validaciÓn de las pruebas de potencia e identidad para …
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VALIDACIÓN DE LAS PRUEBAS DE POTENCIA E IDENTIDAD PARA
UNA VACUNA CONTRA LA FIEBRE AMARILLA
ANA SOFIA RINCÓN MANTILLA
JULIANA DEL PILAR ROJAS AMORTEGUI
_______________________ _____________________
FIRMA DIRECTOR FIRMA CODIRECTOR
Dr. JAIRO JOSE OVIEDO Dra. JANETH ARIAS, Msc.
____________________
ASESOR
Dra. DIANA M. MARTÍNEZ
VALIDACIÓN DE LAS PRUEBAS DE POTENCIA E IDENTIDAD PARA
UNA VACUNA CONTA LA FIEBRE AMARILLA
ANA SOFIA RINCÓN MANTILLA
JULIANA DEL PILAR ROJAS AMORTEGUI
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Santafé de Bogotá, D.C, Septiembre de 2001
VALIDACIÓN DE LAS PRUEBAS DE POTENCIA E IDENTIDAD PARA
UNA VACUNA CONTRA LA FIEBRE AMARILLA
ANA SOFIA RINCÓN MANTILLA
JULIANA DEL PILAR ROJAS AMORTEGUI
Trabajo de grado presentado como Presentado como requisito para
optar al título de Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Santafé de Bogotá, D.C, Septiembre de 2001
VALIDACIÓN DE LAS PRUEBAS DE POTENCIA E IDENTIDAD PARA
UNA VACUNA CONTRA LA FIEBRE AMARILLA
ANA SOFIA RINCÓN MANTILLA
JULIANA DEL PILAR ROJAS AMORTEGUI
________________________ ___________________________
Dr. CARLOS CORREDOR, PhD Dra .AURA ROSA MANASCERO
DECANO ACADEMICO DIRECTORA DE CARRERA
FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
VALIDACIÓN DE LAS PRUEBAS DE POTENCIA E IDENTIDAD PARA
UNA VACUNA CONTRA LA FIEBRE AMARILLA
ANA SOFIA RINCÓN MANTILLA
JULIANA DEL PILAR ROJAS AMORTEGUI
______________________ _____________________
FIRMA JURADO FIRMA JURADO
Dr. CARLOS MARIO AGUDELO Dra. PIEDAD SERRANO
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No. 13 de Julio de 1946: “La universidad no se
hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis
de grado”.
AGRADECIMIENTOS
A Jairo José Oviedo, Subdirector Industrial del Instituto Nacional de Salud,
por permitirnos llevar a cabo éste trabajo, por su valiosa colaboración y por
su confianza .
A Janeth Arias, Docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por su
constante colaboración, sus conocimientos, su paciencia, preocupación y
apoyo.
A Diana Martínez, profesional del grupo de Aseguramiento de la calidad del
Instituto Nacional de Salud, por su conocimientos y consejos útiles para
nuestra vida personal y profesional, además de su entusiasmo y su apoyo
incondicional.
A toda la División de Aseguramiento de la Calidad por su colaboración y
apoyo a lo largo del desarrollo del proyecto.
A Juliana Cuervo, compañera y amiga, por toda su colaboración, sus
conocimientos e interés para el buen desarrollo de éste trabajo.
A nuestras familias por su paciencia, apoyo y cariño brindado.
GRACIAS!!
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
1. MARCO TEORICO Pg. 10
1.1. RESEÑA HISTÓRICA. 10
1.1.1. Desarrollo de la vacuna de Fiebre Amarilla en Colombia 11
1.1.2. Problemática actual. 13
1.2.EL VIRUS DE FIEBRE AMARILLA. 15
1.2.1. El Genoma. 16
1.2.2 Ciclo de Vida. 19
1.3. AGENTE ETIOLÓGICO 21
1.4. TRANSMISIÓN. 22
1.4.1. La enfermedad y sus características clínicas. 24
1.4.2. Diagnóstico. 25
1.4.3. Tratamiento. 27
1.4.4. Prevención y control. 28
1.5. VACUNA CONTRA FIEBRE AMARILLA. 29
1.6. CULTIVO CELULAR. 34
1.6.1. Clases de cultivos celulares. 36
1.6.2. Células VERO. 37
1.7. CONTROL DE CALIDAD. 38
1.7.1. Prueba de Potencia. 39
1.7.2. Prueba de Identidad. 40
1.8. VALIDACIÓN. 41
1.8.1. Calificación / Calibración. 43
1.8.2. Validación de procesos. 45
1.8.3. Validación del ensayo. 46
1.9. ESTÁNDAR DE REFERENCIA. 50
2. JUSTIFICACIÓN 53
3. OBJETIVOS 55
4. MATERIALES Y METODOS
4.1. TIPO DE ESTUDIO. 56
4.2. MUESTRA. 56
4.2.1. Recepción de viales de muestra. 58
4.3. CALIFICACIÓN Y/O CALIBRACIÓN DE EQUIPOS. 58
4.4. CULTIVO CELUAR CON CÉLULAS VERO. 59
4.5. VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE POTENCIA 59
4.5.1. Repetibilidad. 60
4.5.2. Reproducibilidad 60
4.5.3. Linealidad. 61
4.5.4. Limite de detección (LDO). 62
4.5.5. Limite de cuantificación (LQO). 62
4.5.6. Robustez 63
4.6. VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE IDENTIDAD 63
4.7. ACTUALIZACIÓN DE LOS POE´S. 64
4.8. ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN 64
4.8.1. Precisión 64
4.8.1.1. Reproducibilidad 64
4.8.1.2. Repetibilidad 66
4.8.2. Linealidad 66
4.8.3. Limite de Detección (LDO) 67
4.8.4. Limite de Cuantificación (LQO) 67
5. RESULTADOS
5.1. RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE
IDENTIDAD
68
5.2. RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE
POTENCIA
70
5.2.1. Reproducibilidad. 71
5.2.2. Repetibilidad 78
5.2.3. Linealidad 80
5.2.4. Limite de Cuantificación 83
5.2.5. Limite de Detección 83
5.2.6. Procedimientos Operativos estándar. 84
6. DISCUSIÓN. 85
CONCLUSIONES 88
RECOMANDACIONES. 90
BIBLIOGRAFÍA
GLOSARIO
ANEXOS
LISTA DE TABLAS
Pagina
Tabla No.1. Numero de casos de Fiebre amarilla 14
Tabla No.2. Países de vacunación obligatorios para la Fiebre
Amarilla.
29
Tabla No.3 Datos de la Prueba de Interoperadores 72
Tabla No.4 Datos de prueba de Interdía 75
Tabla No.5 Datos de prueba de Repetibilidad 79
Tabla No.6 Datos de prueba de Linealidad. 80
Tabla No.7 Datos de Limite de Detección 84
LISTA DE FIGURAS
Pagina
Figura No. 1. Genoma viral del Flavivirus. 16
Figura No. 2. Proteínas virales del Flavivirus 17
Figura No. 3. Ciclo de vida del Flavivirus. 19
Figura No. 4. Aedes aegypti 21
Figura No. 5. Distribución de Aedes aegypti en el mundo 22
Figura No. 6 Ciclos de transmisión del virus 23
Figura No. 7 Células con Efecto Citopático 35
Figura No. 8 Moncapa de células VERO 37
Figura No. 9 Vacuna Stamaril Pasteur® 57
Figura No. 10 Vacuna del Instituto Nacional de Salud® 57
Figura No. 11 Placas de 24 pozos con la Prueba de identidad
de la Vacuna de Aventis Pasteur
69
Figura No. 12 Placas de 24 pozos con la Prueba de identidad
de la Vacuna del Instituto Nacional de salud.
69
Figura No. 13 Grafica de Linealidad: Log. Dilución Vs. Log.
UFP.
82
LISTA DE GRAFICAS
Pagina
Grafica No. 1 Prueba Vs. UFP/ml - Interoperador 73
Grafica No. 2 Operador Vs. UFP/ml – Interacción de
variables – Interoperador
74
Grafica No. 3 Día Vs. UFP/ml, Operador 1, Día 1 y 3 76
Grafica No. 4 Día Vs. UFP/ml, Operador 1, Día 2 y 4 76
Grafica No. 5 Día Vs. UFP/ml, Operador 2, Días 1 y 3 77
Grafica No. 6 Día Vs. UFP/ml, Operador 2, Días 2 y 4 77
Grafica No. 7 Hora Vs. UFP/ml – Repetibilidad 79
RESUMEN
La validación de pruebas analíticas es la caracterización de un ensayo que
permite determinar la importancia de los resultados obtenidos. Los ensayos
biológicos tiene diferentes fuentes de variación, sin embargo un control
efectivo de los procedimientos puede permitir una optima interpretación de
resultados. El propósito del presente estudio fue validar las pruebas de
potencia e identidad, empleando la técnica de cultivo celular en placas de
micro titulación, usando la vacuna Antiamarílica Stamaril Pasteur Mérieux
ConnaughT®. Se realizaron 5 repeticiones del procedimiento para la prueba
de identidad, por 2 observadores, para evaluar si la técnica cumple con el
propósito de determinar la presencia del virus de fiebre amarilla en la vacuna.
Para la Prueba de Potencia, se realizaron 4 repeticiones del procedimiento,
por 2 operadores diferentes y utilizando el mismo lote de vacuna
Antiamarílica en diferentes días, con el fin de evaluar los parámetros de
precisión (repetibilidad y reproducibilidad), linealidad, limite de detección y
limite de cuantificación. Para ambas pruebas se empleo la vacuna
Antiamarílica el Instituto Nacional de salud® lote 784, de titulo conocido,
como control positivo. Los resultados obtenidos con la validación de la
prueba de identidad, demostraron la capacidad de la prueba para reconocer
el virus de fiebre amarilla en el 100% de los ensayos con las dos vacunas
utilizadas, evidenciando la especificidad y confiabilidad de dicha prueba.
Los resultados obtenidos por la prueba de potencia muestran que los
parámetros de precisión (repetibilidad y reproducibilidad), linealidad, limite de
detección y limite de cuantificación, fueron aceptados como validos.
INTRODUCCION
La Fiebre Amarilla es una enfermedad viral tropical que se presenta por
periodos endémicos. Es la tercera enfermedad mundial, después de la
viruela y la rabia, controlada por vacunación. (LANG, J. 1999). Sin embargo,
en los reportes publicados por la OMS desde los años 80s, la enfermedad ha
presentado una dramática reincidencia en América y África, con un total de
18.735 casos y 4.255 muertes reportadas (ROBERTSON, S: 1996), lo que
representa que las epidemias tiene un 33% de ataque y más de 75% de
mortalidad en la población mundial (LANG; J. 1999). En Latinoamérica se
han notificado 1.392 casos en los últimos 10 años, de los cuales 80% han
ocurrido en Perú y Bolivia. (IQUEN,1999)
En Colombia se ha notificado 21 casos en los últimos 10 años, siendo
posible que estemos frente a un alto riesgo para la urbanización de la
enfermedad considerando que, en los últimos años, se han presentado
grandes movilizaciones de población debido a la situación de orden público
del país, así como el incremento en la población vectorial de Aedes aegypti,
siendo necesarias acciones que modifiquen las actuales condiciones.
(IQUEN,1999)
Ante la situación de tener una enfermedad considerada bajo control, pero
siendo de alto riesgo para la salud pública, el Comité Directivo de la OPS, en
1997, recomendó la inclusión de la vacuna contra la Fiebre Amarilla en los
programas nacionales de vacunación de los países suramericanos con
riesgo de urbanización de la enfermedad. (IQUEN,1999)
Los requisitos para la manufactura de la vacuna de fiebre amarilla, fueron
formulados inicialmente por le Comité de expertos de la OMS en 1958,
señalando que debía ser preparada a partir de una cepa apropiada del virus.
La vacuna obtenida con estas recomendaciones ha sido empleada en
campañas de vacunación y aplicación de refuerzos a viajeros con el fin de
obtener la certificación exigida para viajes internacionales y en programas
nacionales de inmunización, empleando la cepa 17D. En 1969 el comité de
expertos en estandarización de biológicos de la OMS, determinó que los
desarrollos en virología en general y la elaboración y control de la vacuna en
particular, garantizaban una revisión de los requerimientos existentes debido
a su uso nacional e internacional.
En 1975 el Comité revisó y formuló los requerimientos finales para la
producción de la vacuna, y desde entonces se han realizado varias
actualizaciones del documento que no han involucrado cambios radicales en
los parámetros establecidos. (OMS,1998).
Dentro del sistema de control de calidad aplicado a la vacuna, encontramos
pruebas biológicas, como Potencia e Identidad, que garantizan la calidad y la
efectividad de los productos biológicos, en este caso de la vacuna contra la
Fiebre Amarilla. Es importante asegurar, por tanto, la confiabilidad de éstas
pruebas por medio de un proceso de validación, el cual minimice las
probabilidades de error que se puedan presentar en el desarrollo de las
mismas.
1. MARCO TEORICO
1.1. RESEÑA HISTÓRICA La Fiebre Amarilla se distinguió por primera vez del paludismo, el dengue y
otras enfermedades tropicales durante una serie de epidemias que se
produjeron entre 1647 y 1649 en Barbados, Cuba, Guadalupe y México.
Desde entonces, periódicamente se han producido epidemias reconocidas
de Fiebre Amarilla en zonas de América y África. En 1900, una comisión
encabezada por el médico estadounidense Walter Reed confirmó que la
enfermedad se transmitía entre seres humanos por conducto del mosquito
Aedes aegypti, hipótesis que ya había propuesto el médico cubano Carlos
Finlay en 1881 (OMS, 1998).
En los años treinta se obtuvieron dos vacunas antiamarílicas vivas
atenuadas: la vacuna neurotrópica francesa (FNV), preparada a partir de
virus humano pasado por cerebro de ratón, y la vacuna “17D”, preparada a
partir de la cepa 17D del virus humano cultivada por huevos de pollo
embrionados. Actualmente se produce la vacuna 17D, con dos subcepas:
17D-204 y / o 17DD; pues se observó que el uso de la vacuna FNV estaba
asociado a una alta incidencia de reacciones encefalíticas en niños. La
vacuna 17D fue obtenida por Theiler y Smith en 1937 (OMS,1998).
Se han administrado más de 200 millones de dosis de la vacuna 17D, que ha
demostrado ser una de las vacunas más seguras de todos los tiempos,
debido a su gran eficacia en la lucha contra la fiebre amarilla durante los
brotes y entre epidemias. En 1990, el Grupo Consultor Mundial del Programa
Ampliado de Inmunización, recomendó que todos los países expuestos a la
Fiebre Amarilla incorporasen la vacuna a sus programas habituales de
inmunización. En 1992, 16 de esos 33 países en África habían incluido la
vacuna Antiamarílica en sus programas nacionales de inmunización. (OMS,
1998)
1.1.1. Desarrollo de la vacuna contra Fiebre Amarilla en Colombia
Hace sesenta años, 1939, se inició la producción de la vacuna contra la
Fiebre Amarilla en el laboratorio de la sección de Estudios Especiales del
Ministerio de Trabajo, Higiene y Prevención Social. Fue éste el tercer
laboratorio en el mundo donde se elaboraba tal producto con el virus
modificado 17D. El primero había sido el laboratorio de la fundación
Rockefeller en Nueva York donde Max Theiler, con la cooperación de Hugh
H Smith, había desarrollado la vacuna año y medio antes. El segundo fue el
Instituto Oswaldo Cruz de Río de Janeiro. (GROOT, H. 1999)
La importancia de producir la vacuna en Colombia era de exaltarse, pues
significaba una protección contra una enfermedad que golpeaba
frecuentemente con su alta mortalidad que aterrorizaba a las personas,
cerraba los puertos, paralizaba las ciudades y suspendía el comercio.
