DEPARTAMENTO ACADÉMICO:

Morfología Humana

CURSO:

Genética Médica

TÍTULO:

Diagnóstico y tratamiento genético de las enfermedades

INTEGRANTES:

Pérez Ramírez, James

Polo Mejía, Juan Julio Joseph

Polo Saona, Christian

Poma González, Elka

Pretell Vargas, Crystel Yasmín

Pumamango Córdova, Jimmy Emerson

Quiroz Aldave, Juan Eduardo

Reyes Florián, Giuliana

Rivalles Alvarez, Renzo Renato

TRUJILLO – PERÚ

2010

Tabla de contenido

Introducción................................................................................................................................................3

Estrategias generales de diagnóstico de enfermedades..............................................................................4

Métodos de detección de mutaciones....................................................................................................4

Métodos de barrido.............................................................................................................................5

Métodos de comprobación...............................................................................................................35

Aplicación del ligamiento al diagnóstico (proceso de diagnóstico indirecto de las enfermedades genéticas)..............................................................................................................................................49

Tratamiento genético de las enfermedades..............................................................................................59

Proteínas recombinantes.......................................................................................................................69

Células madre......................................................................................................................................102

2

Introducción

Gran parte del conocimiento de la genética humana se funda en el estudio de las enfermedades

hereditarias (codificación genética que puede o no tener manifestaciones congénitas, como en la Corea

de Huntington, y la identificación de nuevos procedimientos clínicos ha estimulado el interés en su

estudio. El control en otro tipo de enfermedades ha propiciado que aumente la frecuencia de las de

etiología genética, por ejemplo, desde principios de siglo, los esfuerzos por preservar la salud han sido

dirigidos principalmente contra enfermedades infecciosas, pero debido al control epidemiológico

progresivo y uso de antibióticos, la esperanza de vida se ha incrementado en forma considerable, con la

consiguiente disminución de enfermedades.

En el presente trabajo ampliaremos a fondo respecto a las estrategias actualmente utilizadas para el

diagnóstico de enfermedades, los tratamientos genéticos seguidos como el uso de proteínas

recombinantes, y la aplicación de la tecnología de las células madre en el tratamiento y prevención de

enfermedades genéticas

Palabras clave: Métodos de detección de mutaciones, Aplicación del ligamiento al diagnóstico, Tratamiento

genético de las enfermedades, Proteínas recombinantes, Células madre

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Estrategias generales de diagnóstico de enfermedades

Métodos de detección de mutaciones

Método de barrido

SSCP (single strand conformation polymorphism, Polimorfismo de la conformación de las

cadenas simples)

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante)

DHPLC (Denaturing HPLC)

Rotura de desemparejamiento (Mismatch cleavage)

PPT (Protein Truncation Test, Prueba de truncamiento de proteínas)

Secuenciación

Métodos de comprobación

PCR – digestión

ASO (Allele Specific Oligonucleotide, Oligonucleótido específico de alelo)

ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

OLA (Oligonucelotide Ligation Assay, Ensayo de ligación de oligonucleótidos)

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Métodos de barrido

SSCP (single strand conformation polymorphism, Polimorfismo de la conformación de las cadenas

simples)1

En la búsqueda de mutaciones puntuales, se emplean métodos como el secuenciamiento directo,

RFLPs (Southern, 1975), clivaje químico,CCM (Cotton et al., 1988), clivaje por RNAsa (Goldrick et al.,

1996) u oligonucleótidos alelo específicos para hibridación (ASO) (Nollau & Wagener, 1997), entre

otros. Estos métodos presentan diferentes rangos de sensibilidad, además de requerir reactivos y

equipos sofisticados, que aumentan su complejidad y costo operativo.

Frente a ellos, el método de SSCP es fácil y económico, pues usa segmentos amplificados por PCR

visualizados en geles de acrilamida con adyuvantes (Orita et al., 1989).

El SSCP es un método capaz de identificar la variación de un sólo nucleótido en un segmento de

ADN, típicamente entre 150 a 200 nucleótidos de largo. En condiciones ideales el rango de

sensibilidad del SSCP varía entre 8090% para detectar mutaciones en fragmentos menores de 200

pares de bases (Sheffield et al., 1993). El método del SSCP se basa en que bajo condiciones no

desnaturalizantes una hebra individual de ADN adopta una conformación espacial que es específica

de la composición de su secuencia nucleotídica (Fig. 1).

Esta conformación sería dependiente de la hibridación entre distintas regiones de un segmento de

ADN replegado sobre sí mismo. La configuración diferente es provocada por el cambio de una sola

base, entonces podría ser detectada en algunas condiciones de migración electroforética en una

matriz de poliacrilamida (Orita et al., 1989, Humphries et al., 1997).

La técnica es simple, versátil y económica, pero exige la optimización de parámetros en la

composición del gel para cada fragmento a evaluar

1 Alejandro Estrada-Cuzcano, José Sandoval, María L. Guevara-Fujita y Ricardo Fujita. Uso de la técnica SSCP para detectar mutaciones puntuales del ADNmitocondrial humano

5

Figura 1. Representación esquemática del

fundamento de la técnica de SSCP durante la

electroforesis en un gel no desnaturalizante.

La movilidad electroforética de cada

fragmento depende del auto plegamiento de

acuerdo a la formación de estructuras

secundarias.

Procedimiento

El analisis de SSCP puede realizarse con la amplificacion por PCR para analizar pequeñas regiones

amplificadas directamente del DNA genomico o del cDNA.Para ello se sintetizan dos

oligonucleotidos cebadores que flanquean (con sentido y antisentido)la region de interes y el DNA

se amplifica por PCR en presencia de nucleotidos marcados radiactivamente.El producto de la PCR,

un DNA de doble hebra marcado, se desnaturaliza por calor en presencia de formamida al 80% e

inmediatamente se procede a sus analisis a traves de elctroforesis en un gel de poliacrilamida no

desnaturalizante .Durante esta los fragmentos de ADN de cadena sencilla se pliegan en una forma

tridimensional de acuerdo a su secuencia.La separacion depende,por tanto,de la forma de las

moleculas de cadena sencilla. Las movilidades de los productos de los pacientes se comparan con las

de los controles a partir de sujetos normales,pues si los productos normal y mutante difieren en

algun nucleotido adoptaran estructuras tridimensionales diferentes y mostraran distintas

movilidades electroforetica.

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La conformación del ADN en el gel puede ser alterado por una serie de condiciones que tienen que

ser optimizado para detectar la mutación. Estas variables incluyen:

Propiedades y tamaño de los poros del gel, estos se determinan por el porcentaje de

poliacrilamida, la relación de acrilamida / bis (cross-linker), y la Temperatura en la que la

polimerización se lleva a cabo, incluyendo la Temperatura de los reactivos.

Presencia y porcentaje de glicerol,este tiene una accion desnaturalizante debil para abrir

parcialmente la estructura del DNA plegado en una mayor superficie para que el gel detecte

cambios conformacionales

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Temperatura ala que se realiza la electroforesis

pH del buffer usado para hacer el gel

pH y fuerza ionica del sitema buffer.

Preparacion de muestras y electroforesis

Gel colorante cargado que contiene formamida impide la renaturalización del DNA de cadena simple

después de la desnaturalización. ADN de doble cadena (dsDNA) se ejecuta con las muestras para

actuar como un marcador y distinguir su banda de los creados por ssDNA

1. Las muestras serán preparadas como siguen en las etiquetas de los tubos

2. Los tubos tienen un límite y se centrifuga durante unos segundos a 4 ° C

3. Las muestras se desnaturalizaron a 95C durante 6 minutos. Esto se puede hacer en un bloque

caliente, pero es más conveniente utilizar un ciclador termal PCR.

4. Para evitar la renaturalización, los tubos son colocados inmediatamente en hielo durante 10

minutos.

5. Centrifugar los tubos de nuevo durante 1 min a 4 ° C, a continuación, inmediatamente vuelve a

poner en el hielo

6. Preparar el ADN de doble cadena simple en un tubo con la etiqueta:

7. Las muestras se cargan en el gel de poliacrilamida con un pico de pato punta de la pipeta

8. El gel se suele ejecutar a 25 W durante aproximadamente 18 horas en 1XTBE. Un simple DNA de

cadena simple de 200 pb tendrá una duración aproximada de tres cuartas partes del camino por el

gel. El poder puede ser modificado para variar el tiempo de ejecución y la separación.

8

Los patrones de bandas de SSCP se pueden detectar mediante el uso de la radiactividad, tinción de

plata o de fluorescencia.

Aplicaciones clinicas frecuentes del SSCP

Esta tecnica puede utilizarse para el diagnostico de gran numero de enfermedades y mutaciones

somaticas.

Aplicaciones clínicas más frecuentes del SSCP

1. Mutaciones somáticas en cáncer

RAS

P53

RB

2. Genes de enfermedades hereditarias

Neurofibromatosis tipo I

Poliposis colónica familiar (APC)

Síndrome de mujer XY

Síndrome de Marfan (gen de fibrilina)

Parálisis periódica hiperkalémica

Tumor de Wilms

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Fibrosis quística

Hipertriglicerdemia

Tay Sachs tipo 1

Fenilcetonuria

Hemofilia B

Raquitismo vitamina D dependiente

Retinitis pigmentosa (gen de rhodopsina)

Peripherin – RDS gen

Enfermedad Pelizaeus – Merzbacher

Polimorfismos y alteraciones alélicas familiares

Desventajas de la técnica SSCP

Las desventajas del método PCR-SSPC son los falsos negativos, que como hemos indicado pueden ocurrir hasta en un 10% de las ocasiones y que no nos permiten estar seguros de que no haya ninguna mutacion en los casos negativos.

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante)

La electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización, también referida como electroforesis en

gel desnaturalizante en gradiente, (en el ámbito científico comúnmente referida por su abreviación

en inglés: DGGE) es una técnica de huella, rastreo o trazado molecular (vulgarmente conocida en

Inglés como molecular fingerprinting) usada en diversas disciplinas de la biología y la química, que

consiste en la separación de cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de

desnaturalización, siendo dicha desnaturalización definida en éste caso como la separación de

cadenas complementarias de ADN

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Procedimiento

DGGE se basa en la moovilidad electroforetica de una molecula de doble cadena a traves de

concentraciones linealmente crecientes de un agente desnaturalizante.El gradiente desnaturalizante

en gel para electroforesis [DGGE] literalmente separa los fragmentos de acuerdo con sus

propiedades desnaturalizantes.En consecuencia,el éxito de DGGE depende de la eleccion cuidadosa

de las condiciones de desnaturalizacion. La foramida y la urea se utilizan sobretodo como agentes

desnaturalizantes,pero el aumento de gradiente de temperatura es usado con frecuencia por

muchos investigadores.

El punto de desnaturalización de tal fragmento de ADN aumentará con el tamaño de la secuencia de

nucleótidos que lo conforman, y también por la composición de nucleótidos de la secuencia, que

suele aumentar con altos contenidos de Guanina (G) y Citosina (C), aumentando la probabilidad en

el incremento de secuencias que lleven consecutivamente G o C. Hay relaciones derivadas de esta

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relación: secuencias ricas en GC tienen, con sus secuencias de bases complementarias,

apareamientos más espontáneos (fenómeno conocido en inglés como Base Stacking) ya que en

estos casos, tienen energía de Gibbs más negativa y por tal motivo aumenta la temperatura mínima

de fundición (o desnaturalización en este caso, conocido en Inglés con la abreviatura Tm) de la

secuencia de ADN. Un DNA doble con un par mal unido se desnaturaliza con mayor rapidez que un

doble unido perfectamente. Si ocurre la desnaturalización, se acompañara por una disminución en la

migración sobre el gel y aparecerá como un alto peso molecular con respecto al control del doble

unido perfectamente. Generalmente se utilizan dos métodos para crear dicho gradiente

desnaturalizante en un gel: por incremento de concentraciones de sustancias desnaturalizantes

dependiendo de la distancia recorrida en el gel, o por incremento de la temperatura a través del

tiempo en que los fragmentos van migrando a través del gel

La tecnica de PCR-DGGE es muy poderosa cuando se aplica para la deteccion de variantes de

nucleotidos para heterocigotos.La desnaturalizacion continua y el realineamiento de moleculas de

cadena simple durante la PCR permiten la formacion de dobles homologos asi como de dobles

heterologos hibridados.La presencia de una simple union mal efectuada en dobles heterologos

disminuye en forma importante su temperatura de fusion y permite la separacion de los dobles

homologos y su facil visualizacion para la deteccion de mutaciones.Con los fragmentos de DNA de

mas de 500 pares de bases ,el DGGE ha sido altamente sensible y detecta el 99% de las secuencias

cambiadas si las condiciones del gel son optimas.La tecnica de exploracion detecta cerca del 50% de

toddos los cambios de bases simples.Aunque este es un campo de desarrollo rapido,la tecnica de

DGGE ha permanecido como la prueba del momento.

Esta tecnica presenta ventajas,pero tambien desventajas con respecto a otras tecnicas.Asi,una sw

las principales ventajas de la DGGE es la posibilidad de identificar los organismos presentes,

mediante el corte y secuenciacion de las bandas que aparecen despues de la elctroforesis,por

tecnicas de hibridacion con sondas especificas,o bien con tecnicas de clonacion,etc.Otra de las

ventajas es la posibilidad de obtener informacion sobre mutuaciones puntuales,ya que el cambio en

un solo nucleotido puedce ser detectado por esta tecnica.

La principal desventaja de esta tecnica es que distintas secuencias pueden migrar hasta el mismo

punto, esto sobre todo es importante cuando se recortan bandas para su secuenciacion ya que

pueden recogerse bandas situadas muy proximas entre si.Otra desventaja es que aunque es capaz

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de identificar mutaciones en una secuencia no da informacion de a que nivel se encuentra la

mutacion ,aunque esta informacion puede obtenerse con la secuenciacion de fragmentos de ADN.

DHPLC (Denaturing HPLC)2

Antes de estudiar el fundamento del DHPLC tenemos que conocer cómo se procesan las muestras

previamente a ser analizadas. Así pues, una vez extraído el ADN, se amplifica el fragmento de gen a

estudiar por medio de una PCR convencional; posteriormente, se realiza una desnaturalización a 95

°C durante tres minutos, seguido de una disminución progresiva de la temperatura de 95 °C a 65 °C

durante 30 minutos, permitiendo así que las hebras renaturalicen lentamente.

Con este proceso se podrán detectar las mutaciones (mismatches) sobre la base de las diferentes

uniones formadas después de la renaturalización entre los fragmentos de gen amplificados, es decir,

al renaturalizar lentamente provocamos que se forme de nuevo la doble hebra de ADN, uniéndose

las hebras exactamente igual que las originales (la doble hebra de ADN wild type “normal”, por una

parte, y la mutada por otra), a las que llamaremos homodúplex, y además provocamos que se unan

combinaciones de las cadenas sentido y antisentido de cada homodúplex, para formar los llamados

heterodúplex.

Así pues, se puede decir que el DHPLC detecta las mutaciones según los diferentes homodúplex y

heterodúplex que se forman del fragmento de gen estudiado. Los heterodúplex, que son

2 A. Pons Castillo, A. Bennani, F. Cañizares Hernández. HPLC desnaturalizante (DHPLC): nuevo método descreening de enfermedades genéticas

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térmicamente menos estables que su correspondiente homodúplex, se separan por cromatografía

líquida de fase reversa, que trabaja en un rango de 50-70. La clave del funcionamiento consiste en

una fase estacionaria inerte física y químicamente, compuesta por partículas de poliestireno-

divinilbenceno de 2-3 μm de diámetro. Dicha fase estacionaria es eléctricamente neutra e

hidrofóbica. El ADN, que posee grupos fosfato, está cargado negativamente y, por lo tanto, no

puede adsorberse a la matriz de la columna por sí mismo. Con el fin de permitir que el ADN se una a

la fase estacionaria, se usa una molécula conocida por el nombre de “reactivo de par-iónico”,

tratándose en este caso del acetato de trietilamonio (TEAA), que posee carga positiva, gracias a los

iones amonio. La carga positiva de los iones amonio del TEAA interacciona con la carga negativa de

los iones fosfato del ADN, mientras que las cadenas alquil del TEAA interaccionan con la superficie

hidrofóbica de la fase estacionaria. Por tanto, las moléculas de doble cadena de ADN se retienen

según su longitud. La elución de las moléculas de ADN se consigue haciendo pasar por la columna

acetonitrilo (solvente orgánico) que será la fase móvil, lo cual resulta en la desorción de los iones

anfifílicos y moléculas de ADN. Dicha elución se percibe en un detector de ultravioleta a una

absorbancia de 254 nm, de tal forma que se elimina el tedioso proceso de teñir geles.

El tiempo de retención de la doble cadena de ADN cambia con la temperatura de la columna. A

temperatura < 50 °C el orden de elución es estrictamente basado en la longitud de la doble cadena

de ADN, en cambio a temperatura > 50 °C las moléculas de DNA se desnaturalizan, separándose en

dos cadenas simples complementarias. La desnaturalización en los heterodúplex es más extensa

que la correspondiente a los homodúplex que tienen las bases perfectamente emparejadas, por

consiguiente, los heterodúplex se retienen menos, eluyendo delante de los homodúplex como uno

o más picos adicionales, dependiendo del número de mutaciones (mismatches) que existen.

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La inestabilidad térmica de los heterodúplex dependerá de los puentes de hidrógeno entre las bases

que están causando la mutación (bases no opuestas), tales como GT y GA, y de la influencia de la

secuencia cercana. En la práctica cualquier cambio en el perfil de elución, incluyendo cambios

sutiles, como la apariencia del frente o un ensanchamiento de un pico, es diagnóstico y permite

establecer la localización y naturaleza de la base o bases alteradas.

Sensibilidad y especificidad en la detección de enfermedades

La temperatura es el parámetro más importante que afecta la sensibilidad del DHPLC en la

detección de mutaciones. Originariamente, la temperatura para el análisis de una secuencia

particular de ADN se determinaba empíricamente, realizando repetidas inyecciones de una muestra

y aumentando gradualmente la temperatura de la columna hasta que los picos empiezan a aparecer

a tiempos de retención más cortos. A partir de este punto, la presencia de mutación o mutaciones

(mismatches) se detecta por la aparición de uno o más picos que eluirán inmediatamente antes que

los homodúplex. Sin embargo, esta forma empírica para determinar la temperatura adecuada de

análisis, corre el riesgo de que los fragmentos ricos en dominios AT, que poseen baja temperatura

de meelting (desnaturalización), no se detecten debido a su completa desnaturalización. Por este

motivo se ha desarrollado un algoritmo, que calcula la temperatura en una secuencia conocida para

que el 50% del fragmento permanezca sin desnaturalizar. Este algoritmo está disponible en la web:

http://insertion.stanford.edu/melt.html.

El primer gen que se analizó por DHPLC fue el gen CACNL1A4, del canal de Calcio. Hasta la fecha se

han analizado más de 100 genes por DHPLC, obteniendo una sensibilidad y especificidad excelente,

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para la detección de pequeñas mutaciones, estando todas ellas documentadas en la literatura

<http://insertion.stanford.edu/pub.html>.

En el análisis para detectar mutaciones en el exón H del gen del factor de coagulación IX (F9) y el

exón 16 del gen tipo 1 de la neurofibromatosis (NF1) se describe una sensibilidad y una especificidad

del cien por cien. Análisis previos del exón H del gen F9 por análisis conformacional de cadena

sencilla (SSCP) detectó únicamente el 50% de las mutaciones.

Se han estudiado más de 180 mutaciones diferentes en los genes de cáncer de mama BRCA1 y

BRCA2 por DHPLC, encontrando 179 perfiles de elución diferentes de las 180 mutaciones existentes.

El estudio del gen BRCA1 identificó en 41 casos, cuatro mutaciones causantes de enfermedad,

mientras que sólo tres de estas cuatro mutaciones se detectaron mediante electroforesis en gel

desnaturalizante (DGGE).

La sensibilidad del análisis conformacional de cadena sencilla (SSCP) disminuye enormemente

cuando se intentan analizar fragmentos más grandes de 300 pares de bases, o en el caso de

mutaciones localizadas dentro de estructuras conformacionales en horquilla.

La sensibilidad del DHPLC se mantiene con tamaños de fragmentos comprendidos entre 150 y 700

pares de bases y, además, no se ha identificado, hasta la fecha, ninguna estructura conformacional

que impida la detección de mutaciones por DHPLC.

En el ADN también nos podemos encontrar dominios en los que existen fragmentos que poseen

diferentes temperaturas meelting. El DHPLC demuestra estar menos afectado que el DGGE al

analizar este tipo de dominios, así pues, el análisis por DHPLC del exón 8 del gen HPRT detectó 20 de

20 mutaciones, independientemente de su localización en cualquiera de los dominios, con

temperaturas que diferían de 65 a 69 °C. En cambio, el análisis por DGGE no detectó mutaciones en

los dominios con mayores temperaturas meelting.

La secuenciación directa está considerada el “estándar oro” en el análisis de mutaciones.

Sin embargo, la secuenciación directa falla en la determinación de alelos mutantes poco frecuentes.

El DHPLC, en contraste, detecta fiablemente alelos mutantes presentes a frecuencias tan bajas como

el 10%. Por tanto, perfiles de heterodúplex que son reproducibles mediante el análisis por DHPLC no

deberían clasificarse de antemano como falsos positivos, si la secuenciación directa falla en

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identificar los mismatch. Por consiguiente, los fragmentos amplificados deben ser clonados, y a

continuación realizar una secuenciación de un número suficiente de clones.

Análisis por desnaturalización completa

El análisis de fragmentos cortos de ADN (50-100 pb) se realiza en el DHPLC bajo condiciones

desnaturalizantes completas. El elevado poder de resolución del sistema de separación permite

discriminar entre dos ácidos nucleicos monocatenarios de idéntico tamaño, con unas diferencias en

la composición que pueden oscilar desde una base a 100 pares de bases.

Análisis multiplex por DHPLC

A diferencia de la electroforesis capilar, el HPLC convencional no se ha podido poner a punto para

analizar muestras en paralelo, usando una batería de columnas. Pero con la reciente introducción de

columnas capilares de poliestireno divinilbenceno, ahora es posible analizar varias muestras en

paralelo. El rendimiento aumenta con el número de columnas usadas en el sistema, y con el número

de muestras analizadas simultáneamente en la misma columna, lo cual es posible por la nueva

tecnología fluorescent color multiplexing.

Los diferentes amplificados por PCR se marcan con fluoroforos diferentes, usando primers

fluorescentes. Las reacciones de PCR se juntan después de haberse desnaturalizado y renaturalizado

por separado, analizándose simultáneamente en una misma columna. La elución de los diferentes

fragmentos se realiza usando un detector que registre las diferentes longitudes de onda

características de los fluoróforos empleados.

Puesto que los fluoróforos afectan al tiempo de retención de los ácidos nucleicos marcados, el

mismo amplificado marcado con diferentes fluoróforos dará diferentes perfiles.

Rotura de desemparejamiento (Mismatch cleavage)

Se produce los heterodúplex ADN:ADN por calor y reacoplamiento y se exponen a una endonucleasa

tras lo cual los fragmentos se analizan por electroforesis en gel. Se ha utilizado las nucleasas de la

haba mung y S1, pero este método es muy dependiente de la secuencia y no detecta muchas

mutaciones.

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EMC con resolvasas de bacteriófagos:Es un método sensible para la detección de mutaciones en

heterodúlplexs de ADN ramificadas. Dos de estas enzimas, la T4 endonucleasa VII (T4E7) y la T7

endonucleasa I, (T7E1) rompen en ADN cerca de los sitios de discordancia de las bases. Los

productos de la rotura pueden ser analizados mediante electroforesis en gel y permite analizar

fragmentos de al menos 1500 bp. el método permite detectar un 95% de las mutaciones y parece

ser más sensible que SSCP en el cribado de algunos genes, como BRCA1215.

Heteroduplexes generados por la desnaturalización de calor de los productos PCR de ADN

polimórfico o de tipo salvaje y mutante alelos, respectivamente, se incuban y troceados por

cualquiera de la T4 YII bacteriófago T7 endonucleasa o fragmentos de ADN se analizan I. por

electroforesis. Tinción de plata deben ser factibles.

Tamaño del Fragmento: Las mutaciones son detectables en los productos de PCR entre 88 y

940 pb o de hasta 1,5 kb.

Límite de detección: No hay estudios sistemáticos sobre la menor proporción de mutantes

para detectar alelos de tipo salvaje se conocen

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PPT (Protein Truncation Test, Prueba de truncamiento de proteínas)

El PTT (protein truncation test) sólo sirve para detectar mutaciones que implican la aparición de un

codón (secuencia de 3 nucleótidos) de fin de la traducción proteica (stop codon). Se realiza una PCR

para amplificación de un gen que codifica para una determinada proteína utilizando iniciadores a los

que se ha añadido secuencias de iniciación para células eucariotas y un promotor T7. Por lo tanto,

los productos de PCR (que contienen estas secuencias) se pueden someter a reacciones de

transcripción-traducción con lo que se consigue péptidos. El tamaño de los péptidos será menor en

el caso de que ADN contenga una mutación que determine la aparición de un codón de fin puesto

que la reacción se detendrá en este punto. El tamaño de los péptidos se determina mediante

electroforesis de los mismos para proteínas (Western blot).

