productos mismos. En el caso particular de la práctica se utilizará un método espectrofotométrico para cuantificar el crecimiento de cepas productoras de proteasas y amilasas, en un sistema de cultivo sumergido que contiene medio de cultivo líquido compuesto de proteínas o almidón como nutrimento principal. Se determinará cuales son las mejores cepas productoras de estas enzimas en función de que desarrollen el mayor crecimiento en las condiciones de laboratorio proporcionadas.

MATERIAL

Por equipo: Celdas para espectrofotómetro 4 Pipetas de 1ml estériles 4 pipetas de 10ml estériles 4 matraces Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo nutritivo 4 matraces Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de caldo nutritivo


2 mecheros Fisher 1 Gradilla para tubos de ensaye Cepas aisladas de la práctica No. 1 Asa bacteriológica con porta-asa Benzal y esponja

Por grupo: Espectrofotómetro para utilizarlo durante seis muestreos con una hora de intervalo. 300 ml de hipoclorito de sodio al 1% Pipeta de vidrio de 5 ml limpia 1 matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de caldo nutritivo (blanco para la determinación del crecimiento de las cepas)

MÉTODO

Preparación de los cultivos primarios

1. En condiciones asépticas, tomar una asada gruesa de una cepa aislada productora potencial de proteasas y colocarla en el matraz Erlenmeyer de 125 ml que contiene 50 ml de caldo nutritivo.

2. Repita la operación con la siguiente cepa productora de proteasas

3. De la manera descrita anteriormente colocar las cepas productoras potenciales de amilasas en los matraces Erlenmeyer con 50 ml de caldo nutritivo.

4. No olvide identificar con la clave cada una de las cepas.

5. Incubar los matraces a 37 °C durante 18-24 horas. Al finalizar el tiempo de incubación saque los matraces de la estufa. Estos matraces con crecimiento microbiano se denominan cultivos primarios.

Selección secundaria de las cepas seleccionadas

1. Etiquetar los matraces que contienen 100 ml de caldo nutritivo con la clave de las cepas correspondiente.

2. A partir de los cultivos primarios, tomar 10 ml para inocular los matraces que contienen 100ml de caldo nutritivo recién etiquetados.

3. Evaluar el crecimiento de cada cepa utilizando un espectrofotómetro, para lo cual tomar en condiciones asépticas 2 ml del contenido del matraz Erlenmeyer de 250ml y colocarlo en una celda para espectrofotómetro.


4. Determinar su absorbancia a 650 nm después de inocular los matraces y cada hora durante un periodo de seis horas como mínimo. Utilizar como blanco caldo nutritivo estéril

5. Al finalizar cada determinación de absorbancia, colocar en la celda 1 ml de NaClO al 1%, agitar unos segundos, enjuagar con agua de la llave y desechar el contenido en la tarja.

6. El los matraces donde se encuentran las cepas deben regresarse a la estufa de 37 ºC inmediatamente después de haber tomado la muestra.

RESULTADOS

Anotar los datos de absorbancia obtenidos en la siguiente tabla:

Absorbancia registrada para las diferentes cepasTiempo Cepas(horas) Proteolíticas Amilolíticas

0

1

2

3

4

5

6

Trazar las gráficas de absorbancia contra tiempo, calcule la velocidad específica de crecimiento y el

tiempo de generación por cada cepa, utilizando las siguientes fórmulas:

Reportar las gráficas y los resultados de los cálculos en la siguiente tabla:

ln Xt – ln Xoµ=

tx - to


ln 2g =

µ

Datos cinéticos de las cepas aisladas

Clave de la cepa Datos cinéticos

Velocidad específica de crecimiento Tiempo de generación

Proteolítica 1:

Proteolítica 2:

Amilolítica 1:

Amilolítica 2:

Utilizar el resultado cuantitativo de estas variables como criterio de selección secundaria para

determinar cual es la mejor cepa productora por cada enzima.

En el reporte deberán aparecer los resultados de su equipo exclusivamente, sin embargo para la

exposición del seminario de resultados deberán presentarse los obtenidos por todo el grupo.


CUESTIONARIO

1. ¿Cuál fue su criterio para decidir que cepa es la mejor productora de proteasas y amilasas?

2. Discuta la veracidad de su criterio de selección de las cepas en función del método analítico empleado.

3. Escriba cinco procesos analíticos aplicados en la selección secundaria y mencione para que productos microbianos se utilizan.

REFERENCIAS

Demain, L.A. and A.S. Nadine, (1986). Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM press, Washington D.C. Steele, D.B. and D.M. Stowers (1991). Techniques for selection of industrially important microorganisms, Annu. Rev. Microbiol. 45:89-106.

PRÁCTICA 3TIPOS DE CULTIVO MICROBIANO

EPLEADOS EN BIOSÍNTESIS INDUSTRIAL

OBJETIVO:

3. Obtener los parámetros cinéticos del desarrollo de los tipos de cultivo “por lote” y “lote alimentado”.


4. Analizar los datos obtenidos para establecer las diferencias entre los dos tipos de cultivo.

INTRODUCCIÓN

El sistema de cultivo representa la parte principal en la obtención de los productos microbianos de interés industrial.

El sistema de cultivo comprende tres aspectos fundamentales:

El tipo de sistema de cultivo, incluyendo las características del biorreactor La composición del medio de cultivo La cepa microbiana a utilizar

La combinación de estos aspectos permite la obtención de cantidades aceptables del producto de interés.

Dentro de los tipos de cultivo existen cuatro grupos generales:

1. Por lote2. Por lote alimentado3. Continuo4. En estado sólido

Cada uno de ellos tiene características que los definen. En particular, el cultivo por lote incluye los sistemas más utilizados en la industria, el cual consiste de un biorreactor cerrado que no presenta entrada de medio de cultivo nuevo ni salida de desechos metabólicos. Esto significa que la cantidad de producto está definida la velocidad específica de crecimiento del microorganismo, la concentración y el consumo máximo del substrato.

En el tipo de cultivo por lote alimentado se pretende conseguir un estado “semi-estable”, en el cual se logra obtener un mantenimiento por más tiempo de la velocidad máxima de crecimiento del microorganismo, de una manera similar a un cultivo de tipo continuo.

El sistema de cultivo por lote alimentado posee una entrada de medio de cultivo nuevo y se logra una dilución de los productos de desecho, pero no presenta una salida específica para estos residuos.

MATERIAL

Por equipo: 1 Frasco de boca ancha de vidrio de 1 litro de capacidad 2 tuberías de vidrio de 1 m de largo por 0.5 cm de ancho 1 bomba para pecera*


1 tapón de hule con diámetro igual al de la boca del frasco de boca ancha* 1 filtro de algodón 2 m de tubería de hule latex (manguera) de 0.5 cm de diámetro* 1 pinza de metal* 2 celdas para espectrofotómetro 10 pipetas de 1 ml desechables estériles 2 Jeringas de 50 ml desechables estériles 42 tubos de ensaye de 13x100 con 4.5 ml de solución salina estériles 5 tubos de ensaye de 16x150 con tapón de rosca vacíos estériles 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio A estéril 1 frasco de vidrio o matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de CuSO4 al 1% 21 cajas Petri con agar Sabouraud estériles 1 mechero Fisher 1 probeta de 100ml estéril 1 Gradilla para tubos de ensaye Cepa de Saccharomyces cerevisiae Asa bacteriológica con porta-asa Benzal y esponja 1 Caja Petri de vidrio 200 ml de etanol

*El material señalado debe ser traído por los alumnos el día que se necesite para la práctica.

Exclusivamente para los equipos que desarrollen el cultivo por lote alimentado: 2 Matraces Erlenmeyer de 1l con 400 ml de caldo nutritivo estéril cada uno 1 probeta de 100ml estéril

Exclusivamente para los equipos que desarrollen el cultivo por lote: Matraz Erlenmeyer de 1l con 800 ml de caldo nutritivo estéril

Por grupo: 1 matraz Erlenmeyer de 125ml con 50ml de medio A estéril

MÉTODO


6. En condiciones asépticas, tomar una asada gruesa de la cepa de Saccharomyces cerevisiae y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 100 ml de medio A.