El laboratorio de la Sección de Estudios Especiales había sido el resultado
de un acuerdo entre el gobierno de Colombia y la Fundación Rockefeller.
Sus trabajos iniciales consistieron en proyectos cooperativos entre científicos
colombianos y norteamericanos para hacer algunas encuestas serológicas y
estudiar los brotes de fiebre amarilla en el Meta. (GROOT, H. 1999)
Los primeros lotes de la vacuna Bogotana fueron preparados por Doctor
Smith quien, desde un principio, se dedicó igualmente a adiestrar a un grupo
de científicos colombianos, tanto en la técnica de la elaboración de la vacuna
como en los procedimientos para aplicarla y para valorar su eficacia. Durante
1939, se prepararon 353.620 dosis y desde un principio se comprobó que su
calidad era igual a la de la vacuna preparada en Nueva York. A tal punto
llegó su prestigio que se recurrió a la vacuna preparada en Bogotá como
semilla para preparar nuevos lotes. Bien pronto, el laboratorio colombiano
aumentó su producción y pudo así atender las solicitudes de distintos países
de Latinoamérica e inclusive del África que la requerían para sus campañas
de vacunación. (GROOT, H. 1999)
En 1944, se cambió de nombre por el de “Instituto Carlos Finlay ”, en honor
al sabio cubano que descubrió la transmisión de la fiebre amarilla urbana por
el mosquito Aedes aegypti. Siendo Manuel Roca García nombrado director
de la misma en 1948, el ministerio de higiene se hizo cargo del control de la
institución, la cual a partir de 1950 recibió el apoyo de la Organización
Panamericana de la Salud. En 1961, el Instituto Finlay se fusionó con el
Instituto Nacional de Higiene Samper Martínez y con el Parque de
Vacunación para constituir lo que actualmente se conoce como Instituto
Nacional de Salud, a partir de entonces, la vacuna se ha venido preparando
ininterrumpidamente en su Laboratorio de Producción. (GROOT, H. 1999)
La vacuna ha mantenido siempre sus condiciones de excelencia. Durante
los últimos años se han preparado cantidades variables de 1 a 4 millones de
dosis por año, según las necesidades del país. Sin embargo, el laboratorio
está en capacidad de producir 8 a 10 millones anuales de dosis si tales
cantidades fueran necesarias. Millones de personas han sido protegidas con
la vacuna colombiana y a miles también se les ha evitado una muerte
dramática. (GROOT, H. 1999)
La preparación de la vacuna ha sido invariablemente el resultado de un
magnífico trabajo de equipo en el que los directores de la institución y los
responsables inmediatos de la elaboración. El país ha contraído una deuda
impagable con tan selecto grupo de personas, dedicadas exclusivamente a
buscar el bien de la humanidad. (GROOT, H. 1999)
1.1.2. Problemática Actual
Se ha presentado una reemergencia dramática de Fiebre Amarilla tanto en
África como en América del Sur. Entre 1987 y 1991 un total de 18.735 casos
de Fiebre Amarilla y 4522 muertes fueron reportadas alrededor del mundo,
con la mayoría de los casos en África. Esto representa la mayor actividad de
fiebre amarilla reportada por la Organización Mundial de la Salud (OMS,
1998), en un período de 5 años, desde que los reportes comenzaron en
1948. Los casos reportados en 1992 (295 casos) y 1993 (393 casos).
(ROBERTSON, S. 1996)
La fiebre amarilla continúa siendo un problema de salud pública importante
en América del Sur. Entre 1985 y 1999, Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador,
Perú, Venezuela y la Guayana Francesa señalaron 2.935 casos y 1.764
muertes (ver tabla 1). Durante este período, más del 80% de los informes de
Fiebre Amarilla en la región Suramericana se presentaron en Bolivia y Perú.
En 1999, Bolivia, Brasil y Perú mostraron unos porcentajes del 33%, 36% y
27% de todos los casos, respectivamente. Sin embargo, a partir de enero a
mayo 2000, un total de 66 casos confirmados fueron reportados en Brasil,
que representa más que 90% de todos los casos notificados en la región
durante este período. Todos los casos notificados en la región desde los
años 40 han sido por el ciclo selvático de fiebre amarilla, transmitida por los
mosquitos del género Haemagogus. Sin embargo, la propagación
abrumadora del mosquito Aedes aegypti, significa una amenaza para las
zonas urbanas. La seriedad de la situación actual de la fiebre amarilla en la
región exige una consolidación firme por los países a una estrategia fuerte y
eficaz para controlar la enfermedad. La Organización Panamericana de la
Salud (OPS), se preocupa por la prevención de está situación, por medio de
vigilancia, vacunación y control del vector.
(www.paho.org/English/SHA/be_v21n2-yellowfever.htm).
Los países y los territorios que han incluido la inmunización de niños contra
la Fiebre Amarilla son Trinidad y Tobago, Guyana y la Guayana Francesa.
Brasil, Ecuador y Perú han dado prioridad a la inmunización de niños en
áreas enzoóticas. Perú, Bolivia, Suriname y Venezuela han desarrollado
planes para introducir la vacuna contra la Fiebre Amarilla en sus planes de
vacunación de los niños, así como la vacunación de todas las edades en
áreas enzoóticas.
Tabla N.1. Numero de casos de Fiebre Amarilla
Epidemiological week 48
YELLOW FEVER: Number of cases and deaths notified to PAHO, 1985-2000
1985-94 1995 1996 1997 1998 1999* 2000* Case
s Death
s Case
s Death
s Case
s Death
s Case
s Death
s Case
s Death
s Case
s Death
s Case
s Death
s
Bolivia 409 304 15 15 30 21 63 47 57 39 68 33 7 5 Brazil 198 86 4 2 15 13 3 3 34 15 76 28 83 39 Colombia 52 44 3 3 8 4 5 4 1 0 2 2 3 2
Ecuador 44 28 1 1 8 8 31 4 4 4 3 1 2 1 French Guiana - - - - - - - - 1 1 - -
Perú 932 722 499 192 86 34 44 20 165 49 56 33 5 3 Venezuela - - 2 1 - - - - 15 4 1 1 Total 1635 1184 524 214 147 80 146 78 277 112 206 98 100 50
*Provisional Data Source Ministries of Health
Tomado de www.paho.org/English/SHA/be_v21n2-yellowfever.htm
En 1995 Perú experimentó el más grande problema reportado de fiebre
amarilla desde 1950 en algún país de Sudamérica. Basados en datos de la
OMS, se estima que algunos 200.000 casos de fiebre amarilla ocurren cada
año, con muchos de éstos en África. (www.paho.org/English/SHA/be_v21n2-
yellowfever.ht )
1.2. EL VIRUS DE FIEBRE AMARILLA
El virus de fiebre Amarilla pertenece a la Familia: Flaviviridae, Género:
Flavivirus. Esta Familia, de este genero presenta reportes de cerca de 70
miembros, siendo los más patógenos para el hombre, el virus del dengue y
fiebre amarilla. Este virus presenta una estructura física de pequeñas
proyecciones lisas y esféricas, con un tamaño de 35 a 45 nanómetros (OMS,
1998), con RNA lineal de cadena sencilla y de polaridad positiva que
contiene 10.862 nucleótidos con un relativo peso molecular de 3.75*106, y
está formado por una envoltura estrechamente adherida derivada de la célula
huésped y compuesta por una bicapa lipídica cubierta por peplómeros de
glucoproteinas que rodean una nucleocápside con simetría icosaédrica
(TOMORI, O. 1999).
Este virus presenta propiedades neurotrópicas y viscerotrópicas en una
variedad de huésped vertebrados. El viscerotropismo se presenta cuando el
virus tiene afinidad por tejidos viscerales, tales como el hígado, bazo y riñón,
produciendo destrucción. El neurotropismo se da cuando el virus tiene
afinidad por el sistema nervioso central, especialmente, el cerebro,
produciendo encefalitis y parálisis. (RICO. 1975). Después de pases
seriados en cerebro de ratón, el virus se adapta y llega a presentar un
neurotropismo más pronunciado y un viscerotropismo más atenuado. Los
cultivos prolongados de éste virus en embrión de pollo, han permitido la
obtención de una cepa atenuada llamada 17D, que ahora se utiliza como
vacuna.
El virus es inactivado por compuestos como el éter, cloroformo, Desoxicolato
de sodio, proteasa y lipasas, por calor (56°C por 30 minutos) y por luz
ultravioleta.(TOMORI, O. 1999)
1.2.1. El Genoma
Su genoma presenta una metilación en 5' pero con extremo 3’ no
poliadenilado. Según estudios del genoma, especialmente del genoma viral
de la subcepa 17D-204, la región 5´ cuenta con 118 nucleótidos, mientras
que la región 3´ cuenta con 511 nucleótidos (BARRETT, D.T. 1997). Su
marcación de lectura abierta, open reading frame (ORF), codifica una única
poli proteína, el extremo 5’ del genoma codifica para las proteínas
estructurales y las siete proteínas no estructurales por el resto del genoma.
Esta organización genómica implica que las proteínas víricas maduras se
producen mediante fragmentación y modificación post – traducción de una
poli proteína. Además, presenta estructuras secundarias y secuencias
conservadas en los extremos 5' y 3'
(http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
Figura No.1. Genoma viral de Flavivirus
Tomado (http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-
Hernanz/ricky.htm)
El genoma se encuentra envuelto por una proteína, proteína E, que
contiene una glicoproteina con un determinante antigénico especifico de tipo
y de grupo, considerándola como la proteína estructural más conservada.
Participa en la fusión con célula huésped inducida por un pH bajo.
Otra proteína es la asociada a la membrana, la proteína M, la cual se puede
presentar de 2 formas, dependiendo de la maduración del virus: como la
proteína pre-M (prM), donde la célula esta asociada a viriones inmaduros.
Tal proteína es Glicosilada, Heterodimeriza con proteína E. La otra forma es
la proteína de membrana madura M, cuando es extracelular o de virus
maduros. Es el resultado de la proteólisis de prM y eliminación de la
porción amino terminal C-terminal no glicosilado. La rotura ocurre justo antes
de que el virion se libere y sea requerido para la actividad de fusión e
infectividad.
Por último, la proteína C de la cápside que consiste en una Proteína
pequeña y componente básico de la nucleocápside
(http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
.
Figura No.2. Proteínas virales de Flavivirus
Tomado de www. Vu_wien.ac.at/i123/SPEZVIR/Flavivirus.html
En las proteínas no estructurales, no se ha podido determinar las funciones
de todas éstas. Entre ellas están:
- NS1 glicoproteína, la cual se presenta de formas secretada y no-secretada.
Tiene un papel en la replicación temprana basada en análisis mutacional
- NS3, Proteína altamente conservada, trifuncional, ya que es componente
de la replicación del RNA: helicasa y con actividad RNA trifosfato (formación
de la estructura 5' cap) y actividad proteasa contra la poliproteina asociada
a membrana.
- NS5, Proteína altamente conservada y bifuncional, ya que codifica para una
RNA polimerasa dependiente de RNA basada en la homología de
aminoácidos y tiene actividad metiltransferasa, realizando la metilación del
extremo 5'.
- NS2A, NS2B, NS4A, NS4B que son proteínas menos conservadas.
Sus funciones en los virus no son bien conocidas
(http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
Proteína E (Dímero)
Proteína M
Proteína C
Membrana
1.2.2. Ciclo de vida
Figura No.3. Ciclo de vida del flavivirus
Tomado de http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm
Su ciclo de vida se puede dividir en varias etapas:
1. Infección, la cual inicia con la adherencia del virus a la célula huésped
mediante los receptores celulares del huésped que interactúan con las
proteínas de la superficie de la partícula viral, mediando la unión a la célula,
por endocitosis (penetración).
El pH bajo causa un cambio conformacional importante para la fusión del
virus a la membrana de la vesícula, permitiendo así que el ácido nucléico del
virus se separe de su cubierta de proteína, es decir, el RNA viral se separa
de su cubierta protéica quedando la partícula viral como entidad infecciosa
(desnudamiento) (OSSA, J. 1990;
http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
2. Replicación del virus, donde el genoma puede servir de mRNA. El RNA en
primer lugar se traduce a proteínas, la primera de las cuales es una
polimerasa necesaria para que el RNA positivo sea copiado a RNA negativo
y éste a su vez en un RNA positivo que será el nuevo genoma para
completar, con las proteínas previamente formadas, el nuevo virus; siendo
directamente traducido por la polimerasa celular en un polipéptido. El
proceso donde el RNA positivo replicado a cadena negativa o encapsulado
en nuevos viriones, ocurre en asociación con el Retículo Endoplasmático
(ER). (OSSA, J. 1990; (http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-
Hernanz/ricky.htm)
3. Ensamblaje de los viriones, se lleva a cabo al nivel de membranas
celulares, donde el genoma RNA positivo se asocia con la proteína C
(cápside) para formar la nucleocápside. El genoma encapsulado entra en
el lumen del retículo endoplásmico y adquiere su envoltura. Tal genoma se
forma del ensamblaje de las proteínas virales y el nuevo genoma, dando la
formación de nuevas partículas. El rápido montaje y maduración de los
viriones ocurre en vesículas intracelulares, siendo las responsables del
aumento de la proliferación de estructuras de membrana en células
infectadas por flavivirus.
La salida de los viriones por exocitosis mediante la vía secretoria celular
(liberación). (OSSA, J. 1990; http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-
00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
La replicación del flavivirus se da en una variedad de cultivos celulares, ya
sean primarios o como líneas continuas. Dentro de las líneas continuas se
puede trabajar con células de riñón de mono verde africano, Cercopithecus
aethiops, (Vero), células de riñón de mono adulto de la India, Macaco
mulata, (LLC-MK2), células de hámster bebe (BHK) y células de riñón de
cerdo, mientras que en células primarias en monocapa, están los fibroblastos
de embrión de pollo y pato. La cepa 17D, utilizada en la producción de la
vacuna, puede lograr unos altos títulos y evidenciar mucho mejor el efecto
Citopático (CPE) en los cultivos de estas células.
1.3 AGENTE ETIOLÓGICO (VECTOR)
Figura No. 4. Aedes aegypti
La transmisión del virus de fiebre amarilla ocurre entre humanos y monos,
mediante el mosquito vector, el cual infecta a un huésped virémico (humano
o mono) y estos lo transmiten a otros susceptibles.
Los mosquitos son el principal reservorio del virus, ya que ellos son los que
continúan infectados por toda la vida, además de que el virus se replica en el
tracto genital de la hembra e infecta los óvulos, y así lo distribuyen a parte de
su descendencia, por medio de huevos infectados. Mientras que los
humanos y monos, por otro lado, juegan un papel de amplificadores
temporales. En los humanos se presenta un alto nivel de viremia después de
la infección hasta cerca del cuarto día, donde se inicia la aparición de
anticuerpos específicos.
