validacion metodos cuanti y cuali
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VALIDACIÓN DE
MÉTODOS
ANALÍTICOS
¿Por qué validar?
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¿Por qué validar?
La validación forma parte integral del sistema de
calidad.
Las BPM exigen que tanto los procesos como las
metodologías analíticas estén validadas.
Proporciona confianza y seguridad al método
analítico y calidad a los resultados.
Optimización del método.
Competitividad.
Y …
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NTC 17025 REQUISITOS TÉCNICOS
5.4.2 Selección de los métodos.
.....Preferiblemente, se deben emplear
métodos publicados en normas
internacionales, regionales o nacionales. El
laboratorio debe garantizar que utiliza la
última edición válida de las normas, a
menos que sea apropiado o imposible de
hacerlo así.
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5
NTC 17025 REQUISITOS TÉCNICOS
5.4.2 Selección de los métodos.
.... Los métodos desarrollados o
adoptados por el laboratorio también
pueden ser utilizados si resultan
adecuados para los fines propuestos
y si están validados. El cliente debe
ser informado sobre el método elegido
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NTC 17025 REQUISITOS TÉCNICOS
5.4.3 métodos desarrollados por el
laboratorio.
La introducción de métodos de ensayo y
calibración desarrollados por el
laboratorio para su propio uso debe ser
una actividad planeada y se debe
asignar a personal calificado y equipado
con los recursos adecuados.
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NTC 17025 ¿Qué es validar?
5.4.5 Validación de los Métodos.
5.4.5.1 Validación es la confirmación
por examen y suministro de evidencias
objetivas del cumplimiento de los
requisitos particulares para un uso
específico.
USP
Proceso por el cual se establece mediante
estudios de laboratorio que las características
de calidad del método analítico se adecuan a
los requerimientos y necesidades de la
aplicación analítica propuesta.
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¿Qué es validar?
DEFINICIONES
TÉCNICA
Aplicación de un principio
científico del cual se ha
demostrado su utilidad para
proveer información analítica.
Ej.: AA , IR, CG, HPLC.
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Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.
DEFINICIONES
MÉTODO
Adaptación de una técnica
para una medición específica
con un fin determinado.
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Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.
DEFINICIONES
PROCEDIMIENTO
Conjunto de instrucciones detalladas
necesarias para llevar a la práctica un
método, presentadas en forma escrita.
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Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.
FASES DE LA
VALIDACIÓN
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FASE I : ESTANDARIZACIÓN
OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES Y
VARIABLES
FASE II : DETERMINACIÓN DE LAS
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO DEL
MÉTODO
FASE III : EVALUACIÓN POR RESULTADO
VALIDACIÓN La documentación es parte esencial de la
validación
PROTOCOLO
DE VALIDACIÓN
REALIZACIÓN DE LA
VALIDACIÓN
EVALUACIÓN
RESULTADOS
ANALÍTICOS
INFORMES
TÉCNICOS CERTIFICADO
DE VALIDACIÓN
ESTANDARIZACIÓN
OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES
Y VARIABLES
PROTOCOLO DE
VALIDACIÓN
Conjunto de instrucciones que garantizan
resultados uniformes de un
procedimiento de validación, constituye la
planificación, ejecución, verificación y
control de la validación.
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PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
Generalidades
Objetivos
Alcance
Responsabilidad
Referencias
Factores críticos
Equipos, materiales y
reactivos
Preparación de Muestras
Método analítico
Parámetros a evaluar
Criterios de evaluación
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VALIDACIÓN- Referencias
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ICH USP
VALIDACION
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Parámetro I II III IV
Cuan-
titativo
Ensayo
límite
Exactitud Si Si * * No
Precisión Si Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Límite de detección No No Si * No
Límite de
cuantificación
No Si No * No
Linealidad Si Si No * No
Rango Si Si * * No
* Puede ser requerido, dependiendo del ensayo
Especificidad vs Selectividad
Selectividad: la selectividad de un ensayo
es una medida del grado en que el método
puede determinar un compuesto particular en
las matrices analizadas sin interferencia de
los componentes de la matriz. Un método
que es perfectamente selectivo para un
analito o grupo de analitos es específico.
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EURACHEM/WELEC Guidance. Document No. WGD2 (1993) Accreditation for chemical laboratories: Guidance on the
interpretation of the EN 45000 series of standards and ISO Guide 25. Laboratory of the Government Chemist, Teddington, UK
Especificidad vs Selectividad
Especificidad: capacidad del método para
evaluar inequívocamente el analito en
la presencia de otros componentes que
pueden estar presentes (por ejemplo, las
impurezas, productos de degradación y
componentes de la matriz).