7. Incubar los matraces a 28 °C durante 18-24 horas. Al finalizar el tiempo de incubación sacar el matraz de la estufa. Este matraz contiene el inóculo primario para los tipos de cultivo que se desarrollarán en la práctica.

Construcción del biorreactor

1. Verificar que el tapón de hule embone perfectamente en la boca del frasco.

2. Realizar tres perforaciones al tapón de hule del tamaño del diámetro de la tubería de vidrio.

3. Cortar y doblar tres secciones de tubo de vidrio de acuerdo a la tabla I:

Tabla I. Forma y dimensiones de la tubería de vidrio necesaria para el biorreactor

Tamaño de la tubería Forma40 cm de largo Recta

40 cm de largo Curva

20 cm de largo Curva

Introducir las secciones de la tubería anteriores en las perforaciones de los tapones y coloque el tapón en el frasco, de acuerdo a la figura 1:


35 cm

5 cm

15 cm5 cm

Frasco de vidrio

Tapón de hule

Fig. 1. Construcción del biorreactor para desarrollar los tipos de cultivo microbiano

4. Tener mucho cuidado al introducir la tubería para evitar cortaduras.

5. Colocar en cada una de las secciones de tubería del biorreactor un pequeño trozo de algodón y esterilizarlo a 121 °C durante 15 minutos.

6. Esperar a que se enfríe y conectar los diferentes aditamentos del sistema de acuerdo a la figura 2:

Fig. 2. Esquema del dispositivo empleado para los sistemas de cultivoPor lote y lote alimentado

En donde:a) Bomba para pecerab) Filtro de algodón estérilc) Tubería de hule latexd) Entrada de la aireación del biorreactore) Tubería para toma de muestraf) Salida de gasesg) Trampa para gases liberados (CuSO4 al 1%)h) Pinza de metal

Desarrollo del sistema de cultivo por lote

1. En condiciones asépticas adicionar 800 ml de caldo nutritivo estéril dentro del biorreactor


d)

f)

e)

c)

a)b)

g)

c)h)

2. Con ayuda de una probeta de 100 ml estéril, tomar 80ml del contenido del cultivo primario y colocarlos dentro del biorreactor.

3. Una vez montado el dispositivo de la figura 2, evaluar el crecimiento de la cepa por cuenta viable y por incremento de la absorbancia cada 60 minutos durante seis horas, para lo cual tomar por la tubería correspondiente 10ml del contenido del biorreactor y colocarlos dentro de un tubo de 16x150 mm estéril.

4. Para determinar el crecimiento por cuenta viable, tomar una muestra de 0.5 ml del contenido del tubo de 16x150 mm. Realizar y sembrar las diluciones señaladas en la tabla II, utilizando tubos de 13x100 mm con solución salina y cajas Petri con agar nutritivo.

Tabla II. Diluciones a sembrar de acuerdo a la hora de muestreo

Hora de muestreo Dilución a realizar0 10-2 a la 10-4

1 10-2 a la 10-4

2 10-3 a la 10-6

3 10-3 a la 10-6

4 10-5 a la 10-7

5 10-5 a la 10-7

6 10-6 a la 10-8

5. Sembrar una caja por dilución e incubarlas a 28°C durante 24-48 horas.

6. Contar el número de colonias presentes y calcular las UFC/ml

7. Para determinar el crecimiento por incremento de la absorbancia, del tubo de 16x150 mm tomar el volumen necesario en una celda para espectrofotómetro y medir su absorbancia a 650 nm, utilizando como blanco medio A estéril.

8. Al finalizar la lectura, regresar el contenido de la celda al tubo de 16x150 mm. Adicionar a la celda 2 ml de NaClO al 1% agitar y eliminar el contenido por el desagüe.

Desarrollo del sistema de cultivo por lote alimentado

1. En condiciones asépticas adicionar 400 ml de caldo nutritivo estéril dentro del biorreactor

2. Con ayuda de una probeta de 100 ml estéril, tomar 80 ml del contenido del cultivo primario y colocarlos dentro del biorreactor.


3. Una vez montado el dispositivo de la figura 2, evaluar el crecimiento de la cepa por cuenta viable y por incremento de la absorbancia cada 60 minutos durante seis horas, de la manera descrita para el cultivo por lote.

4. Después del transcurso de dos horas, adicionar en condiciones asépticas el volumen de medio A señalado en la tabla III

5. Es muy importante que la muestra sea tomada antes de la adición de medio de cultivo nuevo

6. Al finalizar los muestreos, adicionar el contenido del matraz que contiene el CuSO 4 dentro del biorreactor, agitar de manera intermitente durante 5 minutos y desechar el contenido por el desagüe.

Tabla III. Adiciones de medio nuevo para el sistema de cultivo por lote alimentado

Hora Volumen de medio de cultivo nuevo por adicionar

Volumen final del sistema de cultivo por lote alimentado

0 0 4001 0 4002 100 5003 100 6004 100 7005 100 8006 0 800

RESULTADOS

Anotar los datos obtenidos por medio de cultivo en la siguiente tabla:

Sistema de cultivoPor lote Por lote alimentado

(horas) UFC/ml Absorbancia UFC/ml Absorbancia0

1

2

3

4


5

6

Trazar las gráficas de logaritmo de UFC/ml contra tiempo y la de absorbancia contra tiempo. Calcular

la velocidad específica de crecimiento y el tiempo de generación por cada sistema de cultivo, utilizando

las ecuaciones de la práctica No. 2.

En función de los resultados, discutir que sistema de cultivo es más eficiente para desarrollar el

crecimiento de la cepa de Saccharomyces cerevisiae.

CUESTIONARIO

4. ¿Cuáles son las ventajas de utilizar el sistema de cultivo por lote alimentado sobre el sistema por lote?

5. Discuta sobre el diseño del biorreactor utilizado en la aplicación del sistema de cultivo por lote alimentado.

6. ¿Qué ventajas existen al utilizar el sistema de cultivo por lote exclusivamente?

REFERENCIAS

Demain, L.A. and A.S. Nadine, (1986). Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM press, Washington D.C. Wang C.D., L.C. Cooney, L.A. Demain, P. Dunhill, E.A. Humphrey and D.M. Lilly (1979). Fermentation and enzyme technology, John While & Sons, N.Y.

APÉNDICE


Composición del medio de cultivo A

Compuesto g/lGlucosa 10Peptona 5Extracto de levadura 0.5KH2PO4 0.2CaCl2 0.1MgSO4 7H2O 0.1pH final: 5.2

PRÁCTICA 4PRODUCCIÓN DE SEMILLA PARA EL CULTIVO DE HONGOS COMESTIBLES

OBJETIVO:


Preparación:Agregar los ingredientes y disolverlos uno por uno. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

5. Aislar al hongo Pleurotus ostreatus para desarrollarlo en cultivo sólido de semilla de trigo estéril.

6. Probar diferentes semillas como substrato sólido alterno para el crecimiento de Pleurotus ostreatus

INTRODUCCIÓN

Los hongos son microorganismos eucariontes que se utilizan como alimento por el hombre desde hace mucho tiempo. Los griegos y romanos conocían a las trufas y las consumían como fuente de proteína, en Japón el cultivo de especies particulares de hongos, como Lentinus edodes, se aplica desde hace 200 años.

La producción anual de hogos frescos a nivel mundial se estima en 2x106 toneladas/año, la mitad de ésta la ocupa una sola especie: Agaricus brunnescens, la cual es el conocido champiñón (Agaricus bisporus es la especie de champiñón cultivada en América latina).

El contenido de nutrimentos de los hongos es la principal causa de interés en su cultivo, el cual es de 3-4% de proteína en peso fresco. Por el tipo y abundancia de aminoácidos, la proteína de los hongos se sitúa en una posición intermedia entre los vegetales y la carne, ya que contiene lisina y triptofano en mayor cantidad que los primeros, pero presentan menor cantidad de metionina y cisteína comparados con la carne.