La prueba de truncamiento de proteína (PTT) provee una excepción rara, apuntar a las mutaciones

que generan acortó proteínas, terminación de traducción principalmente prematura. La prueba de

truncamiento de la proteína (PTT) proporciona no un rara excepción, dirigido un las mutaciones que

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generan proteínas acortado, terminación de la traducción, principalmente prematuros. PTT tiene

varias características atractivas, incluyendo precisando el sitio de una mutación, la buena

sensibilidad, una tasa del positivo falso bajo, y, más importante aún, el destacamiento de exclusiva

cercana de mutaciones que causan enfermedad. PTT tiene varias características atractivas,

ferrocarril elevado como señalando sitio de no un mutación, no un buena sensibilidad, no un baja

tasa de falsos positivos, y, más importante aún, la casi exclusiva destacando de mutaciones

causantes de enfermedad. Además, PTT facilitó la detección de un tipo nuevo de mutación,y, un

cambio de secuencia generando una región hipermutable saliendo a la superficie en la RNA.

Además, PTT facilitado la detección de tipo de mutación nueva, es decir, cambio de secuencia de

generación de no un ferrocarril elevado región hipermutables la superficie en ARN. Los problemas

técnicos principales son con los que se guardó relación el hecho que PTT generalmente usa un

blanco RNA, incluyendo las dificultades que provienen de la expresión diferencial potencial y la

estabilidad de los traslados derivativos del presente de dos alelos. Los problemas técnicos

principales se relacionan atraiga con engaño ferrocarril elevado hecho de que PTT generalmente

utiliza objetivo de ARN, incluyendo las dificultades que surgen de la expresión diferencial de

potencial y la estabilidad de los transcritos derivados de los dos alelos presentes. El PTT apenas ha

evolucionado del método originalmente descrito, con multiplexing y proteína terminal a N

etiquetando formando las únicas modificaciones que innova. El ferrocarril elevado del ferrocarril

elevado PTT apenas ha evolucionado desde método descrito originalmente, contra la proteína de la

multiplexación y de terminal a N marcado que forman las únicas modificaciones innovadoras.

Implementar rendimiento específico alto oculta usar a PTT, las mejoras principales del

procedimiento básico serán requeridas. La contra del rendimiento de la contralto Para Implementar

las pantallas de PTT, ferrocarril elevado las grandes mejoras de procedimiento básico se requiere.

Limitaciones

Detección de la mutación por PTT puede ser limitado de dos maneras: 1) el ferrocarril elevado falta

de amplificar alelo mutado y, 2) los deletions/insertions del marco falta de detección muy pequeño

en o mutaciones de mal-sentido supresiones marco inserciones o mutaciones pecan sentido. El

fracaso de amplificación puede tener varias explicaciones incluyendo una mutación de la cartilla

Error de amplificación puede tener varias explicaciones como no un sitio obligatorio mutación de la

cartilla (una secuencia alterada o suprimida), unas inserciones grandes, desplazamientos y unas

inversiones que traspasan largos del amplifiable, o sitio de unión (no un secuencia de alteración o

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borrado), grandes inserciones, duplicaciones translocaciones e inversiones que del vehículo

remolque recubierto más allá de longitudes amplificable, o cuando único o sitios de ambos

imprimador de obligatorio consiste dentro del ferrocarril elevado duplicado del segmento

duplicaciones cuando uno o ambos sitios de unión cartilla se encuentran dentro de segmento

duplicado. Las mutaciones que afectan la cantidad de RNA Las mutaciones que afectan un la

cantidad de ARN producido o que entregue el mRNA mutado sensitivo también no puede ser

ferrocarril elevado detectado producidos o que hacen que ARNm mutado inestable tampoco

pueden ser detectados. PTT no podrá detectar muy parte pequeña hacia adentro no tender una

celada a PTT ferrocarril elevado detectar muy pequeñas dentro de marco deletions/insertions

porque los trajes rectos de movilidad son muy pequeños para detectar a . deleciones / inserciones,

hijo porque los cambios de la movilidad demasiado pequeños para detectarlos. Las mutaciones

Missense no saldrán de mutaciones de cambio de sentido no descubiertos detectada del mar.

Secuenciación

A finales de los años 70 se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y rápida,

determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN. Estos primeros intentos de

secuenciar ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper

las moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia

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a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta relativamente sencillo para proteínas donde

estas resultan de la combinación de hasta 20 aminoácidos distintos, pero constituye un problema en

el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro

nucleótidos diferentes.

Métodos clásicos de secuenciación

Los dos protocolos clásicos de secuenciación (método químico y enzimático) comparten etapas

comunes.

Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente

Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos

tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas de distintas longitudes pueden

separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea,

donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud varía en un único nucleótido.

Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:

Método químico de Maxam y Gilbert

Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.

Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente

con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas

cuatro reacciones se resuelven, por electroforésis, en función de su tamaño en geles de

poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas

obtenidas.

Un fragmento de ADN se marca radiactivamente en sus extremos con gamma 32P ó gamma 32S

dATP por acción de la polinucleótido quinasa. La técnica consiste en romper estas moléculas

marcadas con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Cuatro

alícuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas, posteriormente el

tratamiento con piperidina rompe la molécula de ADN a nivel de la base modificada. Los

productos de estas cuatro reacciones se resuelven en función de su tamaño en geles de

poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas

obtenidas. Esta técnica permite la lectura de unas 100 bases de secuencia.

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Método enzimático de Sanger

Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en

1977 y se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi.

Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador,

cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a

iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que

va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Se diseña un oligonucleótido sintético de unos 17-20 bases complementario de la cadena de

ADN que se quiere secuenciar y situado a unos 20-30 bases de distancia del comienzo de la

23

secuencia que se quiere leer. Si este oligo se diseña fuera de la región de clonaje de los

plásmidos podrá emplearse el mismo oligo para secuenciar distintos insertos.

El dúplex formado entre el oligo y el ADN complementario de cadena sencilla se convierte en

sustrato de la ADN polimerasa I que va a extender la cadena desde grupo OH libre del extremo 3

´ del oligo, incorporando dNTPs y copiando el molde de ADN al sintetizar la cadena

complementaria. Como enzima se emplea el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I que

carece de actividad exonucleasa 5´- 3. También pueden emplearse otras polimerasas como la

Taq polimerasa o la polimerasa del fago T7.

Durante la secuenciación se llevan a cabo cuatro reacciones de síntesis separadas incluyendo en

cada una de ellas pequeñas cantidades de los dideoxinucleótidos (ddNTP: ddGTP; ddATP, ddCTP,

ddTTP) que carecen de extremo 3´ OH libre y que al incorporarse en la cadena de ADN que se

esta sintetizando acaban con la elongación de la misma.

La incorporación al azar de un ddNTP en competición con el dNTP correspondiente, implica la

formación de una mezcla de cadenas de distintas longitudes, todas ellas empezando en el

extremo 5´ y acabando en todas las diferentes posiciones posibles donde un ddNTP puede

incorporarse en lugar de un dNTP. El promedio de longitud de las cadenas puede alterarse

modificando la relación dNTP/ddNTP en la mezcla de reacción. Por ejemplo, aumentando la

concentración de ddNTP aumenta el número de cadenas de pequeña longitud al aumentar la

frecuencia de incorporación de este tipo de nucleótidos.

La sustitución de uno de los dNTPs por el mismo nucleótido marcado radiactivamente permite la

visualización de las bandas de distinta longitud en un gel de poliacrilamida donde cada una de

las reacciones se carga en un carril. En el gel la separación de las distintas bandas se produce en

función de su tamaño y la secuencia puede determinarse leyendo las bandas de los cuatro

carriles. En este tipo de geles pueden leerse hasta 300 bases. En carreras más largas la lectura

puede llegar a ser de hasta 500 bases.

24

Secuenciación automática empleando el metodo enzimático

Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores

con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los productos de la reacción

se detectan directamente durante la electroforésis al pasar por delante de un láser que al

excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida.

Secuenciación empleando cebadores fluorescentes

Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el

oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente

en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo.

25

Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el

oligonucleótido marcado en 5´ con una sonda fluorescente distinta, junto con la polimerasa, los

dNTPs y el ddNTP correspondiente. Las sondas empleadas son:

para A ---> JOE. Emisión: verde. Derivado de fluoresceína

para C ---> FAM. Emisión: azul. Derivado de fluoresceína

para G --> TAMRA. Emisión: amarillo. Derivado de rodamina

para T --> ROX. Emisión: rojo. Derivado de rodamina

Durante la electroforésis las bandas del ADN de cadena sencilla pasan a través de un láser de

argón que excita las sondas fluorescentes, la señal de emisión de fluorescencia, una vez

amplificada, es detectada a través de un filtro y asignada a la base correspondiente

Secuenciación empleando terminadores fluorescentes

Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos

marcados con una sonda fluorescente distinta.

26

De modo alternativo, la secuenciación puede llevarse a cabo empleando terminadores marcados

cada uno con un fluoróforo diferente. Esta química es más sencilla porque permite llevar a cabo

la reacción en un solo tubo, en que se añaden los cuatro terminadores marcados.

Secuenciadores automáticos

Secuenciadores automáticos capilares

Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema

basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un

polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de

secuenciación; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza

para lecturas no superiores a unos 450pb.

El equipo funciona de forma completamente automática inyectando las muestras (que se

preparan exactamente igual que durante la secuenciación en geles y se colocan en una placa de

96 pocillos), en un capilar previamente cargado con un cierto polímero que funciona como lo

27

hace la matriz de acrilamida: bisacrilamida:urea de los geles de secuencia, permitiendo resolver

fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian en una única base.

A una altura determinada el laser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de

ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la secuencia correspondiente. Una

vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se vacía rellenándose

nuevamente con polímero fresco: Se inyecta a continuación una segunda muestra, se procede a

desarrollar nuevamente la electroforesis y así sucesivamente.

28

Las principales ventajas de estos nuevos equipos son:

Automatización completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia

de un técnico que cargue las muestras en los diferentes capilares del equipo.

Rapidez en el analisis de cada muestra: dado el pequeño diámetro de los capilares, se

pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de acrilamida:bisacrilamida:urea, por

lo que pueden leerse del orden de 450 nucleotidos en el plazo de una hora mientras que

esta misma longitud de secuencia necesita unas 2-4 horas en un secuenciador en gel.

El tiempo necesario del proceso es. para la polimerizacion del mismo, unas dos horas y

para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.

Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida

La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel

de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que

sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplará en el secuenciador

automático para proceder a la carga de la muestras

Secuenciación automática mediante

geles desnaturalizantes, se realiza

polimerizando un gel de acrilamida/bis

entre dos cristales montados

adecuadamente sobre el cassette que

sirve de soporte para los mismos y que

posteriormente se acopla en el

secuenciador automático para proceder

a la carga de la muestras.

El número de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el número de

pocillos que posee el peine ( de dientes de tiburón) que utilicemos. Hay peines de cuatro

tamaños distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos.

La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de unos 700pb

aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN, de la correcta cuantificación del

mismo, de la utilización del primer adecuado, y de la polimerización correcta del gel de

acrilamida/bis principalmente.

29

Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb, podemos disminuir

el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la velocidad de barrido del laser, y el

resultado es igualmente optimo.

Otros métodos de secuenciación automática

Secuenciación de ADN empleando microarrays

Los microarrays constituyen la última línea de técnicas basadas en la interacción de cadenas

complementarias de ADN. Este tipo de técnicas introducen básicamente dos nuevas

innovaciones: el empleo de soportes sólidos no porosos tales como cristal que facilitan la

miniaturización y la detección basada en fluorescencia y el desarrollo de métodos de síntesis in

situ de oligonucleótidos a altas densidades sobre el soporte sólido.

Principio:

Existen muchas variedades de microarrays o ADN-chips como también se les denomina. Desde

los microarrays "artesanales" realizados en el laboratorio a los ofrecidos por compañías de

biotecnología, el principio que rige su diseño es el mismo: la complementariedad de las cadenas

aisladas de ADN: o propiedad de las citadas cadenas de hibridarse con otras cadenas aisladas de

ADN que posean una estructura complementaria.

Básicamente un microarray consiste en una matriz de "pocillos" microminiaturizados sobre un

substrato de vidrio en donde se implantan, utilizando diversas técnicas, cadenas simples de

oligonucleótidos. El poder adherir una cadena corta de oligo sobre una superficie plana es

decisivo en el diseño de los microarrays.

(Molecular interactions on microarrays)

En la figura se muestran esquemáticamente unas pocas celdas de un microarray. En cada celda,

adherida por uno de sus extremos, existe una determinada cadena de oligonucleótido. (Zona

inferior izquierda de la imagen) Si se pone el microarray en contacto con una mezcla de cadenas

30

simples de ADN a identificar, marcadas fluorescentemente, (zona superior izquierda) éstas se

hibridarán con su oligo complementario. (zona derecha).

Dado que conocemos la secuencia y distribución de los oligonucleótidos en el microarray

podemos, al excitar el microarrray con un laser y estar las cadenas hibridadas

fluorescentemente, conocer la ubicación de las cadenas de las mismas y su secuencia.

Visualización típica de una secuenciación

mediante microarrays

Fabricación:

En la fabricación de microarrays se emplean técnicas fotolitográficas análogas a las utilizadas en

microelectrónica. Un sustrato de vidrio se trata químicamente con determinados grupos

reactivos para permitir la implantación de los oligonucleótidos sobre el mismo; a continuación

se deposita sobre el substrato una película fotodegradable y mediante la utilización de una

plantilla y un haz luminoso, se crea la estructuura de celdas del microarray.

Fabricación de las celdas del microarray

Existen dos técnicas para para acoplar los oligos a cada una de las celdas.

31

Implantar en cada celda, mediante un brazo robotizado, el oligonucleótido

presintetizado que corresponda.

Sintetizar en las propias celdas, mediante ciclos sucesivos de síntesis, los

oligonucleótidos correspondientes.

El proceso de síntesis "in situ" de los nucleótidos en el microarray se realiza en las siguientes

fases:

Elaboración previa de un mapa de distribución del tipo de oligonucleótido

correspondiente a cada celda del microarray.

Preparación del sustrato y deposición de una película fotodegradable. (1)

Aplicación de una máscara que permita eliminar selectivamente la película protectora

en las zonas del microarray correspondiente a un determinado nucleótido. (2 y 3)

Incubación química y acoplamiento del nucleótido previsto (4).

Una nueva capa fotodegradable es aplicada sobre el microarray (5)

Se repiten los pasos anteriores para cada nucleótido hasta obtener la secuencia prevista

Se elimina definitivamente la película fotodegradable (10).

Pirosecuenciación

32

Se trata de un método simple y consistente, útil para la secuenciación de fragmentos de ADN de

tamaños pequeños o medianos

Etapas del proceso:

Un cebador específico se une a una cadena de ADN sencilla en presencia de dNTPS, ADN

polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa así como de los sustratos APS

(adenosina 5 fosfosulfato) y luciferina.

El primero de los cuatro dNTPs se añade a la reacción. La ADN polimerasa cataliza su

incorporación a la cadena; si este dNTP es complementario de la secuencia del ADN

molde se libera PPi en una cantidad equimolar a la cantidad de nucleótido incorporado.

La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el Ppi en ATP en presencia de APS. Este

ATP media la conversión de luciferina en oxiluciferina por parte de la luciferasa,

produciéndose luz visible en intensidad proporcional a la cantidad de ATP. Esta luz es

detectada por una cámara CCD y se visualiza en el pirograma como un pico, siendo la

altura del pico proporcional al número de nucleótidos incorporados.

La apirasa degrada de forma continúa tanto el ATP como los dNTPs no incorporados

apagando de esta forma la emisión de luz y regenerando las condiciones para que pueda

ser añadido un nuevo nucleótido en la reacción.

33

La adición de nucleótidos ocurre de uno en uno. Se sustituye el dATP por dATPalfaS

porque este sustrato es reconocido eficientemente por la ADN polimerasa pero no por

la luciferasa.

Aplicaciones de la secuenciación de ADN

Detección de mutaciones

Secuenciación de ADNs fósiles

Diagnóstico de enfermedades genéticas

Identificación de especies y control de cruces entre animales

Proyecto genoma humano

34

Métodos de comprobación

PCR – digestión

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, o PCR.

Esta técnica ha invadido de tal forma la Biología Molecular, que hoy en día es muy difícil imaginar

esta ciencia sin ella. En 1989, Science seleccionó el PCR como el principal desarrollo científico, y la

Taq polimerasa como la molécula del año. En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento el

Premio Nobel de Química.

Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no es una limitación en la investigación en

Biología Molecular, ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio del ADN. Una de

sus posibles aplicaciones se centra en la secuenciación del ADN de muestras biológicas.

Procedimiento:

Las bases teóricas de la reacción de PCR son simples. En la reacción intervienen tres segmentos de

ADN: el segmento de doble cadena que queremos amplificar, y dos pequeños fragmentos de cadena

sencilla, los oligonucleótidos (primers), que tienen la misma secuencia que los extremos

flanqueantes del ADN molde. Además, participan en la reacción la enzima Taq polimerasa (Taq),

deoxinucleótidos-trifosfato (dNTPs), sales, y un tampón.

Los primers se añaden a la reacción en exceso con respecto al ADN que desea amplificarse. Los

primers hibridarán con las regiones complementarias del ADN, quedando orientados con sus

extremos 3´ enfrentados, de modo que la síntesis mediante la ADN polimerasa (que cataliza el

crecimiento de nuevas cadenas 5´-> 3´) se extiende a lo largo del segmento de ADN que queda entre

ellas.

El primer ciclo de síntesis producirá nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su vez,

son capaces de hibridar con los primers. Este tipo de productos se irá acumulando de forma

geométrica, con cada ciclo de síntesis, utilizando como moldes las moléculas de ADN parental de la

reacción.

35

Durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a su vez como moldes,

generándose en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del fragmento que engloba los extremos

de ambos primers. Estas nuevas cadenas hijas servirán de molde a su vez para sucesivos ciclos de

síntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulando de

forma exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrán aparecido 270 millones de estas moléculas, por cada

una de ADN original que hubiese.

El primer paso necesario en este proceso de la síntesis es la desnaturalización del ADN. Puesto que

el molde es una molécula de ADN de doble cadena, será necesaria la separación de estas para que

los primers puedan acceder a sus secuencias complementarias y unirse a ellas en el siguiente paso,

llamado de alineamiento ("annealing"). Una vez que los primers se han unido a las cadenas, sirven

como cebadores para la acción de la ADN polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos

nuevas cadenas de ADN complementarias, en el proceso de elongación. Estos tres pasos

consecutivos (desnaturalización, alineamiento y elongación) constituyen un ciclo de síntesis.

Para las reacciones de PCR de secuenciación se ha diseñado una Taq polimerasa especifica, Taq FS

(fluorescente sequencing), a partir de la Taq polimerasa de Thermus aquaticus y modificada

genéticamente de forma que posee muy baja actividad exonucleasa 5´->3´ con lo que los resultados

son más limpios con menos ruido de fondo y apenas falsas terminaciones. Además este enzima

incorpora los ddNTPs marcados fluorescentemente más eficientemente, con lo cual son necesarios

menos ddNTPs-fluorescentes y menos ADN molde para conseguir la misma señal.

En los últimos años, también se ha avanzado notablemente en la obtención de sondas fluorescentes

cuyos espectros de emisión de fluorescencia presentan un mínimo solapamiento.

36

ASO (Allele Specific Oligonucleotide, Oligonucleótido específico de alelo)

PCR-ASO: Hibridación con oligonucleótidos aleloespecíficos

Esta técnica es la más utilizada hoy en día para el tipaje de especificidades HLA. Como se describe en

los graficos, el gen DQB de cada individuo a estudiar se amplifica por PCR, con el fin de tener

material suficiente de ese gen. Para ello, se utilizan cebadores o primers que corresponden a una

región conservada del gen DQB (aquella zona de un gen que tiene la misma secuencia en todos los

alelos) de manera que se asegura la amplificación de cualquiera de los alelos. El ADN amplificado se

deposita, en formato dot blot, sobre una membrana de nylon, para su hibridación con sondas

marcadas. En el caso del gen DQB, el ADN amplificado de cada individuo se reparte en 20

membranas (igual al número de sondas que se van a utilizar) . Cada una de estas membranas, en la

que se puede depositar ADN de hasta 96 individuos, se incuba con una de las sondas ASO

37

(oligonucleótidos correspondientes a regiones polimórficas -variables-) del gen DQB, de forma que

se hibridarán al ADN depositado en la membrana solo si esa variante polimórfica está presente. Una

vez reveladas todas las pruebas, se analizan los resultados; la combinación de sondas para las que

una muestra hibrida positivamente nos dará los dos alelos presentes en ese ADN genómico. La

mayor ventaja de esta técnica estriba en la posibilidad de tipar en poco tiempo un gran número de

muestras. No obstante, debido a un cierto nivel de reacción cruzada que existe entre las diferentes

sondas ASO, la interpretación de los resultados no es siempre sencilla, y se precisa de personal

experimentado en el HLA. Se están identificando nuevos tipos y subtipos continuamente, de forma

que la cantidad de sondas a utilizar y la complejidad del análisis es cada vez mayor, hasta el punto

de que existen equipos informáticos capaces de asignar los “subtipos más probables” a partir de los

resultados del dot blot.

38

ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

Introducción

La técnica de PCR se puede adaptar de muchas maneras para facilitar el análisis de ADN. Diferentes

tipos de estrategias se utilizan para la detección de mutaciones puntuales. Los métodos actuales se

basan en la amplificación de destino, por lo general por PCR, seguida de la identificación de

variantes de ADN con sondas, enzimas de restricción, ligasas y polimerasas. En ARMS, el par de

primer está diseñado para que uno de los extremos 3’ coincida con una variante de nucleótidos en la

secuencia de destino.3

Cuando el primer no corresponde a la plantilla de la frecuencia, la extensión es muy baja y por lo

tanto el número efectivo de copias disponibles para la amplificación de la secuencia se reduce

considerablemente. ARMAS-PCR aprovecha una polimerasa termoestable que carece de actividad

exonucleasa 3’ (por lo general Taq polimerasa). Estas enzimas extienden primers obligados a su

objetivo de secuencias, que es muy ineficiente cuando la base 3 'no coincide. Debido a la actividad 3

'exonucleasa, necesario para la reparación de errores no está presente, la extensión de los

cebadores en la PCR es un evento raro y la amplificación se retrasa. Sin embargo, una vez que una

extensión de desajuste se ha producido, la amplificación procede, normalmente, de la línea de meta

de nueva síntesis.

El sistema de amplificación de mutación-refractario (ARMS) es un método simple para detectar

cualquier mutación que impliquen cambios en una sola base o pequeñas deleciones. ARMS se basa

en el uso secuencias específicas de cebadores de PCR que permite la amplificación de ADN de

prueba sólo cuando el alelo de destino se encuentra dentro de la muestra. Después de una reacción

ARMS, la presencia o ausencia de un producto de PCR es diagnóstico para detectar la presencia o

ausencia del alelo de destino.

El protocolo básico describe el desarrollo y la aplicación de una prueba de ARMS para una sola

mutación, el protocolo alterno extiende esto un para el análisis de dos o más mutaciones. El

soporte de protocolo describe un método rápido de extracción de ADN de muestras de sangre o el

enjuague bucal que produce ADN compatibles con el tipo de pruebas del sistema descrito. ARMS es

un método simple para detectar cualquier mutación que implicara cambios en una sola base. Por

3 http://www.currentprotocols.com/protocol/hg0908

39

tanto ARMS es un método simple para detectar cualquier mutación que implicaran cambios en una

sola base

El sistema de amplificación mutación refractarios (ARMS), que también ha sido descrita como un

PCR alelo-específico (ASP) y la amplificación por PCR de alelos específicos (PASA), es un método

basado en PCR para detectar mutaciones de una sola base. ARMS se ha aplicado con éxito para el

análisis de una amplia gama de polimorfismos, mutaciones de línea germinal y mutaciones

somáticas. La técnica tiene la capacidad de discriminar bajos niveles de “secuencias mutante” en un

fondo de ADN de difícil manejo. En una PCR- ARMS el nucleótido ubicado en el extremo 3' terminal

de uno de los cebadores de PCR coincide con la mutación de destino. La mayoría de las aplicaciones

del método de análisis se basan en "punto final", utilizando el método clásico de gel de

electroforesis. Sin embargo, en este tipo de análisis sólo se puede evaluar la presencia o ausencia de

secuencias mutantes o de tipo poco manejable y no da una indicación de la proporción de

secuencias mutantes de este tipo en una población mixta de ADN. Aquí se describe una adaptación

de la PCR en tiempo real de ARMS, ARMS cuantitativa, que permite la medición del tamaño de la

población de cada variante en una mezcla. Un método para la detección de mutaciones humanas

del virus de la hepatitis B que confiere resistencia a los antivirales.

Así, un importante principio de las ARMS es que no se emparejen (es decir, no se unan sólo en el

extremo 3 'de un cebador) plantilla puede ser amplificado. Los factores que contribuyen a este

aparente «fracaso» de ARMS es que cuando un número muy elevado de moléculas de plantilla se

añaden a la reacción, la amplificación es probable que continúe porque la pequeña proporción de

las extensiones de primer no coincidentes, alcanzan el umbral de sensibilidad de la reacción. En

segundo lugar, ciertos no coincidentes estén extendidos más eficientemente que los otros, por tanto

esas extensiones extendidas en cada ciclo de PCR varia.