La transmisión por mosquitos se da especialmente por Aedes aegypti, un
mosquito en el cual el virus se multiplica entre epitelio, cerebro y glándulas
salivales; y por el Haemagogus sp. Como vector selvático.
La infección de fiebre amarilla es muy común en ciudades pobres y
superpobladas, por el contrario a la urbanización, ya que ha sido el factor
mayoritario de la diseminación de las especies (TOMORI, O. 1999;
http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
Figura No.5. Distribución de Aedes aegypti en el mundo
Tomado de http:// infecto.edu.uy/revisiontemas/tema10/den6290.htm
1.4 TRANSMISIÓN-EPIDEMIOLOGÍA
Transmitido en un ciclo que implica humanos y mosquitos con ~100 millones
(http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm) de
casos de fiebre Amarilla ocurren anualmente en una gran área del mundo
como son las áreas tropicales de Asía, Oceanía, África, Australia y América,
ya que en ellas se presentan áreas temperadas, la cuales tienen mayor
susceptibilidad en verano a la actuación del mosquito Aedes aegypti y así a
la diseminación del virus en dichas áreas tropicales tienden a tener las
epidemias durante la estación lluviosa. Los estallidos normalmente
empiezan en Mayo y llegan a la cima en Julio y Agosto antes de empezar a
descender en octubre.
En Sudamérica existen 2 tipos de ciclos epidemiológicos, urbano y selvático.
Las dos formas de transmisión llevan a una enfermedad idéntica desde el
punto de vista clínico, puesto que el agente etiológico es el mismo virus. En
las epidemias de fiebre amarilla por ciclo urbano el virus se transmite al
hombre por medio de la picadura del mosquito A.aegypti, el cual se produce
en botes de basura y desechos. En cuanto al ciclo selvático, se caracteriza
por la transmisión del virus, de un mono a otro, por medio de un mosquito
del género Haemagogus. En estas circunstancias el hombre solo se infecta
al recibir una picadura de un Haemagogus a su vez infectado. (TOMORI, O.
1999)
Haemagogus Aedes aegypti
Mono Mono Humanos
Humano
Haemagogus Aedes aegypti
Ciclo selvático Ciclo urbano
Figura No.6. Ciclos de transmisión del virus.
En América, el virus de la fiebre amarilla circula hoy en día siguiendo un ciclo
selvático endémico que da lugar a varios cientos de notificaciones de
infección al año en trabajadores de la selva no inmunizados. En África, el
virus circula en ciclos tanto urbanos como selváticos y periódicamente
abandona su comportamiento endémico y afecta a gran número de personas
no inmunes en el curso de grandes epidemias.(OMS, 1998)
Aunque los mosquitos Aedes aegypti se encuentran en todos los climas, a
través de 90 años, la fiebre amarilla ha ocurrido únicamente en África y
Sudamérica. Estas Zonas de riesgo han sido confirmadas por estudios
serológicos. El porqué de la no-aparición de la enfermedad en otras regiones
del mundo, no ha podido ser explicado. (ROBERSONT, S. 1996)
1.4.1 La Enfermedad y Sus Características Clínicas
La Fiebre Amarilla es una enfermedad infecciosa aguda de duración breve y
gravedad variable. Presenta dos fases de desarrollo, separadas por un corto
periodo de aparente recuperación.
La Fiebre Amarilla, usualmente es reconocida por epidemias imprevistas, con
fiebre, escalofríos, dolor lumbar intenso y cefalea. Su periodo de incubación
habitual es de 3 a 6 días después de presentarse la picadura de un mosquito
infectado, recibiendo el nombre de fase congestiva. Los casos más leves se
presentan con un cuadro febril de pocos días de duración, imposible de
diferenciar con otros estados febriles agudos. Los síntomas más comunes
con los cuales comienza la enfermedad son fiebre alta (39 – 40°C),
escalofrío, intenso dolor de cabeza, un dolor muscular general, nausea y
vómito, la orina en este estado es de color oscuro y la mayoría no contiene
albúmina, y se presenta un pulso suave con relación a la fiebre es también
típico de este estado. Un periodo de aparente mejoría, se presenta
generalmente, después de las 12 – 24 horas siguientes, este se caracteriza
por una disminución de la temperatura, desaparece el dolor de cabeza y hay
una mejora en la condición general del paciente. Sin embargo, aparece
nuevamente un periodo de intoxicación o fase hepatorenal, en la cual
nuevamente hay un aumento de temperatura, reapareciendo todos los
síntomas y se observa sobre todo hemorragias, en particular hematemesis
(vómito negro), icteria ligera, hipotensión, taquicardia relativa, postración
marcada. El resultado de tal estado es una deshidratación, principalmente
por el vomito, una disfunción renal, que se hace notoria por un repentino
aumento en la albuminuria y disminución en la orina, shock, y un hipo
intratable, son considerados signos terminales.
Los casos de fatalidad de un total de casos infectados por fiebre amarilla
severa está entre el 50% o más altos. La muerte ocurre generalmente entre
los días 7 – 10 después de la aparición de la infección. La convalecencia en
el paciente puede durar de 1 a 2 semanas. (TOMORI,O. 1999;
http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
1.4.2 Diagnóstico
El diagnóstico diferencial se debe hacer con Hepatitis viral, Dengue, Malaria,
especialmente, sin olvidar la Leptospirosis, Influenza, fiebre por garrapatas,
Intoxicaciones por drogas y tóxicos según las condiciones y lugar de origen
del paciente.
Las pruebas rutinarias en el laboratorio, no pueden diagnosticar un caso de
Fiebre Amarilla; por lo tanto, hay 3 enfoques que pueden aplicarse para
confirmar un caso sospechoso:
A. El virológico.
El aislamiento del virus es relativamente fácil pero requiere equipos y
material especial, se consigue mediante la inoculación intracerebral de
ratones lactantes o cultivo de células con material infectado, puede ser
sangre obtenida durante los primeros 3 días de la enfermedad.
En los ratones, la infección se conoce por una parálisis ascendente a los
6 o 12 días de la enfermedad. (STRANO., 1975).
B. El Serológico.
El diagnostico Serológico emplea técnicas como Neutralización, Fijación
del complemento e inhibición de la hemoaglutinación.
La neutralización consiste en una reacción antígeno – anticuerpo, donde
la combinación especifica del determinante del antígeno con la región
variable de la molécula del anticuerpo reduce y hasta elimina totalmente
la actividad biológica del antígeno. Para ello empleamos un suero que
proteja al animal experimental o al cultivo de células contra el virus de
Fiebre Amarilla. Los anticuerpos neutralizantes se pueden encontrar en
el suero de los pacientes, después del quinto día de la enfermedad; son
protectores, y en este caso eliminan la infecciosidad del virus.
La fijación por complemento, se define como la capacidad que tiene un
virus para fijar un complemento, en grado tal que una segunda reacción
de antígeno – anticuerpo dependiente de complemento no pueda
producirse. Los anticuerpos para esta prueba aparecen después de 6
semanas de haber comenzado la enfermedad y por un periodo de tiempo
breve, siendo un buen método de diagnostico solo cuando hay indicios de
infección reciente. (STRANO. 1975).
La Inhibición por Hemoaglutinación es la capacidad de los sueros inmune
específicos en prevenir la aglutinación de glóbulos rojos de pollo, que
generalmente ocurre cuando es expuesto al virus de fiebre amarilla.
Aunque la gran desventaja es la utilización del virus vivo. Estos
anticuerpos aparecen dentro de las 5 – 6 semanas después de que
comienza la enfermedad, alcanzando rápidamente niveles elevados,
disminuyendo al año y permaneciendo luego indefinidamente, es la
menos especifica de las pruebas serológicas. (STRANO.1975)
Es importante anotar que el virus de fiebre amarilla, empieza a elevarse
hasta encontrar su máximo nivel a las 96 horas después de la infección, de
tal forma que a las 120 horas el virus ya no se identifica.
C. El histopatológico.
Las muestras de vicerotomía de hígado son una ayuda diagnóstica muy
importante desde los primeros casos de Fiebre amarilla en el país.
(STRANO.1975)
1.4.3 Tratamiento
Al considerarse como una enfermedad aguda los cuidados deben ser muy
estrictos. Además, la ausencia de una terapia especifica, el tratamiento de la
Fiebre Amarilla es principalmente de soporte, por que en la mayoría de áreas
donde se presenta la infección no hay recursos para un adecuado
tratamiento (TOMORI. 1999). En la fase temprana, la terapia se basa en el
control de la fiebre, vomito, y dolor de cabeza mediante el uso adecuado de
antipiréticos o baños para mantener la temperatura por debajo de 40°C, la
aspirina es permitida especialmente donde la población es endémica,
aunque puede causar gastritis y acidosis.
Durante la fase hepatorenal, la terapia debe contar con una monitoreo que
permite controlar las hemorragias y manifestaciones del daño hepatorenal;
dentro de los cuidados se tiene en cuenta el permanecer en cama, tener los
analgésicos o sedantes usados para los pacientes que tienen dolor severo.
Los fluidos orales son recomendados para pacientes con excesivos vómitos
o diarreas y si el caso lo requiere dar una asistencia con terapias de
oxígeno.
1.4.4 Prevención y control Este se ha venido realizando con el desarrollo de una vacuna, como una
prioridad de WHO (World Health Organization), la cual debe proporcionar
una inmunidad valida por 10 años. Aparte, se debe contar con un plan de
sanidad apropiada y educación pública, especialmente en los países
endémicos. Para ello se plantearon varias propuestas, que son: establecer
una rutina de inmunización, inspección, incluyendo monitorización y control
del vector. Además, los países en riesgo requieren de un continuo y sensible
sistema de monitoreo para una clara detección de los casos de fiebre
amarilla para una rápida respuesta en caso de una epidemia. Los
laboratorios de diagnostico diferencial son esenciales, ya que pueden
presentarse dificultades para distinguir la infección de fiebre amarilla con
otras muy similares como hepatitis, malaria, fiebre tifoidea y otros tipos de
icterias febriles.
Es importante tener una reducción o erradicación de Aedes aegypti,
eliminando los sitios de reproducción, y según sea el caso el adecuado uso
de larvicidas e insecticidas. (http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-
00/Bascon-Hernanz/ricky.htm)
Cuando se diagnostica un caso de Fiebre amarilla en una zona endémica, el
paciente debe permanecer en una habitación a prueba de mosquitos para
evitar contagios, por lo menos durante los primeros 5 días de la enfermedad.
1.5 VACUNA CONTRA FIEBRE AMARILLA
Se entenderá por vacuna contra la Fiebre Amarilla, una preparación de virus
de la Fiebre Amarilla viable y modificado, que se ajuste a todas las Normas
para las sustancias Biológicas de la Organización Mundial de la Salud.
(BERNAL, E. 1975)
Dicha vacuna se recomienda, y en algunos casos en forma obligatoria, a los
viajeros que se dirijan a los siguientes zonas:
Tabla No.2. Países de vacunación obligatoria contra la Fiebre Amarilla
América del sur Centroamérica Caribe y Antillas Europa Bolivia Belice Aruba Albania Brasil El Salvador Bahamas Malta
Colombia Guatemala Cuba Portugal Guayanas Honduras Dominica Paraguay México Jamaica Surinam Nicaragua Haití
Venezuela Panamá Puerto Rico Rep. Dominicana
Tomado de www.pucp.edu.pe/servcom/medico/fie_ama.htm.
La vacuna contra la Fiebre Amarilla se prepara en embrión de pollo,
utilizando la cepa 17D, de virus vivo atenuado, que satisface los
requerimientos formulados por la OMS. (OMS, 1987)
En el desarrollo de una adecuada inmunización se han desarrollado dos
vacunas antiamarílicas vivas atenuadas: la vacuna neurotrópica francesa
(FNV), preparada a partir de virus humano pasado 128 veces por tejidos de
cerebro de ratón y tejido de pollo, en los pasajes 250 a 260 de la vacuna de
virus viscerotropico (FVV) original. La vacuna “17D”, preparada a partir de la
cepa 17D del virus humano (conocido como virus ASIBI) fue pasada por
huevos de pollo embrionados por 176 pasajes. Ambas, la FNV y la 17D, no
fueron unas vacunas virales muy útiles, por que causaban viscerotropismo
como característica de la cepa silvestre del virus, en humanos y micos. Se
observó que el uso de la vacuna FNV estaba asociado a una alta incidencia
de reacciones encefalíticas en niños, razón por la cual se detuvo su
producción hacia el año de 1980, mientras que la vacuna 17D fue aprobada
por su mayor eficacia y seguridad. (BARRETT, D.T. 1997).
Se ha demostrado que la vacuna Antiamarílica es segura. Sólo se han
comunicado 19 casos de encefalítis temporalmente asociada a la vacuna
preparada a partir de la cepa 17D, principalmente en niños, a pesar de que
desde 1945 se han administrado más de 200 millones de dosis. Puesto que
todos esos casos salvo seis se produjeron en niños inmunizados a los cuatro
meses de edad o menos, un cuadro de expertos recomendó que la vacuna
Antiamarílica no se administrase antes de los seis meses de edad salvo en
casos excepcionales. (OMS, 1998; MEEGAN, JM. 1991)
Anteriormente hubo algunos problemas asociados a la atenuación
insuficiente o excesiva de la cepa 17D en el pase. Esos problemas se
resolvieron mediante el establecimiento de un sistema de lotes de siembra
de virus. Hoy en día se utilizan varias subcepas para la fabricación de la
vacuna 17D. (GALAZKA, A.M. 1993), que son: la subcepa 17D-204, la cual
fue derivada del pasaje 204 de la 17D, mientras que la subcepa 17DD fue
derivada del pasaje 195 de la 17D, aunque en países de Sudamérica tiene
pasajes adicionales (286-288) en huevos de embrión de pollo. (BARRETT,
D.T. 1997).
Un estudio detallado en el que se recurrió a la cartografía de
oligonucleótidos y al análisis de anticuerpos monoclonales de la variación
genética y antigénica entre esas subcepas demostró una homología de
nucleótidos del 98% al 100% en la secuencia de ARN, lo que demuestra un
alto grado de semejanza genética y antigénica entre las subcepas (OMS,
1998). En Sur África, la subcepa 17DD difiere de la subcepa 17D-204 por un
oligonucleótido, algo similar ocurre con la subcepa 17D-204 producida en
Brasil, Senegal y Colombia, todas difieren una con otra por un nucleótido.
Así, las vacunas manufacturadas por diferentes productores parecen ser muy
similares sobre los oligonucleotidos. el genoma del virus ASIBI y los virus
vacunales 17DD y 17D-204 ya han sido secuenciados, Se describen 68
nucleótidos diferentes entre el virus Asibi y 17D-204, el cual codifica 32
aminoácidos diferentes. También, se han establecido cambios comunes en
los virus 17DD y 17D-204 del Asibi, además, no presentan cambios en la
región 5´, indicando que no juega un papel en la atenuación del fenotipo
(BARRETT, D.T.1997).