Otra característica atractiva de los hongos es su bajo contenido de carbohidratos, el cual hace muy apreciado su consumo por personas que necesitan de dietas bajas en calorías pero con un buen sabor.

El cultivo industrial de los hongos puede dividirse en tres etapas generales:

1. Aislamiento de la cepa2. Obtención del inoculante3. Cultivo en sustrato sólido

En el desarrollo de la práctica se realizarán las etapas 1 y 2. La número 3 no se desarrollará por falta de condiciones de incubación para el crecimiento de los hongos en paja de maíz.

1. Aislamiento de la cepaCosiste en obtener micelio aislado de la cepa que nos interesa cultivar, para lo cual se utilizan las técnicas básicas de aislamiento de microorganismos a partir de muestras naturales.

2. Obtención del inoculanteUna vez aislada la cepa de interés, se desarrolla su crecimiento en un substrato de fácil manipulación que le proporcione al hongo los nutrimentos necesarios para su crecimiento. Además el substrato también debe tener una consistencia y características similares al


ambiente en el que el hongo se desarrollará para obtener el producto de interés (biomasa). Este substrato es la semilla de trigo precocida y esterilizada.

3. Cultivo en substrato sólidoSe utilizan residuos agroindustriales como paja de maíz, biruta de pino, pulpa de café entre otros. En esta etapa se utiliza el inoculante obtenido en la etapa 2 y se obtiene el hongo comestible después de un periodo de incubación en oscuridad que va de tres a cuatro semanas y a 28 °C.

El éxito del cultivo de hongos se centra en las dos primeras etapas, ya que la probabilidad de contaminación por otros microorganismos no deseados es muy alta y para evitarla se necesita el conocimiento y aplicación del conocimiento básico de microbiología general.

MATERIAL

Por equipo: 5 cajas de Petri con agar Sabouradu 5 cajas de Petri con agar Papa Dextrosa Bisturí con navaja nueva o en buen estado Pinzas para disección Aguja de disección 2 cajas de Petri de vidrio estériles 1 caja de Petri de vidrio limpia 2 mecheros Fisher 100 ml de etanol Benzal y esponja 2 frascos de vidrio de boca ancha de 1 l* 1 kg de semilla de trigo* Autoclave 1Matraz Erlenmeyer de 500 ml con 200 ml de solución salina estéril Algodón y gasa 1 jeringa de 50 ml desechable estéril Par de guantes latex por alumno

Por grupo Licuadora con baso estériles 100 ml de KOH al 1% 6 frascos gotero 1 kg de ejemplares frescos de setas*



MÉTODO

Aislamiento de la cepa

8. Desinfectar el área de trabajo y encienda los mecheros

9. Con las manos protegidas con guantes de latex, tomar un ejemplar fresco de seta y colocarlo sobre la base de una caja de vidrio estéril

10.Observar la figura 1 e identificar en el ejemplar el píleo. Esterilizar con alcohol el bisturí y cortar el píleo a la mitad, sin tocar la parte interna con las manos

11.Esterilizar nuevamente el bisturí y de la porción carnosa interna obtener trozos pequeños en forma de cubos de 4 a 10 mm de lado


Fig. 1. Partes de un hongo macromicetoTomada de Gaston et al. 1993

12.Esterilizar las pinzas y la aguja de disección. En condiciones asépticas y con ayuda del material anterior, colocar un mínimo de 6 cubos sobre la superficie de una caja Petri con agar Sabouraud, verificar que los éstos queden separados uno de otro

13.Repetir los pasos 4 y 5 hasta completar el total de las cajas con agar Sabouraud y agar Papa Dextrosa.

14. Incubar las cajas a 28 °C durante 7 días

15.Del crecimiento obtenido hacer preparaciones en fresco del micelio utilizando gotas de KOH al 1% par aclarar las hifas.

Preparación de la semilla

1. Limpiar la semilla de trigo eliminando todo material ajeno como tallos, hojas, piedras etc.

2. Realizar diferentes lavados de la semilla con agua de la llave hasta que quede limpia

3. Introducir la semilla lavada en un recipiente metálico con suficiente agua para cubrirla. Hervir la semilla hasta que presente de 50 a 55% de humedad (seguir las instrucciones del profesor). Mover periódicamente la semilla durante este punto.

4. Escurrir el exceso de agua y llene los frascos de boca ancha hasta 2/3 partes de su capacidad. Tapar los frascos con algodón y gorro de papel y esterilizarlos a 121 °C durante 40 minutos (verificar que la autoclave tenga suficiente agua)

5. Sacar los frascos de la autoclave para enfriarlos a temperatura ambiente

Inoculación de la semilla

1. Esterilizar el vaso de la licuadora con todas sus partes y 200 ml de solución salina

2. En condiciones asépticas armar el vaso de la licuadora y colocar en su interior la solución salina estéril

3. Con ayuda de un bisturí esterilizado a la flama del mechero, cortar en cubos todo el contenido de las cajas con la cepa aislada e introducir este material en el vaso de la licuadora

4. Tapar el vaso y licuar su contenido por 30-40 segundos

5. En condiciones asépticas y utilizando una jeringa desechable estéril de 50 ml, tomar la mitad del contenido del vaso de la licuadora y distribuirlo sobre la semilla esterilizada de uno de los frascos. Repetir este punto con el segundo frasco

6. Incubar los frascos a 28 °C durante tres semanas


RESULTADOS

Registrar los resultados obtenidos en la siguiente tabla.

Equipo Número de aislamientos en agar

Sabouraud

Número de aislamientos en agar

Papa Dextrosa

Número de cajas contaminadas

123456

Reportar las observaciones microscópicas del micelio aislado en los espacios respectivos.

Observaciones microscópicas del micelio aislado del píleo de Pleurotus ostreatus

Describir el aspecto, olor y consistencia de la semilla inoculada con la cepa aislada libre de

contaminación en la siguiente tabla.

Descripción de las características de la semilla inoculada


Equipo Aspecto Olor Consistencia

1

2

3

4

5

6

Con la ayuda de unas pinzas de disección estériles abrir el frasco en condiciones asépticas y tomar una

porción del micelio. Realizar cuatro preparaciones en fresco y cubrirlas con gotas de KOH al 1%.

Reportar las observaciones al microscopio y compararlas con el micelio observado en el aislamiento de

la cepa de Pleurotus ostreatus.


CUESTIONARIO

1. Enliste las fuentes de contaminación en el aislamiento de la cepa y preparación de la semilla

2. ¿Cuál es el efecto de aumentar el porcentaje de humedad de la semilla sobre el crecimiento del hongo?

3. Enliste cinco sustratos sólidos utilizados en el cultivo de hongos comestibles, describiendo sus características que favorecen su uso para este fin

REFERENCIAS

Gastón G., G. Mata, D. Salmones, C. Soto-Velazco y L. Guzmán-Dávalos (1993). El cultivo de los hongos comestibles, IPN, México Moore-Landecker E. (1996). Fundamentals of the Fungi, 4th ed., Prentice-Hall, New Jersey, USA.

PRÁCTICA 5PRODUCCIÓN DE BIOMASA

OBJETIVO:

7. Obtener proteína microbiana a partir de dos levaduras utilizando un medio de cultivo sintético y un biorreactor de laboratorio.


8. A partir de la producción de biomasa, calcular las variables de productividad y rendimiento total.

INTRODUCCIÓN

Uno de los procesos más conocidos de producción de metabolitos de interés industrial es la producción de biomasa a partir del crecimiento de microorganismos.

La necesidad de fuentes alternas de proteína manifestada durante la década de los setentas, impulsó el desarrollo de la tecnología para la producción de biomasa microbiana a gran escala con fines de consumo para la población humana.

La proteína microbiana o proteína unicelular son términos aplicados para referirse a la proteína obtenida a partir de microorganismos, la cual se considera como un producto completo desde el punto de vista nutrimental ya que contiene una gran cantidad de aminoácidos esenciales para la dieta del hombre.

Actualmente la proteína unicelular no se utiliza como fuente principal de proteína en la dieta de una persona, su uso es más difundido como complemento alimenticio.