40

Ilustración esquemática de ARMS

ARMS para el diagnóstico prenatal y la Fibrosis Quística

ARMS se ha aplicado al diagnóstico prenatal y la detección de portadores de fibrosis quística. Se ha

determinado la secuencia de nucleótidos de los dos alelos del polimorfismo de la restricción de

longitud de los fragmentos en el locus KM19, que muestra el desequilibrio de ligamiento con fibrosis

quística. ARMS permite el análisis directo de los alelos de este polimorfismo en el ADN aislado de la

biopsia de vellosidades coriónicas o células blancas de la sangre.

HFE genotipificación por ARMS y desnaturalización HPLC

La Hemocromatosis hereditaria (HC) es una de las enfermedades genéticas más frecuentes en

poblaciones caucásicas [prevalencia de hasta 1 en 300 en el norte de Europa, con una frecuencia

portadora estimada de 1 de cada 10]. Causado por un aumento progresivo de hierro, se caracteriza

por complicaciones graves y una progresión potencialmente letal que puede ser totalmente

prevenida con la remoción regular del hierro por medio de la sangre. La disponibilidad de un

tratamiento preventivo eficaz destaca el valor de la detección temprana. El descubrimiento del gen

HFE por Feder y otros, ha dado una prueba genética para el riesgo de la enfermedad. Dos

mutaciones C282Y y H63D, situadas respectivamente en los exones 4 y 2, la alteración de la función

41

HFE probados para, junto con una tercera variante que se encuentra en el exón 2. Dos genotipos

(homocigotos C282Y y heterocigotos compuestos C282Y/H63D) se asocian con el riesgo de HC

Debido a que muchos podrían beneficiarse de las pruebas, numerosos métodos han sido descritos,

además de los ensayos convencionales de PCR de restricción. Métodos descritos incluyen PCR en

tiempo real con sondas fluorescentes, ensayo convencional de restricción de PCR con el uso de HPLC

o la electroforesis capilar para resolver los fragmentos de restricción, los productos de PCR alelo-

específicas resueltos en geles de losa o por electroforesis capilar, y seguido por un paso de

extensión de un solo nucleótido la detección de electro quimioluminiscencia, o ensayo de

hibridación reversa.

Desnaturalización HPLC (DHPLC) es un nuevo método para la detección de polimorfismo de

nucleótido único, que ha sido eficaz en términos de costo por análisis, sensibilidad y especificidad.

Sin embargo, una limitación de (DHPLC es que en la mayoría de los casos apenas se diferencia de los

genotipos homocigotos mutantes homocigotos de tipo poco manejable, y por lo tanto, no se

recomienda para enfermedades que se caracterizan por un alta prevalencia de algunas mutaciones.

DHPLC fue utilizado con éxito para detectar pacientes con heterocigosis a C282Y y H63D, pero la

detección de los pacientes homocigotos requiere un doble análisis: el primero utilizando con la

muestra sola y luego un segunda PCR en el que se mezcla la muestra con un control de tipo poco

manejable para revelar pacientes homocigotos con mutaciones. Se ha diseñado un método que

utiliza un ARMS múltiple PCR y DHPLC (ARMS-DHPLC) para la determinación del genotipo HFE en un

procedimiento de dos pasos

Se utilizaron muestras de EDTA de sangre obtenidas de pacientes con exceso de hierro o familiares

que se refiere a nosotros para la determinación del genotipo HFE. El ADN se extrajo con fenol-

cloroformo, y los genotipos HFE se determinaron mediante ensayos de PCR de restricción Rsa I

(C282Y), HPH I (H63D), y HinfI (S65C).

Para cada (C282Y y (H63D), se diseñó un conjunto de primers, dos específicos para los alelos de tipo

poco manejable y con mutaciones y una tercera común. Para cada conjunto, la cartilla específica

para el alelo con mutaciones portada a 12 pb 5‘ de la cola. Para aumentar la especificidad de la

cartilla r-Y282, se introdujo se diseñó un desfase cercano al extremo 3'. Cebadores fueron

seleccionados y se calcula la compatibilidad en la técnica de PCR utilizando un software. Igualdad de

42

eficiencia de amplificación de cada conjunto logró mediante el ajuste de la concentración de cada

cebador.

El método de ARMS DHPLC combina el tamaño. Las propiedades de detección de la conformación

del ADN y la detección de las propiedades de DHPLC, lo que permite genotipo HFE rápido y fiable.

Las características principales de este método son que hace uso de una sola reacción básica de PCR

con patrón estándar de pH y la ADN polimerasa, primers regulares (es decir, sin marcaje

fluorescente o modificación de terminales), tubos estándar de PCR, sin etapas de reacción más o

manipulación, y 260 nm ADN de medida de absorción. Esto debería compararse con las limitaciones

técnicas en tiempo real de métodos de fluorescencia de PCR y otros métodos

Los ARMS DHPLC ensayos son altamente automatizados, de dos pasos método de determinación del

genotipo. Aplicada a la determinación del genotipo HFE, que da resultados sin ambigüedades de las

dos mutaciones más frecuentes asociadas HC (C282Y y (H63D), y es capaz de detectar otras

mutaciones en los productos de amplificado sin pérdida de precisión para las dos principales

mutaciones, como se muestra para la menos frecuente (S65C y la rara mutación E277K).

Una característica de HC es que en número sustancial de pacientes el típico fenotipo de HC,

genotipo HFE convencionales es decir, la rara mutación de detección de la conformación del de las

tres mutaciones más frecuentes, detecta una sola o ninguna mutación. Esta peculiaridad le pide

revisión exhaustiva de la secuencia del gen HFE para identificar mutaciones. Esto permitiría la

identificación de pacientes con exceso de hierro en los que la HFE no está implicada en la

enfermedad.

43

Determinación de haplotipos usando doble ARMS. La figura ilustra el doble haplotipo

de un individuo que es heterocigotos en ambos sitios polimórficos 1 y 2. a, b, c, y d son

las bases complementarias que corresponde a A, B, C y D, respectivamente. El objeto del

doble análisis de ARMS es determinar si el alelo A está relacionado con el alelo B o el

alelo A está relacionado con el alelo D. Este problema se puede resolver con relativa

facilidad utilizando ARMAS por llevar a cabo la amplificación mediante ARMS ARMS-A y-

B. Si un producto se observa ampliado, a continuación, el alelo A está relacionado con el

alelo B en el mismo cromosoma. La PCR confirmatoria segundo puede llevarse a cabo

utilizando armas A y ARMS-d, que debe ser negativa. Para un análisis más detallado del

número de reacciones de ARMS para resolver los haplotipos

44

OLA (Oligonucelotide Ligation Assay, Ensayo de ligación de oligonucleótidos)

Es un método rápido, sensible y específico para la detección de polimorfismos conocido un solo

nucleótido (SNPs). Este método se basa en la unión de dos sondas de oligonucleótidos adyacentes

utilizando una ligasa de ADN.4

En esta técnica se utilizan dos pares de iniciadores ,complementarios a lugares donde puede haber

mutaciones o polimorfismos en el ADN a estudio, de modo que estos iniciadores se acoplen con el

ADN quedando consecutivos ,es decir, que el extremo 3’ del primero se continúe con el extremo 5’

del segundo.

Cuando no hay mutación los iniciadores se colocan consecutivos y se puede ligar por la acción de

una ligasa tras lo cual es posible amplificar el ADN con PCR, pero si hay mutación los fragmentos no

se acoplan 100% al ADN muestra y no están consecutivos, por lo tanto la ligasa no puede unirlos.

La ligasa sella el corte creado entre 2 sondas adyacentes si hay una perfecta unión alrededor de él.

La ligación de bases mal apareadas es fuertemente desfavorable. La ligasa T4 puede hacer una

discriminación 5 veces mayor cuando el mal emparejamiento esta en el extremo 3’ de las sonda

aguas arriba que cuando está en la base 5’ terminal aguas abajo. El análisis de mutaciones

puntuales normalmente se lleva a cabo estableciendo la reacción OLA con 2 sondas alélicas

competidoras que ligadan en una sonda común solo si son perfectamente complementarias al

DNA blanco.

Esta técnica se ha usado para la discriminación alélica de mutaciones puntuales en la fibrosis

cística, b-globina, a-antitripsina, y genes de la 21-hidroxilasa.

4 Ana Alonso Pacho, José Sabán Ruiz. Control global del riesgo cardiometabólico. Ediciones Díaz de Santos, 2009. Pág. 205

45

Esquema del procedimiento del Ensayo de Ligación de Oligonucleótidos (OLA)

Un avance posterior, la reacción OLA múltiple, requiere balances de Tm's de todas las sondas para

que todas las reacciones puedan producirse bajo las mismas condiciones de tampón y temperatura.

Se consigue balancear la señal gracias al ajuste de la concentración relativa de cada set de sondas.

Sometiendo las sondas a ciclos que varían entre una gran temperatura de desnaturalización y una

baja temperatura a la que puedan anillar y ligar se promueven múltiples oportunidades para que

cada una pueda encontrar su complementaria perfecta. Esta técnica produce amplificación lineal de

la señal OLA y se llama reacción de detección de la ligasa (LDR). Tanto la OLA múltiple como la LDR

múltiple, necesita un ensayo para diferenciar unos productos OLA de otros. Este puede realizarse

utilizando diferentes marcajes para cada set de sondas OLA o usando diferentes ganchos. Si se

utiliza una captura en fase sólida para análisis de productos OLA suele emplearse el mismo gancho

46

para capturar los productos y detectar marcas diferentes. Esas marcas pueden ser diferentes

haptenos que se unan a diferentes anticuerpos o pueden ser moléculas directamente detectables

como tintes fluorescentes. La variación de los ganchos se suele usar cuando el análisis de productos

de OLA se realiza con electroforesis. En este caso se sintetiza una sonda de cada par con una cola de

nucleótidos no complementarios (tales como poli-A de diferentes tamaños), sin nucleótidos, o con

colas modificadoras de movilidad (Como colas de varias longitudes de oxido de hexaetileno). Cada

producto de OLA tendrá un único tamaño. Mediante combinaciones de ganchos y etiquetas se ha

creado un OLA múltiple con 60 alelos para mutaciones en el gen regulador transmembranal de la

fibrosis cística.5

Sondas de DNA: Pueden sintetizarse utilizando la química usual de síntesis de DNA. Las sondas del

ensayo de ligación aguas abajo deben ser fosforiladas en su extremo 5’ (el extremo que se enfrenta

al corte). Esto puede hacerse mediante fosforilación enzimática o mediante la adicción de fosfato

durante las síntesis de la sonda. El OLA puede hacerse con sondas que varían en su temperatura

media desde 45ºC a 70ºC. Para hacer la discriminación alélica, la Tm de sondas alélicas competentes

deben ser cuidadosamente ajustadas para evitar la preferencia por un alelo en la producción del

OLA, mientras que las sondas comunes deben tener una alta temperatura. Para LCR, es importante

que las 4 sondas tegan la Tm ajustada próxima para minimizar eficientemente las diferencias entre

las 2 cadenas. Cuando se usa la gap-LCR, es importante bloquear la extensión por DNA polimerasa

mediante modificación de los extremos exteriores de las sondas con los ganchos y etiquetas

requeridos para la posterior detección del producto o con un grupo no extensible como una amina.

Ligasa: Los primeros trabajos con OLA usaban ligasa de E. Coli o T4. Sin embargo, para muchas

aplicaciones se usan ligasas térmicamente estables como las de Thermus aquaticus (Taq) o

Pyrococcus furiosus (Pfu). Estas fuentes de enzima difieren en el cofactor que requieren como

proveedor de energía para la formación del enlace químico entre las sondas. Las ligasas T4 y Pfu

usan ATP, mientras que las de E. coli y Taq usan NAD.

Detección del producto.

Los productos de la reacción de la ligasa pueden ser detectados utilizando ensayos de

microtitulación, electroforesis en gel o un analizador clínico automático. Para la detección de

microtitulación en plato se modifica una sonda con un hapteno como la biotina que puede ser

5 http://eureka.ya.com/jaleo/7_detecc5.htm

47

capturada en una placa recubierta con avidina o estreptoavidina. La captura también puede hacerse

gracias a la adicción de colas de poli-A como hapteno para una de las sondas y capturando el

producto de ligación en bolas magnéticas de oligo dT. La segunda sonda contiene la etiqueta que

puede o detectarse directamente o unirse a un anticuerpo conjugado con una enzima para una

detección por amplificación enzimática.

48

Aplicación del ligamiento al diagnóstico (proceso de diagnóstico indirecto de

las enfermedades genéticas)

El estudio de ligamiento genético es un método indirecto que permite establecer la relación de una

condición o enfermedad genética entre distintos miembros de una familia. Para establecer esta relación

se utilizan marcadores genéticos localizados en la región cromosómica de interés, tratando de acotar el

gen o la mutación asociada a la enfermedad o a la alteración investigada.

En la práctica clínica, las principales limitaciones de este estudio son:

Es imprescindible que exista un diagnóstico clínico

Es necesaria la colaboración en el estudio del máximo número posible de miembros de la familia

El resultado se indica en términos de una probabilidad dependiente de la informatividad

genética de cada familia y de posibles sucesos de recombinación.

Aplicaciones al diagnóstico:

Segregación de una condición genética entre los individuos de una familia

- Diagnóstico genético de portadores

- Diagnóstico genético presintomático

- Diagnóstico genético de exclusión

- Diagnóstico genético de informatividad

- Diagnóstico genético prenatal

- Diagnóstico genético preimplantación

Pérdida de heterocigosidad (LOH)

Disomía uniparental (UPD)

Detección de deleciones o duplicaciones

Estudios de discriminación entre varios genes o loci asociados a una misma enfermedad

El diagnóstico indirecto

El diagnóstico indirecto es independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la

mutación a diagnosticar y para llevarlo a cabo solo es preciso conocer la localización cromosómica del

locus implicado. Dicha estrategia consiste en estudiar, en la familia del propositus, la segregación

49

conjunta de la enfermedad y secuencias polimórficas físicamente próximas (ligadas) al locus de la

misma.

El ADN es una molécula lineal en la que las secuencias de nucleótidos se hallan contiguas y distribuidas a

lo largo de la doble hélice en un mundo de una dimensión. Existe pues una relación física de proximidad

entre secuencias de ADN. Dicha relación de continuidad puede alterarse durante el proceso de la

división meiótica que se presenta durante la formación de las células germinales. En la profase de la

primera división meiótica, los cromosomas homólogos (uno proveniente de la línea paterna y el otro de

la línea materna) intercambian material por el proceso de entrecruzamiento. El resultado final es tal que

los cromosomas de la célula germinal madura (espermatozoide u óvulo) presentan nuevas

combinaciones de las secuencias existentes en la célula original (nuevos recombinantes). Dada la

relación física existente entre secuencias adyacentes en un mismo cromosoma, la frecuencia en que dos

de estas secuencias se transmitan (segregan) independientemente de una generación a la siguiente es

directamente proporcional a la distancia que las separa. Es decir, cuanto menor es la distancia que

separa a dos secuencias de ADN, menos probable es el entrecruzamiento entre ellas y por lo tanto

segregarn independientemente con una menor frecuencia. Cuando se da esta situación decimos que

ambas secuencias están ligadas.

El ligamiento entre secuencias de ADN se establece mediante el estudio de la segregación de los alelos

de dichas secuencias en genealogías. Este tipo de estudios permiten la obtención del mapa genético de

una determinada región cromosómica. Dicho mapa contendrá puntos de referencia al estilo de un mapa

de carreteras. Así, mientras que el mapa de carreteras nos informa de la posición de pueblos y ciudades,

el mapa genético contendrá información sobre la posición de los genes. Además de pueblos y ciudades

el mapa de carreteras contiene otros puntos de referencia orientativos como pueden ser un cruce de

carreteras, un puerto de montaña o una vista panorámica. Dichos puntos de referencia son

fundamentales para orientarse a lo largo de la carretera. Su equivalente en el mapa genético serán por

ejemplo los puntos de rotura de una determinada translocación o las secuencias polimórficas repartidas

a lo largo de la molécula de ADN.

Secuencias polimórficas

Como su nombre indica, las secuencias polimórficas (también conocidas como secuencias anónimas, loci

anónimos, loci polimórficos, marcadores anónimos o marcadores polimórficos) son secuencias de ADN

que, normalmente, no codifican para un producto génico, se distribuyen de forma más o menos

50

aleatoria a lo largo del genoma y presentan como característica singular el hecho de ser polimórficas.

Este último hecho es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias la característica

primordial del análisis genético, la variabilidad.

Las variantes de un locus es lo que conocemos como alelos. Ya hemos utilizado este concepto

anteriormente al hablar de los alelos de loci implicados en enfermedades (el alelo 508 de la fibrosis

quística o el alelo S de la anemia falciforme). Sin embargo, este tipo de alelos son, afortunadamente,

muy poco frecuentes y no nos serían útiles en los estudios de ligamiento. Por el contrario las secuencias

anónimas o loci polimórficos presentan por definición varios alelos con una frecuencia

significativamente alta en la población (superior al 1% para el menos frecuente).

Supongamos que queremos saber si el locus a, que está implicado en una enfermedad hereditaria, esta

ligado al locus b, que es una secuencia anónima de ADN. Lo primero que necesitaremos será identificar

las variantes de la secuencia anónima en cada uno de los miembros de la familia y estudiar su

segregación juntamente con la de la enfermedad. La aplicación de diversos métodos estadísticos nos

permitirá establecer la existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia

que los separa.

En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en función de la frecuencia en

que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centimorgan (cM). Si dos loci recombinan en el 1%

de las meiosis, decimos que les separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de recombinación entre dos

loci puede variar desde 0 (decimos entonces que dichos loci están íntimamente ligados) hasta el 50% y

decimos entonces que son independientes. Aunque no nos podemos extender aquí sobre este aspecto,

no existe siempre una relación lineal entre distancia genética (frecuencia de recombinación medida en

cM) y distancia física (número de nucleótidos que las separan, medida en pares de bases). Para

frecuencias de recombinación inferiores al 20% se puede establecer una relación de 106 pares de bases

por cada 1% de recombinación.

Tipos de variación polimórfica en secuencias anónimas

Hemos indicado que la característica primordial de las secuencias anónimas es su variabilidad, veamos

ahora en que consiste dicha variabilidad. Básicamente existen dos tipos de polimorfismos, los que

derivan de la substitución de un nucleótido por otro y los que derivan de la inserción o deleción de

51

secuencias de ADN. En estos últimos distinguimos dos subtipos: las inserciones o deleciones de

fragmentos de ADN y las repeticiones de secuencias de entre dos y cientos de nucleótidos.

Polimorfismos del tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP del inglés "restriction fragment

length polymorphism").- Cuando el cambio de un nucleótido altera la diana para un determinado ER o la

inserción o deleción de un fragmento de ADN se localiza entre dos dianas de un ER, podemos detectar el

polimorfismo en función de la variación que éste genera en el patrón de restricción. Los RFLP son

polimorfismos que presentan normalmente un número bajo de alelos y por lo tanto su utilización en el

diagnóstico indirecto es limitada.

Polimorfismos del tamaño de fragmentos de restricción (RFLP). La pérdida o ganancia de una

diana de restricción por efecto de la substitución de un nucleótido (A), o la inserción o deleción

de un fragmento de ADN (B), pueden ser detectados por las variaciones en los tamaños de los

fragmentos de restricción. En la figura se presenta el resultado esperado de este tipo de

polimorfismos en individuos homozigotos para la presencia de la diana o la deleción (+ +), los

homozigotos para la ausencia de diana o la inserción (- -) y los heterozigotos (+ -). El método de

detección puede ser tanto hibridación y southern (esquematizado en la figura) como mediante

PCR.

Polimorfismos de repetición.- Existen dos tipos de polimorfismos de repetición de uso en diagnóstico

genético, los VNTR-minisatélites y los VNTR-microsatélites. En ambos casos presentan un número

variable de repeticiones en tandem (VNTR del inglés "variable number of tandem repeats").

Los minisatélites son loci que corresponden a secuencias de ADN de unas pocas decenas de nucleótidos

repetidas en tandem. El número de dichas repeticiones varia de cromosoma a cromosoma, de forma

que en un cromosoma el número de repeticiones en tandem puede ser de 10, en otro de 15 en otro de

52

22, etc, etc. La singularidad más especial de este tipo de polimorfismos está en que cada loci puede

presentar muchos alelos distintos (tantos como repeticiones), sin embargo presentan el inconveniente

que no están distribuidos por todo el genoma y por lo tanto solo pueden ser utilizados en el diagnostico

de un número muy reducido de enfermedades. Los VNTR-minisatélites han encontrado su máxima

aplicación en la determinación de la paternidad y en los protocolos de identificación genética en el

ámbito judicial. Cuando se habla de huellas dactilares del ADN se está hablando de este tipo de

polimorfismo.

Los VNTR-microsatélites son por excelencia los polimorfismos anónimos utilizados en el diagnóstico

genético. Corresponden a la repetición en tandem de secuencias de entre 2 y 5 nucleótidos. Los

microsatélites presentan dos características que los hacen ideales para su uso. En primer lugar, están

distribuidos de forma casi homogénea por todo el genoma y en segundo lugar, presentan un número

elevado de alelos con frecuencias similares entre sí, de forma que la probabilidad de que un individuo

sea heterozigoto es muy elevada (presentan una alta heterozigosidad). Su detección se realiza

normalmente mediante la técnica de PCR.

Detección mediante PCR de distintos alelos de un polimorfismo microsatélite. En el ejemplo se

presentan dos individuos heterozigotos para los alelos de 6 y 7 repeticiones y de 4 y 8

repeticiones del dinucleótido (CA)n. La detección se realiza mediante PCR utilizando como

53

cebadores oligonucleótidos que flanquean a la región que contiene la repetición (flechas). De

cada individuo se amplifican fragmentos de ADN que difieren entre si por el número de

repeticiones. El resultado de la amplificación se fracciona en un gel de acrilamida-urea para

determinar el genotipo de cada individuo.

Aplicación en el diagnóstico indirecto de enfermedades hereditarias

El ejemplo más sencillo de aplicación de los polimorfismos anónimos en el diagnóstico indirecto lo

tenemos en el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X. En la familia en cuestión ha nacido un

varón afectado de una enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X. De acuerdo con el patrón de

herencia, su padre presentará el alelo normal de la enfermedad, mientras que su madre será portadora,

es decir heterozigota. El varón afectado habrá heredado de su madre el cromosoma con el alelo de la

enfermedad y dada su condición de hemizigoto, manifestará el fenotipo correspondiente a la misma. Sin

embargo no podemos predecir, más allá del modelo mendeliano, el genotipo de la hermana ni el del

feto que se está desarrollando.

Supongamos que existe un locus polimórfico, tipo microsatélite, próximo al locus de la enfermedad,

íntimamente ligado (frecuencia de recombinación igual a 0). Si identificamos los alelos de dicho

polimorfismo en cada uno de los miembros de la familia podremos inferir el alelo del locus de la

enfermedad que porta cada individuo.

En la parte inferior de la figura se presenta, de forma simplificada, el resultado obtenido al caracterizar

mediante PCR el locus polimórfico. En el margen izquierdo se presenta un patrón correspondiente al

número de repeticiones del dinucleótido CA (de 1 a 6) y perpendicularmente a cada individuo el alelo

correspondiente a cada uno de ellos. Podemos ver que el varón afectado ha heredado de su madre el

alelo de 2 repeticiones, por lo que podemos inferir que dicho alelo está junto al alelo de la enfermedad.

Según ello, la hermana habrá heredado de su padre el alelo 4 del polimorfismo junto con el alelo normal

de la enfermedad y de su madre el alelo 6 que también en este caso irá junto al alelo normal. Por lo

tanto la hermana será homozigota para el alelo normal de la enfermedad. Siguiendo un razonamiento

similar podemos inferir que el feto será una niña (presenta dos alelos del polimorfismo) y heterozigota

para la enfermedad, pues ha heredado de su madre el alelo 2 del polimorfismo que como hemos

indicado anteriormente está acompañado por el alelo que causa la enfermedad. La Figura 20 es una

interpretación de lo anteriormente indicado.

54

Genealogía de una familia en la

que se hereda una enfermedad

ligada al cromosoma X. Véase el

texto.

En el ejemplo anterior hemos utilizado como marcador del locus de la enfermedad a un locus altamente

polimórfico, los cromosomas paternos presentan alelos distintos y por lo tanto los podemos identificar

sin ambigüedad alguna, y íntimamente ligado, es decir no existe recombinación entre ambos loci y por lo

tanto el alelo del polimorfismo que en la madre va junto al alelo de la enfermedad continuará junto a

éste en los cromosomas de la descendencia. Estas dos características son fundamentales en el momento

de escoger un determinado polimorfismo en el desarrollo de una estrategia de diagnóstico indirecto.

Representación gráfica del razonamiento

aplicado para determinar los genotipos

de los miembros de la familia de la figura

anterior. Los varones presentan dos

cromosomas distintos (un cromosoma X y

un cromosoma Y). La estrella vacía indica

el alelo normal y la estrella llena el alelo

de la enfermedad. Cada alelo del locus

del polimorfismo está indicado de

acuerdo con el número de repeticiones

del dinucleótido CA.

