PRACTICA 7. DETERMINACION DE VIABILIDAD CELULAR

INTRODUCCION.La determinacin de la Viabilidad celular constituye en uno de los mtodos moleculares fundamentales para evaluar el grado de toxicidad celular que tiene una substancia sobre las clulas, en un cultivo.Este mtodo requiere los siguientes pasos:Aislamiento de clulasRecuento celularTratamiento: Incubacin de clulas en presencia de un estimuloEvaluacin de viabilidad celular

PROCEDIMIENTO.EXTRACCIN Y AISLAMIENTO DE MACRFAGOS1. Transcurrido los das de incubacin, en donde los macrfagos migrarn desde la sangre hacia el lquido asctico en donde se encuentra restos de lisado bacteriano. Inyectar a los animales 2 ml de NaCl al 0.9% por va intraperitoneal.1. Hacer masajes en el vientre de la rata, durante 5 minutos1. Sacrificar al animal y rpidamente abrirle el abdomen y con ayuda de una pipeta, retirar cuidadosamente todo el lquido asctico y colocarlo en tubos de ensayo.1. Para concentrar los macrfagos, centrifugar la suspensin celular a 2000 r.p.m., durante cinco minutos.1. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 ml de NaCl al 0.9%1. Realizar el recuento celular con objetivos de mediano aumento.

Nota: Si la suspensin celular se encuentra contaminada con glbulos rojos, lo que se manifiesta con la presencia de una coloracin rojiza, se recomienda eliminarlos mediante un choque osmtico: resuspender el pellet en 2 ml de agua destilada y mezclar durante 20 segundos e inmediatamente aadir 2 ml de NaCl al 1.8% y proceder con el lavado normal.Dibujo del procedimiento

EXTRACTO DE UNCARIA TOMENTOSASe usar un extracto acuoso de Ua de gato a una concentracin de 10% p/v. Se pesa 10 gr de muestra pulverizada de corteza (Tallo) de Uncaria tomentosa (willd) D.C Ua de gato , aforando la muestra a 100 ml con agua destilada, se procede a mezclar con agitacion suave, esta suspensin se sometera a calor de ebullicion por espacio de 30 minutos agitando constantemente y luego se repone el volumen de agua que se evapor, para completar una concentracin de 10%. Para fines de los ensayos la solucion de extracto de Ua de gato es ajustado a un pH de 7 y esterilizado por microfiltracin utilizando una membrana microporo de fibra de vidrio. La uncaria tomentosa que se us fue obtenida del laboratorio de control de calidad de la Universidad Catlica de Santa MaraDibujo del procedimiento

TRATAMIENTO DE MACRFAGOS DE RATA CON UNCARIA TOMENTOSA

Aproximadamente 2x106 macrfagos aislados sern cultivados en placas petri conteniendo 5 ml de medio de cultivo (Buffer Fosfato pH 7.2 suplementado con 10% de suero de bovino y Penicilina 100 UI/ml, Estreptomicina 100 g/ml), es decir; para preparar el medio se usa un stock de buffer fosfato 10 veces concetrado y se diluye hasta 1x utilizando, segn sea agua esteril o agua mas extracto de ua de gato a la concentracion deseada. Los cultivos son incubados a 37 C con diferentes concentraciones de extracto de Ua de gato (0,5 10 20 y 50 g %), y a diferentes tiempos (0, 0.25, 0.5, 1, 6 y 12 horas). Terminada la incubacion, se utilizan las clulas para evaluar la morfologa nuclear y viabilidad celular, Dibujo del procedimiento

DETERMINACIN DE VIABILIDAD CELULARFinalizado el tiempo de incubacin (0, 0.25, 0.50, 1, 6h) de los macrfagos con el extracto acuoso de ua de gato (10 g%), se procedi a determinar la viabilidad de los macrfagos a los diferentes tiempos de incubacin, colocando en un tubo eppendorf 85 l de muestra (macrfagos), 2 l de NaCl (4.25%) Y 8 l de azul de tripan (0.2%), se mezcla bien y se deja en reposo 5 min para luego observar al microscopio y hacer el recuento.Las clulas transparentes corresponden a las clulas vivas y las clulas teidas de azul corresponden a las clulas muertas.

Anotar los resultados, y hacer los clculos para expresar los resulados en forma de porcentaje, Graficarlos y hacer los clculos estadsticos y pruebas de signoficancia.