Se han utilizado diferentes tipos de microorganismos para producir proteína, como son las bacterias, algas, levaduras y hongos filamentosos, los cuales poseen los siguientes atributos:

Rápido crecimiento en medios de cultivo de composición sintética Crecimiento en biorreactores de diseño simple Fácil separación de las células del medio de cultivo No son patógenos al hombre, plantas y animales Buen sabor y alta digestibilidad Alto contenido nutritivo

En la actualidad solo se conocen algunas levaduras que cumplen los requisitos anteriores, las cuales pueden contener hasta un 50% de proteína como peso seco, sin embargo estos microorganismos contienen bajas cantidades de los aminoácidos cisteína y metionina, por lo que los alimentos preparados a base de levaduras se combinan con harina de trigo o maíz, para incrementar su valor nutritivo.

El tipo de substrato que se ha utilizado para la producción de biomasa es muy variado, como lo es el metanol, etanol, celulosa y papel periódico. En la presente práctica se utilizará glucosa como fuente de carbono y energía para el crecimiento de levaduras con alto contenido de proteínas.

MATERIAL


Por equipo: 7 tubos de ensaye de 16x150mm con tapón de rosca vacíos y estériles 7 tubos de ensaye de 16x150mm 4 pipetas Pasteur 7 frascos de vidrio a peso constante (frascos Gerber)* 2 jeringas estériles de 10 ml 7 pipetas de 1 ml estériles 1 biorreactor de 1l con tapón y tubería y conecciones estériles 1 bomba para pecera 1 matraz Erlenmeyer de 1l con 800 ml de medio A estéril 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio A estéril 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de CuSO4 al 1% 1 probeta de 100 ml estéril 1 Filtro de algodón para biorreactor

Por grupo: 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio A estéril (blanco para espectrofotómetro) Tres cepas aisladas de Saccharomyces sp. Tres cepas aisladas de Candida sp.


MÉTODO


16.En condiciones asépticas, tomar una asada gruesa de la cepa proporcionada de acuerdo al número del equipo (tabla I) y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 100 ml de medio A.

Tabla I. Cepa de trabajo en función del número de equipo

Número de equipo CepaNon Candida sp.Par Saccharomyces sp.

17. Incubar los matraces a 28°C durante 18-24 horas. Al finalizar el tiempo de incubación sacar el matraz de la estufa. Este matraz contiene la fuente de inóculo para la producción de proteína unicelular que se desarrollará en la práctica.


Preparación del biorreactor

2. Se utilizará el biorreactor construido en la práctica No. 3. Colocar en cada una de las secciones de tubería del sistema un pequeño trozo de algodón y esterilizarlo a 121 °C durante 15 minutos.


Fig. 1. Esquema del dispositivo empleado para la producción de proteína unicelular


Producción de proteína unicelular

9. En condiciones asépticas adicionar 800 ml de medio A estéril dentro del biorreactor

10.Con ayuda de una probeta de 100 ml estéril, tomar 80 ml del contenido del cultivo primario y colocarlos dentro del biorreactor.

11.Conectar el sistema de aireación y con una jeringa de 10ml tomar una muestra 15ml del contenido del biorreactor por la tubería para tal fin (fig. 1) y colocarla en un tubo de ensaye de 16x150 con tapón de rosca estéril

12.Medir la absorbancia de la muestra utilizando 2ml de ella y un espectrofotómetro ajustado a 650 nm. Utilizar como blanco medio A estéril


d)

f)

e)

c)

a)b)

g)

c)h)

13.Repetir el punto anterior cada hora durante un mínimo de seis muestreos

Separación de la biomasa

1. Centrifugar la muestra contenida en el tubo de ensaye de 16x150mm con tapón de rosca a 4000 rpm durante 10 minutos. Con ayuda de una pipeta Pasteur retire la mayor cantidad posible del medio, evitar la resuspensión de la biomasa.

2. Con un mínimo de sobrenadante y con la pipeta Pasteur, resuspender el paquete celular y colocarlo en un vaso de vidrio a peso constante. Introducir los vasos de vidrio en un horno eléctrico y evaporar el resto de medio de cultivo a 40°C durante 24 horas.

3. Pesar la biomasa y registrar los datos.

Determinación de pH y azúcares totales

1. Medir el pH al sobrenadante separado con un potenciómetro calibrado.

2. A partir del sobrenadante realizar las diluciones necesarias para poder calcular la cantidad de azúcares totales presentes, seguir las indicaciones del profesor

3. Tomar 0.2ml de la dilución y colocarlos en un tubo de ensaye de 16x150mm. Adicionar 1.8 ml de agua destilada y sumergirlos en un baño de hielo.

4. Agregar 4 ml del reactivo de antrona al 0.2% resbalándolo por las paredes del tubo.

5. Agitar el contenido en un vortex y colocarlos a ebullición durante 10 minutos, utilizando un baño maría.

6. Leer el contenido en un espectrofotómetro a 640 nm, utilizando como blanco un tubo tratado de la manera descrita pero adicionado exclusivamente de 2 ml de agua destilada.

RESULTADOS


Datos cinéticos de la producción de biomasa


Cepa: _________________________

Tiempo (horas) Absorbancia650 nm Mg/l de biomasa pH Mg/l de azúcares reductores

0

1

2

3

4

5

6

Trazar la gráfica de absorbancia, mg/l de biomasa, mg/l de azúcares reductores y pH contra tiempo.

Calcular la velocidad específica de crecimiento, tiempo de generación, productividad y rendimiento

total por cada cepa.

Analizar los resultados, en función de la producción de biomasa por cepa. Comentar el comportamiento

del pH, la cantidad de biomasa y la concentración de azúcares totales en función del tiempo y por cepa.

CUESTIONARIO

4. Reporte el nombre científico de cinco cepas que sean utilizadas para producir proteína unicelular

5. El medio de cultivo utilizado en la práctica fue un medio sintético. Escriba la fórmula de dos medios que sean utilizados para producir biomasa a nivel industrial

6. En función de la velocidad de consumo de sustrato de la cepa que utilizó en la práctica, calcule en cuanto tiempo agotará la concentración de glucosa que le proporcionó en el medio de cultivo.


REFERENCIAS

Demain, L.A. and A.S. Nadine, (1986). Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM press, Washington D.C. Wang C.D., L.C. Cooney, L.A. Demain, P. Dunhill, E.A. Humphrey and D.M. Lilly (1979). Fermentation and enzyme technology, John While & Sons, N.Y.

APÉNDICE


Compuesto G/lGlucosa 10Peptona 5Extracto de levadura 0.5KH2PO4 0.2CaCl2 0.1MgSO4 7H2O 0.1pH final: 5.2

Curva tipo para calcular azúcares totales

Mg/ml de azúcares totales Absorbancia650nm

0.0 0.00.1 0.1190.2 0.2050.4 0.4030.6 0.6100.8 0.7981.0 0.963

Reactivo de antrona 0.2%

Reactivo Cantidad


Preparación:Agregar los ingredientes e irlos disolviendo uno por uno. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

Obtener las constantes pendiente y ordenada al origen de los datos de la tabla por regresión lineal, para poder extrapolar los datos de absorbancia.

Sumergir en un baño de hielo el ácido sulfúrico y disolver con mucho cuidado la antrona.

Antrona 0.2 gÁcido sulfúrico concentrado 100 ml

PRÁCTICA 6OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA

OBJETIVOS:

9. Aumentar la cantidad de proteína microbiana producida por levaduras, modificando las condiciones de cultivo como son: pH, concentración de sustrato y aireación.

10.Determinar las condiciones óptimas de producción de biomasa microbiana a partir de levaduras.


INTRODUCCIÓN

La producción de un producto microbiano de interés económico siempre podrá estar sujeta a la optimización, es decir, a aumentar la cantidad de producto a través de la modificación de las condiciones de cultivo.

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos y en su caso, para la optimización.Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un papel fundamental en los procesos de biosíntesis, ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea indispensable la optimización de los medios de cultivo. Algunas de las causas son las siguientes:

1) Carencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado.

2) Existencia de limitaciones nutricionales desconocidas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.