55

Si el marcador utilizado no presenta muchos alelos entonces pueden darse situaciones de ambigüedad

cuando uno o ambos padres sean homozigotos para un determinado alelo del marcador. En este caso

diremos que la familia es "no informativa" para dicho marcador y por lo tanto deberemos utilizar otro

polimorfismo en el diagnóstico de dicha familia. Por otra parte, si el marcador no está íntimamente

ligado, es decir existe recombinación entre el locus de la enfermedad y el locus del marcador, el

diagnóstico deberá tener en cuenta dicha posibilidad.

Veamos el siguiente ejemplo. En la siguiente figura se presenta la genealogía correspondiente a una

familia en la que se hereda una enfermedad con una herencia autosómica dominante. Con una

probabilidad del 50% la madre afectada transmitirá a sus descendientes el carácter. La utilización de un

locus polimórfico ligado al carácter en cuestión nos permitirá establecer un diagnóstico más ajustado

para el feto en desarrollo. En dicha figura, A se muestra el resultado obtenido al analizar un

polimorfismo microsatélite (repetición del dinucleótido CA). Vemos que la madre presenta los alelos 6 y

2 y el padre los alelos 4 y 7. Por su parte el hijo normal es portador de los alelos 2 y 7, el primero

procedente de la madre y el segundo del padre. Si el carácter es penetrante, podemos considerar que el

alelo 2 en la madre está junto al alelo normal del locus de la enfermedad. Por lo tanto, si el feto

presenta el alelo 2 del polimorfismo podremos inferir que también ha heredado el alelo normal del otro

locus.

Sin embargo, tal y como se presenta en la figura ya mencionada, B, si la distancia que separa a ambos

loci es tal que permite la recombinación entre ellos, es posible que el feto haya heredado de su madre el

alelo 2 del polimorfismo junto con el alelo de la enfermedad, debido a la recombinación de ambos loci

en la meiosis de la madre. La frecuencia con la que se presentará este segundo caso será la frecuencia

de recombinación entre los loci implicados. Así, si la distancia que les separa es de 5 cM, es decir su

frecuencia de recombinación es del 5%, el diagnóstico que daremos en el caso presentado será de un

95% de probabilidad de que el feto sea normal (apartado A) y de un 5% de que el feto haya heredado el

alelo de la enfermedad junto con el alelo 2 del polimorfismo (apartado B).

56

Diagnóstico indirecto de una enfermedad autosómica dominante. En A el locus del

polimorfismo y el de la enfermedad no presentan recombinación. En B, el feto en desarrollo

presenta un cromosoma materno en el cual se ha dado un evento de recombinación (flecha)

durante la meiosis de la madre. La simbología es la misma que la utilizada en la figura anterior.

Para obtener una mayor fiabilidad en el diagnóstico se utilizan varios loci polimórficos localizados a

ambos lados del locus de la enfermedad. Con ello se consiguen evitar las ambigüedades generadas por

el entrecruzamiento.

La dimensión social del diagnóstico genético

Si bien este aspecto será tratado con una mayor extensión y detalle en otros capítulos del libro, no

quisiera finalizar este capítulo sin abordar algunos de los aspectos ético – sociales que acompañan al

diagnostico genético. En la introducción se enumeraron algunas de las características diferenciadoras de

este tipo de diagnóstico respecto al diagnóstico convencional. Las diferencias no son de índole

metodológica o tecnológica, dado que en los distintos ámbitos de la biomedicina la complejidad

tecnológica es similar, sino que estas radican en el ámbito de sus implicaciones ético-sociales. Desearía

destacar algunos de los aspectos más significativos de esta dimensión ético – social.

El primero se refiere a la relación que se establece entre el paciente y su familia. Todo diagnóstico

genera en el paciente una tensión que se resuelve en un sentido positivo o negativo según sea el

57

resultado. El diagnóstico genético no solo genera tensión en el propositus sino que toda su familia se ve

implicada en él. Esta implicación no es solo de índole solidaria, la tensión en la familia obedece a una

reacción primaria al verse directamente implicados en la patología como potencialmente afectados. Es

por ello que el genetista debe considerar a la familia como la unidad de diagnóstico y aliviar mediante la

adecuada información, la angustia y la tensión que el diagnóstico pueda generar.

El segundo aspecto hace referencia a la componente predictiva del diagnóstico genético. Sin duda

alguna la fatalidad que acompaña al diagnostico positivo de una enfermedad hereditaria no tiene

parangón en otras disciplinas médicas. Ello es así, porque en la actualidad la mayoría de las

enfermedades hereditarias carecen de una terapia curativa. Cuando en una familia se diagnóstica un

hijo con fibrosis quística no solo se está dando una predicción sobre la progresión clínica del paciente en

un futuro próximo, sino que además se está asignando a la familia una predicción sobre futuros

embarazos. Así mismo, cuando uno de los miembros de una familia es diagnosticado como afecto de

una enfermedad hereditaria de manifestación tardía, los miembros jóvenes de la familia reciben una

carga de angustia y tensión. Un ejemplo de esta situación lo tenemos en el diagnóstico de la

enfermedad de Huntington. ¿Querrán los miembros de la familia saber cuál es el diagnóstico del

propositus? ¿Desearán los familiares asintomáticos ser sometidos a un diagnóstico? Estas y otras

cuestiones se podrán plantear y la respuesta no es obvia.

La determinación de los factores de riesgo y el estudio de la predisposición o susceptibilidad genética es

uno de los campos de futura aplicación del diagnostico genético. Sin duda alguna esto comportará

grandes beneficios medico-sociales, al facilitar la medicina preventiva en enfermedades como la

diabetes, la hipertensión, las enfermedades cardiovasculares u otras de carácter multifactorial, que

tienen una gran prevalencia en nuestra población. Sin embargo, todo lo positivo que comporta este tipo

de estudios puede verse truncado por una mala utilización de la información obtenida.

No se debe asignar rango de infalibilidad a una información de tipo probabilístico. La probabilidad de

padecer la enfermedad de Alzheimer se incrementa en un factor de 8 en los individuos homozigotos

para el alelo APO – 4, pero ello no implica que un individuo homozigoto para dichos alelos vaya a

manifestar inexorablemente la enfermedad. Los factores ambientales, la historia natural de cada

individuo, y el fondo genético tienen un papel muy importante en la manifestación fenotípica de un

carácter. Resulta curioso constatar que en la actualidad los más acérrimos defensores del papel del

ambiente en la ecuación: fenotipo = genotipo + ambiente, sean los genetistas.

58

Tratamiento genético de las enfermedades

Terapias génicas. Enfermedades tratables y tratamientos posibles6

Las enfermedades hereditarias provocadas por la carencia de una enzima o proteína son las más idóneas

para estos tratamientos. Pero también aquellas en las que no importa demasiado el control preciso y

riguroso de los niveles de la proteína cuya producción se pretende inducir mediante manipulación

genética (ej., el factor VIII de la sangre). Se trata, normalmente, de enfermedades monogénicas,

originadas por la alteración de un único gen recesivo anómalo y en las que basta la mera presencia del

producto génico para corregir el defecto.

A finales de los 80 se consideraban alteraciones idóneas para ser objeto de tratamiento génico la

enfermedad de Lesch-Nyhan (provocada por la ausencia de la enzima HPRT -hipoxantina-guanina

fosforribosil transferasa-, que provoca grave deficiencia mental y tendencia compulsiva al

automutilamiento) e inmunodeficiencias como PNP (muy grave, provocada por la carencia de una purina

nucleósido fosforilasa) y ADA (la que padecen los "niños burbuja", en los que la falta del enzima

adenosina desaminasa les deja absolutamente indefensos contra cualquier agente patógeno,

obligándoles a vivir en un ambiente absolutamente estéril). En estos casos se conocían y habían sido

clonados los genes implicados. Bastaría una pequeña presencia de los productos génicos necesarios para

corregir la alteración, y unos niveles ligeramente superiores de los mismos no parece tener

consecuencias negativas. Las células implicadas en la producción de estos enzimas se hallan en la

médula ósea, lo cual plantea el problema adicional de hallar donantes compatibles para iniciar el

tratamiento. Los experimentos indican que el tratamiento génico de algunas células extraídas a los

enfermos y su posterior reinserción está siendo eficaz -al menos en ADA-, y que, tras dos o más años de

tratamiento se ha conseguido la relativa normalización del sistema inmune y la restauración de la

inmunidad celular y humoral, gracias en parte a ventajas de crecimiento que las células tratadas

genéticamente parecen tener sobre las anómalas

Aparte de la médula ósea, los tejidos humanos mejor conocidos eran hasta hace muy poco la piel y la

sangre. En otras células se plantean múltiples problemas para extraer las células necesarias, cultivarlas

durante el tiempo requerido para manipularlas genéticamente y ser reimplantadas al paciente. El bajo

número de células madre en la médula ósea, no diferenciadas todavía -antes de constituir las células 6 http://www.biotech.bioetica.org/ap47.htm

59

específicas de la sangre- y problemas en su reconocimiento han constituido un importante obstáculo

para la terapia génica. Además, ninguna de las técnicas disponibles a comienzos de los 90 permitía

insertar un gen en su locus o lugar cromosómico específico dentro de la célula diana.

Cuadro 1. Algunas enfermedades hereditarias tratables mediante terapia génica

Enfermedad Incidencia Producto normal del

gen defectuoso

Células a modificar por

la terapia génica

Inmunodeficiencia

combinada severa

(SCID) (“niños

burbuja”)

Rara Enzima adenosin

desaminasa (ADA)

Células de la médula

ósea o linfocitos T

Hemoglobinopatías

(talasemias)

1 cada 600 personas en

ciertos grupos étnicos

β - globina de la

hemoglobina

Células de la médula

ósea

Hemofilia A 1/10.000 varones Factor VIII de

coagulación

Células del hígado o

fibroblastos

Hemofilia B 1/30.000 varones Factor IX de

coagulación

Células del hígado o

fibroblastos

Hipercolesterolemia

familiar

1/500 personas Receptor del hígado

para lipoproteínas de

baja densidad (LDL)

Células del hígado

Enfisema hereditario 1/3.500 personas α-1-antitripsina

(producto hepático que

protege los pulmones

de la degradación

enzimática)

Células del pulmón o

del hígado

Fibrosis quística 1/2.500 personas Producto del gen CFTR

que mantiene libre de

mucus los tubos aéreos

de los pulmones

Células del pulmón

Distrofia muscular de

Duchenne

1/10.000 varones Distrofina

(componente

Células musculares

60

estructural del

músculo)

Fuente: Lacadena Calero, R. Genética. Universidad Complutense (Madrid-España) 1999.

A fines del siglo XX, las posibilidades y aplicaciones de los tratamientos génicos se ampliaron

notablemente, con diferentes resultados según las líneas celulares manipuladas:

Tratamiento génico de enfermedades hepáticas

Los experimentos con ratones transgénicos, bioquímica y fenotípicamente modificados, han permitido

evaluar la eficacia terapéutica de la transferencia génica somática de vectores adenovirales con

replicación alterada que codificaban el ADNc de la ornitina transcarbamilasa (OTC). La duración de su

expresión está por determinar todavía, creo, pero los primeros resultados parecen esperanzadores. Algo

parecido puede decirse sobre la expresión de beta-galactosidasa y a 1-antitripsina humana en

hepatocitos aislados en modelos transgénicos. A pesar de los problemas técnicos que persisten en

relación con la transferencia ex vivo de células y de la duración limitada de la expresión terapéutica, hay

al menos dos protocolos clínicos aprobados para la transferencia ex vivo de genes al hígado. Los

tratamientos van destinados a pacientes con insuficiencia hepática aguda y al tratamiento de la

hipercolesterolemia familiar. De manera global, la precaución y el estudio detenido de los protocolos

clínicos presentados seguirán siendo la norma, mientras persistan los problemas de expresión

transitoria y grado de eficacia insuficiente en el tratamiento genético hepático tanto in como ex vivo.

Hemoglobinopatías y tratamiento génico de células hematopoyéticas

El dominio adquirido en los trasplantes de médula ósea y la capacidad que tienen las células

primordiales hematopoyéticas (CPH) para reconstituir totalmente la médula ósea, hacen del sistema

hematopoyético un candidato idóneo para el tratamiento génico. Las inmunodeficiencias combinadas

severas (ADA), las hemoglobinopatías (talasemias), las deficiencias de adhesión leucocitaria y las

enfermedades de depósito lisosomal (enfermedad de Gaucher) han acaparado la mayor parte de las

investigaciones en tratamiento génico. Recientemente se han identificado los genes responsables de

tres enfermedades inmunitarias ligadas al cromosoma X, y diversos tipos de leucemia, el cáncer y el

SIDA están siendo objeto de intensos estudios que incluyen aproximaciones terapéuticas de tipo

genético. En las CPH los vectores retrovirales parecen ser, de momento, los más eficaces para la

transferencia.

61

ADA (trastorno autosómico recesivo; frecuencia: 25% de las ICS)

Su deficiencia origina una disfunción intensa en las células T y B, que provoca la muerte de los pacientes

antes de los 2 años de edad por infección masiva. Actualmente, el tratamiento preferido es el trasplante

de médula ósea procedente de un donante HLA idéntico, que puede producir una curación completa

aunque conlleva una alta morbilidad. Pero menos de un 30% de los pacientes tienen un hermano HLA

idéntico. La sustitución enzimática no consigue una restitución inmunitaria completa y produce otros

efectos tóxicos. Un tratamiento sustitutorio, consistente en inyectar el enzima ADA combinada con

polietilenoglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad. Pero es un

tratamiento muy caro, ininterrumpido y de eficacia inconstante.

Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron a mediados de los años ‘90 ensayos

clínicos de transferencia génica de ADA hacia las células T periféricas, previamente tratadas in vitro.

Aunque algunos pacientes experimentaron una notable mejoría clínica e inmunitaria, los resultados

difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los índices de la función

inmunitaria. En opinión de algunos, ni en este ensayo pionero ni en otros existen evidencias inequívocas

de que el tratamiento genético ha producido beneficios terapéuticos. Los riesgos de posible

mutagénesis insertiva de genes relacionados con el cáncer, después de repetidas transferencias

retrovirales, no se han visto confirmados hasta el momento. Pero los modestos resultados han

estimulado otras propuestas de ensayos clínicos en Italia y Países Bajos. Según sus autores, en uno de

estos últimos ensayos la transferencia genética había funcionado y se había conseguido la reconstitución

inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo también

inyecciones rutinarias de ADA sintética, y estos tratamientos convencionales podrían ser responsables

en buena parte de su buena salud.

Enfermedad de Gaucher

Autosómica recesiva, es producida por el derivado proteico de un gen que codifica la enzima

glucocerebrosidasa. El trasplante alogénico de médula ósea ha corregido la enfermedad en algunos

pacientes, pero ya se ha conseguido la trasferencia génica retroviral de un gen recombinante normal de

la glucocerebrosidasa en células madre de ratón, seguida de la expresión proteica en macrófagos

diferenciados a partir de células madre transducidas.

Las hemoglobinopatías representan el trastorno genético más frecuente en humanos, y la mayor parte

de los experimentos con tratamiento génico persiguen la expresión regulada de altos valores del gen de

62

la globina utilizando vectores retrovirales. Pero a mediados de 1994 no se había conseguido la expresión

regulada de los genes de la globina utilizando vectores retrovirales.

Tratamiento genético del cáncer

Los procesos cancerígenos hereditarios como el retinoblastoma, poliposis adenomatosa familiar, cáncer

de mama y melanoma están relacionados con un gen único que predispone al paciente a presentar

neoplasia. Leucemia y linfomas no hereditarios parecen provocados por nuevas mutaciones

(translocaciones, a menudo) que confieren un nuevo rasgo genético a la célula maligna. La corrección

génica de todas las células malignas implicadas en procesos cancerígenos constituye un desafío

sorprendente. Muchos estudios han intentado incrementar la cantidad y citotoxicidad especifica de los

linfocitos que reaccionan con las células tumorales. Los primeros intentos incluían el marcaje de unas

células inmunes llamadas linfocitos de infiltración tumoral (TILs, tumor-infiltrating lymphocytes) para

seguir el progreso del tratamiento contra el melanoma maligno.

Steven Rosenberg, uno de los más conocidos investigadores sobre el cáncer de los NIH, consiguió en

1990 la aprobación definitiva para una segunda aplicación de la terapia génica a pacientes con casos

avanzados de melanoma, cáncer de piel que anualmente mata a unos 28.000 ciudadanos en EE.UU. El

enfoque adoptado por Rosenberg reconoce las limitaciones del recurso a fuerzas externas (radiación,

quimioterapia y cirugía) con los pacientes cancerosos y propone una estrategia basada en los propios

mecanismos internos del cuerpo, como la terapia génica, para conseguir que el propio cuerpo rechace la

enfermedad. Rosenberg y su equipo extrajeron linfocitos de infiltración tumoral procedentes de los

tumores de pacientes con melanoma. Los TILs fueron introducidos en una solución de interleuquina-2,

una sustancia natural que potencia su efecto destructor, y posteriormente expuestos a retrovirus de

leucemia de ratón manipulados. El sistema de transporte y distribución de Rosenberg había sido

neutralizado y dotado mediante técnicas de ADN recombinante con un gen humano. Este gen codifica

un factor de necrosis tumoral (TNF), una proteína que interfiere con el suministro de sangre al tumor y

debilita las células tumorales. Los virus alterados se insertan ellos mismos junto con su gen polizón

dentro del material genético de los TILs, y estos son inyectados en la sangre de los pacientes con

melanoma. Conforme a las previsiones, los TILs activados se hospedarían en los tumores como si fuesen

misiles teledirigidos, atacando las células cancerosas y a la vez liberando el factor antitumoral (tóxico)

para ayudar a exterminarlos.

63

Un año después, sin embargo, el comité de asesores científicos del National Cancer Institute's Division of

Cancer Treatment cuestionó la fiabilidad y algunos elementos cruciales de los experimentos de

Rosenberg, negándole un contrato de 3,9 millones de dólares por 3 años para desarrollar células TIL en

un laboratorio independiente. Han fallado varios aspectos importantes en los dos años de

experimentación. Aunque los TILs sí se dirigían al tumor, no lo hacen los modificados con el TNF. Parece

que algo relacionado con la inserción del TNF interfiere con su capacidad para hospedarse en el tumor.

El resultado es que la mayor parte de los linfocitos modificados quedan atrapados en el hígado, bazo y

pulmones, donde probablemente son destruidos. Y la expresión no regulada en estos órganos del TNF

puede originar procesos tóxicos secundarios.

Otro método basado en la inmunoterapia ("vacunación genética" o inmunoterapia activa) trata de

aumentar el carácter "extraño" de las células tumorales para estimular la acción antitumoral de las

células asesinas (linfocitos T y macrófagos) del sistema inmunitario. Las células tumorales producen en

su superficie unas proteínas anómalas capaces de activar las células asesinas. Algunos tumores incluso

son portadores de antígenos propios ("antígenos asociados a los tumores") que permanecen

"silenciosos" en las células normales.

Incremento de la inmunogenicidad de las células tumorales

Mediante modificación genética se intenta potenciar la respuesta inmunitaria dirigida contra el tumor.

Se utilizan diversas proteínas específicas, especialmente citoquinas y moléculas de adhesión celular

(interleuquina-2, interleuquina-4, el TNF, etc.) que no producen ningún efecto sobre el crecimiento de

las células tumorales in vitro pero inhiben el crecimiento del tumor in vivo. En ratón, las células

tumorales son eficazmente rechazadas cuando han sido manipuladas mediante técnicas de ingeniería

genética para expresar diversas citoquinas o bien el complejo principal de histocompatibilidad. Esto

hace pensar que en humanos, el protocolo debería incluir la eliminación de una parte del tumor, la

transducción de las células in vitro con las formas de expresión adecuadas y el reimplante de estas

células tumorales al paciente. Se han aprobado diversos protocolos clínicos en todo el mundo para la

transferencia in vitro a células tumorales de genes de citoquinas (IL-2, IL-4, el interferón g , el GM-CSF o

factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, etc.) para diferentes tipos de cáncer:

colonrrectal, de mama, melanoma maligno, neuroblastoma, carcinoma de pulmón, de riñón, etc.

Genes protectores y destructores

64

Otros ensayos persiguen la utilización de genes protectores, mediante la transferencia de genes que

incrementen la resistencia a varios fármacos en células madre de pacientes con tumores sólidos o

leucemia y permitan niveles superiores de quimioterapia para erradicar la enfermedad residual. Otros

estudios proponen utilizar genes destructores como los de la toxina diftérica y los que codifican el TNF

para eliminar las células cancerosas; o el empleo de "genes suicidas", que transforman un producto no

tóxico (por ejemplo, un antivírico como el aciclovir) en un veneno que provoca la muerte de las células.

Otros enfoques del tratamiento génico contra el cáncer pretenden el marcaje de las células malignas

con proteínas codificadas por genes de supresión tumoral como el p53 (alterado en el 50% de los casos)

o ras (alterado sólo en el 30%). In vitro, las células malignas a las que se ha transferido la forma natural

del p53 ya no tienen capacidad tumorigénica o la tienen más débil que las células originales.

Poco tiempo antes de concluir el siglo XX se ha desvelado el funcionamiento de otro gen muy

directamente implicado en la supresión de tumores, el p16. De momento, se están diseñando los

vectores para introducirlo adecuadamente en las células tumorales y conseguir su expresión con arreglo

a las previsiones. Pero el propio director de equipo, el español Manuel Serrano, reconoce las dificultades

inherentes todavía a las terapias génicas y deposita más esperanzas en el diseño de alguna molécula por

síntesis química capaz de imitar la acción del gen p16.

Todas estas alternativas presentan numerosos inconvenientes todavía. Sigue siendo difícil extraer y

modificar células tumorales. Sólo una fracción de ellas -poco controlable- resulta manipulable para una

posible fabricación de vacunas parciales. No todos los tumores son físicamente accesibles. El problema

más importante lo constituye la elevada eficacia necesaria en la transferencia de las células modificadas

a las células neoplásicas, de modo que no perjudiquen a las normales. Por último, la manipulación de

células tumorales con genes inhibidores de la proliferación celular como el p53 requiere la modificación

de todas las células tumorales, y como la mayoría de cánceres proceden de una cascada de anomalías

genéticas, la reversión de una sola de ellas no bastaría seguramente para detener la enfermedad.

Tratamiento genético de las células respiratorias

Para la fibrosis quística (enfermedad autosómica recesiva, que afecta a 1/2.500 recién nacidos blancos)

existe un tratamiento convencional (fluidificación de las secreciones del sistema respiratorio,

tratamiento de las infecciones y sustitución de las enzimas pancreáticas). Se ha descubierto

recientemente el gen implicado en la enfermedad, el regulador de la conductancia transmembrana

(CFTR), lo que ha supuesto un importante avance hacia su tratamiento génico. Se están siguiendo

65

estrategias in vivo para el tratamiento de la FQ, más adecuadas y viables que las ex vivo. Después de

algunos intentos con ratones (instilación traqueal de un adenovirus recombinante con replicación

defectuosa que codifica el CFTR) con buenos resultados -aunque la expresión del gen no ha durado más

de 42 días- se aprobaron varios ensayos clínicos en humanos utilizando un vector adenoviral con CFTR y

transferencia genética de un complejo ADN-liposoma. Los riesgos de toxicidad parecen descartados en

los primeros intentos y basta algo tan sencillo como un inhalador para conseguir la expresión del gen y

aliviar en un 30% los síntomas de la enfermedad.

Tratamiento genético muscular (Síndrome de Duchenne)

En ratones se ha conseguido la sustitución de las secuencias anómalas del gen mutante por secuencias

normales, corrigiendo así el defecto genético.

Cada día la literatura científica da cuenta de una nueva enfermedad sometida a esta terapia. El tumor de

páncreas –por ejemplo-, que carece de un tratamiento realmente efectivo y es de pronóstico tan

negativo, justifica la estrategia de la terapia genética. La técnica en desarrollo se basa en genes suicidas,

que por sí mismos carecen de actividad nociva; y que codifican para una proteína capaz de transformar

una pro-droga (fármaco con baja toxicidad) en un metabolito tóxico, que es el que causará la muerte de

la célula cancerosa. Este sistema tiene la ventaja de que el metabolito tóxico puede difundirse de una

célula a otra con lo que, modificando una célula mediante herramientas de terapia génica, se puede

conseguir la muerte de las células tumorales adyacentes.

Otro caso logrado por el equipo de investigadores dirigidos por Joseph Glorioso, del Departamento de

Genética Molecular y Bioquímica de la Universidad de Pittsburgh, en Estados Unidos, quienes han

obtenido la patente para un vector genético capaz de bloquear respuestas dolorosas en ratones. El

vector se basa en la utilización del herpes virus, uno de cuyos genes produce una enzima que bloquea el

dolor. Esta técnica –cuyos resultados en cobayos se han mantenido hasta por siete días- podrá utilizarse

para tratar el dolor asociado al cáncer, la artritis, la angina y las neuropatías periféricas, patologías cuya

medicación actual está basada en narcóticos que provocan, entre otros efectos secundarios, confusión

mental y letargo. En comparación con estos métodos convencionales, la terapia genética es muy

específica, mientras que la liberación de sustancias analgésicas se encuentra limitada a la

hiperestimulación de un grupo limitado de nervios.