Es importante que todos los países que utilizan el virus de siembra, estén
exentos de virus de la leucosis aviar, sin embargo, algunos países permiten
la producción de vacuna en huevos de pollo embrionados en los que no se
ha demostrado la ausencia de ese virus. Esta práctica puede estar justificada
cuando el costo y la dificultad de obtener huevos embrionados sin virus de la
leucosis aviar pudiera limitar la disponibilidad de vacuna Antiamarílica,
particularmente en vista de las pruebas epidemiológicas que demuestran la
falta de relación entre la vacunación contra la fiebre amarilla y la leucemia, el
linfoma u otros cánceres. Por este motivo, las Normas revisadas no
especifican que los huevos deban estar exentos de virus de la leucosis aviar
(OMS, 1998).
Es importante velar por que las nuevas mezclas de virus de siembra, sean
lotes maestros o de trabajo, tengan niveles de neurotropismo y
viscerotropismo comprendidos entre límites de seguridad. La neurovirulencia
o inmunogenicidad es probada por inoculación intracerebral de grupos de
mas de 100 monos, Rhesus o Cynomolgus son los monos más usados, por
que han mostrado una deficiencia pre-existente de anticuerpos antiflavivirus.
Entre las observaciones clínicas se debe tener en cuenta que no mas del
10% de los monos en prueba puedan desarrollar signos de encefalitis,
(parálisis), la viremia no puede exceder de 1.65*104 UFP/ml (DL50/ml) en el
90% de los monos; y el 90% de los monos puede desarrollar anticuerpos
neutralizantes. El virus semilla también es examinado para vicerotropismo,
por medición de niveles enzimáticos vivos. Si el virus semilla pasa sobre
está prueba la vacuna es aprobada para humanos. La prueba de inocuidad
pertinente, efectuada en monos, se ha mantenido por consiguiente en las
normas revisadas. (BARRETT; D.T. 1997)
Una importante enmienda en las Normas se refiere a la inclusión de una
prueba de la termoestabilidad de la vacuna a título de requisito y no de
recomendación. Cada lote de vacuna Antiamarílica, entonces, deberá ser
evaluado ensayando su potencia antes y después de ser almacenado a 37°C
durante dos semanas. (OMS, 1988).
La vacuna es contraindicada en individuos inmuno comprometidos, como
mujeres embarazadas, pues en el primer trimestre, el bebe genera un alto
nivel de IgM y neutraliza Anticuerpos del virus de Fiebre Amarilla, lo que
indica que el virus cruza la placenta e infecta al bebe; otro grupo de personas
a las que se contraindica, es a los que sufren de SIDA, pues se estimula su
inmunidad o el virus muta revirtiéndose la virulencia. (BARRETT, D.T. 1997)
La OMS puede proporcionar virus de siembra primario para la producción de
la vacuna Antiamarílica. (OMS, 1998)
Las normas de la vacuna Antiamarílica (Normas para sustancias biológicas
No.3) fueron formuladas por primera vez por un Grupo de Estudio de la OMS
en 1958. (OMS, 1959). Las normas incluían recomendaciones formuladas
por el primer Comité de Expertos de la OMS en Vacuna Antiamarílica y se
referían a la vacuna preparada a partir de una cepa adecuada de virus de la
fiebre amarilla. La vacuna debía ser administrada por inyección subcutánea.
La conformidad con éstas normas ha sido la base para la aprobación por la
OMS de la vacuna Antiamarílica utilizada para la vacunación y revacunación
contra la fiebre amarilla en relación con la certificación a los fines de los
viajes internacionales; esa aprobación se ha concedido solamente a las
vacunas preparadas utilizando lotes de siembra derivados de la cepa 17D del
virus de la fiebre amarilla. Las autoridades nacionales también han utilizado
normas para el control y la aprobación de la vacuna Antiamarílica utilizada en
los programas nacionales de inmunización. En 1969, el comité de expertos
de la OMS en Patrones Biológicos acordó en su reunión No. 22 que los
avances de la virología en general y de la fabricación y control de la vacuna
Antiamarílica en particular justificaban la revisión de las normas vigentes, con
la debida consideración a su aplicación tanto nacional como internacional
(OMS, 1998).
En 1975, el comité de expertos de la OMS en Patrones Biológicos en su
reunión No.27 formuló normas revisadas para la vacuna Antiamarílica por
primera vez. Actualmente, después de haber adquirido gran experiencia con
la preparación de vacuna Antiamarílica, estas normas se encuentran en el
documento escrito en 1998 por la OMS.
1.6. CULTIVO CELULAR
El cultivo de células (o “cultivo de tejidos”, como también se denomina) tiene
su origen en el siglo XIX, cuando se comenzaron a estudiar con cierto detalle
los tejidos y órganos en vasos de vidrio. El término in vitro significa
literalmente “en vidrio”, aunque en la actualidad la mayor parte de los cultivos
celulares se realizan en o sobre plástico. La mayoría de los medios para el
cultivo de células actualmente utilizados se basan en experiencias iniciales
sobre la composición de soluciones que permitían que células obtenidas de
tejidos sobreviviesen fuera del organismo donante durante cortos períodos.
El cultivo celular ha alcanzado en el presente una posición en la que su
objetivo es con frecuencia reproducir las condiciones existentes in vivo que
permitan el crecimiento en cultivo de células “normales” (no tumorales). En la
actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una
amplia gama de tejidos y organismos diferentes. (MORGAN, S. 1995)
El cultivo de células es un proceso por medio del cual células animales
tomadas de diferentes órganos y colocados en condiciones especiales;
logran sobrevivir y multiplicarse manteniendo sus funciones metabólicas en
forma similar a la que poseían en el huésped original. El procedimiento
consiste en la separación de las células por acción de una enzima
proteolítica, tripsina, pancreatína o colagenasa y la siembra de estas células
individualizadas en un medio nutritivo de crecimiento, con base de sales,
aminoácidos, vitaminas y suero. (FRESHNEY, I.R. 1995).
La técnica de cultivos celulares permite realizar Aislamiento y cultivo de virus
con fines diagnósticos, Cuantificación de Replicación viral, Producción de
virus purificado, Producción de interferón, además de Producción y control
de vacunas. Generalmente, se evidencia por Unidades formadoras de placa
(UFP), las cuales son grupos celulares que forman desprendimientos en
forma redondeada y tamaño bastante regular, por la infección de los viriones
que se replican y afectan las células del cultivo, produciendo degeneración y
muerte de las mismas. (FRESHNEY, I.R. 1995; FRENNER, F. 1992).
En 1973, un grupo de consultores de la OMS, dice que los estudios para
determinar la potencia de la vacuna de Fiebre Amarilla, pueden ser llevados
a cabo satisfactoriamente a través de la técnica de cultivo celular, ya que
esta, demostró ser un método practico y confiable. Sin embargo, se
reconoce que muchos laboratorios no tienen acceso a dicha técnica, ya que
existe una dificultad para adquirir los materiales y equipos necesarios
(SEAGROATT, V. 1983).
Figura No.7. Células con Efecto Citopático: (ECP)
Estos cultivos pueden elaborarse:
a. En monocapa o cultivos estacionarios, en los cuales las células se
sedimentan y adhieren al vidrio u otras superficies como plástico,
multiplicándose hasta formar una capa continua o red. Las células de
estos cultivos toman forma de huso, poligonal o ameboide. Se
elaboran en tubos, frascos planos o cajas de petri y laminillas o en
frascos redondos colocados en aparatos giratorios, obteniéndose así
una mayor superficie de cultivo. (MORGAN, S. 1995)
La técnica de cultivos celulares en monocapa fue ideada por Earle y
colaboradores y sirve para un amplio espectro de líneas celulares y
cultivos primarios. Los cultivos en monocapa son los más usados para
aislamiento de virus. (FRESHNEY, I.R. 1995).
b. En suspensión, caso en el cual las células no se adhieren al vidrio, pues
se mantienen en agitación rápida y se multiplican en el medio de cultivo.
1.6.1. Clases De Cultivos Celulares
1- Cultivos primarios (Diploides). Son preparados de tejidos u órganos de
animales recién sacrificados o de fetos. Estos se inician principalmente de
tejidos de embriones sanos y se consideran como los más satisfactorios,
para la propagación de virus. Los órganos pueden ser obtenidos de
embriones, de animales recién nacidos o de adultos; sin embargo se
prefiere tejido embrionario debido a que proporciona más ventajas para la
preparación, adaptabilidad y crecimiento. (FRESHNEY, I.R. 1995).
2- Subcultivos (Diploides). A partir de los primarios. Estos son cultivos de
células primarias, propagadas seriadamente, las cuales retienen un
número normal de cromosomas. El número de transferencias que puede
llevarse a cabo satisfactoriamente, depende en forma considerable del
tejido y de las especies animales. (FRESHNEY, I.R. 1995).
3- Cultivos Semicontinuos o Cepas celulares (Diploides). Se logran
efectuando un número alto de subcultivos (hasta 50) sin que haya
degeneración celular.
4- Cultivos Continuos o Líneas Celulares (Heteroploides). Cuyo origen
puede ser de células normales o malignas que pueden subcultivarse
indefinidamente. Estas son células con número de cromosomas anormal
(heteroploides) y una morfología que las capacita para mantenerse
indefinidamente in vitro por la transferencia en serie. Las líneas celulares
son más resistentes a un mayor número de pasajes. (FRESHNEY, I.R.
1995).
1.6.2. Células Vero
Según la ATCC, las células Vero provienen del organismo Cercopithecus
aethiops (Mono Verde Africano). Esta línea celular se inició del riñón de un
mono verde Africano el 27 de marzo de 1962 por los investigadores Y.
Yasumura y Y.Kawakita. En la Universidad de Chiba en Japón. Estas células
poseen una morfología epitelial y su crecimiento es adherente.
(http://www.atcc.org)
Figura No.8. Monocapa de Células VERO
1.7. CONTROL DE CALIDAD
De acuerdo a los parámetros internacionales de la OMS, y para garantizar la
calidad y efectividad de la vacuna de Fiebre Amarilla, se realizan varias
pruebas de control, como son las pruebas de Potencia e Identidad, las
pruebas de esterilidad, inocuidad y las respectivas fisicoquímicas, entre
otras. (OMS, 1998).
Las pruebas de Potencia e Identidad se pueden realizar in vivo (ratones) o In
vitro (células). Según un estudio realizado en 1995, muestra que el ensayo
en cultivos celulares (In vitro) es eficiente para medir la infectividad, por su
sensibilidad, rapidez y reproducibilidad; mientras que con animales (In vivo)
hay riesgos de muerte prematura, cambio en la inmunidad y sensibilidad del
animal. (SOOD D,K. 1995).
Tanto en la prueba de potencia como en la prueba de identidad realizadas In
vitro (células), se infecta la monocapa celular con diferentes diluciones de la
vacuna, lo que da como resultado la aparición de Unidades Formadoras de
Placa, es decir, la muerte de grupos celulares que producen
desprendimientos en forma redondeada y tamaño bastante regular.
Estas Unidades Formadoras de Placa (UFP) se presentan por la destrucción
de las células por parte del virus cuando éste se replica, por lo que en la
monocapa celular aparecen gradualmente evidencias visibles del daño
celular a medida que los viriones formados afectan las nuevas células del
cultivo; fenómeno conocido como efecto Citopático. (FRENNER.1992).
1.7.1. Prueba de Potencia
La prueba de potencia permite establecer el número de partículas virales por
dosis humana, mostrando la capacidad de la vacuna para inducir una
respuesta inmune.
El contenido viral de una vacuna puede ser cuantificado por la técnica de
cultivo celular en células VERO de riñón de mono verde Africano, conocida
como dosis infecciosa en placa, ó por inoculación en ratones con Dosis letal
50 (DL50), es decir, determinar la concentración viral que puede matar a
50% de los ratones. A través de ambas técnicas se puede calcular el titulo
del virus, aunque algunos estudios han reportado discrepancias e
inconsistencias entre la dosis requerida para ratones y la requerida para
infectar un cultivo celular. La OMS, requiere que cada dosis contenga
menos de 1000 DL50 en Ratón (ó su equivalente en UFP: unidades
formadoras de placa), lo cual determina cada laboratorio según sus
procedimientos, ya que tal equivalencia total no se encuentra determinada.
Las diferencias entre ratones y cultivo celular para conocer la concentración
de virus en la vacuna son evidentes, así se ve en un estudio hecho en 1988
en 300 hombres voluntarios de la milicia Francesa, donde se descubrió que
solo 200 UFP (o 600 DL50 en ratón) fueron suficientes para inmunizar 100%
de los voluntarios, mientras que un estudio realizado por Freestone reporto
que 178 UFP (equivalente a 30 DL50 en su sistema) inmunizaron el 85% de
sus voluntarios. (BARRETT, D.T. 1997).
Según el Informe Técnico de la OMS de 1998, para la prueba de potencia se
deben elegir al azar tres viales definitivos de cada lote final y se ensayarán
por separado el mismo día con una preparación de referencia de vacuna
Antiamarílica aprobada por el organismo nacional de inspección. Los viales
se someterán a ensayo en cultivos celulares.
Antes del ensayo, pero después de la reconstitución de la vacuna en el
volumen recomendado por el fabricante para la preparación destinada al ser
humano, la vacuna se mantendrá a una temperatura entre 20ºC y 30ºC
durante 20 minutos antes de diluirla. Este material se considerará vacuna no
diluida.
Cada laboratorio determinará, a satisfacción del servicio nacional de
inspección, la relación entre la DL50 en ratones y la UFP.
El ensayo en placa ofrece una ventaja específica de producir un evento
contable, como es; la formación de placas Vs la dosis de virus. El título de
virus/ml, es determinado por la división del número total de unidades
formadoras de placa (UFP) / volumen total evaluado. (DARLING, A. 1998)
Cada laboratorio que utilice un ensayo en cultivo celular contará con la
correspondiente aprobación del servicio del servicio nacional de inspección
(OMS, 1998). En Colombia, le corresponde al INVIMA realizar estas
aprobaciones.
1.7.2. Prueba de Identidad
La prueba de Identidad nos permite identificar y verificar la presencia del
principio activo en la vacuna, es decir el virus de Fiebre Amarilla. (FIOCRUZ
1988).
Según el Informe Técnico de la OMS de 1998, la prueba de identidad se
efectuará en al menos uno de los viales de cada lote final tras la
reconstitución de la vacuna de acuerdo con las indicaciones del fabricante
para la preparación de la vacuna para administrarla a seres humanos. Se
utilizará un suero Hiperinmune de mono específico de alta titulación del que
se sepa que está exento de agentes neutralizantes que reaccionen con otros
flavivirus. Pueden usarse dos métodos para la prueba de identidad. La
prueba en ratones y prueba en cultivos celulares (Prueba de reducción en
placas).