3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.

La metodología más elemental consiste en realizar experimentos en los cuales se varía la concentración del componente a ensayar manteniéndose constante las concentraciones de los demás ingredientes. Esta sencilla metodología puede aplicarse a diferentes variables de cultivo como pH, aireación, velocidad de agitación, temperatura de incubación entre otras.

En este caso, las variables a cuantificar para determinar el grado de optimización son la velocidad de crecimiento y la concentración de biomasa obtenida.

Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el microbiólogo industrial no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento o cuales son las condiciones óptimas de crecimiento y producción del metabolito en función del microorganismo utilizado. Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes y condiciones de crecimiento, el método resulta poco práctico. Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentración de un componente dependa de los niveles de los otros. Se puede mejorar mucho la optimización en cultivo por lote empleando técnicas estadísticas o utilizando sistemas continuos con adición de nutrimentos por pulsos de componentes.

MATERIAL

Por equipo: 7 tubos de ensaye de 16x150mm con tapón de rosca vacíos y estériles 7 tubos de ensaye de 16x150mm 4 pipetas Pasteur


7 frascos de vidrio a peso constante (frascos Gerber)* 2 jeringas estériles de 10 ml 7 pipetas de 1 ml estériles 1 biorreactor de 1l con tapón y tubería y conecciones estériles 1 bomba para pecera 1 matraz Erlenmeyer de 1l con 800 ml de medio A estéril 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio A estéril 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de CuSO4 al 1% 1 probeta de 100 ml estéril 1 Filtro de algodón para biorreactor

Por grupo: 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio A estéril (blanco para espectrofotómetro) Tres tubos de ensaye con medio agar Sabouraud inclinado con las cepas aisladas de la que presentó mayor crecimiento de acuerdo a los resultados de la práctica 5.


MÉTODO


18.En condiciones asépticas, tomar una asada gruesa de la cepa de levadura que tuvo un crecimiento mayor de acuerdo a los resultados de la práctica 5 y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 100 ml de medio A.

19. Incubar los matraces a 28°C durante 18-24 horas. Al finalizar el tiempo de incubación sacar el matraz de la estufa. Este matraz contiene la fuente de inóculo para optimizar la producción de proteína unicelular.


Seguir las instrucciones descritas en la práctica 5.

Condiciones de cultivo

Cada equipo trabajará con condiciones diferentes de acuerdo a la siguiente tabla:


Equipo Condiciones de cultivo1 pH 5.02 pH 7.03 5 g/l de glucosa4 20 g/l de glucosa5 40 g/l de glucosa6 Aireación de 500 ml/minuto7 Aireación de 250 ml/minuto

El resto de variables permanecen sin modificar, ejemplo: el equipo 1 ajustará el pH del medio de cultivo a un valor de 5, la concentración de glucosa y la aireación permanecen sin cambios.

Producción de proteína unicelular

14.En condiciones asépticas adicionar 800 ml de medio A estéril con la concentración de glucosa correspondiente al número de equipo dentro del biorreactor


16.Conectar el sistema de aireación y ajustarlo al valor correspondiente al número de equipo. Con una jeringa de 10ml tomar una muestra 15ml del contenido del biorreactor por la tubería para tal fin (fig. 1) y colocarla en un tubo de ensaye de 16x150 con tapón de rosca estéril

17.Medir la absorbancia de la muestra utilizando 2ml de ella y un espectrofotómetro ajustado a 650 nm. Utilizar como blanco medio A estéril

18.Repetir el punto anterior cada hora durante un mínimo de seis muestreos





RESULTADOS



Datos cinéticos de la producción de biomasa por equipo

Cepa: _________________________

Tiempo (horas) Absorbancia650 nm Mg/l de biomasa pH Mg/l de azúcares reductores

0

1

2

3

4

5

6

Trazar la gráfica de absorbancia, mg/l de biomasa, mg/l de azúcares reductores y pH contra tiempo.

Calcular la productividad y rendimiento total.

Anotar los resultados de productividad de todos los equipos en la siguiente tabla

Equipo Condición de cultivo Productividad total (mg biomasa/hora)

1 pH 5.0

2 pH 7.0


3 5 g/l de glucosa

4 20 g/l de glucosa

5 40 g/l de glucosa

6 Aireación de 500 ml/minuto


Anotar los resultados de rendimiento total de todos los equipos en la siguiente tabla

Equipo Condición de cultivo Rendimiento total (%)

1 pH 5.0

2 pH 7.0

3 5 g/l de glucosa

4 20 g/l de glucosa

5 40 g/l de glucosa



Analizar los resultados y determinar cual es el efecto de la variación de las condiciones de cultivo.

Establecer cuales son las condiciones óptimas de cultivo para la producción de biomasa para la cepa

utilizada, para esto deberá utilizar los datos de productividad y rendimiento obtenidos en la práctica 5.

CUESTIONARIO

1. Escriba el nombre de tres variables, diferentes a las modificadas en la práctica, que puedan modificarse para optimizar la producción de un metabolito microbiano y describa cuales serían esas modificaciones

2. Describa cuales serían los efectos de aumentar el tiempo de funcionamiento del biorreactor como un factor que optimice la producción de un metabolito microbiano


3. Tomando como ejemplo la producción de biomasa microbiana, describa qué tipo de reacciones bioquímicas deben ser favorecidas para optimizar la producción (considere la respiración y fermentación)

4. Escriba el nombre de tres productos microbianos que ha sido optimizada su producción

REFERENCIAS

Demain, L.A. and A.S. Nadine, (1986). Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM press, Washington D.C. Wang C.D., L.C. Cooney, L.A. Demain, P. Dunhill, E.A. Humphrey and D.M. Lilly (1979). Fermentation and enzyme technology, John While & Sons, N.Y. www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi.pdf, fecha de consulta: 13 de Julio de 2004.

APÉNDICE


Compuesto G/lGlucosa 10Peptona 5Extracto de levadura 0.5KH2PO4 0.2CaCl2 0.1MgSO4 7H2O 0.1pH final: 5.2

Curva tipo para calcular azúcares totales

Mg/ml de azúcares totales Absorbancia650nm

0.0 0.00.1 0.1190.2 0.2050.4 0.4030.6 0.6100.8 0.7981.0 0.963



Preparación:Agregar los ingredientes e irlos disolviendo uno por uno. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

Obtener las constantes pendiente y ordenada al origen de los datos de la tabla por regresión lineal, para poder extrapolar los datos de absorbancia.


Reactivo CantidadAntrona 0.2 gÁcido sulfúrico concentrado 100 ml

PRÁCTICA 7PRODUCCIÓN DE BIOMASA

EMPLEANDO UN MEDIO DE CULTIVO DE TIPO INDUSTRIAL

OBJETIVO:

11.Obtener proteína microbiana utilizando jugo de uva o extracto de betabel como medio de cultivo industrial.

12.A partir de la producción de biomasa en medio industrial, calcular las variables de productividad y rendimiento total.


INTRODUCCIÓN

El medio de cultivo es uno de los elementos más importantes que conforman un proceso de biosíntesis industrial, ya que de éste depende el abastecimiento de las fuentes de carbono, nitrógeno y azufre, además de oligonutrimentos requeridos por el microorganismo empleado.

La composición del medio de cultivo también determina el costo del proceso. Mientras más económico sea, el costo del producto microbiano obtenido será menor.

Un medio de cultivo industrial se caracteriza por su bajo costo de formulación, ejemplo de éste son la melaza de caña de azúcar, concentrados de pulpa de frutas e hidrolizados de substratos ricos en proteína.

Como medio de tipo industrial en ocasiones puede utilizarse residuos de otro proceso, como el procesamiento de la caña de azúcar o la elaboración de queso, los cuales al considerarse un desecho pueden conseguirse a muy bajo costo.

A pesar de que un medio de cultivo de tipo industrial debe ser económico, no debemos olvidar que debe proporcionar todos los nutrimentos que el microorganismo necesite para crecer y producir el metabolito de interés.