En 1990 fue posible que una niña de cuatro años afectada de inmunodeficiencia combinada aguda

(IDCA) fuera inoculada con glóbulos blancos genéticamente modificados conteniendo una copia

66

funcional del gen de la enzima adenosina-desaminasa (ADA), proteína esencial para el desarrollo y

funcionamiento del sistema inmunitario humano. La niña había heredado de ambos padres las copias

defectuosas del gen de la ADA; ellos, a su vez, había heredado una variante defectuosa del gen de uno

de sus progenitores pero el mismo había quedado “compensado” por la copia normal heredada del otro

progenitor, y habían gozado siempre de perfecta salud. La niña podía haber heredado las copias

normales o al menos una normal, y hubiese sido saludable. La carencia de ADA es uno de los más de

7.000 “trastornos de un solo gen” que provocan enfermedades genéticas o hereditarias en los seres

humanos. La terapia somática a la que fue sometida no alteró en la niña su genoma (y las copias que de

ella heredarán sus hijos serán defectuosas), sino que modificó funcionalmente su sistema inmunológico

al introducir los nuevos glóbulos blancos alterados para producir la proteína deseada en las cantidades

necesarias, en el momento adecuado. Aún falta alterar las células-madre productoras de los glóbulos

blancos, con la instrucción correcta de producir la enzima ADA. La alteración del genoma -mediante

terapia germinal- podría ser intentada en el cigoto (embrión de una sola célula) de los hijos de la niña o,

quizás, en las gametas que una vez adulta se destinen a la procreación, la cual debería ser llevada a cabo

in vitro

Otros métodos alternativos que se están ensayando son, por ejemplo, el de inyectar directamente genes

normales que codifican para la distrofina para tratar de curar la distrofia muscular de Duchenne, o

inhalar mediante pulverización con aerosol virus o liposomas portadores de genes normales que, una

vez dentro de las células de los pulmones, permitan curar la fibrosis quística.

Un grupo importante de enfermedades que se originan por la alteración de multiples genes es el de los

cánceres. Dejando de lado los factores ambientales que en estas enfermedades –como en otras- tienen

una decisiva relevancia, y centrándose en el ámbito estrictamente genético se verifica que los genes

protagonistas de la cancerización pueden pertenecer a uno de dos grupos antagónicos: 1) los

procarcinogénicos denominados oncogenes y 2) los que suprimen la formación de tumores conocidos

como antioncogenes o emerogenes. De los cien mil genes promedio en cada célula de nuestro

organismo, se calcula que hay aproximadamente cien oncogenes y cien antioncogenes. Los primeros

pueden producir cáncer cuando su estructura se altera por mutaciones, traslocaciones y por pérdidas

parciales o totales de su secuencia. Pero además de los cambios en los oncogenes, la cancerización

también implica la pérdida de la función de uno o múltiples antioncogenes en prácticamente todos los

cánceres humanos. Los antioncogenes, al sufrir mutaciones o perdidas parciales o totales de su

secuencia, dejarán de suprimir algunos pasos que evitan la cancerización de las células. De esta forma, la

67

cancerización se conceptualiza actualmente en términos de activación de oncogenes asociada a la

inactivación de antioncogenes, y se inscriben en la lista de candidatos para las terapias génicas.

Esto ocurre con productos génicos descubiertos en algunos melanomas humanos, las proteínas MAGE

(melanoma antigen) y MART (melanoma antigen recognized by T-cells) descubiertas recientemente por

los equipos de T. Boon y Rosenberg, respectivamente. Normalmente, los antígenos son presentados a

las células inmunitarias en forma de fragmentos por las proteínas del complejo mayor de

histocompatibilidad (HLA) presentes en las superficies de las células. Pero una de las diferencias

fundamentales entre las células normales y las tumorales está en que estas últimas no presentan

correctamente los antígenos tumorales. Esta es una de las características que se pretenden modificar.

68

Proteínas recombinantes

Biotecnología de las proteínas recombinantes 7

La Biotecnología de proteínas está implicada en el aislamiento, producción y mejoramiento de las

propiedades biológicas de proteínas específicas a partir de diversas fuentes naturales tales como

plantas, animales o bien microorganismos, para su subsiguiente empleo en diversas aplicaciones. La

tecnología del DNA recombinante ha jugado un papel muy importante en el desarrollo de la

Biotecnología de proteínas ya que gracias a la manipulación de genes ha sido posible producir grandes

cantidades de proteínas, muchas de las cuales se encuentran en concentraciones muy bajas en su

ambiente natural. Se considera una proteína recombinante o proteína heteróloga aquella proteína cuya

síntesis se realiza en un organismo distinto al organismo nativo. Actualmente se ofrecen en el mercado

internacional una gran variedad de proteínas recombinantes para un amplio abanico de aplicaciones,

incrementándose día a día la lista de estos productos, lo que ha llegado a constituir toda una revolución

en el mercado biotecnológico y a la vez ha impulsado la investigación en este campo (Walsh &Headon

1995).

El desarrollo de la tecnología del DNA recombinante y el avance logrado en la optimación de

bioprocesos con organismos recombinantes ofrece una amplia gama de posibilidades para la producción

de proteínas nativas o modificadas con nuevas y mejores propiedades.

Para la producción de proteínas recombinantes se hace uso de uno de los múltiples sistemas de

expresión disponibles comercialmente o de aquellos desarrollados con fines de investigación, o bien se

pueden diseñar y construir sistemas de expresión según necesidades específicas. Un sistema de

expresión lo conforma un organismo hospedero y un vector de expresión o fragmentos de DNA que

poseen los elementos génicos necesarios para realizar los procesos de trascripción y traducción en dicho

organismo hospedero, además de recibir las moléculas de DNA recombinante.

Para la selección de un sistema de expresión adecuado para la síntesis de una proteína recombinante se

tienen que tener en consideración el origen biológico y las propiedades químicas y biológicas de la

proteína de interés, su aplicación posterior y el bioproceso que se empleará para su producción (Tabla

7 Guerrero - Olazarán, Cab - Barrera, Galán - Wong y Viader – Salvadó. Biotecnología de Proteínas Recombinantes para la Aplicación en Acuacultura. 2004. Avances en Nutrición Acuícola VII. Memorias del VII Simposium Internacional de Nutrición Acuícola. Hermosillo, Sonora, México. Págs. 419 - 427

69

1). El origen biológico de la proteína es importante ya que generalmente un sistema de expresión

eucariota es más eficiente para sintetizar una proteína de origen eucariota que un sistema de expresión

procariota. Respecto a las propiedades químicas y biológicas de la proteína es importante analizar su

secuencia nucleotídica codificante para evaluar el uso de codones preferenciales y la presencia de

secuencias de finalización prematura de la transcripción, la secuencia aminoacídica para evaluar el peso

molecular, punto isoeléctrico y tipo de modificaciones postraduccionales presentes, la estabilidad al pH,

temperatura y proteólisis, la posible toxicidad sobre el hospedero, el destino celular deseado

(extracelular o intracelular) y el grado de pureza deseado. Un tercer factor a considerar es la aplicación

que se le dará posteriormente a la proteína, si ésta se aplicará en las áreas biomédica (agentes

terapéuticos, vacunas y diagnóstico clínico) o de alimentos (procesos industriales, aditivos y

nutraceúticos) para emplearla en humanos, animales o plantas, o en el área de la Química de la

transformación como la industria del papel, textil y del cuero, farmacéutica y química, o bien como

reactivo en el área de la química analítica o en el medio ambiente como fuente de energía o tratamiento

de residuos. Por último se tiene que considerar el bioproceso que se empleará para su producción

específicamente el tipo y condiciones operacionales de cultivo, la escala de producción de la proteína de

interés según si sólo se requieren unos pocos miligramos para fines de investigación o en la escala de

gramos o kilogramos para fines industriales, además de evaluar el costo del bioproceso.

Tabla 1. Factores determinantes en la selección de un sistema de expresión

ORIGEN DE LA

PROTEÍNA

Procariota

Eucariota

PROPIEDADES DE

LA PROTEÍNA

Secuencia nucleotídica

Propiedades químicas

Estabilidad

Uso de colores

preferenciales

Tamaño

pI

Modificaciones

postraduccionales

Proteólisis

pH

70

Toxicidad

Destino celular

Grado de pureza

Temperatura

Extracelular

Intracelular

APLICACIÓN

Biomedicina

Alimentos

Química de la Trasformación

Reactivo químico

Medio ambiente

Agente terapéutico

Vacunas

Diagnóstico

Procesos Industriales

Aditivos

Nutracéuticos

Suplemento alimenticio

Industria del papel

Industria textil y del cuero

Industria farmacéutica

Industria química

Reactivo analítico

Energía y combustibles

Tratamiento de residuos

Humanos

Animales

Vegetales

Catálisis enzimática

Síntesis estereoselectiva

BIOPROCESO Tipo

Condiciones de cultivo

Escala

Costo

Actualmente se emplean una gran variedad de hospederos que van desde organismos unicelulares tales

como bacterias, hongos, levaduras y líneas celulares de mamíferos, insectos o plantas, hasta organismos

completos como animales y plantas transgénicas.

Dentro de las bacterias, Escherichia coli ha sido la más empleada para estos fines, aunque también se

han utilizado Bacillus subtilis, Caulobacter crescentus, Pseudomonas sp., Streptomyces lividans,

71

Lactobacillus lactis, etc. (Walsh & Headon 1995). Debido al nivel de conocimiento sobre su fisiología y

genética, E. coli ofrece varias ventajas (Tabla 2) respecto a otros hospederos, lo que ha permitido el

desarrollo de una gran variedad devectores de expresión y cepas mutantes. Sin embargo, el empleo de

E. coli tiene también desventajas, tales como su ineficiencia para secretar proteínas al medio de cultivo y

además éstas suelen precipitar como cuerpos de inclusión insolubles en el citoplasma celular.

Adicionalmente, la síntesis de las proteínas heterólogas en E. coli induce a un incremento de la

proteólisis celular, cuenta con un sistema ineficiente para realizar modificaciones postraduccionales y

genera endotoxinas dañinas para la salud.

Si se emplea Bacillus subtilis, se tiene la ventaja de la secreción de la proteína heteróloga, sin embargo

esta bacteria secreta una gran cantidad de proteasas, además se dispone de una menor cantidad de

vectores de expresión, elementos promotores para la regulación de la expresión de los transgenes y se

ha reportado menor estabilidad genética de los plásmidos incorporados en el hospedero.

Los sistemas de expresión de proteínas recombinantes basados en levaduras han demostrado ser una

fuente eficiente y económica de proteínas de eucariotas superiores de interés industrial y/o académico

(Buckholz & Gleeson 1991, Romanos et al. 1992). Las levaduras ofrecen un ambiente apto para el

plegamiento de proteínas eucarióticas, llevan a cabo algunas modificaciones postraduccionales y

pueden secretar las proteínas recombinantes al medio de cultivo. Además las levaduras mantienen las

ventajas de los microorganismos al ser unicelulares, de fácil manipulación y rápido crecimiento. Por otro

lado tienen una organización celular eucariótica que permite la realización de procesos de expresión y

maduración característicos de células animales y vegetales (Eckart & Bussineau 1996), lo cual les da una

ventaja para la producción de proteínas de origen Eucariota.

El empleo de Saccharomyces cerevisiae como hospedero en un sistema de expresión eucariota ofrece la

ventaja de ser uno de los organismos eucariotes mejor caracterizado, su genoma ha sido totalmente

secuenciado y es considerado como organismo GRAS (Generally Recognized as Safe) por la FDA (Food

and Drug Administration) americana.

Por estos motivos, muchos de los sistemas de expresión desarrollados para la producción de proteínas

heterólogas están basados en S. cerevisiae. Las limitaciones de este microorganismo se han puesto de

manifiesto al aumentar de manera significativa el número de sistemas de expresión basados en

levaduras no convencionales (no Saccharomyces), los cuales exhiben mejores prestaciones como

productores de ciertas proteínas heterólogas. Entre estos nuevos microorganismos hospederos se

72

incluyen Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis, los cuales

constituyen la base de diversos procesos desarrollados a escala industrial.

Tabla 2. Ventajas y desventajas de diferentes hospederos para la producción de proteínas

recombinantes

BACTERIAS

Escherichia coli

VENTAJAS DESVENTAJAS

Buen nivel de conocimiento sobre su fisiología y

genética

Se cuenta con una gran variedad de vectores de

expresión y cepas mutantes

Fácil manipulación

Cultivos baratos con altas densidades celulares

Niveles moderados de producción de la proteína

recombinante

Ineficiente secreción de la proteína al medio de

cultivo

Formación de cuerpos de inclusión insolubles en el

citoplasma celular

La síntesis de las proteína heterólogas induce a un

incremento de la proteólisis celular

Realiza pocas modificaciones postraduccionales

Generación de endotoxinas dañinas para la salud

humana y animal

Bacillus subtilis

Secreción de proteína heteróloga Secreta una gran cantidad de proteasas afectando el

rendimiento del producto recombinante

Dispone de pocos vectores de expresión y elementos

promotores para la regulación de la expresión de los

transgenes comparado con E. coli

Menor estabilidad genética de los plásmidos

incorporados en el hospedero

73

LEVADURAS

Saccharomyces cerevisiae

Sistema eucariota mejor caracterizado desde el punto de vista de la Biología

Molecular y la Fisiología

Genoma totalmente secuenciado

Vectores de expresión y cepas disponibles

Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e industrial

Cultivos baratos

Se producen altos niveles de proteína recombinante

Realiza modificaciones postraduccionales

Es considerado como organismo GRAS

Produce

hiperglicosilaciones

Baja eficiencia en la

producción de proteína

heteróloga

Pichia pastoris

Emplea los promotores más fuertes y eficientemente regulados, de los conocidos

Vectores de expresión y cepas disponibles

Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e industria

Secreción eficiente de proteína heteróloga

Medios de cultivo son baratos y formulados libre de toxinas y pirógenos

Los cultivos alcanzan altas densidades celulares

Altos niveles de producción

Bajos niveles de secreción de proteínas endógenas facilitando la purificación de la

proteína heteróloga

Produce patrones de

glicosilación no

deseables para

algunas proteínas

Actividad

proteolítica

Algunas proteínas

no se producen de

forma eficiente

74

El sistema de expresión basado en la levadura metilotrófica Pichia pastoris ha ganado aceptación como

hospedero para la producción de proteínas recombinantes (Romanos 1995, Escamilla-Treviño et al.

1999, Cereghino & Cregg 2000). Pichia pastoris comparte las ventajas de fácil manipulación genética y

bioquímica con S. cerevisiae pero supera a ésta de 10 a 100 veces en los niveles de producción de

proteínas heterólogas (Cregg et al. 1993, Romanos 1995, Guerrero-Olazarán & Viader-Salvadó 2003).

Ambas levaduras se han utilizado en la producción de muchas proteínas eucariotas y en la mayoría de

los casos la productividad de P. pastoris ha sido muy superior a la de S. cerevisiae (Romanos 1995,

Cereghino & Cregg 2000). Pichia pastoris comparada con S. cerevisiae, presenta importantes ventajas

para la expresión de proteínas heterólogas. En P. pastoris el promotor usado para transcribir genes

heterólogos proviene del gen de la enzima alcohol oxidasa 1 (AOX1) de P. pastoris cuya expresión es

regulada por metanol. Este promotor es uno de los más eficientes y fuertemente regulados de los

conocidos actualmente. Esta capacidad para mantener los cultivos con la expresión heteróloga

“apagada” en ausencia de metanol es importante para minimizar el efecto tóxico que presentan muchas

proteínas heterólogas sobre el hospedero (Cereghino & Cregg 1999). Por otro lado, mientras que S.

cerevisiae presenta dificultades para conseguir elevadas densidades celulares, P. pastoris es

relativamente fácil de cultivar a densidades celulares de ~100 g/L, en peso seco. Además, S. cerevisiae

puede presentar baja eficiencia en la secreción de proteínas heterólogas (Cereghino & Cregg 1999,

Guerrero-Olazarán & Viader-Salvadó 2003). Adicionalmente, la glicosilación en el proceso de post-

traducción en P. pastoris se lleva a cabo con oligosacáridos más pequeños que en S. cerevisiae,

reduciendo los fenómenos de hiperglicosilación de muchas proteínas de eucariotas expresadas en este

último sistema (Romanos 1995, Higgins & Cregg 1998). Cabe destacar los bajos niveles de secreción al

medio de cultivo de proteínas endógenas en P. pastoris, lo cual supone una gran ventaja para la

purificación de la proteína recombinante producida. Finalmente, el medio de cultivo empleado para el

cultivo de P. pastoris en un biorreactor es una mezcla definida de sales, oligoelementos, biotina y fuente

de carbono y nitrógeno que no resulta ser caro y puede ser formulado libre de toxinas y pirógenos

(Higgins & Cregg 1998, Viader-Salvadó & Guerrero-Olazarán 2003).

Aunque muchos metabolitos se obtienen a partir de microorganismos no modificados por ingeniería

genética, la incorporación de esta metodología permitió optimizar la eficiencia del proceso de

producción y/o la calidad del producto. Por un lado, fue posible modificar el control de vías metabólicas,

75

por ejemplo para la sobreproducción de metabolitos, y por otro, permitió fabricar proteínas bajo la

forma de proteínas recombinantes.8

Las ventajas que presenta la producción de una proteína bajo la forma de proteína recombinante son:

Permite obtener a partir de un microorganismo, cultivo de células, planta o animal una proteína

completamente ajena, tal es el caso de la producción de insulina en bacterias, anticuerpos

humanos en plantas y vacunas en levaduras.

Se obtienen grandes cantidades del producto, fácil de purificar y más barato, en comparación

con el purificado a partir de su fuente natural (en el caso de la insulina, se obtenía a partir de

páncreas de animales).

Se obtienen productos libres de patógenos y otros riesgos potenciales. Esto es particularmente

importante en el caso de los productos farmacéuticos, ya que mucha gente ha contraído

enfermedades como SIDA y hepatitis B o C por empleo de hormonas o factores derivados de

suero o sangre (por ejemplo, los factores de coagulación para el tratamiento de la hemofilia

ahora pueden administrarse como proteínas recombinantes, libres de contaminación).

Pueden producirse proteínas que no existen en la naturaleza, como ciertas estructuras de

anticuerpos denominadas “anticuerpos de cadena simple”, útiles en el diagnóstico y tratamiento

de algunas enfermedades.

En los últimos años han sido publicados diversos estudios focalizados a la optimización de la producción

y escalado de proteínas recombinantes (proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería

genética producidas en células distintas a las que se producen en la naturaleza) para uso médico,

veterinario e industrial. Aunque se han producido en células de mamíferos, insectos y levaduras, la

bacteria Escherichia coli continúa siendo el microorganismo más empleado para la expresión de genes

heterólogos o recombinantes.

Muchas proteínas heterólogas expresadas intracelularmente en E. coli se producen rutinariamente con

niveles superiores al 15% del total de proteínas celulares producidas en esta bacteria, a menudo en

forma de agregados insolubles intracelulares, llamados cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión

están determinados por una combinación de factores relativos a la velocidad de plegamiento y

8 Concejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/07.php

76

agregación, solubilidad de la proteína, estabilidad termodinámica y plegamiento intermediario así como

susceptibilidad a degradación proteolítica e interacción con chaperonas.

Al elegir un sistema de expresión de proteínas recombinantes para incrementar los niveles de

producción de las mismas deben tenerse en cuenta muchos factores. Estos incluyen características del

crecimiento celular, niveles de expresión, expresión intracelular y extracelular, modificaciones post-

traduccionales, actividad biológica de la proteína de interés, así como características especiales en el

caso de la producción de proteínas terapéuticas. La selección de un sistema particular de expresión

requiere además la valoración de costos del proceso así como de otras consideraciones económicas. Si

bien E. coli es el microorganismo más empleado para la producción de proteínas recombinantes, debido

en parte al conocimiento de la biología molecular del mismo, no todos los genes pueden expresarse

eficientemente en este microorganismo. Esto puede estar determinado por las características de la

secuencia génica, estabilidad y eficiencia traduccional del ARN mensajero (ARNm; molécula usada como

molde, formada a partir de la secuencia de ADN necesaria para la síntesis de una determinada proteína),

plegamiento proteico, degradación proteica por enzimas celulares llamadas proteasas, diferencias de

uso de determinados codones (código de ADN que indica un determinado aminoácido), así como la

toxicidad potencial de la proteína heteróloga en la célula donde se va a producir. Las mayores

desventajas de los sistemas de expresión en E.coli incluyen la incapacidad de realizar modificaciones

post-traduccionales (o sea modificaciones que se realizan en las proteínas inmediatamente después que

la misma ha sido sintetizada en la célula) en proteínas eucariotas (proteínas sintetizadas en células no

bacterianas), la carencia de mecanismos de secreción para la liberación eficiente de proteínas al medio

de cultivo, y limitada capacidad de formación de puentes disulfuro. Sin embargo, por otro lado, muchas

proteínas eucariotas retienen su actividad biológica en forma no glicosilada pudiendo ser producidas

eficientemente en E. coli.9

Factores antihemolíticos

Los factores de la coagulación, a excepción del 6, se enumeran con números romanos, y son:

I: Fibrinógeno

II: Protrombina

9 Este artículo está basado en parte del trabajo de tesis de la Maestría en Biotecnología: “Producción de Estreptolisina-O recombinante para uso diagnóstico” realizado por Blanca Velázquez (Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay)

77

III: Factor tisular (Tromboplastina)

IV: Calcio

V: Proacelerina (factor labil)

VII: Proconvertina (factor estable)

VIII: Factor antihemofílico A

IX: Factor antihemofílico B, Factor de Christmas

X: Factor de Stuart-Prower

XI: Factor antihemofílico C

XII: Factor de Hageman

XIII: Factor estabilizante de la fibrina

Son esenciales para que se produzca la coagulación, y su ausencia puede dar lugar a trastornos

hemorrágicos graves. Se destacan:

El factor VIII: Su ausencia produce hemofilia tipo A.

El factor IX: Su ausencia provoca hemofilia B.

El factor XI: Su ausencia provoca hemofilia C.

El factor antihemofílico (FAH), o proteína coagulante factor VIII, es una proteína que regula la activación

del factor X por las proteasas generadas en la vía intrínseca de la coagulación. Se sintetiza en el hígado y

circula formando un complejo con otra proteina, el factor de Von Willebrand (FvW). El factor VIII está

presente en concentraciones bajas (10ug/L) y el gen que codifica este factor esta en el cromosoma X.10

Uno de cada 10.000 varones nace con un déficit o defecto funcional de la molécula del factor VIII. El

proceso resultante, la Hemofilia A, se caracteriza por hemorragias en los tejidos blandos, los músculos y

las articulaciones que soportan peso. Los pacientes con manifestaciones clínicas suelen tener

concentraciones del factor VIII inferiores al 5%. Los pacientes que tienen menos de 1% de actividad del

factor VIII padecen una forma grave de hemofilia; sangran con frecuencia incluso sin traumatismos

perceptibles. Los pacientes con una concentración de 1 a 5% tienen una hemofilia moderada con

episodios hemorrágicos menos frecuentes; y los que tienen concentraciones de más del 5% presentan

10 HARRISON T.R. Principios de medicina interna. Vol 1. Edicion 15. New York, 2001; Mc Graw Hill Corp; pag 882-901.

78

un cuadro leve con hemorragias infrecuentes desencadenadas casi siempre por algún traumatismo. La

mayoría de los pacientes con hemofilia A tienen concentraciones del factor VIII inferiores al 5%.11

Las hemorragias de la hemofilia aparecen horas o días después de sufrir una lesión, pueden afectar a

cualquier órgano y si no se tratan pueden persistir durante días o semanas. Así, pueden formarse

grandes acúmulos de sangre parcialmente coagulada que comprimen los tejidos próximos y producir

necrosis musculares, congestión venosa y lesiones isquémicas de los nervios. Normalmente el

hemofílico consulta por dolor seguido de una hinchazón en la articulación que soporta peso como la

cadera, la rodilla o el tobillo. La acumulación de sangre en la articulación (hemartrosis) y la hematuria

sin afección genito urinaria son frecuentes en estos pacientes. Los pacientes con sospecha de hemofilia

deben estudiarse mediante recuento plaquetario, TH, TP y TPT. Generalmente el paciente tiene un TPT

prolongado con normalidad de las otras pruebas es necesario realizar análisis especifico para cuantificar

el factor VIII y X e identificar que factor es el afectado. El 10-20% de los pacientes presentan inhibidores

del factor VIII y el tratamiento médico depende de la presencia o ausencia de estos, en casos de no

presentarlos el manejo puede incluir la utilización de estimulantes transitorios del factor VIII como

(DDAVP), agentes antifibrinoliticos como el acido epsilon-aminocaproico (EACA) o el acido tranexamico

o la sustitución de factores con crioprecipitados, plasma fresco congelado, factor VIII purificado a alta

temperatura o utrapuro. En casos de cifras bajas o moderadas de los inhibidores de Factor VIII se

pueden utilzar dosis altas de factor VIII purificado, esteroides o concentraciones de factor VIII de porcino

y en los casos de niveles altos de inhibidores de factor VIII se utilizan concentrados de complejo

protrombina, factor IX activado, esteroides y concentraciones de factor VIII de porcino.