En ésta última, en la técnica se realizan diluciones de la vacuna con suero
Hiperinmune y no inmune. Para ello se mezclarán diluciones 1:10, 1:40 y
1:160 de suero Hiperinmune de mono, con un volumen igual de virus de
vacuna de la cepa 17D en una dilución que se haya demostrado que produce
un número óptimo de placas cuando se ensaya con un método de cultivo
celular. Estas mezclas de sueros y virus se incubarán en un baño de agua a
37°C durante 1 hora y a continuación se enfriarán en un baño de agua y hielo
antes de la inoculación de partes alícuotas de 0.2ml de cada mezcla en
cuatro placas de cultivo celular distintas. Además se inocularán 10 placas del
mismo modo con virus y un volumen igual de una dilución 1:10 de suero de
mono que no contenga anticuerpos neutralizantes del virus de la fiebre
amarilla. Al final del período de observación, el número medio de UFP en las
placas que han recibido virus y suero no inmune, se compararán con el
numero medio de UFP en las placas que han recibido virus y suero de mono
Hiperinmune. Para que se supere la prueba de inmunogenicidad o identidad,
el suero Hiperinmune de las diluciones, no deberá presentar Unidades
formadoras de placa, en comparación con las diluciones del suero no
inmune. (OMS. 1998)
1.8. VALIDACIÓN.
El control de calidad y los análisis específicos de un producto biológico son
indispensables para asegurar su eficacia y cumplimiento de ciertos
requerimientos y poseer características precisas de confiabilidad. Por ello, se
hacen necesarios determinar un adecuado método de análisis que permitan
obtener un resultado que pueda o no ser validado. (ROJAS, J. 1997)
El proceso de validación tiene sus inicios en los años de 1972-78, donde se
busco satisfacer exigencias normativas y defender líneas de producción.
Hacia el año 1983, la validación sirve como método de acción fundamental
defensiva y mejora de procesos; posteriormente, la validación se enfoca a
diferentes áreas de producción y optimización de procesos dando diversos
conceptos de validación, los mas importantes son:
- Es el proceso para determinar la capacidad de una metodología
analítica para producir resultados analíticos útiles (Taylor) (ROJAS, J.
1997).
- Proceso por el cual se establece mediante estudios de laboratorio que
las características de desempeño del método analítico cumplen los
requerimientos para la aplicación analítica propuesta (USP XXIII)
(ROJAS, J. 1997). Entre otras definiciones.
Un adecuado proceso de validación debe desarrollase dentro del marco de
las Buenas practicas de Laboratorio, ya que garantizan la seguridad de los
datos obtenidos y poder así juzgar sobre la seguridad de un producto,
permitiendo dar una documentación confiable y segura, además la validación
permite obtener la optimización y estandarización de procesos al disminuir el
tiempo muerto del equipo, dar mayor rapidez y seguridad de las pruebas, así
como el desarrollo de estándares y mejores limites de especificación para el
proceso; la reducción de costos (preventivos, agregado – inspección
/análisis - y costos por fallas externas), la reducción de la probabilidad de
fallas en el proceso y por lo tanto reproceso y rechazos, permiten reducir los
análisis finales y incrementa la productividad. Así mismo se cumplen con
regulaciones gubernamentales, al ser la validación parte esencial de las
Buenas Practicas de Laboratorio, permitir el establecimiento de procesos y
procedimientos consistentes, ya que sin procesos validados y controlados es
imposible obtener productos con calidad. (ROJAS, J. 1997)
A pesar de ello, el proceso de validación presenta algunas limitaciones entre
las que está el personal, con respecto a los operarios y supervisores, los
costos que genera el control en el proceso y los de estudios de validación, y
el 100 % de aseguramiento es irrealizable.
En conclusión, se busca la idoneidad probada para el uso pretendido
permitiendo validar instrumentos, componentes y sistemas, así como la
validación de métodos de análisis, permitiendo dar bases estables de
idoneidad del sistema. (ROJAS, J. 1997)
Dentro de este proceso, se validan:
1. Equipo, como instrumento y el que lo controla.
2. Método analítico: su sensibilidad, precisión, etc.
3. Sistema analítico: la combinación de instrumentos, ordenados y
método. Se confirma que el conjunto funciona como se espera.
4. Análisis de la muestra: documentación y comprobación de los datos
primario.
1.8.1. Calificación / Calibración
Dentro del proceso de validación, se debe incluir la calificación y/o
calibración de equipos o instrumentos, ya que estos son parte fundamental
del desarrollo de un procedimiento.
- Calibración: comparación de un estándar de medida o instrumento de
exactitud conocida con otro estándar o instrumento para detectar,
correlacionar, reportar, y/o eliminar por ajuste cualquier variación en la
exactitud del instrumento que está siendo comparado. Los datos que se
recogen dependen de la confiabilidad de los instrumentos de medida.
Debe existir un programa de calibración para instrumentos de proceso y
sistemas analíticos.
- Calificación: Ejecución de pruebas para determinar si un componente
de un proceso de fabricación posee los atributos requeridos para obtener
un producto con una calidad determinada. La calificación se realiza
contra las especificaciones y/o normas nacionales o internacionales,
además provee de información básica acerca del diseño, instalación,
operación, funcionamiento y mantenimiento (limpieza) de cualquier
sistema como asegura que los procesos permanecen en su estado de
validación. (ROJAS, J. 1997)
Para la calificación se debe tener en cuenta:
- D.Q : CALIFICACIÓN DEL DISEÑO: determinación de la factibilidad que
tiene un proceso o sistema para ser desarrollado y alcanzar su objetivo.
- I:Q: CALIFICACIÓN DE INSTALACIONES: verificación documentada de
que todos los aspectos claves de la instalación están de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante y corresponden a las especificaciones
aprobadas en el diseño.
- O.Q : CALIFICACIÓN OPERACIONAL. Verificación de que los equipos
funcionan en la forma esperada y son capaces de operar satisfactoriamente
sobre todo el rango de los parámetros operacionales para los que han sido
diseñados.
- P.Q : CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO: Demostrar la efectividad y
reproducibilidad del proceso, bajo condiciones normales de operación y bajo
condiciones limite de operación.
D.Q.
I.Q O.Q P.Q Validación
Calibraciónn
1.8.2. Validación de Procesos
Dentro de la validación de procesos encontramos 4 tipos de validación:
a. Validación Prospectiva, consiste en establecer evidencia
documentada para demostrar que un proceso cumplirá con su
propósito, basados en información obtenida antes de la
implementación del mismo, es decir, se hace antes de que el proceso
entre a formar parte de la fabricación comercial.
b. Validación Retrospectiva, consiste en establecer evidencia
documentada de que el proceso cumple con su propósito, basado en
la revisión y análisis de la información histórica del mismo. Se emplea
cuando el producto ya se encuentra en el mercado y cuyo proceso de
manufactura no se considera estable, así como cuando las
características del producto, económicamente no justifican hacer una
validación prospectiva.
c. Validación concurrente, consiste en establecer evidencia
documentada para demostrar que un proceso cumple con su
propósito, basados en información obtenida durante la implementación
del mismo, es decir, los datos se toman durante el desarrollo del
proceso.
d. Revalidación, la cual es la repetición de un proceso de validación o
parte del mismo, sin que el programa original sea repetido,
simplemente es realizado cuando hay cambios de algún componente,
pieza, instalaciones, y además especificaciones criticas del
producto.(ROJAS, J. 1997)
En la validación de procesos es muy importante mantenerse el buen estado
de la misma, por ello se deben tener en cuenta las “BPV” o Buenas
Prácticas de validación, es decir, establecer un programa de calificación
periódica a equipos, calibración de instrumentos y análisis del sistema, así
como de las posibles variables. Es un programa preventivo, en donde los
posibles cambios del sistema no serán una alteración.
1.8.3. Validación del Ensayo
Con la validación se busca dar una importancia a los resultados obtenidos en
el ensayo a evaluar, mediante una serie de pruebas (BARRET, D.T. 1997),
lo que hace necesario definir apropiadamente las condiciones en las cuales
un procedimiento se llevara a cabo (OMS, 1992), en el caso de las pruebas
biológicas, que tiene diversas fuentes inherentes de variación, el control
cuidadoso de reactivos y los procedimientos estrictamente controlados,
permiten una cuantificación e interpretación segura de los resultados.
Primero que todo, la validación de un ensayo es la práctica de una buena
ciencia. Existe una guía específica para ensayos de validación, la cual
aunque formulada para ensayos de potencia para productos, es
suficientemente aplicable a los ensayos biológicos como la detección y
cuantificación de virus (DARLING, J. 1997 ). Entre las características que
pueden ser examinadas, están: precisión, repetibilidad, reproducibilidad,
linealidad, límite de detección, límite de cuantificación y robustez. (ROJAS, J.
1997)
a. Precisión: es el grado de concordancia entre los resultados de
pruebas individuales. El método se aplica repetidas veces a muestras
separadas e idénticas, obtenidas del mismo lote del material
homogéneo (OMS, 1992). Es una medida de la repetitibidad y
reproducibilidad de un método de análisis bajo condiciones normales.
b. Exactitud: se define como el grado de concordancia o la diferencia
entre los resultados encontrados en el estudio y el valor de la
referencia o estándar aceptado (ROJAS, J. 1997). Para titulación de
virus, el estándar de referencia debe ser de un virus certificado o de
un stock a el cual el titulo ha sido determinado por titulación repetitiva.
(DARLING, J. 1998).
c. Repetibilidad: se trabaja como una variación dentro del laboratorio, y
hace parte de la precisión del procedimiento, cuando repetidas veces
por un mismo analista, bajo condiciones que son lo mas constantes
posibles (reactivos, equipos, e igual laboratorio) , durante un intervalo
corto de tiempo. Se determina sobre muestras separadas, pero
idénticas, del mismo lote homogéneo y así provee una medida de la
precisión del procedimiento bajo las condiciones normales. (OMS;
1992; DARLING, J.1997)
d. Reproducibilidad: es la precisión de un procedimiento cuando éste
es llevado a cabo bajo condiciones diferentes (usualmente en
diferentes laboratorios), en muestras separadas e idénticas, del mimo
lote homogéneo. Consiste en medir habilidad del ensayo para producir
resultados similares sobre largos períodos de tiempo e incluye días /
horas diferentes, y operadores diferentes. (OMS; 1992; DARLING, J.
1997)
e. Robustez: es la medida de la capacidad de un procedimiento
(titulación de un virus) para proporcionar a los resultados analíticos, la
exactitud y precisión, bajo variedad de condiciones, es decir,
determina si el método no es afectado por cambios deliberados en los
parámetros del método e indica su confiabilidad durante su uso
normal. Se determina sobre muestras separadas, pero idénticas, del
mismo lote homogéneo. (OMS; 1992; DARLING, J. 1997).
f. Linealidad y rango: se refiere a la capacidad de un método para
producir resultados directamente proporcionales a la concentración o
cantidad de virus en el ensayo. El rango del método es una expresión
de los niveles mas altos y más bajos del virus que se encuentran para
ser demostrados con precisión , exactitud y linealidad aceptable. La
linealidad puede ser representada en una grafica de Dosis Vs.
Respuesta, con una disminución significante de la menor a la mayor
dilución, donde se podrá determinar precisamente el título en la parte
lineal de la curva. (OMS; 1992; DARLING, J.1997).
g. Sensibilidad: es la capacidad del método de prueba para detectar
pequeñas concentraciones de la sustancia evaluada. Un uso más
general del término debe abarcar el límite de la detección y/o límite de
la cuantificación debe ser evitado. (OMS; 1992).
h. Limite de detección: es un número, expresado en unidades de
concentración o cantidad, que describe el más bajo nivel de
concentración o cantidad de un virus que puede ser detectado, pero
no necesariamente cuantificado. (DARLING, J.1997)
i. Limite de cuantificación: corresponde a la más baja concentración o
cantidad de virus que puede determinarse cuantitativamente con
precisión y exactitud aceptables cuando se aplica el procedimiento
requerido. En muchos casos el límite de la cuantificación es
aproximadamente dos veces el límite del detección. (OMS; 1992).
Este se ve en la curva de dosis Vs. Respuesta, cuando empieza a
desviarse de la linealidad y donde la inclusión de un dato más lejano
de una dilución subsiguiente podría contribuir a un error significativo
en el calculo. (DARLING, J.A. 1997)
Además de tener en cuenta tales parámetros, se deben conocer los
principios científicos sólidos y validados fundamentales del método, su
descripción y la debida documentación, la utilización de un estándar de
referencia y llevar controles de desempeño y eficacia. (ROJAS, J. 1997)
Para aceptar un método depende de su correcta validación y de la
documentación que lo apoya, que esta esté disponible. Mientras que la
descripción debe ser clara y de carácter completo dando preparación de
reactivos, controles, calibración, seguridad, formulas, etc.
1.9. ESTÁNDAR DE REFERENCIA
En los ensayos biológicos los resultados varían considerablemente, razón
por la cual son necesarios los patrones biológicos, los cuales se establecen
primordialmente con el fin de garantizar que los ensayos biológicos den
valores comparables. La función principal de ellos es la homogeneidad y la
especificidad de los resultados.
Según el nivel de producción, la complejidad del estudio de valoración, su
pureza y especificidad, los patrones y preparaciones de referencia son
designados:
- Nacionales (ejemplo, Japón, Alemania, Estados Unidos, etc.)
- Regionales (Consejo de Europa)
- Internacionales (OMS; Fármacopedia Internacional, Otras
organizaciones).
Los patrones internacionales tiene por objetivo “La calibración de patrones
regionales y nacionales mediante valoraciones biológicas comparativas”.
Un patrón Biológico Internacional es una preparación de una sustancia de
origen biológico o sintético por medio de la cual la Organización Mundial de
la Salud (OMS) define en forma general una unidad internacional – U.I. -
después de haberse completado un estudio internacional al respecto. Por lo
general, se asigna un número internacional de unidades a un patrón
internacional original en forma arbitraria. En cambio, a los patrones
internacionales de reemplazo se les asigna una actividad en unidades
internacionales, calibrándolos contra patrones anteriores mediante estudios
comparativos internacionales. En todos los casos, dichos estudios deben
demostrar que los materiales propuestos son apropiados para servir de
patrones internacionales.
Cada productor fabrica su propia referencia de trabajo; para determinar la
valoración en U.I tiene que calibrar la preparación de trabajo con la
referencia nacional (para uso dentro del país) o la referencia internacional
para los biológicos destinados a la exportación. Muchos países no cuentan
con patrones nacionales, en tales países se puede suministrar sustancias
nacionales de otros países, regionales o quizás internacionales, según el
caso que requiera el laboratorio nacional. Para solicitar tales patrones, se
puede dirigir la solicitud a la Oficina Central de la OPS (Organización
Panamericana de la Salud) o a la sede OMS en Ginebra.
De ningún material (patrón o preparación) se facilita cantidades suficientes
para sus empleos rutinarios en el laboratorio de control. Por eso es
imprescindible que cada controlador produzca su preparación de trabajo, las
cuales se titularán con patrones tipo nacionales.
La OMS suministra: patrones biológicos internacionales, preparaciones
biológicas internacionales de referencia, y reactivos biológicos
internacionales de referencia.
Los reactivos biológicos de referencia internacionales se emplean, por
ejemplo, en la identificación de microorganismos (o productos derivados de
ellos), o bien para el diagnóstico de enfermedades. En un principio fueron
establecidos para poder contar con un medio de asegurar la especificidad de
los reactivos de trabajo correspondientes. Sin embargo, ciertos reactivos de
referencia (como por ejemplo los reactivos internacionales de referencia para
la titulación de las vacunas o para la valoración de las antitoxinas por
floculación) se emplean en valoraciones cuantitativas en las cuales es
inapropiado expresar en Unidades Internacionales la actividad de los
productos biológicos ensayados. En tales casos, pueden asignarse unidades
de actividad a los reactivos de referencia en lo que respecta a una propiedad
adecuada, como la forma recíproca de la dilución en la que ocurre un
determinado punto final. La diferencia entre patrones internacionales y
reactivos internacionales de referencia, se basa entre otras cosas, en el
propósito para el cual son usados y en el alcance de su caracterización. Sin
embargo, la diferencia no siempre está bien definida. (OMS, 1976)
La utilización del estándar de referencia depende del método de análisis y su
empleo no siempre es obligatorio. Si es utilizada, este debe poseerse en
cantidad suficiente, homogéneo y estable, además de ser OFICAL, ejemplo,
de la OMS.