MATERIAL

Por equipo: 7 matraces Erlenmeyer de 50 ml estériles 7 frascos de vidrio a peso constante* 7 tubos para centrífuga de plástico 7 jeringas de 10 ml desechables estériles 2 pipetas Pasteur con bulbo de hule 1 biorreactor de 1l con tapón y tubería y conecciones estériles 1 bomba para pecera 1 coladera metálica* Machacador de plástico, procesador portátil de alimentos o licuadora con baso* 1 matraz Erlenmeyer de 1l 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de Medio A estéril 1 Probeta de 100 ml estéril 1 Filtro de algodón para biorreactor Algodón y gasa 1 kg de betabel o 1 kg de uvas oscuras, lavados ambos materiales con agua de la llave* Recipiente de Plástico de 1l de capacidad*

Por grupo: Tres cepas aisladas de Saccharomyces sp. Tres cepas aisladas de Candida sp. Peptona, KH2PO4 , NaCl y MgSO4.7H2O, una libra de cada uno



MÉTODO


20.En condiciones asépticas, tomar una asada gruesa de la cepa proporcionada de acuerdo al número del equipo (tabla I) y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 100 ml de medio A.


Número de equipo CepaNon Candida sp.Par Saccharomyces sp.

21. Incubar los matraces a 28 °C durante 18-24 horas. Al finalizar el tiempo de incubación sacar el matraz de la estufa. Este matraz contiene la fuente de inóculo para la producción de proteína unicelular que se desarrollará en la práctica.


4. Se utilizará el biorreactor construido en la práctica No. 3. Colocar en cada una de las secciones de tubería del sistema un pequeño trozo de algodón y esterilizarlo a 121 °C durante 15 minutos.



d)

f)

e)

c)

a)b)

g)

c)h)

Fig. 1. Esquema del dispositivo empleado para la producción de proteína unicelular


Preparación del medio de cultivo industrial

19.Cortar en trozos pequeños el betabel o separar del racimo todas las uvas

20.En caso de prepara el medio a partir de uvas, estas no deberán tener semillas

21.Colocar el material anterior dentro del recipiente de plástico de 1l y molerlo con el equipo disponible (licuadora, machacador o procesador portátil). En el caso del betabel adicionar 300 ml de agua destilada para macerarlo

22.Cuando el substrato esté molido completamente, con ayuda de la coladera filtrar el material para eliminar los residuos sólidos. Es muy importante que elimine todos los sólidos presentes ya que con esto se evitaran interferencias en la separación y cuantificación de la biomasa

23.En un matraz Erlenmeyer de 1l adicionar 400ml del extracto obtenido y completar el volumen a 800ml con agua destilada

24.Posteriormente adicionar 4g de peptona, 0.16g de KH2PO4 , 0.08g de NaCl y 0.08g de MgSO4.7H2O

25.Colocar un tapón de algodón y gorro de papel sobre el matraz. Esterilizar a 10 lb durante 10 minutos

Producción de biomasa a partir del medio industrial

1. En condiciones asépticas colocar el medio industrial dentro del biorreactor estéril


2. Con ayuda de una probeta de 100ml estéril, tomar 80ml del contenido del cultivo primario y colocarlos dentro del biorreactor.

3. Conectar el sistema de aireación y con una jeringa de 10 ml tomar una muestra 20 ml del contenido del biorreactor por la tubería para tal fin (fig. 1) y colocarla en un matraz estéril de 50 ml

4. Repetir el punto anterior cada hora durante un mínimo de seis muestreos


Seguir el procedimiento descrito en la práctica 5


Seguir el procedimiento descrito en la práctica 5

RESULTADOS


Datos cinéticos de la producción de biomasaCepa: _________________________

Tiempo (horas) Mg/l de biomasa pH Mg/l de azúcares reductores totales

0123456

Trazar la gráfica de mg/l de biomasa, mg/l de azúcares reductores y pH contra tiempo. Calcular la

velocidad específica de crecimiento, tiempo de generación, productividad y rendimiento total por cada

cepa.


Escribir en las siguientes tablas los datos obtenido de la práctica 5 y compararlos con los resultados

obtenidos en ésta práctica.

Comparación de datos cinéticos entre el medio de cultivo sintético e industrial

cepa: Candida sp.

Medio de cultivo m g Productividad total Rendimiento total

Sintético

Industrial

Comparación de datos cinéticos entre el medio de cultivo sintético e industrial

cepa: Saccharomyces sp.

Medio de cultivo m g Productividad total Rendimiento total

Sintético

Industrial

Comentar el comportamiento del pH, la cantidad de biomasa y la concentración de azúcares totales en

función del tiempo y por cepa.


Analizar los resultados de manera comparativa entre las constantes cinéticas obtenidas por los dos

medios de cultivo.

CUESTIONARIO

7. ¿Cuáles son las diferencias entre un medio de cultivo industrial y uno sintético?

8. ¿Bajo que condiciones no puede utilizarse un residuo de un proceso como medio industrial?

9. ¿Por qué se utilizó extracto de betabel o jugo de uva como medio de cultivo de tipo industrial?

REFERENCIAS

Demain, L.A. and A.S. Nadine, (1986). Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM press, Washington D.C. Prescot M.L., J.P. Harley y D.A. Klein (1999). Microbiología, 4ª ed, McGraw-Hill

Interamericana, Madrid. Wang C.D., L.C. Cooney, L.A. Demain, P. Dunhill, E.A. Humphrey and D.M. Lilly (1979). Fermentation and enzyme technology, John While & Sons, N.Y.

PRÁCTICA 8PRODUCCIÓN DE ETANOL

OBJETIVO:

13.Obtener y separar etanol producido a partir de la actividad metabólica de dos levaduras diferentes.

INTRODUCCIÓN

La producción de solventes a partir de la actividad metabólica de microorganismos, es un proceso que aporta grandes beneficios económicos para la industria productora.

Entre los solventes que se pueden obtener destacan la acetona, butanol, metanol y etanol. La producción microbiana de este último solvente se basa en el empleo de medios de cultivo con alto contenido de azúcares fermentables, como la glucosa, sacarosa y almidón soluble.


El proceso debe realizarse en ausencia de aireación y a temperatura ambiente, para evitar la formación de biomasa y desplazar la reacción hacia la formación de etanol, como se muestra en la figura 1.

Fig. 1. Ruta metabólica involucrada en la producción microbiana de etanol

Los solventes producidos pueden separarse del medio de cultivo después del tiempo de incubación del microorganismo, por destilación. En el caso particular del etanol la temperatura mínima de calentamiento es de 78 °C, ya que ésta corresponde a la del punto de ebullición del solvente.

Entre los microorganismos más empleados para la producción de este solvente se encuentran la levadura Saccharomyces cerevisiae. y la bacteria Zymomonas mobilis, su limitante es su incapacidad para metabolizar azúcares pentosas para producir etanol. Candida sp. y otras levaduras como Pachysolen tannophilus y Pichia stipitis son microorganismos que si poseen la capacidad de usar pentosas para producir etanol.

Una limitante importante en la producción de etanol por estos microorganismos es el hecho de que el solvente producido inhibe su crecimiento y actividad, ya que los microorganismos solo soportan un 12% de etanol en el medio. El uso de cepas resistentes a altas concentraciones del solvente, obtenidas por modificación genética es una alternativa para superar esta limitante.

MATERIAL

Por equipo: 2 Matraces Erlenmeyer de 50 ml estériles 4 jeringas estériles de 10 ml 1 biorreactor de 1l con tapón y tubería y conecciones estériles 1 bomba para pecera


GlucosaC6H12O6

PiruvatoCOOH

C=O

CH3

CO2

TTPMg

+ NAD+

H

C=O

CH3

Acetaldehido

Piruvato descarboxilasa Etanol deshidrogenasa

OH

CH2

CH3

Etanol

1 matraz Erlenmeyer de 1l con 800 ml de medio A estéril para producción de etanol 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio A estéril para producción de etanol 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de CuSO4 al 1% 1 Probeta de 100 ml estéril 1 Filtro de algodón para biorreactor 2 pinzas de metal para sujetar tubería del biorreactor* 90g de sacarosa (azúcar de mesa)*


Por grupo: Cepas aisladas de Saccharomyces sp. Cepas aisladas de Candida sp.