Los pacientes con hemofilia A deben ser manejados teniendo en cuenta la ínter consulta con el

hematólogo el cual establece el diagnostico, el grado de deficiencia del factor VIII y la presencia de algún

inhibidor de este. Posteriormente, selecciona el tipo de sustitución a realizar y determina la dosis.

DNAasa I (DNASA I - Desoxirribonucleasa I - Bovine Páncreas - Páncreas de Bovino)

Desoxirribonucleasa I (generalmente llamada DNAasa I), es una endonucleasa codificada por el gen

humano DNASE1. DNasa I es una nucleasa que corta el ADN preferentemente en los enlaces fosfodiéster

adyacente a nucleótidos de pirimidina, produciendo polinucleótidos terminados en 5'-fosfato- con un

grupo hidroxilo libre en posición 3', en tetranucleótidos de producción promedio. Actúa sobre cadena de

11 KASPER D, BRAUNWALD E, FAUCI A, HAUSER S. Harrison’s Principles of Internal Medicine. Vol 1. 2005; Mc Graw Hill; pag 681-689.

79

ADN simple, doble cadena de ADN y la cromatina. Se ha sugerido una de las desoxirribonucleasas como

responsable de la fragmentación del ADN durante la apoptosis.12

DNasa I se une a la proteína de citoesqueleto, actina. Se une monómeros de actina con muy alta

afinidad (sub-nanomolar) y polímeros de actina con menor afinidad. La función de esta interacción no

está clara. Sin embargo, la unión actina – DNasa I es enzimáticamente inactiva, el complejo DNasa -

actina podría ser una forma de almacenamiento de DNasa I que previene el daño de la información

genética.

Este gen codifica un miembro de la familia DNasa. Esta proteína se almacena en los gránulos de

zimógeno de la envoltura nuclear y funciona en el clivaje del ADN de una manera endonucleolítica. Al

menos seis alelos codominantes autosómica se han caracterizados, DNASE1*1 a DNASE1*6. Las

mutaciones en este gen, así como el factor de inactivación de su producto de enzima, se han asociado

con el lupus eritematoso sistémico (LES), una enfermedad autoinmune. Una forma recombinante de

esta proteína se utiliza para tratar uno de los síntomas de la fibrosis quística hidrolizando el DNA

extracelular en el esputo y la reducción de su viscosidad. Variantes del empalme transcripcional

alternativo de este gen se han observado, pero no han sido bien caracterizadas.

Riesgos

12 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=1773

80

Regulación de la expresión génica a nivel de la cromatina13

Existen cuatro subniveles de regulación al nivel de la cromatina:

1. Condensación de la cromatina: sitios sensibles e hipersensibles a la DNasa I

2. Zonas superenrolladas

3. Metilación de las citosinas

4. Reordenamiento del genoma

Condensación de la cromatina: sitios sensibles e hipersensibles a la DNasa I

La estructura cromatiniana descondensada representa, al parecer, el primer y más elevado nivel de

regulación. Es a este nivel que se llevará a cabo la selección entre los genes que la célula está

autorizada a transcribir y aquellos que ella no debe transcribir. La cromatina está constituida por el

DNA enrollado alrededor de una serie de nucleosomas, empaquetada más relajada en las regiones

que contienen genes activos. Además de los cambios generales que ocurren en las regiones activas o

potencialmente activas, ocurren cambios estructurales en sitios específicos asociados con la

iniciación de la transcripción o con determinadas características estructurales del DNA. Estos

13 http://fbio.uh.cu/sites/genmol/confs/conf7/index_euc.htm

81

cambios se detectaron por primera vez gracias a los efectos de la digestión con concentraciones

muy débiles de la enzima DNAsa I.

Cuando la cromatina se digiere con DNAsa I, el primer efecto es la introducción de cortes en la doble

cadena en sitios hipersensibles específicos. Ya que la susceptibilidad a la DNAsa I refleja la

disponibilidad del DNA en la cromatina, consideramos que estos sitios representan regiones de la

cromatina en las cuales el DNA está específicamente expuesto porque no está organizado en la

estructura nucleosómica usual. Un sitio hipersensible típico en la cromatina es cien veces más

sensible al ataque de las enzimas. Estos sitios también son hipersensibles a otras nucleasas y a

agentes químicos. Ellos representan fragmentos de DNA desprovistos de nucleosomas.

Muchos de los sitios hipersensibles están relacionados con la expresión génica. Cada gen activo

tiene su sitio en la región del promotor y a veces más de un sitio. La mayoría de los sitios

hipersensibles se encuentran solamente en la cromatina de las células en las cuales se está

expresando el gen asociado; no se encuentran cuando el gen está inactivo. Se asume que un sitio

hipersensible es el resultado de la unión de proteínas reguladoras específicas que excluyen los

nucleosomas. Los factores de transcripción pueden generar sitios hipersensibles asociados a la

transcripción.

Zonas superenrolladas

El superenrollamiento negativo del DNA hace que las bases estén más accesibles a las proteínas.

Algunos resultados experimentales demuestran que la variación del grado de torsión del DNA se

utiliza como medio para modificar el acceso de las proteínas al promotor, lo mismo en eucariontes

que en procariontes, regulando así la expresión de los genes correspondientes. Las mutaciones en

los genes de las topoisomerasas, que son las enzimas que crean o eliminan los supergiros,

disminuyen su actividad y también disminuyen importantemente la transcripción de numerosos

genes. Este efecto también se obtiene por los inhibidores de las topoisomerasas. Sin embargo, este

resultado no es general, y sólo algunos genes están afectados. Las topoisomerasas implicadas en

esta regulación parecen fijarse a determinadas secuencias específicas del DNA situadas antes de los

promotores.

82

La expresión génica está asociada a la no-metilación

La metilación del DNA tiene lugar en sitios específicos. En bacterias está asociado a la identificación

de una determinada cepa bacteriana y también con la diferencia entre el DNA replicado y el no

replicado. En eucariontes, su función primordial conocida está asociada al control de la

transcripción. Entre el 2 y el 7% de las citosinas en el DNA de las células animales está metilado (el

valor varía con las especies). La mayoría de los grupos metilo se encuentran en los "dupletes" CG, y,

de hecho, la mayoría de las secuencias CG están metiladas. Generalmente, los residuos C en ambas

cadenas de este tipo de secuencia palindrómica están metiladas. Cuando un duplete está metilado

en una sola de las dos cadenas, se dice que está hemimetilado.

Muchos genes tienen un patrón de metilación que es constante en la mayoría de los sitios, pero

puede variar en otros. Una minoría de sitios está metilado en tejidos en los cuales no se expresa el

gen, pero no están metilados en los tejidos en los cuales el gen se encuentra activo. Por tanto, un

gen activo se puede describir como hipometilado. Un gen metilado es inactivo, pero el no metilado

es activo. Una región hipometilada coincide con una región de máxima sensibilidad a la DNAsa I. La

metilación en el extremo 5´ de un gen puede estar directamente relacionada con su expresión.

Muchos genes no están metilados en el extremo 5´ cuando se expresan, aunque permanecen

metilados en el extremo 3´. Al igual que como sucede con otros cambios en la cromatina, parece

probable que la ausencia de grupos metilo esté asociada con la posibilidad de transcripción y no con

el propio acto de la transcripción.

Reordenamiento del genoma

Entre los genes cuya expresión está condicionada por un reordenamiento genómico figuran los

genes de determinados antígenos de superficie en el tripanosoma, los genes de las proteínas del

sistema inmune y los genes que intervienen en la esporulación de la levadura (mating-type o

fenotipo sexual). Los reordenamientos del DNA generan diversidad, tanto en procariontes como en

eucariontes. Las consecuencias generales del reordenamiento pueden ser:

a) Crear nuevos genes como es el caso de las inmunoglobulinas, necesarias para la expresión en

determinadas circunstancias.

b) El reordenamiento puede ser responsable del cambio de la expresión de un gen ya existente en

otro. Esto ofrece un mecanismo para la regulación génica. Este es el caso del fenotipo sexual o

83

esporulación de las levaduras.

Eritropoyetina (EPO) 14

La eritropoyetina es una hormona glicoproteica de gran importancia para la formación de glóbulos rojos

durante la generación de sangre (hematopoyesis). La palabra deriva del griego erythros “rojo” y poiein

“hacer”, y también se la suele llamar EPO, epoetina y antiguamente hematopoyetina.

Tiene 30 400 d de peso molecular y regula la proliferación y diferenciación de los precursores eritroides

en la médula ósea, su gen se expresa en el cromosoma 7 (q11- q22) y codifica una proteína de 193

aminoácidos.

La EPO está entre los Agentes Estimulantes de la Eritropoyesis. Como medicamento, la eritropoyetina se

fabrica de forma biotecnológica para el tratamiento de la anemia en pacientes que hacen diálisis, en los

cuales la formación de sangre está alterada debido a un fallo en los riñones, y también después de ciclos

de quimioterapia agresivos. La EPO también es tristemente famosa por los numerosos escándalos de

dopaje en los que se ha visto implicada, en especial en el ciclismo, lo que ha hecho que algunos la

llamen “droga del ciclista”. El principal efecto adverso que produce es un incremento del riesgo de

complicaciones cardiovasculares si se usa para elevar los niveles de hemoglobina por encima de 13

gramos por decilitro de sangre.

Biosíntesis y función biológica

La eritropoyetina pertenece filogenéticamente a la familia de las citoquinas, entre las que se encuentran

también la somatotropina, la prolactina, las interleuquinas 2-7, y los llamados “Factores Estimulantes de

la Colonia” (G-CSF, M-CSF y GM-CSF). En el cuerpo humano, la EPO se forma en un 85-90% en el riñón

mediante el endotelio de los capilares situados alrededor de los canales nefríticos, y en un 10-15% en los

hepatocitos del hígado. Además, podría sintetizarse también en el cerebro, la matriz, los testículos y el

bazo.

El gen de la EPO en el hombre se encuentra en el cromosoma 7 (posición 7q21-7q22). La síntesis es

estimulada por la saturación de oxígeno (hipoxia) en la sangre. Esto lleva a la translocación de la

subunidad alfa del “Factor Inducido por Hipoxia” (brevemente FIH) desde el citoplasma en el núcleo de

las células productoras de EPO. Allí, el FIH se enlaza a la subunidad β (FIH-β) acompañante, de donde se

origina el heterodímero HIF-1. Este se enlaza otra vez con el factor de transcripción CREB y el p300. El 14 http://www.eritropoyetina.com/

84

complejo proteínico resultante consiste de tres elementos iniciales mediante una conexión a tres

bandas del gen de la EPO.

La concentración de la hormona en el suero de un hombre sano es de hasta 19 mU/mL. En la

eritropoyesis, la EPO se enlaza en la médula al receptor de la eritropoyetina en las células del precursor

tipo BFU-E (Unidad Formadora de Colonias Explosivas Eritroides), primero a las células más maduras del

tipo CFU-E (Unidad Formadora de Colonias Eritroides), y finalmente a los eritrocitos diferenciados.

EPO: ruta Jak – Stat (Receptores de la EPO y transducción de señales)

El receptor (EpoR) pertenece a la familia de los receptores de las citoquinas, cuyas características

estructurales comunes consisten en dos o más dominios similares a la inmunoglobulina, cuatro residuos

de cisteína y la secuencia extra-celular WSXWS (Triptófano-Serina-variable Aminoácido-Triptófano-

Serina). La conexión de la EPO produce un homodímero del receptor que activa la enzima quinasa

acoplada al receptor otra vez vía transfosforilación. Además, los restos de tirosina enlazados al receptor

85

se fosforilan y sirven como una estación de acoplamiento para la proteína de transducción de señales

STAT5 mediante la cual se producen diferentes cascadas de señalización. En conjunto hay 94 proteínas

implicadas.

Cada día se generan aproximadamente doscientos mil millones de eritrocitos. Además de en la

eritropoyesis, la EPO actúa en la diferenciación de las células de precursor y también estimula en

pequeña medida la formación de megacariocitos. La insuficiencia aguda y crónica debida a

enfermedades degenerativas del riñón, lleva a una menor formación de EPO y por eso se produce una

anemia renal.

La función de la EPO en el organismo no es sólo la formación de nuevos eritrocitos. El receptor de la EPO

se ha encontrado en diferentes tipos de células somáticas como las neuronas, los astrocitos, células de

la microglía y las células del músculo del corazón. Se han observado interacciones entre la EPO y su

receptor en tejidos que no forman sangre, como en la quimiotaxis, angiogénesis, activación intracelular

del calcio y la inhibición de la muerte celular. Se han encontrado lugares específicos para la EPO en las

neuronas, especialmente en el hipocampo, una región del cerebro muy afectada cuando se produce

falta de oxígeno.

Cualidades estructurales

El gen de la EPO (5,4 kb, 5 exones y 4 intrones) codifica una proteína pro-EPO con 193 aminoácidos.

Mediante una modificación posterior, el terminal N se convierte en un péptido con 27 aminoácidos

residuales así como el residuo de asparagina del terminal C restante mediante la acción de la

carboxipeptidasa intracelular.

Químicamente la EPO humana es un polipéptido ácido no ramificado a partir de 165 monómeros de

aminoácido y un peso molecular de aproximadamente 34kDa. La estructura terciaria consiste de cuatro

hélices α antiparalelas de lazos vecinos. La cantidad de hidratos de carbono es aproximadamente el 40%

de la masa molecular, consistente en un O-glicosídico (Ser. 126) y tres N-glicosídicos (Asn 24, Asn 38 y

Asn 83). Las cadenas laterales, por su parte, están formadas por los monosacáridos manosa, galactosa,

fucosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina y N-acetilneuramianoácido. El N-glicosídico ocupa

las cadenas laterales que poseen varias ramas exteriores que se llaman “antenas”.

86

Al contrario que los aminoácidos constantes de la molécula de EPO, las estructuras de azúcares son

variables. En este sentido se habla de una microheterogeneidad de la molécula de EPO, que se presenta

no sólo en estado natural sino también en la EPO recombinante. Ésta está marcado por una parte por

secuencias variables de monosacáridos en las cadenas laterales de azúcares, y por otra parte por una

cantidad variable de N-acetilneuramínico al final; éste último, también conocido por el nombre común

de ácido siálico, es decisivo para la actividad biológica de las glicoproteínas: cuanto más alto sea el nivel

de ácido siálico más alta será la actividad y la concentración en sangre de la hormona. Hay que destacar

que la isoforma de ácido siálico muestra una afinidad más pequeña al receptor de la EPO en

experimentos in vitro. Las isoformas funcionales son desmontadas poco a poco por las células del

cuerpo que llevan el receptor de EPO. En el desmontaje, las moléiculas de EPO son descompuestas por

endocitosis inducida por el receptor en la parte interna del lisosoma. Una particularidad de la molécula

de EPO es la sulfatación en las cadenas laterales de azúcar del N-glicosídico. Hasta el momento se

desconoce la función exacta de la sulfatación, que se produce tanto en la forma nativa como en la

recombinante.

Estructura de la EPO

87

Indicaciones para la terapia

De los factores de crecimiento empleados clínicamente en la actualidad, es la EPO la que posee el mayor

espectro de indicación. La terapia clásica con EPO está diseñada para poner en marcha la formación de

glóbulos rojos sanguíneos en pacientes con anemia de tipo renal, cancerosa o como consecuencia de

quimioterapias. Además, se considera como seguro que la tasa de reacción puede incrementarse

mediante hipoxia del tumor o quimioterapia del tumor después de la aplicación de EPO.

El mecanismo patológico de una anemia tumoral se produce por una perturbación en la utilización del

hierro que puede ser reparada con la adición de EPO. Dado que estos mecanismos se muestran también

en infecciones crónicas (como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa) o sepsis, se ha utilizado la

EPO como terapia de apoyo desde hace años en estudios clínicos. Se están evaluando otras formas de

terapia con EPO, en el tratamiento del síndrome de fatiga crónica, el síndrome mielodisplásico, la

anemia aplásica, la osteomielofibrosis y las infecciones por VIH. Sus cualidades citoprotectoras en

ensayos con cultivos celulares y con animales hacen a la EPO una candidata interesante para el

tratamiento de enfermedades neurológicas agudas como, por ejemplo, los ataques de apoplejía, y

también para enfermedades neurodegenerativas. Según un estudio piloto publicado en 2006, la EPO

puede producir, posiblemente, una ligera mejora de las capacidades cognitivas como medicamento de

apoyo en el tratamiento de pacientes esquizofrénicos. Los científicos suponen que el efecto observado

podría basarse en las cualidades protectoras de la EPO frente a mecanismos neurodegenerativos; sin

embargo, los resultados no han sido confirmados hasta ahora por otros grupos de investigación. En otro

estudio se ha observado que la EPO produce efectos neuropsicológicos que mejoran el estado de ánimo

en pacientes con miedo y depresión.

EPO y dopaje

El uso de la EPO como droga de dopaje en el deporte está prohibido. El efecto "positivo" de la EPO se

debe a que aumenta la masa eritrocitaria (elevando el hematocrito), lo que permite un mejor

rendimiento del deportista en actividades aeróbicas. De esta forma se aumenta la resistencia al ejercicio

físico.

Glucocerebrosidasa

La enfermedad de Gaucher es una rara enfermedad autosómica recesiva producida por un déficit de

glucocerebrosidasa (glucosilceramidasa), enzima que interviene en la degradación lisosómica de los

88

glucolípidos. En ausencia de dicha enzima se produce una acumulación secundaria de glucocerebrósidos

insolubles (glucosilceramida) en los lisosomas de los macrófagos. La enfermedad de Gaucher es más

frecuente en la población judía, de origen Ashkenazi , aunque también se presenta en otras poblaciones

no judías. La glucocerebrosidasa está codificada por un gen (GBA) situado en 21q en el cromosoma 1.15

Es una enzima lisosomal que degrada lípidos (grasas) complejos, glucoesfingolípidos, como la

glucosilceramida.

La imiglucerasa es una forma modificada de la β-glucosidasa ácida humana producida mediante

tecnología de ADN recombinante utilizando un cultivo celular de mamífero procedente de ovario de

hámster chino (CHO), con modificación en la manosa dirigida a macrófagos. Su utiliza en el tratamiento

de la enfermedad de Gaucher16

Hormona del crecimiento

La Hormona de Crecimiento Humana se sintetiza actualmente mediante tecnología de ADN

recombinante y su secuencia es similar a la hormona de crecimiento humana. Se utiliza en niños con

baja talla idiopática o por déficit de Hormona de Crecimiento, en pacientes con Insuficiencia Renal

Crónica, Síndrome de Turner o Síndrome de Prader Willy.

Existen en la actualidad, diversos preparados comerciales de hormona de crecimiento disponibles en el

mercado. En este informe se analizó la información sobre la composición de cada una de las

presentaciones. Se realizó una búsqueda bibliográfica con la intención de determinar si existe evidencia

científica publicada sobre la superioridad de un tipo de preparado o presentación sobre otro en cuanto a

su eficacia, efectividad o seguridad.17

En el país, todas las presentaciones de hormona crecimiento son realizadas mediante tecnología de ADN

recombinante. Existen 9 marcas comerciales disponibles en un total de 14 presentaciones. Las

principales diferencias entre las distintas presentaciones están relacionadas con el modo de aplicación

(frasco ampolla, jeringas prellenadas, etc.) y no con la droga en sí. Si bien las presentaciones existentes

15 http://www.iqb.es/hematologia/monografias/gaucher/gaucher01.htm16 http://www.iqb.es/cbasicas/farma/farma04/i029.htm17 Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria. Análisis sobre las diferentes presentaciones disponibles deHormona de Crecimiento Humana. Documentos de Evaluación de Tecnologías Sanitarias, Informe deRespuesta Rápida N° 12, Buenos Aires, Argentina. Octubre 2003.

89

pueden diferir en ciertos aspectos técnicos como el material al que se transfiere el material genético o

las técnicas de purificación, en todos los casos se trata del mismo principio activo: hormona de

crecimiento humana elaborada mediante tecnología de ADN recombinante. No se encontró evidencia

científica que haya demostrado la superioridad de alguna forma de hormona de crecimiento sobre otra

ni de una forma de aplicación o presentación sobre otra.

La hormona del crecimiento (HC) es un polipéptido natural producido por la glándula hipofisaria bajo el

control del hipotálamo. Es una hormona esencial para el crecimiento en niños y también tiene

importantes efectos en el metabolismo de proteínas, lípidos y carbohidratos. En los niños, la HC

promueve el crecimiento, estimulando la secreción de hormonas (somatomedinas) en el hígado. En los

adultos, la HC tiene efectos anabólicos estimulando la síntesis de proteínas en el músculo y la secreción

de ácidos grasos del tejido adiposo. Inhibe la captación de glucosa por el músculo y estimula la captación

de aminoácidos.

La deficiencia de la hipófisis da lugar a una producción y secreción insuficiente de la hormona.

Esta deficiencia conduce al retraso del crecimiento. El tratamiento se basaba en el empleo de hormona

del crecimiento obtenida de glándulas hipofisarias de cadáveres humanos. Sin embargo, se interrumpió

esta práctica al ser asociada con la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, trastorno neurológico progresivo

producido por un virus lento. Actualmente su producción se realiza mediante tecnología de ADN

recombinante y su secuencia es idéntica a la de la hormona de crecimiento humana.

Se administra en forma subcutánea 6-7 veces por semana. Los efectos adversos son raros y pueden

incluir cefaleas, nauseas y vómitos, problemas visuales, artralgias, mialgias, parestesias, hipotiroidismo y

reacciones locales en el sitio de inyección.

Todavía hay, sin embargo, incertidumbre sobre su seguridad en el largo plazo. Ha generado

preocupación la asociación encontrada entre el uso de HC y cáncer colorrectal aunque no puede saberse

si esta asociación existiría también con las dosis que se emplean actualmente. El riesgo de desarrollo de

diabetes, sobre todo en la población predispuesta, también debe ser vigilado.

Por otro lado, si bien la HC aumenta en la mayor parte de los casos la velocidad de crecimiento, no en

todas las situaciones clínicas se ha demostrado claramente su capacidad para mejorar la talla final

adulta, que es finalmente el principal objetivo de tratamiento.

90

Por esto motivos, falta de evidencia clara acerca de sus beneficios en determinadas situaciones e

incertidumbre acerca de su seguridad a largo plazo, se debe ser cauto a la hora de decidir su indicación

Se ha postulado su uso en los siguientes escenarios clínicos:

Niños con baja estatura idiopática

Niños con déficit de hormona de crecimiento

Pacientes con insuficiencia renal crónica

Pacientes con síndrome de Turner

Pacientes con síndrome de Prader-Willi

Insulina

La hormona insulina, involucrada en la regulación y metabolismo de la glucosa, fue hasta la década de

los 80 obtenida de páncreas de cerdo o bovino. Fue a partir de 1982, cuando se introdujo en el mercado

insulina humana producida por ingeniería genética, empleando como organismo productor la bacteria

Escherichia coli. Actualmente se emplean además de E. coli otros microorganismos, tales como algunos

tipos de levaduras.

Es de destacar que la insulina humana obtenida por ingeniería genética fue la primera molécula

producida con fines terapéuticos que se introdujo en el mercado. Desde su introducción en el mercado,

ha sustituido paulatinamente a la insulina obtenida de páncreas de cerdos y bovinos. En la década de los

90 la “insulina humana recombinante” representaba el 70% de la insulina disponible en el mercado,

siendo actualmente el 93% de la insulina producida.18

La producción de “insulina recombinante” posee las ventajas de tener protocolos de producción más

sencillos, con altos rendimientos de producto, por lo tanto, a medida que los mismos son introducidos

en el mercado, dan como resultado una sensible reducción en los costos de los mismos.

Las nuevas técnicas de ingeniería genética empleando plantas o animales transgénicos, permitirían aún

mayores rendimientos de producción, sin necesidad de contar con grandes reactores de cultivo en el

laboratorio. Estas nuevas tecnologías aplicadas a la producción en gran escala de insulina actualmente

están en distintas fases de desarrollo y restan realizar en algunos casos pruebas de seguridad y eficacia

del producto; pero de ser los resultados positivos, se estima que en poco tiempo, quizás en unos 3 años,

18 http://www.bioero.com/index.php?tag=insulina-recombinante

91

puedan estar disponibles para el tratamiento de pacientes con diabetes 1 o diabetes tipo 2 con

requerimientos de insulina.

La producción de la molécula de insulina ha sido pionera en el advenimiento de la “era de la ingeniería

genética” , y es sin lugar a dudas una de las moléculas de gran importancia en el mundo de las moléculas

de uso terapéutico; ya que el número de personas, en especial de los países desarrollados que padecen

diabetes es importante, considerando la enfermedad como una pandemia.

Existen en el mundo cerca de 200 millones de personas que padecen diabetes y las proyecciones

epidemiológicas dicen que esta cifra tenderá a duplicarse en los próximos quince años. La producción de

insulina tiene una importante demanda en el mercado mundial alcanzando los 5000 millones de dólares.

Si tomamos el caso de Argentina, existen poco más de un millón y medio de pacientes diabéticos; con

una demanda de insulina de 50 millones de dólares anuales. El tratamiento genera un gran impacto

económico en los pacientes y en los sistemas de salud por tratarse de una terapia crónica con un

producto de considerable valor.