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International Conference on Harmonization, Validation of Analytical Methods: Definitions and terminology. European Agency for the
Evaluation of Medicinal Products, London, UK. 1995
SELECTIVIDAD
Metabolitos del analito.
Productos de degradación.
Matriz de la muestra. 20
Ricard Boqué. La selectividad en análisis
Químico. Grupo de Quimiometría y Cualimetría
Universidad Rovira i Virgili (Tarragona).
SELECTIVIDAD
¿Como se hace?
Analizar matriz sin activo.
Analizar por triplicado matriz adicionado
con los productos de degradación,
sustancias relacionadas y sustancias de
interés equivalente al 100%.
Analizar por triplicado muestras solas,
solo el analito de interés.
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SELECTIVIDAD
¿Como se hace?
Someter al activo a condiciones de
degradación forzada.
Termólisis (105°C, 8 días)
Fotolisis (Luz natural o ultravioleta, 8 días)
Hidrólisis acida (HCl 0.1N, 24 horas)
Hidrólisis alcalina (NaOH 0.1N, 24 horas)
Oxidación (H2O2 4 %)
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SELECTIVIDAD
Ensayos separativos
No se puede hacer identificación sólo con el tiempo de retención.
HPLC/DAD
HPLC/MS
HPLC/MS-MS
CG/MS
CG/FTIR
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SELECTIVIDAD
Criterios de aceptación.
Al analizar el placebo no hay respuesta.
Resolución > 1.5
Factor de coleo < 2
Número de platos teóricos > 2000
Identidad del pico Pureza de pico.
Ausencia de coelución.
Recuperación del analito 98-102%
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LINEALIDAD Y RANGO
Se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta.
¿Como se hace? Solución patrón y Muestra problema 5 - 8 niveles de concentración, mínimo por
triplicado. Métodos bioanaliticos mínimo entre el 10 - 200 % de la concentración esperada.
Blanco de matriz (sin STD I)
Blanco de reactivos
STD 0: Blanco de matriz (con STD I)
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LINEALIDAD Y RANGO
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CONCENTRACION AREA
5 1.56
10 3.21
20 6.78
40 13.56
80 27.02
120 38.46
160 53.98
200 60.92
220 67.84
CONCENTRACION DE XXX
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250
CONCENTRACIÓN
AR
EA
RECTA DE REGRESIÓN
Y = b X + a
LINEALIDAD Y RANGO
Criterios de aceptación
Coeficiente de correlación r y de determinación r2.
r: >= 0.999
r2: >= 0.990
Prueba para el intercepto (prueba t)
Prueba para la pendiente (prueba t)
Prueba para la regresión (Prueba F)
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LIMITE DE DETECCIÓN
(LD)
Mínima cantidad de analito que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada, el límite de detección corresponde a tres veces la relación Señal – Ruido.
IMPORTANTE EN : análisis de trazas, contaminantes y productos de degradación.
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LIMITE DE DETECCIÓN
(LD)
Evaluación visual: concentraciones crecientes hasta encontrar la respuesta inequívoca.
LD = Ruido * 2(3), se debe comprobar experimentalmente.
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Limit of detection Limit of quantitation
Noise
Signal/Noise = 2 to 3 Signal/Noise = 10 to 20
LIMITE DE
CUANTIFICACIÓN (LC)
Mínima cantidad de analito que puede cuantificarse con precisión y exactitud adecuadas, el límite de cuantificación corresponde a diez veces la relación Señal – Ruido.
Se bebe comprobar experimentalmente con la preparación de tres muestras a una concentración que produzca la misma señal teórica. Analizada por duplicado, para calcular esta concentración se usara la ecuación de la curva de la prueba de la linealidad, tomando como valor “y” el valor teórico de la relación señal ruido (10 Np-p).
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LIMITE DE
CUANTIFICACIÓN (LC)
MÉTODOS BIOANALÍTICOS
Menor valor de la curva de calibración con
exactitud y precisión en los valores límites
Número de réplicas: mayor 5
Si se calculó por varios métodos, se selecciona el
valor menor.