MÉTODO


22.En condiciones asépticas, tomar una asada gruesa de la cepa proporcionada de acuerdo al número del equipo (tabla I) y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 100ml de medio A para producción de etanol.


Número de equipo CepaPar Candida sp.Non Saccharomyces sp.

23. Incubar los matraces a 28 °C durante 18-24 horas. Al finalizar el tiempo de incubación sacar el matraz de la estufa. Este matraz contiene la fuente de inóculo para la producción de proteína unicelular que se desarrollará en la práctica.


6. Se utilizará el biorreactor construido en la práctica No. 3. Colocar en cada una de las secciones de tubería del biorreactor un pequeño trozo de algodón y esterilizarlo a 121 °C durante 15 minutos.



Fig. 2. Esquema del dispositivo empleado para la producción de etanol

En donde:a) Biorreactor para producción de etanolb) Tubería de hule latexc) Pinza de metald) Tubería para toma de muestrae) Salida de gasesf) Trampa para gases liberados (CuSO4 al 1%)

Producción de etanol

26.En condiciones asépticas adicionar 800 ml de medio de cultivo A estéril para producción de etanol dentro del biorreactor


28.Cerrar las posibles entradas de aire del biorreactor, con una jeringa de 10 ml tomar una muestra 20 ml del contenido del biorreactor por la tubería para tal fin (fig. 2) y colocarla en un matraz estéril de 50 ml

29.Mantener el biorreactor a temperatura ambiente durante 7 días

30.Al finalizar el tiempo, con ayuda de jeringa de 10 ml tomar una muestra 20 ml del contenido del biorreactor y colocarla en el segundo matraz estéril de 50 ml


a)

e)

d)

f)

b)c)

c)b)

31.Colocar el contenido total del biorreactor dentro de un matraz para destilación y separar el etanol producido a 78 °C por destilación con reflujo simple.

32.Medir lo más exacto posible la cantidad de etanol producida


Seguir el procedimiento señalado en la práctica No.5

RESULTADOS


Cepa Etanol producido (ml) Azúcares totales (mg/l) pHIniciales Finales Inicial Final

Saccharomyces sp.

Candida sp.

Calcular el rendimiento de la producción de etanol por cada cepa.

Analizar los resultados, en función del rendimiento de la producción de etanol por cepa. Comentar el

comportamiento del pH y la concentración de azúcares totales en función del tiempo y por cepa.

CUESTIONARIO

10.Escriba el nombre científico de cinco microorganismos diferentes a los usados en la práctica, que sean productores de etanol

11.Elabore una lista de las industrias o actividades en las cuales se utilice etanol. En el caso de formar parte de un producto, escriba el nombre de éste.

12.¿Por qué las células de microorganismos son capaces de producir etanol y las de un mamífero no?


13.¿Cómo se llama el proceso por el cual una levadura puede hidrolizar polisacáridos?

14.Desde el punto de vista metabólico, ¿cuáles serían las limitantes que podrían impedir una alta producción microbiana de etanol?

REFERENCIAS

Demain, L.A. and A.S. Nadine, (1986). Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM press, Washington D.C. www.nslc.wustl.edu/courses/Bio3920/curtiss/2004/L19b.pdf, fecha de consulta: 13 de Julio de 2004 www.ars.usda.gov/research/publications, fecha de consulta: 13 de julio de 2004

APÉNDICE


Reactivo CantidadAntrona 0.2 gÁcido sulfúrico concentrado 100 ml

Composición del medio de cultivo A para producción de etanol

Compuesto G/lSacarosa 100Peptona 5Extracto de levadura 0.5KH2PO4 0.2CaCl2 0.1MgSO4 7H2O 0.1


Preparación:Agregar los ingredientes e irlos disolviendo uno por uno. Esterilizar a 10 libras durante 10 minutos.pH final: 5.2


PRÁCTICA 9TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

OBJETIVOS:

14.Utilizar un biorreactor de laboratorio para disminuir la concentración de materia orgánica presente en agua residual doméstica.

15.Utilizar la técnica de Demanda Bioquímica de Oxígeno para cuantificar la eliminación de la materia orgánica presente en el agua residual.

INTRODUCCIÓN


El uso del agua está muy relacionado con las actividades económicas y domésticas. Mientras más se usa el agua para satisfacen necesidades mayor será el caudal de aguas residuales descargadas a los sistemas de alcantarillado o drenaje municipales o estatales. Se ha determinado que el mayor volumen de aguas residuales corresponden a las originadas por la vida cotidiana del ser humano, como la limpieza, preparación de alimentos y necesidades fisiológicas. Se calcula que cada persona consume 200 litros diarios para satisfacer estas necesidades.

El agua residual doméstica contiene residuos que son materia orgánica que consume oxígeno por su eliminación biológica, como la material fecal, restos de alimentos, aceites y grasas; otra parte son detergentes, sales, sedimentos, material orgánico no biodegradable y también microorganismos patógenos. La materia orgánica biodegradable y algunas sales inorgánicas son nutrientes para los microorganismos.

Las aguas residuales se denominan también aguas negras o municipales y, como es sabido, se vierten en los sistemas de alcantarillado que las descargan en los cuerpos de agua como mar, lagos y ríos, produciendo la contaminación de estos recursos naturales.

El proceso más generalizado del tratamiento de aguas residuales domésticas puede dividirse en tres etapas:1ª, tratamiento primario o físico; 2ª, tratamiento secundario o biológico y 3ª, tratamiento terciario que normalmente implica una cloración. El tratamiento primario consiste en la remosión de sólidos insolubles como arena y materiales como grasas y espuma. El primer paso de la etapa inicial es la sedimentación y filtración de sólidos a través de rejillas. La sedimentación separa los sólidos suspendidos, que son aquellos que flotan. Durante esta decantación primaria existe la tendencia a que las partículas formen agregados denominados flóculos, los cuales puede favorecerse su formación con la adición de compuestos químicos. El material que flota consiste en aceites, ceras, ácidos grasos y jabones insolubles que se conoce genéricamente como grasas.

El tratamiento secundario se aplica para descomponer por actividad microbiana la materia orgánica presente, la cual al degradarse se flocula y se favorece su separación. Como este proceso biológico ocurre en los cuerpos de agua naturales, su aplicación en aguas residuales en forma regulada, previene la contaminación de los cuerpos de agua cuando en ellos se descargan aguas residuales. Por lo tanto, el tratamiento biológico emplea, con diversas técnicas, la materia orgánica biodegradable de las aguas residuales domésticas, como nutrimentos de un conjunto de poblaciones microbianas a las cuales se les proporciona oxígeno y condiciones controladas para que crezcan y eliminen la materia orgánica presente. El tratamiento biológico es por tanto una oxidación de la materia orgánica biodegradable con participación de bacterias y hongos que se aplica para acelerar un proceso natural y evitar posteriormente la presencia de contaminantes y la ausencia de oxígeno en los cuerpos de agua.

MATERIAL

Por equipo: 1 pipeta de 10 ml estéril 1 biorreactor de 1l con tapón, tubería y conecciones 1 bomba para pecera


1 matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 probeta de 500ml 1 probeta de 100ml 1 botella de plástico desechable de 1l* 2 botellas de vidrio con tapón esmerilado de 300ml 1.4L de agua de dilución (revisar el desarrollo de la práctica y el calendario para prepararla con anticipación)

Por grupo: 4l de agua residual doméstica 4 matraces Erlenmeyer de 250ml 300ml de Na2S2O3 0.025N 100ml de KI alcalino 100ml de MnSO4

20ml de H2SO4 concentrado KH2PO4

K2HPO4

Na2HPO4 7H2O NH4Cl MgSO4 7H2O CaCl2 FeCl3 6H2O 100ml de reactivo de almidón 8 pipetas de 1ml 2 pipetas de 5ml 6 propipetas Estufa para incubación estabilizada en 20 °C 1l de lodos activados


MÉTODO

8. Se utilizará el biorreactor construido en la práctica 5. Para el desarrollo de esta práctica no es necesario utilizarlo en condiciones estériles.