Los controles de desempeño y eficacia, garantizan la validez de los
resultados obtenidos. Los controles deben incluir límites específicos para los
resultados obtenidos con ayuda de estándares y equipos y poder así
demostrar que todos los aspectos del método opera bien.
2. JUSTIFICACIÓN
Colombia posee un clima tropical y muchas de sus zonas han presentado
una alta incidencia de Fiebre Amarilla al reportarse un promedio de 154
casos anuales entre los años de 1985 a 1994 (ROBERSON, E. 1996), por lo
cual existe la necesidad de mejorar su prevención, tratamiento y cobertura en
los planes de inmunización.
La vacuna desarrollada en nuestro país ha mostrado gran efectividad contra
la fiebre amarilla, y se ha enfatizado en la continua necesidad de un control
seguro de la enfermedad por medio de la vacunación apoyada en planes
globales de salud publica en el ámbito nacional.
El Instituto Nacional de Salud ha elaborado la vacuna de fiebre amarilla
desde hace más de 60 años, preocupándose por realizarle un adecuado
control de calidad y así evitar efectos colaterales negativos.
En cumplimiento con la normatividad legal, se ha identificado la necesidad
de la adopción de las BPL (Buenas Practicas de Laboratorio), así como la
validación de las pruebas de control que se realizan a la vacuna, tales como
la de Potencia y la de Identidad.
Por lo tanto, el presente estudio busca probar que los ensayos biológicos se
pueden validar satisfactoriamente a través del control de los diferentes
factores que puedan influir en los resultados de un ensayo, además se busca
probar la confiabilidad de los resultados de éstas pruebas, mediante la
optimización y estandarización de procesos, así como la obtención y
suministro de evidencia escrita y documentada, que cumpla con los
requerimientos de calidad, lo cual aporta beneficios, pues reduce la
probabilidad de fallas en los procedimientos, incrementa la productividad y
permite reducción de costos.
3. OBJETIVO GENERAL
Realizar la validación de las pruebas de Potencia e Identidad para una
Vacuna contra la Fiebre Amarilla.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
§ Determinar las siguientes características para la Prueba de Potencia de
una vacuna Antiamarílica: Precisión (Repetibilidad y Reproducibilidad),
linealidad, limite de detección y limite de cuantificación.
§ Determinar la especificidad de la Prueba de Identidad con una vacuna
Antiamarílica.
§ Actualizar los Procedimientos Operativos Estándar (POE) e instructivos
necesarios para realizar las pruebas de Potencia e Identidad de la
Vacuna de Fiebre Amarilla.
§ Desarrollar la validación dentro del contexto de las Buenas Practicas de
Laboratorio (BPL).
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. TIPO DE ESTUDIO.
Se realizó una validación concurrente, es decir se buscó establecer una
evidencia documentada de un procedimiento implementado; y experimental a
las pruebas de Potencia e Identidad de una vacuna Antiamarílica, y los
resultados se sometieron a un Análisis estadístico.
4.2 . MUESTRA.
Se emplearon 42 viales del lote 6763-2 de la vacuna Stamaril Pasteur®,
producida por Pasteur Mérieux Connaught (Lyon France); cuya presentación
es en viales de 1 dosis y su contenido es un liofilizado, donde la sustancia
activa corresponde al virus de Fiebre Amarilla atenuado, cepa 17D, cultivado
sobre embriones de pollo, los demás ingredientes son: lactosa, sorbitol,
clorhidrato de L-histidina, L-alanina y solución salina tamponada. Dicha
vacuna se almacenó en refrigerador a una Temperatura de 2 a 8°C, según
indicaciones del fabricante. La vacuna se reconstituye con una solución de
cloruro sódico al 4%, la cual viene adjunta en jeringa. Una vez diluida se
conservó entre 0 y 4°C y no se utilizó después de 1 hora de rehidratada y al
finalizar los ensayos se descartó bajo condiciones apropiadas de seguridad
biológica.
Esta vacuna se seleccionó por ser termoestable y por ser aprobada en
cuanto a su seguridad y eficacia en un largo periodo de tiempo, como se ha
demostrado con más de 65 millones de dosis vendidas en el mundo y
aprobada en 51 países (LANG, 1999).
Figura No. 9 Vacuna Stamaril
Pasteur
Además, se emplearon 18 viales del lote 784 de la Vacuna contra la Fiebre
Amarilla, producida por el Instituto Nacional de Salud como vacuna control
positivo, con título conocido y previamente analizada (VER ANEXO No.12).
Su presentación es en viales de 10 dosis y su contenido es un liofilizado del
virus vivo atenuado 17D, preparado en embrión de pollo. Dicha vacuna se
almacenó en congelador a una Temperatura de –30 a -32°C, según
indicaciones del fabricante. La vacuna se diluye con agua destilada estéril
según el número de dosis (0.5ml / dosis). Una vez diluida se conservó entre
0 y 4°C y no se utilizó después de 1 hora de rehidratada y al finalizar los
ensayos se descartó bajo condiciones apropiadas de seguridad biológica.
Figura No.10 Vacuna del
Instituto Nacional de Salud
4.2.1 Recepción de Viales de muestra
Las muestras de la vacuna Stamaril Pasteur, fueron enviadas por el
laboratorio Aventis Pasteur Mérieux Connaught ® a las instalaciones del
Instituto Nacional de Salud. Las muestras se entregaron bajo condiciones de
refrigeración, en caja de icopor con hielo e inmediatamente se llevaron a
nevera de 2°C a 8°C. La fecha de recepción fue el 4 de septiembre de 2001.
4.3 . CALIFICACIÓN Y/O CALIBRACIÓN DE EQUIPOS Dentro del desarrollo de las pruebas experimentales se trabajo con diferentes
materiales y reactivos, así como equipos, (VER ANEXO No.1), siendo
algunos de ellos considerados como posibles factores que puedan influir
dentro del ensayo, razón por la cual fueron calibrados o calificados, según lo
requirieron y evitando así posibles errores, antes de iniciar el trabajo, con el
fin de garantizar la confiabilidad de los resultados obtenidos en las pruebas.
Para poder iniciar el procedimiento fue necesario realizar una calificación y/o
calibración de equipos según correspondió. Los que fueron considerados
son: la cabina de flujo laminar, Incubadora de CO2, balanza digital, Micro
pipetas de 200-1000µl / 50-200µl.
En el caso de la cabina de flujo laminar e incubadora de CO2 y balanza
digital, los cuales fueron calificados, los dos primeros, por el Departamento
de mantenimiento del Instituto Nacional de Salud. (VER ANEXO No. 2).
Mientras que la balanza digital fue calibrada por el distribuidor autorizado.
Las micropipetas de 200-1000µl / 50-200µl fueron calibradas por nosotras
con el procedimiento recomendado por el fabricante (VER ANEXO No. 3),
evidenciando el buen estado de las mismas.
4.4 . CULTIVO CELULAR CON CÉLULAS VERO.
Esta técnica se realizó con el fin de obtener las células suficientes para el
desarrollo de las pruebas de Potencia e Identidad. Estas células son
certificadas por el ATCC (American Type Cell Culture). (VER ANEXO No. 4)
4.5 . VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE POTENCIA
Para validar la prueba de potencia, se realizaron cuatro repeticiones de la
Prueba de Potencia, por cada uno de los observadores, trabajando con la
Vacuna Stamaril, producida por Aventis Pasteur, con su respectivo
certificado de análisis (VER ANEXO No.5), y con el Lote 784 de Vacuna
Contra la Fiebre Amarilla producida por el Instituto Nacional de Salud como
control positivo en cada prueba.
La prueba de potencia de la vacuna contra Fiebre Amarilla es realizada en
células Vero. Es una prueba In vitro definitiva para establecer el número de
partículas vírales por dosis humana, mediante la infección de una monocapa
de células Vero con diferentes diluciones de vacuna liofilizada, una vez que
se ha reconstituido en el diluyente de Fiebre amarilla. (FIOCRUZ, 1988).
(VER ANEXO No. 6). Los resultados finales se obtienen del recuento de las
UFP/ml en cada dilución, y el título de la vacuna es calculado con el
promedio de los recuentos. (VER ANEXO No.7)
Para validar la prueba de Potencia se analizaron los parámetros que
estuvieran acordes y fueran aplicables a un procedimiento de tipo biológico
como éste. Los que se consideraron aplicables son : Precisión (Repetibilidad
y Reproducibilidad con variables de operador y día), linealidad, límite de
detección y límite de cuantificación. Para ello se trabajó así:
4.5.1. Repetibilidad
Se realizaron 2 pruebas por cada uno de los analistas, el mismo día pero en
diferentes horas (Mañana / tarde), con los mismos reactivos y equipos, y se
calculó por el análisis de datos recolectados el mismo día.
4.5.2. Reproducibilidad
Se realizó por cada uno de los analistas, en diferentes días, pero con el
mismo método y muestra. La Reproducibilidad se manejó mediante
Interoperador e Interdía, de la siguiente manera:
a. Interoperador: con iguales condiciones pero diferente operador.
Prueba
Operador 2 (Juliana)
Operador 1 (Sofía)
Titulo (UFP/ml)
Titulo (UFP/ml)
Hora 1
Hora 2
Titulo (UFP/ml)
Titulo (UFP/ml)
Prueba Promedio Operadores
b. Interdía: con iguales condiciones e igual operador pero en diferente
periodo de tiempo.
4.5.3. Linealidad
Se realizaron 4 pruebas por cada uno de los observadores, en diferentes
días y horas, empleando los mismos reactivos y equipos.
Con este parámetro se buscó determinar la relación entre UFP Vs Dilución.
Día 1
Día 2
Titulo (UFP/ml)
Titulo (UFP/ml)
prueba Operador 1
Día 1
Día 2
Titulo (UFP/ml)
Titulo (UFP/ml)
prueba Operador 2
Título (UFP/ml)
Prueba
Operador 1
Operador 2 Título
(UFP/ml)
Dilución Vs. UFP
4.5.4. Límite de detección (LOD)
Se busco evaluar la habilidad del ensayo para detectar la formación de 1
UFP. Para ello se realizó una dilución adicional a una de las pruebas.
4.5.5. Límite de Cuantificación (LOQ)
Se buscó la Concentración hasta la cual el virus puede ser cuantificado con
claridad, mediante la evaluación de las ultimas diluciones.
4.5.6. Robustez
Teniendo en cuenta que este parámetro mide el grado de reproducibilidad de
los resultados, bajo variaciones como operador y día, se tomo como parte de
la precisión del ensayo, bajo el mismo análisis.
4.6. VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE IDENTIDAD:
Se realizaron cinco repeticiones de la Prueba de Identidad, por cada uno de
los observadores, trabajando con la Vacuna Stamaril Pasteur ®, producida
Prueba
Con dilución adicional
Sin dilución adicional
1 UFP/ml
≥≥ 1 UFP/ml
por Aventis Pasteur, con su respectivo certificado de análisis (VER ANEXO
No.5); y 2 pruebas, por cada operador, con el Lote 784 de Vacuna Contra la
Fiebre Amarilla® producida por el Instituto Nacional de Salud como control
positivo.
Se realizó la prueba In vitro definitiva para determinar la presencia del virus
de Fiebre Amarilla en la vacuna, mediante la infección de la monocapa de
células Vero con diluciones de la vacuna, que previamente se han puesto a
reaccionar con suero Hiperinmune de mono y suero normal de mono,
certificados por FIOCRUZ (VER ANEXO No.13). Se espera que en las
células infectadas con el suero Hiperinmune no haya Unidades formadoras
de Placa (UFP), mientras que en las células infectadas con el suero normal si
se presenten Unidades formadoras de placa (UFP). (FIOCRUZ, 1988). (VER
ANEXO NO. 9).
En la prueba de identidad se trabajó con las dos vacunas. Está es una
prueba cualitativa, ya que solo nos determina si está o no el virus de fiebre
amarilla, y trabajamos con el concepto de que el suero Hiperinmune de
mono es especifico para tal virus.
4.7. ACTUALIZACIÓN DE LOS POE’S:
Mediante una revisión de los POE’S teniendo en cuenta las BPL (Buenas
Practicas de Laboratorio). Esta información es confidencial del Instituto
Nacional de Salud, por lo cual no se anexa.
4.8. ANÁLISIS DE INFORMACIÓN.
Para el análisis de información se consideraron los siguientes parámetros:
precisión (repetibilidad y reproducibilidad), linealidad, límite de detección,
límite de cuantificación, y robustez.
4.8.1. Precisión
Teniendo en cuenta que la precisión, lo constituye la repetibilidad y
reproducibilidad, se analizaron cada uno por separado así:
4.8.1.1. Reproducibilidad.
Se manejó mediante dos variables, que fueron, Interoperador e Interdía, las
cuales se analizaron separadamente y con Análisis de Varianza.
Ø Para ínteroperador se hizo un diseño Bi – factorial, teniendo en
cuenta como factores el operador y el numero de prueba. Se planteó
como hipótesis:
Ho: No hay interacción
Ha: Si hay interacción
Interpretación de la Hipótesis Nula: se plantea la posibilidad de que no
hayan diferencias en el conjunto de datos totales de las pruebas de los
operadores.
Ø Para interdía se hizo un diseño Uni – factorial, para cada operador, y
donde el factor era el día. Se planteo la siguiente hipótesis, para cada
uno de los operadores:
Ho: µ día 1 = µ día 2
Ha: µ día 1 ≠ µ día 2
Interpretación de la Hipótesis Nula: Esta hipótesis plantea la posibilidad de
que los títulos de días diferentes para cada operador no presentan
diferencias.
Para ambas variables se manejaron los títulos en UFP/ml, de cada vial en
cada prueba; y como se mencionó anteriormente se empleará la técnica de
Análisis de varianza, utilizando la tabla “ANOVA”.
Para confirmar los datos obtenidos, se realiza un Análisis de Scheffé, por
operador.
4.8.1.2. Repetibilidad.
Se trabajó con un análisis de varianza, mediante un diseño Uni – factorial
para cada uno de los operadores. Se planteó la siguiente hipótesis, para
cada uno de los operadores:
Ho: µ hora 1 (am) = µ hora 2 (pm)
Ha: µ hora 1 (am) ≠ µ hora 2 (pm)
Interpretación de la Hipótesis Nula: Esta hipótesis plantea la posibilidad de
que los títulos de horas diferentes para cada operador no presentan
diferencias.
4.8.2. Linealidad:
Para el análisis estadístico de este parámetro, se empleó una Regresión
lineal, para cada uno de los observadores, comparando las diluciones con las
UFP/ml en cada una de ellas. Se planteó como hipótesis:
Ho: Existe una relación lineal entre UFP/ml Vs. Diluciones, para cada uno de
los observadores.
Ha: No existe una relación lineal entre UFP/ml Vs. Diluciones, para cada uno
de los observadores.
