VECTORES DE CLONACIÓNVECTORES DE CLONACIÓN

Tipos de vectores

-Plásmidos

-Derivados de bacteriófagos

-Cósmidos

- De alta capacidad (P1, PAC, BAC, YAC)

PLÁSMIDOS

-Origen de replicación, genes de resistencia a antibióticos y metales pesados, de utilización de compuestos, etc.

-Para utilización en ingeniería genética: modificaciones: adición de un polilinker (sitio de clonación múltiple: MCS), sistemas de selección de recombinantes.

- Origen de replicación: ejerce un control sobre el número de copias del plásmido en la célula; control relajado (alto número de copias, independiente de síntesis de proteína, se regula por ARN y ARN antisentido), control astringente (bajo número, interviene la proteína del gen repA).

Fenómeno de incompatibilidad:- En una bacteria donde hay un plásmido no pueden entrar otros plásmidos que pertenezcan al mismo tipo de incompatibilidad: es decir, que tengan el mismo origen de replicación. Importante en experimentos de clonación

pBR322

Plásmidos

- Marcadores de selección.

- Un marcador de selección que permite que crezcan sólo las bacterias que llevan el plásmido: transformantes. Resistencia a ampicilina (ampR), a cloramfenicol (CmR)

- Un marcador que permite seleccionar aquellos clones donde el plásmido es recombinante, tiene inserto. En ese marcador se encuentra el MCS

- Inactivación de un gen de resistencia: hace a la bacteria sensible a un antibiótico, ej. pBR322, gen de resistencia a tetraciclina (tetR)

- -complementación: la bacteria es deficiente en la actividad -galactosidasa (gen lacZ), el plásmido tiene un fragmento de la -galactosidasa que complementa esa deficiencia (-complementación); en presencia de X-gal e IPTG forma colonias azules. Cuando se introduce un inserto el fragmento de la -galactosidasa es interrumpido, no hay complementación: colonias blancas. pBluescript, pUC18

- Selección directa: presencia de un gen letal en el vector, sólo si es interrumpido (inactivado) por el inserto la bacteria puede crecer.

Selección de recombinantes en vectores plasmídicos, -complementación

VECTORES DERIVADOS DEL FAGO

VECTORES DERIVADOS DEL FAGO VECTORES DERIVADOS DEL FAGO

Ciclo del fago

- Ciclo lítico y lisogénico

- Ciclo lítico: el ADN se replica y forma concatémeros. 48 kb

- Pueden empaquetarse moléculas de ADN con 78% - 105% de la longitud del genoma

- Región dispensable: no afecta al ciclo lítico

- Vectores derivados de :

- Sustitución o reemplazamiento

- Inserción

- Genes red y gam confieren fenotipo Spi+

VECTORES DERIVADOS DEL FAGO VECTORES DERIVADOS DEL FAGO

Vectores de sustitución

8-23 kb

Vectores de inserción

0,5-10 kb-gt11

Sac

Not

Bam

Eco

Xho

Xba

I I HI

RI I I

Xba

Xho

Eco

Bam

Not

Sac

I I RI HI

I ISfi I T7

SfiISP6

(0'0

)

brazo izquierdo (20 kpb) brazo derecho (9 kpb)

(43'

0)

región centraldispensable (14 kpb)

λ-GEM-12

VECTORES DE ALTA CAPACIDAD

CÓSMIDOS CÓSMIDOS

- Plásmidos que contienen los sitios cos del fago para empaquetamiento in vitro

- Pueden infectar E. coli, pero no lisarla, se comportan como plásmidos, selección por resistencia a ampicilina

- Admiten tamaños entre 35-45 kb

- El ADN para la genoteca se digiere parcial con Sau3AI y se desfosforila, o por selección de tamaño en gel de PFGE

- Rastreo: igual que una genoteca en plásmidos

BACs: BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES BACs: BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES

- Molécula de ADN circular de unas 7 kb con un marcador de selección (CmR), un replicón derivado del factor F (oriS) y tres genes que aseuran la partición de las copias entre las céllas hijas. Sitio de clonación BamHI en fragmento lacZ: permite selección por color. No hay límite de tamaño para el empaquetamiento: tamaño medio 120 kb. El ADN para la genoteca se digiere parcial con Sau3AI y se hace selección de tamaño en gel de PFGE. El vector se corta con BamHI y se desfosforila.

- Rastreo: mediante hibridación de arrays ordenados o por PCR en pooled libraries

YACs: YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES YACs: YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES

- Molécula de ADN lineal con los elementos de un cromosoma de levaduras que le permiten funcionar como tal: origen de replicación ARS1, telómeros. Un marcador de selección en cada brazo que asegura que el DNA foráneo esté flanqueado por ambos brazos. Selección de transformantes usando una cepa auxótrofa de uridina y triptófano, y de recombinantes mediante color. Tamaño medio de los insertos 250-400 kb.