9. Medir 500ml de agua residual doméstica y colocarlos dentro del biorreactor

10.Medir 100ml de lodo activado e introducirlos dentro del biorreactor

11.Conectar los diferentes aditamentos del sistema de acuerdo a la figura 1:


c)

e)

d)

b)

a)f)

b)g)

Fig. 1. Esquema del dispositivo empleado para el tratamiento de agua residual doméstica

En donde:a) Bomba para pecerab) Tubería de hule latexc) Entrada de la aireación al biorreactord) Tubería para toma de muestrae) Salida de gasesf) Trampa para residuos liberados (matraz Erlenmeyer vacío)g) Pinza de metal

12.Conectar la bomba de aire a la corriente eléctrica y dejar funcionando el biorreactor a temperatura ambiente durante 7 días

Determinación de la materia orgánica presente por la técnica de Demanda Bioquímica de Oxígeno

1. Después de preparar el biorreactor, con una pipeta de 10ml tomar 7ml de su contenido y colocarlos dentro de la botella de plástico desechable de 1l

2. Completar a 700ml con agua de dilución fría y agitar fuertemente el contenido durante 2 minutos

3. Llenar completamente las dos botellas de vidrio con tapón esmerilado con la solución recién preparada. Una de ellas utilizarla para cuantificar el oxígeno disuelto inicial de acuerdo al método Winkler descrito en el apéndice. La segunda introducirla en la bolsa de plástico negra e introducirla a la estufa estabilizada a 20 °C, permanecerá en estas condiciones durante cinco días.

4. Después de que transcurran los siete días de funcionamiento del biorreactor, tomar 35ml de su contenido y repetir los pasos descritos en 2 y 3.

5. Para calcular la Demanda Bioquímica de Oxígeno utilizar la siguiente fórmula:

DBO5 (mg/l) =


O2 disuelto inicial – O2 disuelto final

Factor de dilución en decimales

6. El factor de dilución se obtiene a partir del volumen que se tomó del biorreactor para determinar el oxígeno disuelto, al tiempo inicial fue de 7ml y a los siete días fue de 35ml.

Determinación del porcentaje de remosión de la materia orgánica

1. Una vez calculados los valores de DBO inicial y final, substituir los datos en la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de remosión:

% de remosión =

RESULTADOS

Reportar los resultados obtenidos de DBO y porcentaje de remosión en la siguiente tabla.

Remosión de materia orgánica en agua residual doméstica

Equipo Aireación aplicada (ml/h) DBOinicial DBOfinal % de remosión

1

2

3

4

5

6

7

Analizar los resultados en función del porcentaje de remosión obtenido y la aireación aplicada. Determinar si el tratamiento del agua residual es satisfactorio para desargar el agua tratada al sistema de alcantarillado de acuerdo a la norma Norma Oficial Mexicana NOM-001-ECOL-1996 (www.ine.gob.mx).

CUESTIONARIO

1. Escriba el concepto de agua residual industrial

2. ¿Por qué es necesario mantener el biorreactor con aireación para lograr una buena remosión de la materia orgánica contenida en el agua residual?


DBOinicial - DBOfinal

X 100DBOinicila

3. Describa la importancia de los lodos activados en el proceso de tratamiento del agua residual

4. Describa los factores que pueden disminuir la eliminación de la materia orgánica en un sistema de tratamiento aerobio de aguas residuales

5. Mediante un esquema elaborado por usted, represente el tratamiento anaerobio de aguas residuales domésticas

REFERENCIAS

www.ine.gob.mx , fecha de consulta 14 de julio de 2004 www.puc.cl/quimica/agua/ , fecha de consulta: 14 de julio de 2004

APÉNDICE

Reactivos para preparar el agua de dilución (determinación de la DBO5)

Solución A: reguladora de FosfatosKH2PO4 8.50 gK2HPO4 21.75 gNa2HPO4 7H2O 33.40 gNH4Cl 1.70 gAgua destilada 1 LpH 7.20

En un matraz aforado de 1 L, disolver todos los reactivos en 500 ml del agua destilada. Aforar a un litro. Agitar y envasar en un recipiente de vidrio o plástico limpio. Guardar en refrigeración y protegido de la luz.

Solución B: Sulfato de MagnesioMgSO4 7H2O 2.25 gAgua destilada 100 ml

Disolver el reactivo en 50ml de agua destilada. Aforar a 100ml. Homogeneizar y guardar en un recipiente de plástico limpio y en refrigeración.

Solución C: cloruro de calcioCaCl2 2.75 gAgua destilada 100 mL


Disolver el reactivo en 50ml de agua destilada. Aforar a 100ml. Homogeneizar y guardar en un recipiente de plástico limpio y en refrigeración.

Solución D: cloruro férricoFeCl3 6H2O 0.025 gAgua destilada 100 mL

Disolver el reactivo en 50.00 mL de agua destilada. Aforar a 100.00 mL. Homogeneizar y guardar en

un recipiente de plástico limpio en refrigeración y protegido de la luz.

Preparación de agua de dilución para determinar la DBO5

Solución A 1 mlSolución B 1 mlSolución C 1 mlSolución D 1 mlAgua destilada 996 ml

En un matraz aforado de 1 L, adicionar todas las soluciones en 500 ml del agua destilada. Aforar a un

litro.

Técnica de Winkler para determinar oxígeno disuelto

Soluciones y reactivos

Sulfato de Manganeso

MnSO4 240gAgua destilada 500ml

Disolver el sulfato de manganeso en 250ml de agua destilada y una vez disuelto aforar a 500 ml con el agua destilada.

Solución Alcalina de Yoduro de Potasio

NaOH 250gKI 75gAgua destilada 500ml


Disolver el hidróxido de sodio en 250 mL de agua destilada, preferentemente en un baño de hielo. Disolver el yoduro de potasio en un volumen de agua aparte. Una vez frías las soluciones se mezclan y se afora a 500 mL.

Tiosulfato de Sodio 0.025 N

Na2 S2 O3 6.2046gAgua destilada 1L

Disolver el tiosulfato en 500ml de agua destilada. Aforar a 1L

Indicador de Almidón

Almidón 2gAgua destilada 100 ml

Pesar 2 g de almidón soluble, adicionar un poco de agua, calentar si es necesario, enfriar y completar el volumen a 100 ml.

Procedimiento para determinar el oxígeno disuelto por el método de Winkler

1. Añadir a la muestra de agua 2 ml de sulfato de manganeso y 2 ml de solución alcalina de yoduro de potasio introduciendo ligeramente la punta de la pipeta en el agua.

2. Tapar el frasco y mezclar rápidamente por inversión durante 30 segundos. Dejar sedimentar.

3. Añadir 1 ml de ácido sulfúrico concentrado, tapar cuidadosamente y mezclar por agitación hasta que se disuelva el precipitado

4. Medir 200 ml del contenido de la botella en una probeta

5. Vaciar este volumen, cuidadosamente y sin agitar en un matraz de 500 ml

6. Titular con una solución de tiosulfato de sodio 0.025 N hasta obtener un color amarillo paja

7. Adicionar 5 gotas del indicador de almidón y continuar la titulación hasta la desaparición del color azul

8. Anotar el volumen de gasto total de tiosulfato de sodio 0.025 N.

Cálculos y resultados


1. Exclusivamente cuando se titula un volumen de 200 mL de la muestra preparada de acuerdo con las indicaciones anteriores, cada mL de tiosulfato de sodio 0.025 N gastado equivale a 1 mg/L de oxígeno (1 mg/L = 1 ppm).

2. Si la concentración del tiosulfato de sodio es diferente de 0,025 N, o si el volumen de muestra valorada es diferente de 200 mL , se debe aplicar la siguiente ecuación:

( a ) ( N ) ( 8 000 )mg/L de O2 = ---------------------------

b

donde:

a = Volumen de gasto del Na2S2O3

N = Normalidad del Na2S2O3

b = Volumen en mL de la muestra valorada8 000 = Constante estequiométrica


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