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PRECISIÓN Y EXACTITUD
En (a), los disparos no son ni exactos ni precisos. En (b), son precisos pero
inexactos; el tirador dispara bien, pero es evidente una desviación
constante. En (c), los disparos son exactos pero imprecisos: la media de
los disparos estaría justo en el centro de la diana, pero cada uno de los
tiros se desvía significativamente. En (d), los disparos son exactos y
precisos.
ERRORES Y DISTRIBUCIÓN
NORMAL
Medición “Error” de medición
Valor de medición Incertidumbre de
medición
Resultado de
medición Valor de medición Incertidumbre de
medición
Error sistemático Error aleatorio
E.s. conocido E.s. desconocido
Corrección Error residual
*M. Roesslein, EMPA, Measurement Uncertainty in Analytical Chemistry, 2002
ERRORES EN LA MEDICIÓN
EXACTITUD
Grado de concordancia entre el valor que es
aceptado convencionalmente como valor verdadero
o un valor de referencia y el valor encontrado.
Indica que cerca se esta del valor verdadero
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EXACTITUD
¿Como se hace?
Se recomienda un mínimo de 3 determinaciones por 3 niveles de concentración en todo el rango especificado. (80%-120%). Bioanálisis ([] alta, media y baja)
La exactitud se expresa como: Porcentaje de recuperación (%R)
%R = Xm/U*100 % ER (error relativo) = Xm-Ct/Ct*100
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EXACTITUD
Criterios de aceptación
Materia Prima (pureza aproximada del 100%): 98.0 - 102.0%
Productos terminados: 97.0 - 103.0%
Contenidos de activo entre 0.1 – 1.0%: 95.0 – 105.0%
Métodos con procesos complejos de manipulación como extracciones y derivatización se pueden establecer recuperaciones entre 85.0 – 115.0%
Test De Cochran
Si G calculado < G tabulado se acepta Ho entonces las varianzas entre los niveles de concentración son equivalentes, es decir el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.
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PRECISIÓN
Grado de concordancia (grado de dispersión)
entre una serie de medidas obtenidas de
múltiples muestras de una muestra homogénea
bajo condiciones prescritas.
Se presentan tres niveles de precisión
Repetibilidad
Precisión intermedia
Reproducibilidad
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1
2
n
XXS
i
100% xX
SCV
REPETIBILIDAD
Expresa la precisión de la técnica analítica bajo las
mismas condiciones de operación en un intervalo
de tiempo corto.
Es llamada precisión intra-ensayo.
La repetibilidad esta dividida en dos niveles
Repetibilidad del sistema
Repetibilidad del método
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PRECISIÓN
¿Como se hace?
Repetibilidad
Mínimo 6 muestras al 100% ó un mínimo de 3
muestras a tres niveles. (80%-120%)
Precisión intermedia
Se estudiara la variación de los factores día (2 o 3
días) y analista (2 analistas) al 100% de la
concentración.
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PRECISIÓN Criterios de aceptación
Repetibilidad
Materia Prima: <= 2.0%
Productos terminados: <= 3.0%
Métodos de bioanalisis:15.0%
Precisión intermedia
Coeficiente de variación global: <= 2 CV de la
repetibilidad.
El resultado se presenta con intervalos de confianza para
cada nivel de concentración.
X t * s/√n
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REPRODUCIBILIDAD
El objetivo, es verificar que el método de análisis
proporciona los mismos resultados en diferentes
laboratorios.
Es llamada precisión inter-laboratorios.
Se acepta una variación del
10% del valor promedio de los
resultados del laboratorio
primario.
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ROBUSTEZ
Medida de la capacidad para permanecer
inalterado ante pequeñas pero deliberadas
variaciones en ciertos parámetros.
Proporciona idea de fiabilidad durante la
aplicación de rutina.
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ROBUSTEZ
¿Como se hace?
La evaluación de la robustez se realiza mediante
diseños factoriales:
Diseño factorial completo y fraccionado
Diseño de Youden-Steiner
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ROBUSTEZ
Criterio de aceptación
Cálculo del efecto:
|Vd-VD| = s+t+y+z - u+v+w+z
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La influencia de un factor es relevante y se considera significativa, si al comparar el valor del efecto con la expresión s√2 donde s es la desviación estándar de la repetibilidad las diferencias son superiores en valor absoluto al resultado de esta expresión.
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VALIDACIÓN DE
MÉTODOS
ANALÍTICOS
Cualitativos
ESPECIFICIDAD DE LOS
RESULTADOS
Capacidad de un método para detectar
como negativas aquellas muestras que
realmente no posean el elemento
analizado.