Por tal motivo la posibilidad de producir insulina humana a través de bovinos transgénicos,

obteniéndose a partir de leche vacuna, significará un cambio radical; ya que con sólo 25 vacas se

obtendría los 200 kilos de insulina humana que se necesitan por año en la Argentina, y que actualmente

se importan. En tal sentido, la empresa Bio Sidus ha apostado, al producir insulina en bovinos

transgénicos, llegar a la comunidad con este nuevo desarrollo tendiente a disminuir los costos de

producción, que según los expertos sería del 30 – 40%; conjuntamente con las ventajas que conlleva la

independencia de productores extranjeros. Es de elogiar este nuevo avance de Bio Sidus, pues es la

primera insulina humana recombinante en el mundo obtenida por bovinos transgénicos. Sólo hay 2

multinacionales que producen insulina humana empleando cabras transgénicas, purificándose la misma

a través de la leche; y una empresa canadiense que obtiene insulina humana en plantas. Si bien estos

desarrollos no están aún en el mercado, se estima que en poco tiempo estarán disponibles.

Es de destacar que este desarrollo científico-tecnológico posiciona a la empresa Bio Sidus, y a la

Argentina a un nivel privilegiado en lo que respecta a nivel biotecnológico.

Más allá de la inversión monetaria; que sin lugar a dudas fue muy importante, ya que se invirtieron 4

millones de dólares para la realización de este proyecto; así como el trabajo conjunto de más de 50

científicos; lo que se transluce es el sentido de visión estratégica, el alto compromiso, dedicación y

92

profesionalidad que se ha apostado en el área biotecnológica en Argentina. En países como Argentina y

Brasil, esta área ha adquirido un importante desarrollo, contando con carreras universitarias de grado y

postgrados, con maestrías y doctorados específicos en el área, y con polos tecnológicos altamente

desarrollados, con una fuerte y seria interrelación industria-academia. El hecho que la Argentina

mediante la empresa Bio Sidus haya logrado este importante éxito, sumado a los que ya están puestos

en marcha, así como otros emprendimientos vinculados a la producción de insulina humana mediante

ingeniería genética, por distintos laboratorios argentinos, nos demuestran de la pujanza, dinamismo,

capacidad emprendedora y compromiso que tiene este país en lo que a biotecnología respecta.

Interferon alfa

ACCIÓN TERAPÉUTICA: Antineoplásico, modulador de la respuesta biológica (inmunomodulador).

INDICACIONES

Leucemia, célula vellosa (tratamiento): Interferón alfa-2b recombinante está indicado para tratamientos

de leucemia de célula vellosa en pacientes esplenectomizados y no esplenectomizados.

Condiloma acuminado (tratamiento): Interferón alfa-2b está indicado para inyección intralesional para

tratamientos de condiloma acuminado refractarioso externo recurrente (verrugas genitales).

Hepatitis, crónica, activa (tratamiento): Interferón alfa-2b está indicado para tratamientos de hepatitis

no-A, no-B/C en pacientes de 18 años de edad o mayores con enfermedades hepáticas compensadas

que posean historia de exposición de sangre o productos de la sangre y/o que tengan anticuerpos

positivos.

Hepatitis B crónica (tratamiento): Interferón alfa-2b está indicado para tratamiento de hepatitis B

crónica en pacientes de 18 años de edad o mayores con enfermedad hepática compensada y replicación

del virus de hepatitis B (HBV). Se realizará a los pacientes exámenes positivos para el antígeno sérico de

la hepatitis B por lo menos durante 6 meses y deberán tener una replicación del HBV con

aminotransferasa alanina sérica elevada.

Sarcoma de Kaposi, relacionado con el SIDA (tratamiento): Interferón alfa-2b recombinante indicado

para el tratamiento de sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA en pacientes seleccionados de 18

años de edad o mayores.

93

Carcinoma, renal (tratamiento): Interferón alfa-2b recombinante, indicado para el tratamiento del

carcinoma renal y la leucemia mielocítica crónica.

Papilomatosis, de laringe (tratamiento): Interferón alfa-2b recombinante, indicado para tratamiento de

papillomatosis de laringe, incluyendo papilloma de laringe juvenil.

Micosis fungoides (tratamiento): Interferón alfa-2b recombinante, especialmente pequeños linfomas

foliculares de célula partida (tipos nodulares deficientemente diferenciados).

Carcinoma, ovárico, epitelial (tratamiento) o carcinoma, piel (tratamiento): Interferón alfa-2b

recombinante.

Policitemia vera (tratamiento): Interferón alfa-2b recombinante como tratamiento médico razonable en

algún punto en el manejo de la policitemia vera.

A pesar de que la eficacia de todos los interferones alfa parece ser similar para varias indicaciones,

pueden existir diferencias en la eficacia relativa para una indicación particular.

Se ha estudiado el interferón alfa-2b recombinante, en tratamiento en combinación, para uso en el

tratamiento de carcinoma cervical. Algunos expertos médicos consideran que este agente es un

tratamiento médico razonable en algún punto del manejo del carcinoma cervical avanzado (a pesar de

que no es recomendado como un tratamiento de primera-línea).

Se ha demostrado en diferentes estudios que el interferón alfa-2b recombinante, en tratamiento en

combinación, es inefectivo en el tratamiento del carcinoma colorrectal.

CONTRAINDICACIONES:

Las consideraciones/contraindicaciones médicas relacionadas han sido seleccionadas sobre la base

desde su potencial importancia clínica.

• Historia de enfermedad autoimmune (se recomienda tener precaución debido a que el interferón alfa

puede aumentar la actividad del sistema inmunológico.

• Depresión de médula ósea.

» Enfermedad cardíaca, severa, incluyendo infarto de miocardio reciente o

» Diabetes melitus tendiente a cetoacidosis o

94

» Alteraciones isquémicas

» Enfermedades pulmonares (pueden verse agravadas como resultado de la tensión de la fiebre y los

escalofríos que se presentan en la mayoría de los pacientes que reciben interferón alfa).

(El riesgo de cardiotoxicidad del interferón alfa puede aumentar en pacientes con una historia de

enfermedad cardíaca; muy rara vez se ha informado sobre infarto de miocardio).

» Varicela, existente o reciente, incluyendo exposición reciente o

» Herpes zóster (riesgo de enfermedad severa generalizada).

» Función CNS, comprometida o

» Historia de condición psiquiátrica severa, o

» Trastornos de ataques.

• Enfermedad hepática, severa.

» Trastornos infecciosos.

• Enfermedad renal, severa.

» Sensibilidad al interferón alfa.

» Disfunción de la tiroides (se ha informado que el interferón alfa-2b recombinante causa anomalías en

la función de la tiroides.

• Trastornos de coagulación (se recomienda tomar precauciones; el interferón alfa-2b recombinante

puede prolongar el PT y el PTT).19

La infección con el virus de la hepatitis C puede causar enfermedad hepática crónica para la cual no hay

tratamiento efectivo está disponible. Se estudiaron los efectos del interferón alfa recombinante humano

en un estudio prospectivo, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo en pacientes con bien

documentada crónica de la hepatitis C. Cuarenta y un pacientes fueron reclutados en el ensayo, 37 de

los cuales fueron encontrados más tarde a tiene anticuerpos contra virus de la hepatitis C. Veinte y un

pacientes recibieron interferón alfa (2 millones de unidades) por vía subcutánea tres veces por semana

19 http://www.minsa.gob.pe/portalbiblioteca2/biblio/plm/PLM/productos/52823.htm

95

durante seis meses, y 20 recibieron placebo. Los niveles de aminotransferasa sérica media y las

características histológicas del hígado mejoraron significativamente en los pacientes tratados con

interferón, pero no en los pacientes que recibieron placebo. Diez pacientes tratados con interferón (48

por ciento) presentaron una respuesta completa, definida como un descenso en la media de los niveles

de aminotransferasa sérica a niveles normales durante el tratamiento, otros tres tuvieron una

disminución en los niveles de aminotransferasa media de más del 50 por ciento. Después de finalizado el

tratamiento, sin embargo, el suero aminotransferasas por lo general volvió a los niveles pre-

tratamiento, 6 a 12 meses después de la interrupción del tratamiento con interferón, sólo dos pacientes

(10 por ciento) todavía tenía los valores normales.20

Interferon gamma – 1b

El interferon gamma ha sido utilizado con resultados alentadores en ensayos clinicos para el tratamiento

de la Artritis Reumatoide y de la Artritis Reumatoide Juvenil, por lo que se emplea en este trabajo. El

hecho de haber obtenido mejoria en pacientes resistentes a otros tratamientos y ser posible la

suspension de los esteroides, hace que los resultados sean muy alentadores y justifican un ensayo

donde se emplee el IFN gamma como primer inductor de remision.

Interleucina 2, 3, 4

La interleucina-2 es una glicoproteína humana de 133 aminoácidos que resulta vital para obtener una

respuesta inmunológica efectiva. En el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología ha podido

obtenerse por vía recombinante a partir de una cepa de Escherichia coli. Para el control de la calidad de

cada lote producido se hizo necesaria la elaboración de un material de referencia de trabajo. En esta

publicación se describen los pasos seguidos en la obtención del lote candidato y la preparación del

material de referencia como tal. Se demostró que el patrón de trabajo preparado es homogéneo para el

uso en las técnicas analíticas de control de calidad de la interleucina-2 y se predijo una pérdida de

actividad inferior al 5 % anual mediante un estudio de estabilidad acelerada. Se obtuvieron valores

adecuados para la pureza del material de referencia, evaluada por electroforesis y para la actividad

biológica, que se estableció con trazabilidad al material de referencia internacional para este producto.21

20 http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM19891130321220421 Maribel Vega, Kelly Gorrín, Gerardo García, Haydeé Gerónimo, Galina Moya, Marisel Quintana y Mirta Castiñeira. Establecimiento de un material de referencia de trabajo para interleucina-2 recombinante

96

Las proteínas denominadas citoquinas, dentro de las cuales se encuentran las interleucinas, están

involucradas en la patogénesis de muchas enfermedades y pueden también ser utilizadas en su

tratamiento. La primera interleucina descubierta y caracterizada fue la interleucina-2 (IL-2),

glicoproteína de 133 aminoácidos, con masa molecular entre 13 y 17,5 kDa y puntos isoeléctricos entre

6,6 y 8,2; se conoce que resulta vital para la generación de una respuesta inmunológica efectiva. En

1985 se reportó que la IL-2 desempeñaba una función importante en el tratamiento de tumores sólidos,

con lo cual se amplió su utilización en la clínica. También puede ser empleada para aumentar la

respuesta inmunológica, reparar las deficiencias celulares y/o humorales, en pacientes con

enfermedades infecciosas u otros trastornos inmunológicos. Esta proteína se ha obtenido por técnicas

de ingeniería genética, aunque la IL-2 recombinante, a diferencia de la proteína humana natural, no es

glicosilada; pero esta diferencia no tiene un efecto significativo sobre las funciones biológicas de la

proteína.

Activador tisular del plasminógeno

Es una proteína proteolítica implicada en la disolución de coágulos de sangre. Específicamente, es una

serina proteasa que se encuentra en las células endoteliales, las células que recubren el interior de los

vasos sanguíneos. Como una enzima, cataliza la conversión de plasminógeno a plasmina, que es la

enzima principal para la disolución de coágulos de sangre. El t-PA es empleado en medicina para el

tratamiento del ictus o isquemia cerebral provocado por un coágulo de sangre. El t-PA es segregado por

el endotelio vascular después de sufrir una lesión y su función es activar el plasminógeno

transformandolo en plasmina.22

Activadores del plasminógeno tisular recombinante (r-TPA) incluyen alteplasa, reteplasa y tenecteplasa

(TNKase).

La alteplasa es aprobado por la FDA para el tratamiento del infarto de miocardio con elevación del ST

(STEMI), accidente cerebrovascular isquémico agudo (AIS), embolia pulmonar aguda masiva, y el centro

de dispositivos de acceso venoso (CVAD).

22 Rijken DC (1988). «Relationships between structure and function of tissue-type plasminogen activator». Klin. Wochenschr. 66 Suppl 12: pp. 33–9

97

Reteplasa es aprobado por la FDA para el infarto agudo de miocardio, donde cuenta con una

administración más conveniente y más rápido que con alteplasa trombólisis.

La tenecteplasa también está indicada en el infarto agudo de miocardio, mostrando menos

complicaciones hemorrágicas, pero las tasas de mortalidad similares de alguna manera después de un

año en comparación con alteplasa. R-TPA adicionales, tales como desmoteplase, están en fase de

desarrollo clínico.

Anticuerpos para inmunoterapia celular

En los últimos años se observó que los anticuerpos (Ac) monoclonales han crecido en importancia como

drogas potenciales para el tratamiento contra el cáncer. Esto se basa en los efectos de la terapia con Ac

nativos que van desde el aumento de los mecanismos efectores inmunes, tales como la citotoxicidad

dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA),

hasta el efecto antiproliferativo y la inducción de la apoptosis inducida por el bloqueo de la interacción

receptor/ligando. Por lo tanto, para llevar a cabo dichas acciones, el Ac debe unirse a los receptores de

la fracción Fc de la inmunoglobulina (Ig).

Por un lado, la CCDA depende de los monocitos/macrófagos y de las células natural killer (NK). Además,

los autores han demostrado que existe un Ac IgG humano anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) que

parece presentar una importante CCDA contra las células tumorales que expresan dicho antígeno.23

Se ha demostrado que la fracción FcalfaRI representa el receptor Fc de neutrófilos más potente para

desencadenar la CCDA y que los Ac IgA humanos han podido provocar este tipo de respuesta contra

células tumorales de linfoma y tumores sólidos.

Los autores sostienen que en el presente estudio han formulado un Ac recombinante humano de tipo

IgA anti CEA, y evaluaron su eficacia para mediar CCDA con los neutrófilos como células efectoras contra

células que expresen CEA.

Anticuerpos monoclonales

23 http://www.bago.com/bago/bagoarg/biblio/oncoweb286.htm. Zhao J, Kuroki M, Kuroki M y colaboradores, Recombinant Human Monoclonal IgA Antibody Against CEA to Recruit Neutrophils to CEA-Expressing Cells. Oncology Research 17(5):217-222, 2008

98

Los autores comentan que el Ac humano se obtuvo a partir de la infección de las larvas de gusano de

seda con el virus que contenía la secuencia genética del Ac. Luego de que se recolectara la hemolinfa de

las larvas, se le agregó una sustancia que provocó la precipitación de la proteína (Ac) recombinante.

Posteriormente se procedió al proceso de purificación y, de esta forma, se separó el Ac IgA

recombinante humano.

En este trabajo, se evaluó la capacidad del Ac IgA recombinante de inducir una CCDA, para lo cual se

utilizaron neutrófilos contra células que expresaban CEA. Con el objetivo de potenciar esta respuesta,

los autores trataron a los neutrófilos con interferón gamma, que se sabe aumenta la expresión del

receptor del Ac IgA en esta estirpe celular. Se observó que, ante la presencia de la IgA recombinante

humana, los neutrófilos activados ejercieron una respuesta citotóxica contra las células COH que

expresaban CEA; por lo tanto, se asume que los neutrófilos mataron a dichas células ya que

reconocieron la porción Fc del Ac recombinante que se había unido previamente a las células que

expresaban el antígeno.

Vacunas (en mascotas)

El avance en el estudio de las vacunas, ha ofrecido las herramientas necesarias para la prevención de las

enfermedades infecciosas.24

El uso de vacunas muertas o vivas atenuadas en el siglo 20 ha resultado en espectaculares avances en el

control y erradicación de algunas enfermedades mortales para humanos y los animales. Sin embargo, en

el caso de las primeras si bien eran seguras no daban protección prolongada; mientras que las segundas

podían llegar a tener algunos problemas post - vacunales, principalmente en aquellos animales

parasitados, afectados por algunas enfermedades preexistentes, desnutridos, o incluso estresados.

Gracias al constante trabajo de los científicos se pudieron lograr que desaparezcan las desventajas

propias de las vacunas convencionales como las nombradas anteriormente.

Hoy y después de más de 20 años de investigación, estamos en presencia de una nueva era de la

medicina veterinaria preventiva, a través de la ingeniería genética por medio de la Tecnología

24 http://www.foyel.com/cartillas/5/vacunas_recombinantes.html

99

Recombinante. Esta agrega armas nuevas, más seguras y efectivas para la prevención de las

enfermedades infecciosas en los animales de compañía.

Que es un Recombinante

Puede ser cualquier microorganismo, entre ellos una bacteria, un virus, o una levadura en el cual su

información interna, lo que nosotros llamamos material genético, ha sido modificado en forma artificial

o recombinado.

Porqué debemos utilizar un Recombinante

Porque es 100 % seguro, porque no contiene el virus completo ( de ésta forma se elimina el riesgo de

otras complicaciones post - vacunales), sino sólo las partes necesarias para proteger al animal.

Las vacunas Recombinantes se utilizan en otras partes del mundo. En el mercado hay varias vacunas

disponibles; incluso en Estados Unidos y Europa se utiliza una vacuna contra la Rabia vía oral que se

administra mediante cebos los que se distribuyen por medio de helicópteros en las cuevas de los

animales salvajes. Gracias a éste tipo de tecnología segura y efectiva se está eliminando el gran

problema que existe de rabia en esos países.

Hay otros tipos de vacunas Recombinantes para otras especies y en el caso de animales de compañía,

podemos mencionar la de Rabia para gatos , la de Moquillo canino; gracias a éstas se han evitado todos

los problemas post - vacunales que solían ocasionar las tradicionalmente utilizadas hasta ahora.

En el caso del virus del Moquillo, los científicos pudieron estudiar su información interna y determinar

que parte del virus era la responsable de dar protección contra esa enfermedad. Luego que pudieron

determinar esto, por medio de lo que llamamos estudio de su código genético, se extrajeron esas partes

específicas que llevan la información y que más tarde van a dar la respuesta protectora en el animal.

Buscaron un virus que sea totalmente inocuo para el animal, y para todas las especies, incluso en

medicina humana se está utilizando éste virus para la fabricación de la vacuna del H.I.V. (Sida)

justamente por ser totalmente seguro, otras de las características de éste virus es ser lo suficientemente

grande para permitir incorporar más información, el virus que se utiliza es el de la viruela del canario.

Por esta razón lleva el nombre de Recombinante, porque se utiliza éste virus que cuando ingresa al

animal por medio de la vacunación ayuda a expresar esa respuesta protectora contra la enfermedad del

100

Moquillo. Por lo tanto, tenemos protegido al animal sin tener que suministrarle todo el virus entero,

sino la parte específica que estimula el sistema de defensa del animal.

Cuando le damos éste tipo de vacunas Recombinantes el sistema de defensa del animal no se distrae

con un montón de respuestas, sino únicamente con la específica de protección. Con esto nos evitamos

cualquier problema postvacunal asociado a la administración de todo el virus.

Por suerte hoy ésta tecnología está también disponible en la Argentina , al alcance de todos y es lo que

vamos a utilizar de ahora en más.

Para resumir podemos decir que: las vacunas Recombinantes usan sólo las partes específicas del virus

que necesita el animal para quedar protegido y se eliminan todas las partes patógenas o sea toda

aquello que pueda causar algún daño al animal incluso llegar a producirle la enfermedad.

Por lo tanto para mantener a nuestras mascotas con buen estado de salud, es muy importante que se

vacune con el mejor producto disponible, la Tecnología Recombinante nos da esa posibilidad, debido a

su Excelente Eficacia y su Seguridad sin igual.

101

Células madre

Las células madre son células que tienen la capacidad de dividirse indefinidamente y que pueden dar

origen a células más especializadas. Cuando se dividen, las células madre producen un tipo de célula

más especializada y además generan más células madre.25

Concepto de célula madre. A. Vista generalizada de la cascada a partir de la célula madre

pluripotente pasando por la célula madre comprometida, luego por la célula progenitora,

hasta la célula diferenciada. Cuando una célula madre se divide forma una célula más

comprometida y otra célula madre. B. Ejemplo de formación de células sanguíneas basado

en el esquema superior. (Según National Institutes of Health 2001.)

Algunas células madre individuales son capaces de generar todas las estructuras del embrión. Estas

células, denominadas células madre pluripotentes (que pueden formar al embrión, pero no a los tejidos

extraembrionarios), pueden generar ectodermo, mesodermo y células germinales.

Así como dan origen a más células madre pluripotentes, también generan células madre

comprometidas. Estas células madre comprometidas pueden dar origen a una pequeña población de

25 Scott Gilbert. Biología del desarrollo. Ed. Panamericana, 2005. Págs. 73 – 74

102

células. Por ejemplo, un tipo de célula madre comprometida (hemangioblasto) da origen a todos los

vasos sanguíneos, células sanguíneas y linfocitos. Otro tipo de célula madre comprometida, la célula

madre mesenquimática, puede dar origen a la totalidad de los diferentes tejidos conectivos (cartílago,

músculo, adiposo, etc.)

Las células madre comprometidas pueden originar a células madre comprometidas más

específicamente, como las células madre que generan sólo células sanguíneas y linfocitos, mas no vasos

sanguíneos, o éstas pueden generar lo que se conoce como células progenitoras.

Las células progenitoras, también denominadas células precursoras, no son más células madre debido a

que sus divisiones no crean otra célula progenitora similar. En su lugar, la célula progenitora se divide

para formar uno o pocos tipos celulares relacionados, dependiendo del ambiente celular en que se

encuentre. Por ejemplo, hay un precursor celular sanguíneo (la célula progenitora mieloide) que puede

generar todos los tipos diferentes de células sanguíneas. Generalmente, la célula progenitora muestra

alguna evidencia de diferenciación, pero el proceso no se completa hasta que se ha formado la célula

diferenciada.

La restricción del potencial de la célula madre es gradual, y los potenciales de estas células están

determinados por su entorno. Sin embargo, generalmente una vez comprometidas no cambian su

compromiso. Cuando se colocan en un nuevo ambiente, no cambiarán el tipo de células que generan.

Las células madre son críticas para mantener poblaciones celulares que sobreviven períodos

prolongados y que deben ser renovadas. Debido a esto, son importantes para nuestra población

continua de células de la sangre, del pelo, de la epidermis y del epitelio intestinal.

Células madre musculares y medicina regeneradora del aparato locomotor

Investigadores del Instituto de Tecnología Biomédica de la Universidad de Twente en Enschede (Países

Bajos) han desarrollado una nueva técnica de ingeniería molecular que podría permitir utilizar células

madre humanas para reconstruir huesos en pacientes con huesos dañados o desaparecidos. Los

resultados de su trabajo se publican esta semana en la edición digital de la revista 'Proceedings of the

National Academy of Sciences' (PNAS).26

26 http://www.granadadigital.com/gd/amplia.php?id=87074&parte=Sociedad

103

Hasta el momento no ha sido posible utilizar las aplicaciones con células madre mesenquimales (CMM)

en pacientes humanos, pero los investigadores sugieren que han descubierto cómo conseguir producir

cantidades suficientes de tejido óseo a partir de estas células madre.

Los investigadores, dirigidos por Ramakrishnaiah Siddappa, informan de que la activación de la proteína

quinasa A, o PKA, en un modelo de ratón desencadena la capacidad de formar hueso que poseen las

células madre mesenquimales. Añaden que la activación de PKA induce una secreción continua de

factores de crecimiento asociados a los huesos, que conduce a una formación ósea controlada y

sustancial.

Los científicos utilizaron células madre mesenquimales derivadas de más de una docena de pacientes

ortopédicos de edades comprendidas entre los 23 y los 82 años y muestran que al tratarlas estas células

produjeron la matriz necesaria para dar lugar a la formación de hueso. Al estar generadas a partir de las

propias células del paciente las convierten en células personalizadas para cada individuo, añaden los

autores.

Los investigadores sugieren, además, que su método podría facilitar la introducción de tales técnicas de

ingeniería de tejidos óseos en aplicaciones clínicas.

Curación de lesiones musculares con células madre

El uso de células madre para reparar tejido muscular está en fase de investigación, pero en el momento

en el que se llegue a concretar la forma adecuada de hacerlo en humanos será una alternativa para

diversas enfermedades, entre ellas la distrofia muscular.27

Por otra parte, cabe pensar que mas de un laboratorio buscará la forma de extender su uso para

promover el crecimiento de tejido muscular, tal como hoy dia lo hacen los esteroides, con lo que

podrían ser utilizados por deportistas y atletas de diversas especialidades en su afán de ser cada vez

mejores o superiores.

Investigadores de la Universidad de Colorado en Boulder Estados Unidos, han identificado un tipo de

célula madre del músculo esqueletal que contribuye a la reparación de los músculos dañados de los

ratones.

27 http://www.puntofape.com/curacion-de-lesiones-musculares-con-celulas-madre-1403/

104

El descubrimiento, que se publica en la revista Cell Stem Cell, podría tener implicaciones en el

tratamiento de los músculos humanos dañados, enfermos o envejecidos.

Estas células madre se encuentran en poblaciones de células satélite localizadas entre las fibras

musculares y en los alrededores del tejido conectivo responsable de la reparación y mantenimiento de

los músculos esqueletales.