Ho: Existe una relación lineal entre UFP/ml Vs. Diluciones, para el conjunto
de datos totales.
Ha: No existe una relación lineal entre UFP/ml Vs. Diluciones, para el
conjunto de datos totales.
4.8.3. Límite de Detección
El límite de detección del ensayo es, por eso, basado sobre la habilidad del
ensayo para detectar la formación de una unidad formadora de placa, y es
por eso que para este tipo de ensayo es de 1UFP.
4.8.4. Límite de Cuantificación
Se realizó una observación comparativa de las diluciones de cada operador,
con el fin de determinar en cual de ellas se presenta un recuento claro de
Unidades Formadoras de Placa, sin que exista interposición de las mismas.
5. RESULTADOS
5.1. RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE IDENTIDAD.
Después de haber realizado las cinco repeticiones de la prueba de identidad
por cada operador con las vacunas de Aventis Pasteur y 2 pruebas con la
vacuna del Instituto Nacional de Salud por cada operador; y recordando que
ésta es una Prueba Cualitativa y no cuantitativa, por lo tanto, no se realizó el
recuento de UFP/ml, sino que se examino la capacidad de la prueba para
establecer la presencia del principio activo de la vacuna, en este caso el virus
de Fiebre Amarilla. Se obtuvo en los ensayos (VER ANEXO 10), lo
siguiente:
Ø En el 100% de los pozos con células inoculadas con la vacuna y
adicionadas con suero Hiperinmune certificado, no se presentaron
Unidades Formadoras de Placa, ya que los anticuerpos presentes en
el suero, reaccionaron con el virus presente en la vacuna,
neutralizándolos e impidiendo la infección de las células, lo que
demuestra que el suero Hiperinmune utilizado en esta prueba, si tiene
los anticuerpos específicos para el virus de Fiebre Amarilla.
Ø En el 100% de los pozos con células inoculadas con la vacuna y
adicionadas con suero normal certificado, se encontraron Unidades
formadoras de Placa, ya que los virus presentes en la vacuna no
fueron neutralizados por ningún anticuerpo, y se presentó por esto
muerte celular. Demostrando que el suero Normal utilizado, no
contenía ninguna partícula capaz de neutralizar el virus de fiebre
Amarilla.
Figura No. 9. Placas de
24 pozos con la Prueba
de Identidad de la vacuna
Stamaril Pasteur®.
Figura No. 10. Placas de
24 pozos con la Prueba
de Identidad de la vacuna
del Instituto Nacional de
Salud
Ø También se demostró que las células empleadas, si son
susceptibles y sensibles al virus, por lo tanto la prueba es efectiva,
esto se confirmó con el control de células, pues en ningún pozo se
presentaron UFP.
Ø Esta prueba In vitro fue capaz de detectar el virus de fiebre amarilla,
tanto en la vacuna Stamaril Pasteur, como en la vacuna del Instituto
Nacional de salud, lo que demostró que independientemente del
proveedor, la prueba cumplió con su propósito y no varió en sus
resultados.
Ø Es importante resaltar que aunque la prueba se realizó por dos
operadores y en diferentes días, no se alteraron los resultados, lo
que hace pensar que ésta es una prueba segura y efectiva, siempre
y cuando se mantengan las condiciones apropiadas de operación,
así como el adecuado almacenamiento de los reactivos y el manejo
apropiado de los equipos de laboratorio, previamente calibrados.
Ø Se demostró que la Prueba de identidad In vitro (Mediante la
técnica de cultivo celular), para la vacuna Antiamarílica, es una
prueba totalmente confiable y cumple con el propósito para la cual
se creó, que es comprobar la presencia del principio activo en la
vacuna (virus de Fiebre Amarilla)
5.2. RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE POTENCIA.
Tomando los datos de los títulos obtenidos en cada uno de los viales de
las diferentes repeticiones de cada operador, así como los promedios de
los recuentos de UFP/mL en cada dilución (VER ANEXO No.8). Se
obtuvieron y analizaron los resultados para diferentes parámetros
(Reproducibilidad (Interoperador / Interdía), Repetibilidad, Linealidad,
Límite de detección y Límite de cuantificación.
Para los parámetros: Reproducibilidad (Interoperador / Interdía),
repetibilidad y linealidad, se tuvo en cuenta el valor P, obtenido mediante
el Análisis de Varianza, el cual nos indica la probabilidad de que los
resultados se vean afectados por las variables que intervienen o que se
están analizando dentro de la Prueba.
Para poder interpretar el valor P, se toma un intervalo de confianza del
95%, por consiguiente se espera que el valor P sea mayor a 0.05 (5% de
error) lo cual nos indica que el grado de variabilidad es el normal cuando
se aplica una fuente de variación y aceptamos las Hipótesis nulas
planteadas para cada parámetro. Por el contrario, si el valor P es menor
que 0.05, podemos afirmar que la variabilidad que se presenta es debida a
la influencia del Factor de variación y rechazaríamos las Hipótesis nulas
planteadas para cada parámetro. (DANIEL, W 1992). Adicionalmente para
comprobar lo anterior se empleó el análisis de Sheffé para comparar el
grado de diferencia entre una misma variable, lo cual se plasmó en las
gráficas.
5.2.1 Reproducibilidad
Teniendo en cuenta que la reproducibilidad, es un grado de precisión, de
la habilidad del ensayo para producir resultados similares sobre largos
períodos de tiempo con la intervención de variables como Interoperador e
Interdía, se obtuvo:
a. Interoperador: los datos se agruparon por prueba y se separaron por la
variable operador con el fin de determinar las diferencias existentes entre
operadores y la influencia de los mismos dentro de las pruebas (VER
Tabla No.3).
OPERADOR 1 OPERADOR 2 PRUEBA
Título UFP / mL Título UFP / Ml
1 40800 51200
2 49600 62400
3 58800 64000
4 53200 57600
1 49600 59200
2 56000 65600
3 49600 56000
4 68800 64000
1 40000 60800
2 46400 57600
3 51200 52000
4 67200 56000
Tabla No. 3. Datos de la Prueba de Interoperadores
Grafica No. 1. Prueba de Interoperador: Prueba Vs. UFP/ml.
Según la Gráfica No.1 de Prueba Vs, UFP/mL, se puede observar que en
los resultados obtenidos, sin importar el operador, en las pruebas 1, 2 y 3,
al igual que en las pruebas 2, 3 y 4, presentan una diferencia mínima y los
resultados son homogéneos, ya que sus intervalos se tocan; mientras que
en las pruebas 1 y 4 existe una pequeña diferencia, que no es
significativa, ya que sus intervalos no se tocan por un espacio muy
estrecho, lo cual puede representar la facilidad de control de las
condiciones de operación.
Grafica No. 2. Prueba de Interoperador: Interacción de las dos variables.
Con la gráfica No.2 de Operador Vs UFP/mL, se puede observar que a lo
largo de las pruebas, con la intervención de variables como son: prueba y
operador en relación conjunta, no hay diferencias entre los operadores, y
por lo tanto, no hay interacción entre las variables de operador y prueba.
Esto se confirma estadísticamente con el valor P (0.06) > (0.05),
aceptando la hipótesis nula que nos dice que no hay interacción, en
relación con las pruebas de los operadores.
Analizando los datos y al realizar el procedimiento de validación para la
técnica, podemos decir que está no es susceptible al operador, de lo
contrario la variable operador hubiera influido en los resultados de las
pruebas. Sin embargo, la diferencia presentada entre las pruebas 1 y 4
(Grafica No.1) es mínima y esta se puede deber al poco tiempo de
entrenamiento de los operadores, así como a la poca experiencia en el
manejo de la técnica. Esto nos indica que la técnica es reproducible y
segura.
b. Interdía: Los datos se agruparon por operador, por igual hora pero
diferente día (VER Tabla No. 4), con el fin de determinar las diferencias
existentes entre un lapso de tiempo y cada uno de los operadores.
Además del análisis de Varianza, se realizó un Análisis de Scheffé, para
cada uno de los rangos de día seleccionados, por cada observador.
Tabla No. 4. Datos de la Prueba interdía.
OPERADOR 1 UFP/ml
OPERADOR 2 UFP/ml
Día Día 1 y 3
Día Día 1 y 3
1 40800 1 51200 2 58800 2 64000 1 49600 1 59200 2 49600 2 56000 1 40000 1 60800 2 51000 2 52000
OPERADOR 1 UFP/ml
OPERADOR 2 UFP/ml
Día Día 2 y 4
Día Día 2 y 4 1 49600 1 62400 2 53200 2 57600 1 56000 1 65600 2 68800 2 64000 1 46400 1 57600 2 67200 2 56000
Grafica No. 3. Prueba de Interdía: Operador 1 Días 1 y 3
Grafica No. 4. Prueba de Interdía: Operador 1 Días 2 y 4
3
4 2
Grafica No. 5. Prueba de Interdía: Operador 2 Días 1 y 3
Grafica No. 6. Prueba de Interdía: Operador 2 Días 2 y 4
Según las gráficas 3 y 4 del operador 1, así como las graficas 5 y 6 del
Operador 2, se observó que no existe diferencia entre días, ya que sus
intervalos se tocan en la gráfica, como igualmente se muestran en el
3
2 4
análisis de Scheffé, donde los grupos de datos son homogéneos.
Adicionalmente, lo confirmamos estadísticamente con el valor P (0.09) >
(0.05), para los días 1 y 3, y el valor P (0.08) > (0.05), para los días 2 y 4,
del operador 1; el valor P (0.95) > (0.05), para los días 1 y 3, y el valor P
(0.47) > (0.05), para los días 2 y 4, del operador 2 (VER ANEXO No.11,
Tablas de la 4 a la 11), los cuales nos permiten aceptar las hipótesis nulas
:
Ho: µ día 1 = µ día 3
Ho: µ día 2 = µ día 4
Lo que confirma que la técnica no es afectada por variaciones de tiempo
prolongado, por lo tanto, no se afectarán los resultados de las pruebas que
no se realicen un mismo día, siempre y cuando se manejen
adecuadamente las condiciones de operación. Lo que indica que la
prueba es reproducible y precisa
Al analizar Gráficamente y por separado cada uno de los operadores, se
observa que el operador 2 presenta un intervalo mucho mas amplio en la
concordancia de los puntos de UFP entre días, contrario a lo observado en
el operador 1 que presenta intervalos pequeños, haciendo notoria la
necesidad de un entrenamiento optimo y a largo plazo del operador.
5.2.2 Repetibilidad
Teniendo en cuenta que la repetibilidad se define como el grado de
precisión del ensayo bajo las mismas condiciones de operación por un
corto período de tiempo, y es calculado por el análisis de datos
recolectados el mismo día (DARLING 1998), éstos se agruparon por horas
(am, pm) y se manejó un promedio de UFP/mL (VER Tabla No.5).
HORA PROMEDIO OPERADORES
UFP/ mL Am 46000 Am 54400 Am 50400 Am 56000 Am 60800 Am 57602 pm 61400 pm 52800 pm 52002 pm 55400 pm 66400 pm 61600
Tabla No.5. Datos de Prueba de Repetibilidad.
Grafica No. 7. Prueba de Repetibilidad: Hora Vs. UFP/ml
Según la Gráfica No. 7, se determinó que no hay diferencia en los
resultados obtenidos en diferentes horas, ya que sus intervalos se tocan
casi totalmente. Igualmente se evidenció en el análisis de Scheffé (
HORA
ANEXO No. 11, Tabla 13), donde los grupos de datos son homogéneos.
Adicionalmente, el valor P (0.6776) > (0.05) , (ANEXO 11, Tabla 12), nos
permite aceptar la hipótesis nula:
Ho: µ Hora 1(am) = µ Hora 2 (pm)
Indicando que la técnica arroja resultados confiables y repetitivos al
trabajarse con la variable hora, lo que significa que la precisión de la
técnica es válida.
5.2.3 Linealidad
Recordando que la Linealidad es la capacidad de un ensayo para dar una
lectura que es directamente proporcional a la cantidad de virus en el
ensayo (DARLING J, 1998); se agruparon los datos en dilución y en
UFP/ml (VER Tabla No. 6), para cada operador por separado, para
realizar un análisis de Regresión por operador y otro por Total de datos.
DILUCIÓN OPERADOR 1
UFP / mL
OPERADOR 2
UFP / mL
640 21.0 30.0
2560 7.5 8.5
10240 1.0 3.0
640 30.5 38.0
2560 5.5 10.5
10240 2.5 2.0
640 35.0 43.0
2560 8.5 11.0
10240 0 2.0
640 31.0 33.0
2560 5.5 7.5
10240 2.5 3.0
640 29.5 41.0
2560 5.5 8.5
10240 3.0 3.0
640 35.5 41.5
2560 6.5 10.0
10240 2.0 2.0
640 29.5 38.5
2560 11.0 10.0
10240 4.5 2.5
640 33.5 33.5
2560 9.5 9.5
10240 2.5 2.0
640 33.0 27.0
2560 8.0 9.5
10240 2.0 4.5
640 28.5 32.0
2560 9.5 10.0
10240 5.0 2.0
640 37.5 34.0
2560 5.5 8.0
10240 4.0 3.0
640 33.0 30.0
2560 7.0 10.0
10240 3.5 2.5
Tabla No. 6. Datos de prueba de Linealidad.
El Análisis de regresión empleado fue de modo lineal, es decir y = a + bx,
donde y es el valor sobre el eje vertical, x un valor sobre el eje horizontal,
a es el punto donde la recta cruza el eje vertical (intercepto) y b indica la
cantidad con la cual y cambia por cada unidad de cambio en x (pendiente).
Dado que dos parejas cualquiera de las coordenadas x y y determinan una
recta mediante su unión, al localizarse en un sistema coordenado
(DANIEL. W, 1992).
Figura No.11. Grafica de linealidad Log. Diluciones Vs. Log. UFP.
En el análisis de Regresión de las diluciones de cada operador , se
observa que b es negativa para el operador 1 y el operador 2 (-
0.00243087) y (-0.00231585), respectivamente (ANEXO No. 11, Tablas 20
y 21). La recta se extiende de la parte superior izquierda de la gráfica a la
parte inferior derecha de la misma, lo cual se confirma con el valor P = (0)
< (0.05), (ANEXO No. 11 Tablas 20 y 21). Igualmente , al analizar las
diluciones Vs total de datos, se observó que b (la pendiente), es negativa
para el total de los datos (-0.00237336), (ANEXO No. 11,
Tabla 22). Lo cual se confirma con un valor P = (0) < (0.05), (ANEXO No.
11 Tabla 22), nos permite rechazar la hipótesis nula:
Ho: Pendiente = 0
Lo que indica que la técnica si es lineal para las variables de UFP/mL y
dilución, presentándose un descenso lógico en las unidades formadoras
Y: Log. UFP/ml X: Log. Diluciones
y
x 640 2560 10240
1
40
de placa a medida que aumentan las diluciones de la vacuna, y que las
diluciones permiten que la técnica sea cuantificable, permitiendo facilitar el
recuento de las unidades formadoras de placa; cabe resaltar que en
ningún caso se presentó una relación inversa a las diluciones en base
cuatro; así también se demuestra que el operador no afecta éste
parámetro en ninguno de los casos, siendo la técnica completamente
lineal y válida.