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ESPECIFICIDAD DE LOS
RESULTADOS
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Aplicar la tabla 2 x 2
E = d / b + d MUESTRAS
RESULTADOS
VP
FN VN
FP P
N
P N
a b
c d
SENSIBILIDAD DE LOS
RESULTADOS
Capacidad de un método para detectar como
positivas aquellas muestras que realmente
posean el elemento analizado.
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SENSIBILIDAD DE LOS
RESULTADOS
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• Aplicar la tabla 2 x 2
S = a / a + c MUESTRAS
RESULTADOS
VP P
N
P N
FN VN
FP a b
c d
VALORES PREDICTIVOS
POSITIVO
Es la probabilidad de que una muestra contenga el elemento de estudio cuando al aplicar la técnica analítica se obtiene un resultado positivo.
NEGATIVO
Es la probabilidad de que una muestra no contenga el elemento de estudio cuando al aplicar la técnica analítica se obtiene un resultado negativo.
VALOR PREDICTIVO
VPP = a / a + b MUESTRAS
VPN = d / d + c
RESULTADOS
VP P
N
P N
FN VN
FP a b
c d
PUNTO DE CORTE
Valor definido para un método determinado,
a partir del cual se considera positivo un
resultado, y por debajo del cual se considera
negativo.
Una prueba ideal debería ser 100 % sensible y
100 % específica, pero esto no es común.
La sensibilidad crece a expensas de la
especificidad y viceversa.
PUNTO DE CORTE
UMBRAL ( THRESHOLD)
Análisis de drogas de abuso en orina
Metabolitos de marihuana 100 ng / ml
Metabolitos de cocaína 300 ng / ml
Metabolitos de opiáceos 300 ng / ml
Atributos de calidad
métodos cualitativos
Itziar Ruisánchez, Esther Trullols y F. Xavier Rius. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS CUALITATIVOS . Grupo de
Quimiometría y Cualimetría. Departamento de Química Analítica i Química Orgànica. Universitat Rovira i Virgili. Pl. Imperial
Tàrraco, 1, 43005 Tarragona.
CONCORDANCIA
Permite evaluar la concordancia de los
resultados entre métodos o analistas.
IC = (a + d) / t
IC = (87 + 13)/100 = 1.00
INDICE DE KAPPA
Ik = Concordancia observada – concordancia por azar
1 – concordancia Por azar
Concordancia observada = Índice de concordancia
(IC)
Concordancia por azar = [(w * y) + (x + z)]
t * t
INDICE DE KAPPA
Altman DG. Practical statistics for medical research. New York: Chapman and Hall; 1991.
López de Ullibarri Galparsoro I, Pita Fernández, S. Medidas de concordancia: el índice de Kappa. Unidad de Epidemiología
Clínica y Bioestadística. Complexo Hospitalario-Universitario Juan Canalejo. A Coruña (España). Cad Aten Primaria 1999; 6:
169-171.
VALIDACIÓN- Referencias
59
US FDA Guidance on method validation http://www.fda.gov/cder/guidance/2396dft.htm For US FDA data submissions
Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation Published by employees of the US FDA, February 1987, http://www.fda.gov/cder/guidance/ameth.htm
VALIDACIÓN- Referencias
60
Validation of chromatographic methods, Reviewer Guidance (FDA) http://www.fda.gov/cder/guidance/cmc3
Policies and Procedures Guide for the Official Methods Program (OMA)
http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/omamanual.htm
VALIDACIÓN- Referencias
61
USP 34 NF 29. The United States Pharmacopeia – The
National Formulary. Capítulos generales <1010>,
Analytical data – interpretation and treatment y <1225>,
Validation of compendial procedures, United States of
America, 2011.
ICH Q2A: Validation of Analytical
Procedures: Methodology
http://www.fda.gov/cder/guidance/ichqa2.
ICH Publicaciones, Guías:
http://www.ich.org/UrlGrpServer.jser?@_ID=363&
@_TEMPLATE=272
VALIDACIÓN- Referencias
◦ Programas de Validación de Métodos
http://www.aoac.org/vmeth/page1.htm
62
http://www.ivthome.com/publications/index.htm
http://www.ivthome.com/free/index.htm
Aguirre L., Garcia J., Garcia T., Llera M., Juncadella M.
Lizondo M., et al., Validación de métodos analíticos.
Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria
A.E.F.I. 2001.
Miller N.J., Miller J.C., Estadística y quimiometría para
química analítica. Pearson educación S.A. Madrid 2002.