Cuando las fibras musculares están estresadas o traumatizadas, las células satélite se dividen para hacer

más células musculares especializadas y reparar el músculo. Las células madre identificadas entre las

células satélite, denominadas células satélite-SP, renovaban la población de células satélite después de

una inyección en las células musculares dañadas, lo que contribuía a la recuperación del tejido muscular

en los ratones de laboratorio.

Según Bradley Olwin, coautor del estudio, “esta investigación muestra cómo las células satélite

mantienen sus poblaciones en los tejidos dañados. La esperanza es que este nuevo método nos permita

reparar el tejido muscular esqueletal dañado o enfermo”.

Las células madre se distinguen por su habilidad para renovarse a si mismas mediante la división y

diferenciación celular en tipos de células especializadas. En el tejido muscular esqueletal sano, se

mantiene de forma constante la población de células satélite, lo que llega a los autores a pensar que

alguna de estas poblaciones de células satélite incluían células madre.

Los investigadores inyectaron 2.500 células satélite-SP en una población de células satélite del tejido

muscular de un ratón herido. Descubrieron que el 75 por ciento de las células satélite que se

reproducían derivaban de aquellas inyectadas en el tejido. Los resultados demostraron que las células

inyectadas renovaban la cantidad de células satélite.

“El punto clave es si sólo reparamos el tejido. Inyectamos una población autorenovadora permanente

de células madre. Una ventaja de utilizar esta tecnología es que podemos utilizar un número pequeño

de células madre y realizar el trabajo con un número pequeño de inyecciones, en este caso sólo una”,

explica Olwin.

La investigación tiene implicaciones para una variedad de enfermedades humanas. En la distrofia

muscular, la pérdida de una proteína llamada distrofina produce que el músculo se desgaste, un proceso

que no se puede reparar sin un tratamiento celular. Aunque las células inyectadas reparen las fibras

musculares, su mantenimiento requiere inyecciones celulares adicionales.

105

Células madre para el infarto al miocardio

VALLADOLID.- Un hombre de 65 años ha sido el primer paciente del mundo al que se le ha implantado,

directamente en el corazón, quince inyecciones de células mesenquimales a través de un catéter que,

conectado a una máquina llamada NOGA, es capaz de identificar aquellas zonas enfermas donde hay

que colocar las células que, previamente, fueron extraídas de su propia médula ósea.28

Esta intervención pionera la realizaron los doctores Francisco Fernández Avilés, Ricardo Sanz y Javier

López, el 21 de febrero de este año. El enfermo, que había sufrido varios infartos crónicos y contaba con

zonas del corazón absolutamente muertas, experimentó una mejoría sensible.

Hasta el momento, tan novedosa terapia ha sido aplicada en el Servicio de Cardiología del Hospital

Clínico de Valladolid a dos pacientes, con resultados positivos. Su máximo responsable, el doctor José

Alberto San Román, se muestra muy satisfecho con los efectos, "clínicamente ha evolucionado muy

bien, pero con un número tan pequeño de pruebas, nada se puede decir, hay que continuar la

investigación".

El objetivo de este proyecto de terapia celular es conseguir curar a pacientes a los que es imposible

aplicar ninguna otra acción terapéutica, porque tienen el corazón muy estropeado, con las arterias

coronarias "hechas un desastre", por lo que ni tan siquiera se las puede abrir con un catéter y, por

supuesto, evitar el trasplante cardiaco, única solución a la que están abocados alguna de estas personas.

El doctor San Román es un convencido de que la terapia celular "va a ayudar a que cada vez sea menos

necesario el trasplante cardiaco". Según asegura, "sería fantástico, porque el trasplante necesita una

cantidad de recursos humanos y económicos brutales".

Ahora, concluida la primera fase, aún "quedan al menos dos años hasta obtener resultados definitivos",

comenta el también director del Instituto de Ciencias del Corazón. Pero, por lo obtenido hasta ahora, las

conclusiones que ofrecen son prometedoras porque se ha "comprobado una mejoría en la función

ventricular, es decir, en la función de bomba del corazón".

El Hospital Clínico de Valladolid adquirió hace dos meses el sistema de navegación cardiaca NOGA, que

es la tecnología más avanzada disponible en la actualidad en el mercado, y sirve para crear imágenes

altamente precisas en tres dimensiones del corazón. Costó unos 250.000 euros y, para su financiación,

contó con ayudas, tanto del Instituto Carlos III, como de la Consejería de Sanidad.28 http://www.elmundo.es/elmundo/2008/05/18/castillayleon/1211135370.html

106

Hasta el momento, sólo existen tres máquinas de estas características en España. El doctor López

aprendió su funcionamiento durante una estancia de formación en Estados Unidos y es el encargado del

estudio, el sistema NOGA "proporciona un mapa claro, que ayuda a identificar los tejidos enfermos",

apunta este joven cardiólogo. "Es un sistema de análisis muy sofisticado, que ofrece dos mapas del

corazón. En uno puedes ver las zonas que generan electricidad, es decir, que tienen vida, y la partes que

ya no la producen", aclara el doctor.

Corazón bioartificial

Cómo se desarrolla un ser vivo, ya sea un ratón de laboratorio o una persona, a partir de una sola célula

es uno de los grandes misterios de la biología. A pesar de los avances de la genómica y de la

investigación con células madres, los biólogos están muy lejos de entenderlo. Ni siquiera saben cómo

hacer un solo órgano. Las células madre pueden ayudar a regenerar un tejido, pero fabricar en el

laboratorio un órgano completo, pongamos un corazón, es hoy por hoy ciencia-ficción. Si al menos se

tuviera un molde, un andamiaje para que las células madre prendieran y por sí solas se pusieran manos

a la obra de crear un músculo cardiaco que empezara a latir y a bombear.29

Ésta es la ingeniosa idea que han puesto en práctica con éxito científicos de la Universidad de Minnesota

en EE UU y que ayer anunciaron en la edición digital de revista Nature Medicine. El logro ha sido un

primer corazón bioartificial de ratón desarrollado a partir del esqueleto fibroso de un corazón de

cadáver de ratón al que se le inyectaron células madre cardiacas. Y significa un paso adelante hacia los

futuros bancos de órganos bioartificiales para trasplante.

"El objetivo sería poder desarrollar vasos sanguíneos u órganos completos, listos para trasplante, que se

generarían a partir de las células del propio paciente", explica Doris Taylor, autora principal del trabajo y

directora del Centro de Reparación Cardiaca de la Universidad de Minnesota. Hoy, los trasplantes de

corazón de donate sólo alcanzan para el 5% de los pacientes que los necesitan. En España, la mitad de

los enfermos seleccionados para trasplante cardiaco mueren mientras lo esperan.

El logro del grupo de Minnesota es todavía experimental y muy inicial, pero "demuestra que la terapia

celular es una apuesta firme", destaca Francisco Fernández-Avilés, jefe de servicio de Cardiología del

hospital Gregorio Marañón de Madrid, que ya conocía los trabajos de Taylor. Ahora hay que

perfeccionar el modelo en animales más próximos (cerdos) antes de probarlo en humanos. Lo primero

29 http://www.elpais.com/articulo/salud/Creado/corazon/bioartificial/celulas/madre/elpepusocsal/20080115elpepisal_5/Tes?print=1

107

podría demorarse de tres a cinco años, y lo segundo, una década y media, aventura Fernández-Avilés,

que es coordinador nacional de la Red Temática de Investigación Cooperativa en Enfermedades

Cardiovasculares.

"Lo importante de este trabajo es que representa un salto conceptual, que permite seguir una línea de

trabajo y ver el final del túnel, aunque sea lejano", destaca Fernández-Avilés, que se reunirá mañana con

Taylor en Nueva York.

La clave del avance ha sido lo que han llamado "descelularización de órgano completo", un

procedimiento que consiste en eliminar todas las células del corazón del animal muerto dejando intacta

la matriz extracelular. Tras obtener corazones descelularizados de ratón, los investigadores les

inyectaron células madre obtenidas de los corazones de ratas recién nacidas.

El desarrollo de los acontecimientos fue espectacular: a los cuatro días, el esqueleto fibroso sembrado

de células madre empezó a contraerse. "Al ver las primeras contracciones nos quedamos sin palabras",

recuerda uno de los investigadores, Harald C. Ott, que trabaja en el hospital General de Massachusetts

en Boston (EE UU). A los ocho días, el corazón empezó a bombear y podía considerarse un esbozo de

órgano bioartificial.

El grupo de Doris Taylor es uno de los seis equipos que han confirmado que el corazón puede

regenerarse, un hito logrado por el investigador italiano afincado en EE UU Piero Anversa en 2001. Esto

contradecía el dogma científico vigente y resultó polémico. Taylor no sólo ha confirmado que el corazón

tiene células madre cardiacas residentes, capaces de dividirse y producir tejido muscular, vascular o de

conducción, sino que ha sido capaz de aislarlas, de cultivarlas en el laboratorio y de regenerar con ellas

todo un órgano funcional. Este modelo conceptual y experimental también podría ser válido con otros

órganos.

Células madre y sordera

108

Los investigadores lograron recrear en un laboratorio las células de las microscópicas vellosidades que

recogen las ondas de sonido en el oído interno y las transmiten al cerebro humano.30

Según el equipo de la Universidad de Sheffield, Inglaterra, este avance podría eventualmente ayudar a

quienes han perdido esa células, conocidas como ciliadas, por el daño causado por sonidos fuertes o a

las personas que nacieron con problemas de audición hereditarios.

Sin embargo, todavía faltan más investigaciones para que la nueva cura esté disponible, dicen los

científicos en la revista Stem Cell .

"El problema con la sordera es que las células ciliadas sólo se producen durante las etapas de

desarrollo", explicó a la BBC el doctor Marcello Rivolta, quien dirigió el estudio.

"Si estas células se pierden durante la adultez, es imposible regenerarlas. Así que lo que hicimos fue

volver a esas etapas iniciales de desarrollo en el embrión para identificarlas, aislarlas y multiplicarlas en

el laboratorio", dijo el científico.

Los expertos afirmaron que hasta el momento los resultados han sido exitosos y que el siguiente paso

será comprobar con animales si las células creadas logran recuperar las funciones auditivas.

Daño irreversible

Hasta ahora, el daño a las ciliadas es irreversible y causa problemas del oído en un 10% de la población

mundial.

Las células madre pueden solucionar este problema porque tienen la capacidad única de convertirse en

cualquier tipo de célula humana.

Y tal como señaló el doctor Rivolta, no sólo podrían utilizarse para reemplazar las células auditivas

perdidas, sino también cualquier neurona dañada involucrada en las señales que el oído genera y

transmite al cerebro.

"Lo que hemos logrado es contar con un sistema en el laboratorio que hará posible generar ciliadas y

neuronas humanas", dijo el científico.

Y explicó que, en teoría, este procedimiento podría funcionar con cualquier tipo de sordera, incluso la

vinculada al envejecimiento.30 http://news.bbc.co.uk/hi/spanish/science/newsid_7978000/7978673.stm

109

"Todavía falta mucho tiempo para eso, pero creemos que todo lo que está relacionado con pérdida de

células auditivas o neuronas podría ser restaurado con la nueva terapia", explica el doctor Rivolta.

El avance, afirmaron los investigadores, servirá también para probar nuevos tratamientos para la

sordera y entender mejor la función de los genes en el oído.

"Este sistema es lo más cercano que hemos llegado a poder disponer de un oído humano real en el

laboratorio", aseguró el investigador.

"Esperamos que en el futuro nos sirva como un tratamiento contra la sordera, pero a un plazo más

inmediato lo usaremos como un modelo para estudiar la diferenciación de las células humanas", añadió.

Células madre y córnea

La grasa, el tejido con peor fama del organismo, también es el de la reparación. Las células madre

obtenidas de la grasa pueden restaurar fístulas que no cierran y tratar corazones dañados. Ahora el

Instituto Oftalmológico de Alicante ha demostrado que también podría reparar los ojos dañados por

traumatismos, quemaduras o infecciones y convertirse en una alternativa eficaz al trasplante de córnea

de cadáver.31

Bastaría con hacer una liposucción al paciente para tener un material inagotable y sin riesgo de rechazo

para recuperar los ojos dañados. El equipo del profesor Jorge Alió, en colaboración con el Hospital La

Paz, utilizó grasa sobrante de liposucciones para obtener células madre que pudieran reparar la córnea,

la principal lente del ojo. Una vez aisladas y purificadas, las células derivadas de tejido adiposo se

cultivaron y expandieron en el laboratorio para obtener el concentrado celular necesario. Después las

células no se depositaron directamente sobre la superficie ocular. Se realizó una incisión con láser,

similar a la que se realiza en la cirugía de la miopía para llegar al estroma, una de las capas de la córnea.

En ese lecho se colocaron las células madre a la espera de que adquirieran características específicas del

entorno y pudieran reparar la córnea. En el experimento, realizado con conejos y grasa sobrante de

pacientes de liposucción, no hubo rechazo alguno. Se constató que las células humanas trasplantadas se

transformaban en células corneales (queratocitos).

El nuevo tejido mantenía una transparencia funcional, sin ninguna opacidad, característica necesaria

para recuperar la visión. La córnea es una membrana transparente que enfoca las imágenes de la retina,

31 http://www.madrimasd.net/noticias/Regeneran-corneas-danadas-celulas-madre-grasa/34503

110

y cuando se daña pierde su transparencia. Los resultados de este experimento, publicados en la revista

científica «Stem Cells», abre nuevas perspectivas al tratamiento de las dolencias de la córnea. Pero,

sobre todo, sortea el problema de la falta de donaciones y el riesgo de rechazo del organismo. Además,

el trasplante de cadáver obliga a tomar fármacos inmunosupresores para combatir el rechazo del

sistema inmune.

Prótesis humanizadas

Para aplicarlo en pacientes, los oftalmólogos buscan otras fórmulas para que las células de la grasa se

transformen en células corneales en el laboratorio. «De esa forma, se evitaría la agresión con láser y se

controlaría mejor el proceso de diferenciación de las células», explicó Silvia Pastor, responsable del

laboratorio de cultivos celulares.

Las nuevas células se colocarían en un material biocompatible para obtener una prótesis fabricada a

partir de células del propio paciente. Esas prótesis «humanizadas» serían útiles cuando fracasen los

trasplantes clásicos de córnea. La terapia con grasa también podría ser una opción para tratar úlceras

superficiales y el queratocono, un trastorno que deforma la córnea.

Células madre y cáncer

El cultivo de células madre cancerígenas marcará el desarrollo de la neurocirugía y de la oncología

cerebral en los próximos años, según se ha puesto de manifiesto en el décimo tercer Congreso de la

Sociedad Española de Neurocirugía, que se celebra en Valencia.32

En el encuentro participan alrededor de trescientos especialistas en Neurocirugía, que han coincidido en

destacar que su especialidad médica camina hacia el desarrollo de técnicas menos invasivas con el

apoyo de las nuevas tecnologías y la biología molecular, según han informado en un comunicado

fuentes de la organización.

El secretario del congreso y jefe del Servicio de Neurocirugía del Hospital de la Ribera, en Alzira

(Valencia), José Piquer, ha señalado que el desarrollo de la biología molecular ha permitido aislar células

tumorales y conseguir a partir de ellas células madre tumorales.

32 http://actualidad.terra.es/sociedad/articulo/neurocirugia_cultivo_celulas_madre_cancerigenas_2513210.htm

111

'De esta manera podemos entender mucho mejor el comportamiento de los tumores y diferenciar

diferentes vías del origen de los mismos y con ello encontrar nuevas alternativas de tratamiento' de los

tumores cerebrales, que desarrollan diez de cada cien mil personas.

Otro de los grandes avances neuroquirúrgicos es la llamada 'realidad virtual', y en este sentido el doctor

Piquer ha señalado que la resonancia y la navegación 'permiten introducir esta tecnología con una

precisión milimétrica para ubicarnos dentro del cerebro y localizar cualquier lesión con una precisión

exacta'.

Según el experto, el avance de la neurocirugía se sustenta también en nuevas técnicas desarrolladas a

partir de viejas prácticas, como el caso de la psicocirugía y la neurología funcional.

Así, La neuroestimulación de determinados centros cerebrales 'está dando buenos resultados en la lucha

contra enfermedades como el parkinson o la distonía' y también hay buenas experiencias en pacientes

obsesivos.

Células madre en enfermedades hereditarias

La Universidad Autónoma de Madrid albergará el próximo 22 de mayo la Jornada “Terapia celular en la

medicina del siglo XXI”, enmarcada dentro del Foro de Ciencia y Tecnología madri+d dedicado a

Biomedicina y Ciencias de la Salud. La iniciativa, destinada tanto a empresas del sector como a

investigadores, consultores y gestores de este ámbito, ofrecerá una amplia perspectiva sobre los nuevos

avances en terapia celular y medicina regenerativa.33

Actualmente, las enfermedades degenerativas constituyen uno de los principales problemas sanitarios

de los países desarrollados. Estas enfermedades se deben, por lo general, a defectos génicos, lesiones

traumáticas, estilo de vida o al progresivo envejecimiento de la población.

Una característica común en este tipo de enfermedades es la alteración de tejidos y/o la desaparición de

ciertos tipos celulares, provocando una disfunción en distintos órganos. Los fármacos utilizados en el

tratamiento de estas enfermedades frecuentemente palian únicamente los síntomas, en vez de reparar

el daño tisular. Precisamente, el objetivo de la terapia celular es restaurar esos componentes dañados o

ausentes para así intentar recuperar la función del órgano en este tipo de enfermedades.

33 http://www.madridiario.es/2008/Mayo/ciencia-tecnologia/75928/foro-ciencia-tecnologia-salud-terapia-celular-medicina-regenerativa.html

112

Las aproximaciones de la terapia celular son muy variadas: el uso de células autólogas (del propio

paciente), alogénicas (de un donante), xenotransplantadas (procedentes de animales generalmente), el

uso de células madre adultas o embrionarias, células humanas modificadas genéticamente para producir

determinadas sustancias o células transdiferenciadas que ejercen funciones celulares que antes le eran

ajenas (por ejemplo, la producción de insulina por hepatocitos transdiferenciados en células beta), entre

otras.

Todas estas técnicas presentan frente a otras la ventaja de su versatilidad, por lo que las patologías a las

que pueden dirigirse son muy variadas. Han sido aplicadas con mayor o menor éxito a patologías tan

diversas como disfunciones hormonales (diabetes o déficit en la hormona del crecimiento), lesiones

cardiovasculares (isquemia, infarto de miocardio), enfermedades neurodegenerativas (Parkinson,

Alzheimer, Corea de Huntington), lesiones osteoarticulares o simplemente en lesiones en las que haya

que regenerar un tejido (como una fístula).

Parece claro el interés que tiene en el tratamiento de patologías hasta ahora incurables y como la

investigación en este área permitirá identificar los aspectos claves para hacer de la terapia celular una

técnica segura y eficaz que constituya un avance sin precedentes en el campo de la medicina.

La Jornada “Terapia Celular, la medicina del siglo XXI” ofrecerá varias perspectivas sobre la aplicación y

transferencia de conocimiento en este campo teniendo en cuenta sus aplicaciones clínicas en el área de

la medicina regenerativa. La Jornada comenzará con una conferencia magistral impartida por Damián

García Olmo, profesor del Departamento de Cirugía de la Universidad Autónoma de Madrid-Hospital

Universitario La Paz, quien ofrecerá información sobre los ensayos clínicos en terapia celular que se

están desarrollando en España. Posteriormente, tendrá lugar una mesa redonda donde se debatirá

acerca de la transferencia del conocimiento en terapia celular, conducida por Antonio Verde, director de

la OTRI de la Universidad Autónoma de Madrid y que contará con la participación de Jorge Alemany,

director de Estrategia y Operaciones de Cellerix; José Luis Jorcano, director General de la Fundación

Genoma España; y Víctor González, de la Subdirección de Terapia Celular y Medicina Regenerativa del

Instituto de Salud Carlos III.

La importancia de la terapia celular en la aportación de nuevos enfoques para el tratamiento de

enfermedades está reflejada en el interés creciente que la investigación en el área está suscitando. Tan

sólo en el ámbito nacional, podemos encontrar más de 50 grupos dedicados a la investigación en éste

área, existiendo varios centros de investigación dedicados casi exclusivamente a la medicina

113

regenerativa y terapia celular como por ejemplo el Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina

Regenerativa de Sevilla, el Banco de Células Madre de Granada y el Centro de Medicina Regenerativa de

Barcelona.

En la Comunidad de Madrid existen numerosos investigadores que realizan estudios en este campo. Los

intereses en la investigación de un 39 por ciento de los grupos se centran en el estudio de las células

madre, tanto embrionarias como adultas, mientras que un 22 por ciento investigan en las áreas de

regeneración tisular y medicina regenerativa.

El Consejo Superior de Investigaciones Científicas con centros como el Centro de Investigaciones

Biológicas (CIB), el Centro Nacional de Biotecnología (CNB) y el Centro de Biología Molecular (CBM),

ambos centros mixtos UAM-CSIC, concentra una importante actividad investigadora en terapia celular.

El Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) y el Centro Nacional de Investigaciones

Oncológicas (CNIO) son instituciones de referencia en el área, así como centros hospitalarios de

excelencia como La Paz y Gregorio Marañón. La Universidad Complutense y la Universidad Autónoma de

Madrid albergan programas de investigación cooperativa en terapia celular.

Para hacernos una idea de la importancia que se otorga a la investigación en el área de terapia celular,

basta con hacer una revisión del número de ayudas y programas que incluyen esta línea de investigación

dentro de las acciones prioritarias a nivel europeo (el VII Programa Marco), nacional (por ejemplo,

acciones dentro del Plan Nacional o del Instituto de Salud Carlos III a través de las ayudas RECTIS y las

ayudas de apoyo a la investigación Biomédica para Consorcios en red CIBER) y regional.

Consciente de la importancia que la terapia celular tiene para la sociedad y de las posibles aplicaciones

en el ámbito clínico de los resultados de estas investigaciones, la Comunidad de Madrid ha puesto en

marcha varias iniciativas encaminadas a promocionar la investigación de excelencia y la transferencia de

conocimiento en este ámbito.

La Dirección General de Universidades e Investigación ha promovido y financiado programas de

investigación dedicados al estudio de células madre, centrando, por ejemplo, sus investigaciones en

determinar las variables que permitirán aplicar con total seguridad el uso de la células madre para el

tratamiento de diversas enfermedades; o determinando las propiedades biológicas y posibles

aplicaciones clínicas de las células madre mesenquimales. Además, otros grupos identificados en la

Comunidad de Madrid realizan estudios relacionados con la biología de precursores hematopoyéticos,

terapia génica y estudios sobre la estabilidad, biología y aplicación clínica de células madre.

114

El estudio de las células madre nos permitirá conocer los mecanismos de especialización celulares. Qué

mecanismos hacen que un gen sea activo y haga su trabajo y qué mecanismos inhiben la expresión de

ese gen. El cáncer, por ejemplo, es un caso de especialización celular anormal.

Las células madre pueden servir para probar nuevos medicamentos en todo tipo de tejidos antes de

hacer las pruebas reales en animales o en humanos.

Las células madre tendrán aplicaciones en terapias celulares, medicina regenerativa o ingeniería tisular.

Muchas enfermedades son consecuencia de malfunciones celulares o destrucción de tejidos. Uno de los

remedios, en casos muy graves, es el transplante. Las células madre pluripotentes estimuladas a

desarrollarse como células especializadas ofrecen frecuentemente la posibilidad de reemplazar células y

tejidos dañados. Así se podrán emplear para casos de Parkinson y Alzheimer, lesiones medulares,

quemaduras, lesiones de corazón o cerebrales, diabetes, osteoporosis y artritis reumatoide.

Veamos ejemplos de aplicaciones: 34

Según publicó Science Abril de 2000, a dos bebés que nacieron con un defecto genético que les

ocasionaba una severa inmunodeficiencia, les extrajeron células madre de médula ósea. Se cultivaron

las células, se reemplazó el gen defectuoso y se transfirieron de nuevo a los niños. Este experimento, en

el que se emplearon células madre de los propios bebés, constituyó el primer éxito de curación

mediante terapia genética.

Por primera vez en España en la Clínica Universitaria de Navarra se ha curado (PDF) un corazón infartado

implantándo células madre del propio paciente. El paciente tenía una parte del músculo cardíaco

muerta a acusa de varios infartos. Se le extrajeron células del muslo se seleccionaron y purificaron las

células madre. Después de cultivarlas durante tres semanas se inyectaron en el músculo infartado. La

recuperación fue prodigiosa.

Un trabajo de la Universidad Johns Hopkins, en Baltimore, presentado durante el encuentro anual de la

Sociedad Americana de Neurociencia explicaba que la inyección de células madre en el líquido

cefalorraquídeo de los animales lograba devolver el movimiento a unos roedores con parálisis. Los

expertos introdujeron células madre neuronales en los roedores paralizados por un virus que ataca

34 http://www.ecojoven.com/uno/05/celulasm.html

115

específicamente a las neuronas motoras y comprobaron que el 50 por ciento recuperaba la habilidad de

apoyar las plantas de una o de dos de sus patas traseras.

Las investigaciones son muy prometedoras y avanzan muy rápidamente, pero queda mucho por hacer

para llegar a aplicaciones clínicas reales. Todavía falta por conocer los mecanismos que permiten la

especialización de las células madre humanas para obtener tejidos especializados válidos para el

transplante.

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