VIROLOGA

VIROLOGA

DIAGNSTICO VIROLGICO.- MTODOS INDIRECTOS O SEROLGICOSDOCENTE: CARMEN MOSQUERASTEPHANIE CAROLINA ROMERO RAMREZGRUPO 7MTODOS INDIRECTOS O SEROLGICOSConsiste en demostrar en el suero del paciente la presencia de anticuerpos especficos antivirales.

Conversin serolgica.-aparicin de Anticuerpos mas de 4 veces en dos muestras pareadasDeteccin de IgM especfica.- diagnstico de infeccin reciente en una sola muestra de sueroDos mtodos: conversin serolgica y presencia de IgM especfica.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTADiagnstico serolgico

Uso de anticuerpos especficos anti-Igs humanas conjugados con colorantes fluorescentes (fluorescena u otros)

Detectar fcilmente en el suero del paciente la presencia de anticuerpos antivirales.

Permite detectar la presencia de antgenos virales en el interior de las clulas mediante tincin con anticuerpos especficos conjugados con un colorante fluorescente Inmunofluorescencia indirecta para deteccin de anticuerposHacer reaccionar los anticuerpos presentes en el suero con antgenos virales presentes en clulas infectadas fijadas sobre portaobjetos y revelar esa unin antgeno-anticuerpo mediante un segundo anticuerpo anti-Igs humanas, conjugado con fluorocromo.

El fluorocromo mas usado es el isotiocinato de florescena

INMUNOFLUORESCENCIA

La IFI suele ser mas sensible y mas especfica que la directa debido a que tiene un paso mas de amplificacin, por lo que requiere 1-2 horas para su realizacin Requiere de solo un reactivo marcado, la globulina gamma antihumana de cabra conjugada con fluorescena

Inmunofluorescencia indirecta para deteccin de IgM

Se utiliza para el diagnstico de infeccin reciente y para diagnstico de infecciones congnitas.Pueden falsos resultados:Factores reumatoideos(FR) Altos ttulos de IgG especficaLos diferentes tipos de ELISA son: Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA IndirectoELISA sndwich Doble (DAS) Heterlogo (HADAS) Antgeno marcado: ELISA competitivoELISA Sndwich DAS Consta de las siguientes etapas:Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.).Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar.Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

Elisa de captura

ELISA Sndwich HADAS Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.).Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar.Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior.Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA COMPETITIVOConsta de las siguientes etapas:Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior.Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados.

WESTERN BLOT

Javier Agustn Lanez MiteGrupo 7 Cuarto Semestre

DefinicinWestern Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada en biologa celular y molecular, para la separacin e identificacin de protenas.

En virologa sirve para investigar antgenos virales o sus respectivos anticuerpos.

Capacidad de identificar protenas especficas de una mezcla compleja de protenas extradas de las clulas.

Similar a ELISA

WB menos sensibleWB ms especifico

Prueba confirmatoria de la presencia de Ac para HIV en suero de pacientes con serologa positiva determinada por ELISAcmo funciona?Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en funcin de su peso molecular.A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la protena de inters. El resultado aporta informacin sobre el peso molecular de la protena y su cantidad relativa en la muestra.SecuenciaPreparacin del tejidoElectroforesis en gelTransferenciaBloqueoDeteccinAnlisis Muestra:TejidoCultivo celularExtraccin de las protenas de muestras biolgicas mediante disrupcin mecnica o qumica.

Preparacin de la muestra

ELECTROFORESISPara entender la tcnica del Western Blot es necesario comprender que es una electroforesis y en que se basa.

Las protenas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un campo elctrico a una solucin que contenga una mezcla de protenas, stas migrarn a una velocidad que depender de su carga neta, forma y peso molecular. Esta tcnica es conocida como electroforesis.

Las separaciones electroforticas se realizan casi siempre en soportes slidos, generalmente para separar una mezcla de protenas, el soporte de eleccin son los geles de poliacrilamida.Secuencia del Western blot Paso 1Paso 1Electroforesis de las muestras de protenas:

-Las protenas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S--El SDS aporta cargas negativas-Las protenas corren hacia el nodo (+) y se distribuyen en el gel de acuerdo a su peso molecular

Protenas ya corriendo en el gelFuente de poder

Muestra de protenas para cargar en el gelDodecilsulfato sodicoElectroforesis en gelEn esta tcnica la mezcla de protenas se separa mediante una electroforesis en gel, con base en:Peso molecularEstructuraHidrofobicidad

65mm altura Gel de corridaCubeta de electroforesis

transferenciaEstos resultados son luego transferidos a una membrana adsorbente produciendo una banda para cada protena.Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos.Membrana denitrocelulosao dePVDF. Esta transferencia puede realizarse por:DifusinPorvacoPor accin de un campo elctrico (electrotransferencia).

Se construye lo que se conoce como sndwich, donde se apilan sucesivamente una esponja plana, papel absorbente, el gel, la membrana sinttica, ms papel y finalmente otra esponja plana.Buffer de transferenciaSecuencia del Western blotTransferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2-Las protenas separadas por tamao se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las protenas

Cassette listo para iniciar transferencia

Armado del cassette de transferencia

El gel con las protenas se coloca en el cassette de transferencia

Se quitan las burbujas para asegurarla correcta transferencia

Se detiene la corrida electroforetica

Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar el gel con las proteinas separadas por masaTras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel conCoomassie Brilliant Blue(un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.

No se deberan observar protenas coloreadas en el Gel, lo que nos dara a entender que todas las protenas se transfirieron. VERIFICACINbloqueoPuesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia.En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin delcomplejo antgeno-antgenoque se forma con la protena que se busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas:Albmina de suero bovinoo ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA)Leche en polvoo casenaDiminuta fraccin de detergente (Tween 20oTritn X-100)

Se evita falsos positivos.deteccinPosteriormente la membrana se incuba con anticuerpos especficos marcados para la protena de inters.Comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para ello se emplea un anticuerpoespecfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice unareaccin colorimtrica. De esta forma, se hace patente la unin con elantgeno, la protena, as como su localizacin.

Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidosProducto InsolubleTIPOSSe puede hablar de tipos de western blot segn el tipo de deteccin de las protenas.Directo:El anticuerpo primario marcado se une al antgeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una seal detectable. En el mtodo directo de deteccin, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antgeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con una enzima

MTODO DIRECTO

IndirectoEl anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antgeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato. En el mtodo indirecto, se aade primero un anticuerpo primario sin marcar contra el antgeno de la superficie de la membrana; posteriormente se aade un anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo primario.MTODO INDIRECTO

MTODOS DE DETECCINanlisisTras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas que s se han unido a la protena de inters.

cuantificacinEs muy importante ser consciente de que los datos producidos con un western blot se considera generalmente para ser semi-cuantitativa.Debido a que proporciona una comparacin relativa de los niveles de protena, pero no una medida absoluta de la cantidad.Hay dos razones para esto;primero, hay variaciones en los tipos de carga y de transferencia entre las muestras en carriles separados que son diferentes en transferencias separadas.En segundo lugar, la seal generada por la deteccin no es lineal en todo el intervalo de concentracin de muestras.Por lo tanto, puesto que la seal producida no es lineal, no debe ser utilizado para modelar la concentracin.

aplicacionesInvestigacinBiologa molecular.Inmunologa.DiagnsticoPrueba de VIH.Enfermedad de las vacas locas.Enfermedad de Lyme.

TAMIZAJE SEROLOGICOELISANegativo Positivo/Indeterminado RepetidamenteCorrer una nueva muestraRepetidamente POSITIVOEtapa(1)WESTERN BLOTNegativoIndeterminado Positivo Correr una nueva muestra 30 a 60 das despusRepetir etapas 1 y 2Etapa(2)

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WESTERN BLOT

(TEST CONFIRMATORIO)

TEST DE WESTERN BLOT Objetivo- Detectar anticuerpos especficos contra el VIH1/2 FundamentoLisado viral de clulas infectadas, sometidos a electroforsis en gel de poliacrilamida y transferido a hojas de nitrocelulosa

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POSITIVO Si dos bandas presentan intensidad >1+ en relacin al control , Una banda de envoltura y la p24 Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17 para HIV1 Protenas gp105 y gp36 para HIV2Criterios de interpretacingp120 gp41 p31 p24 p173+ 1+ +/-Controlgp105 gp36

INDETERMINADO Si dos o mas bandas presentan intensidad +/- Si una banda presente intensidad