5.2.4 Límite de Cuantificación
Teniendo en cuenta la posibilidad de error en un recuento por eventual
interposición de Unidades formadoras de placas, se analizó hasta cual
dilución es posible realizar un recuento de éstas. Y se llegó a la
conclusión de que la dilución (2560) es la que nos permite realizar un
recuento claro de UFP en la gran mayoría de las pruebas, ya que en la
dilución menor (160), es prácticamente imposible contar las Unidades
Formadoras de Placa, pues éstas se encuentran tan unidas que pueden
estas sobrepuestas y por tanto puede cometerse un error de recuento.
5.2.5 Límite de Detección (LOD):
La mínima concentración de compuesto en una muestra o sea la mínima
cantidad detectable con certeza, se conoce con el límite de detección. Por
esto al analizarlo biológicamente y para ésta prueba de recuento de
Unidades Formadoras de Placa, podemos decir que lo que se buscó fue
determinar la dilución a la cual, se puede evidenciar la mínima cantidad de
virus, en éste caso 1 UFP.
Teniendo en cuenta que en la dilución mayor (10240), no es homogénea
la presencia de 1 UFP, se realizó una dilución adicional con el fin de
determinar si aún se presentaba 1 UFP.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
DILUCIÓN POZO 1
UFP/ml
POZO 2
UFP/ml
PROMEDIO
UFP/ml
640 30 31 30.5
2560 9 11 10
10240 3 2 2.5
40960 1 0 0.5
Tabla No. 7. Datos de Prueba Limite de Detección LOD.
Según la tabla anterior, se puede ver en la dilución adicional la presencia
de 1 UFP, en uno de los pozos, lo cual indicaría que la dilución 40960 es
el límite de detección. Sin embargo, teniendo en cuenta que en ambas
diluciones se observó la presencia de 1 UFP, se puede afirmar que el
límite de detección se encuentra entre las diluciones 10240 y 40960.
5.2.6. Procedimientos operativos Estándar
Los Procedimientos operativos estándar (POE´s) se realizaron con el
formato y requisitos dados por el Instituto nacional de Salud, con el fin de
dejar una evidencia escrita de los procedimientos adecuados para las
Pruebas de potencia e Identidad. Estos no están anexados por que son
información confidencial del instituto.
6. DISCUSIÓN
En la validación de la prueba de Identidad, se demostró que esta es una
prueba específica para el reconocimiento del virus de Fiebre Amarilla, por
la utilización de anticuerpos específicos presentes en el Suero
Hiperinmune. Adicionalmente, se observó que el suero normal no
contenía ningún tipo de partícula capaz de afectar la aparición de
Unidades Formadoras de Placa ocasionadas por el virus. Se demostró
que al trabajar con diferentes proveedores la prueba sigue cumpliendo con
su propósito, adicionalmente es importante el control de las condiciones
de manejo que se le den a las células y los suero Hiperinmune y Normal,
pues cada uno requiere cuidados especiales, como son la temperatura de
almacenamiento e incubación.
En la validación de la Prueba de Potencia, puntualmente en las Pruebas
Interoperador se presento una diferencia mínima, que obedece a las
condiciones intrínsecas de cada operador y el corto tiempo de
entrenamiento que recibió, por lo tanto, consideramos que la técnica es
valida para determinar el titulo de una Vacuna contra la fiebre amarilla.
Observando que no hay variabilidad en la técnica para los parámetros de
reproducibilidad (Interoperador / Interdía) y repetibilidad, se concluye que
la técnica es robusta para estos parámetros, ya que no hay influencia en
los resultados, por algunos cambios en la forma de operación y en las
variables ambientales del método en largos y cortos periodos de tiempo,
teniendo en cuenta las definiciones descritas en el marco teórico por la
OMS, 1992; y DARLING, J.A. 1997.
La prueba de linealidad, mostró cómo los intervalos de las diluciones (en
base 4) son adecuados, por que permitió que el número de UFP/ml fueran
contados cuidadosamente y así incrementar la precisión de los títulos
calculados. Mostrando que a medida que aumenta la dilución, disminuye
la concentración de virus (UFP/ml), razón por la cual la pendiente de la
gráfica es negativa, siendo esta ajustada mediante el análisis estadístico.
En las diluciones más bajas, el recuento del número de UFP/ml dificultó la
cuantificación, ya que hay combinaciones o sobre posición de placas,
ocasionando errores en el conteo. En las mas altas diluciones, la
desviación de la linealidad ocurre como probabilidad para detectar el
virus, dando una consideración a tener. La linealidad es importante por
que nos permitió determinar que el titulo preciso de la vacuna se
encontraba dentro del rango lineal, según los explicado por Darling, J,
1998.
El cumplimiento de las especificaciones de cada procedimiento para las
pruebas de potencia e identidad, experimentalmente fueron llevados a
cabo siguiendo estrictamente los procedimientos de los respectivos
protocolos, lo cual se vió reflejado en los resultados y en el análisis de los
parámetros; los cuales mostraron una concordancia entre ellos.
Así mismo, fue muy importante, llevar un adecuado control del entorno,
mediante la calificación y/o calibración de equipos periódicamente, llevar
registros del empleo de equipos, así como registros de temperaturas,
realizar un adecuado proceso de limpieza del área de trabajo, vestir la
ropa apropiada para el trabajo (bata estéril, gorro, tapabocas), retirar
joyas y mantener el cabello peinado (recogido) y estar sin maquillaje,
evitar el desorden dentro y fuera de la cabina de flujo laminar, y considerar
a todo momento tres reglas importantes para el trabajo en la cabina:
primera, mantener al mínimo el número de objetos presentes en la cabina;
segundo, retirar cada objeto una vez que ya no se necesite, y por ultimo,
mantener los objetos bien separados, pero fácilmente accesibles, dentro
de la cabina.
Aunque en el desarrollo de la validación de las pruebas, no se empleo un
estándar de referencia internacional, como seria el proporcionado por la
Organización Panamericana de la Salud (OPS), la vacuna Stamaril
Pasteur®, producida por Pasteur Mérieux Connaught (Lyon France),
demostró ser una vacuna estable y homogénea, además de estar
aprobada a nivel mundial. En este estudio se hizo evidente que para
realizar una validación, se puede considerar opciones diferentes a la del
estándar de referencia internacional, siempre y cuando se conozcan de
ante mano las condiciones de calidad de la opción empleada.
Las pruebas biológicas, aunque son muy variables, en comparación con
las pruebas de tipo químico, pueden ser validadas satisfactoriamente,
mediante los parámetros estadísticos que permiten determinar, de una
manera real, si hay diferencias significativas en dichas pruebas y así
poder controlar los diferentes factores de variación.
CONCLUSIONES Ø La prueba de Identidad demostró ser altamente especifica y
confiable, ya que cumple con el propósito para la cual fue creada.
Ø Los certificados de sueros y células, son importantes ya que
permiten dar mayor confiabilidad a los resultados obtenidos en las
pruebas de Identidad y Potencia.
Ø La prueba de Potencia cumple con los parámetros de validación
inicialmente propuestos: reproducibilidad (Interoperador / Interdía),
repetibilidad, linealidad, limite de detección, limite de cuantificación
y robustez.
Ø El desarrollo de la validación de la prueba de potencia,
necesariamente debe estar ligado a un análisis estadístico, por que
se trabaja con eventos contables como son las UFP, que permiten
determinar la variabilidad real, así como el desarrollo de pruebas
reproducibles.
Ø La realización de los Procedimientos operativos Estándar (POE´s)
es fundamental, ya que da una evidencia escrita y permite realizar
revisiones de los procedimientos periódicamente.
Ø La variación en la titulación de un virus, puede surgir a raíz de
diferentes factores como son las células, el virus, el medio y el
suero utilizado, así como las condiciones de operación diferentes.
Sin embargo, como se demostró en este trabajo, si se mantiene un
control de las condiciones de operación el método puede
satisfactoriamente validado.
Ø La validación de ensayos es la practica de una buena ciencia, ya
que esta comprendida por una planeación que puede producir
datos importantes sobre el desempeño de una prueba. Por lo tanto,
no se debe ignorar en ningún caso.
Ø Las pruebas de potencia e identidad en cultivo celular, que se
realizan en el Instituto Nacional de salud, son adecuadas en los
análisis de control de calidad para el producto final (Vacuna contra
Fiebre Amarilla). Además, las células VERO, como línea celular, que
se trabajan para estas pruebas, son seguras y especificas para el
virus de fiebre amarilla
RECOMENDACIONES
Ø Todos los procedimientos, tanto de la Prueba de Potencia como de
la Prueba de Identidad, deben desarrollarse teniendo en cuenta las
Buenas Prácticas de Laboratorio, pues la ausencia de las mismas,
puede alterar los resultados de las pruebas validadas.
Ø Una vez validados los parámetros de un ensayo no deben ser
cambiados de ninguna manera, sin antes determinar el impacto que
esto pueda causar en los resultados validados, ya que cambios,
aparentemente insignificantes, podrían tener un efecto dramático
sobre la variación de un ensayo, haciendo necesaria la
revalidación.
Ø La validación seria mas completa, si se desarrollara la técnica con
un estándar de referencia, lo que permitiría diferenciar mas
claramente las posibles variables, o caso contrario, la eficacia de la
técnica.
Ø Es fundamental, realizar calibraciones y calificaciones periódicas de
los equipos empleados en las pruebas, ya que sin esto, los
resultados obtenidos no serían confiables y reproducibles.
Ø Es importante que el operador que vaya a emplear la técnica reciba
un entrenamiento adecuado y a largo plazo, y que demuestre
experiencia en el manejo de cultivo celular.
Ø Teniendo en cuenta que las pruebas de Potencia e Identidad in
vitro se realizan sobre cultivo celular, se debe enfatizar en el
cuidado del mismo, evitando contaminaciones y controlando su
crecimiento, ya que un error en la manipulación puede alterar
totalmente los resultados. Por eso las condiciones de manejo y
mantenimiento de las células dentro de éste estudio de validación,
fueron minuciosamente controladas.
Ø Los ensayos en placa ofrecen una ventaja especifica sobre los
ensayos In vivo, ya que estos últimos pueden tener una
variabilidad mayor, pues pueden interferir las condiciones in natas
de los animales de experimentación, así como las condiciones
ambientales que los rodean.
BIBLIOGRAFIA
Normas Técnicas
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Biológicas No.3, Revisión de 1995) OMS. Serie de informes Técnicos
No.872, 1998.
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6. Normas para las líneas celulares continúas utilizadas en la producción
de Sustancias Biológicas. Adoptadas en 1985. Serie de informes
Técnicos No. 745, 1987.
7. Validación de procedimientos analíticos usados en la examinación de
materiales farmacéuticos, anexo 5. Serie de Informes Técnicos No.
823, 1992.
Consultas en Internet
8. http://mendel.uab.es/biocomputacio/treballs99-00/Bascon-
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11. http://www.paho.org/English/SHA/be_v21n2-yellowfever.htm.
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Libros
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17. MORGAN, S; DARLING, D. cultivo de células animales. Editorial
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18. OSSA, E. Jorge. Principios de virología Médica. Editorial Universidad de
Antioquia. Medellín. Colombia. 1990.
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Colombia, Facultad de Ciencias, 1997.
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Artículos
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32. TOMORI, O. Impact of yellow fever on the developing world. Advances
in virus Research, Vol. 53. 1999
GLOSARIO
Ø ANALISIS DE SHEFFE: Muestra específicamente los grupos de datos
en los cuales existen diferencias. Es un complemento del análisis de
varianza que permite graficar esas diferencias.
Ø ANALISIS DE VARIANZA: Técnica mediante la cual, la variación total
presente en un conjunto de datos se distribuye en varios componentes.
Permite evaluar la influencia real de una fuente de variación en el
ensayo.
Ø BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO (BPL): Indispensables
durante el proceso de validación ya que garantizan la seguridad de los
datos obtenidos y poder así juzgar sobre la seguridad de la prueba.
Ø CALIBRACION: Eliminar y /o reportar por ajuste cualquier variación de
exactitud de instrumento. El conjunto de operaciones que establece,
bajo condiciones específicas, la relación entre los valores indicados por
un instrumento o sistema de medición (especialmente de pesaje),
registro, y control, o los valores representados por una medida
material, y los correspondientes valores conocidos de un patrón de
referencia. Es preciso establecer los límites de aceptación de los
resultados de las mediciones.
Ø CALIFICACION: Pruebas que determinan si el componente cumple
requisitos para un buen producto.
Ø CEPA CELULAR: una cepa celular se deriva de un cultivo primario o
una línea celular por selección o clonación de células, poseen
propiedades específicas o marcadores.
Ø CICLO SILVESTRE: Se da cuando el virus de Fiebre Amarilla es
transmitido a primates no humanos por diferentes mosquitos vectores
y los humanos son infectados aleatoriamente.
Ø CICLO URBANO: Se da cuando el virus de fiebre amarilla es
transmitido de humanos infectados a humanos susceptibles, por el
mosquito Aedes aegypti, el cual se produce en aguas estancadas,
botes de basura o desechos.
Ø CONFLUENTE: Se presenta cuando todas las células de una
superficie están en contacto a su alrededor con otras células y no hay
substrato libre o descubierto.
Ø CULTIVO CELULAR: Cultivos derivados de la dispersión de células
tomadas de un tejido original, de un cultivo primario o de una línea
celular o cepa particular por dispersión enzimática, mecánica o
química en la suspención celular, el cual puede ser cultivado como
una monocapa adherente sobre un sustrato sólido, o como una
suspensión en un medio de cultivo.
Ø DOSIS HUMANA: Cantidad de partículas virales inoculadas,
suficientes para la inmunización humana.
Ø EFECTO CITOPATICO: Se presenta cuando los virus destruyen las
células en las que se replican por lo que en la monocapa celular
aparecen gradualmente evidencias visibles del daño celular a medida
que los viriones formados afectan a nuevas células del cultivo. Se debe
a la multiplicación viral en las células que produce degeneración y
muerte de las mismas.
Ø ENCEFALITIS: Inflamación del cerebro.
Ø EXACTITUD: Es la cercanía o concordancia de los resultados
obtenidos por el método de estudio con el valor aceptado como
referencia.
Ø IN VITRO: Crecimiento de células fuera del organismo (en vidrio).
Ø LINEA CELULAR: Tipo celular establecido in vitro (normalmente
inmortal o transformado). Células de un soloo tipo capaces de
propagarse, in vitro indefinidamente. Se obtiene a partir de tumores
malignos o por transformación espontánea de una cepa celular
diploide.
Ø LINEALIDAD: Capacidad de un método para producir resultados
directa o indirectamente proporcionales a la cantidad del virus en el
ensayo dentro de un rango dado.
Ø LOTE: Una cantidad definida de materia prima, material de envasado o
producto procesado en un solo proceso o en una serie de procesos, de
tal manera que puede esperarse que sea homogeneo.
Ø MONOCAPA: Conjunto de Células que se sedimentan y adhieren al
vidrio u otra superficie, multiplicándose hasta formar una capa contínua
o red, usualmente de una célula de espesor.
Ø MEDIO DE CULTIVO: es una solución nutritiva cuyos componentes
son específicos y escenciales para el cultivo y mantenimiento de
células.
Ø NEUROTROPISMO: Se presenta cuando el virus tiene afinidad por el
sistema nervioso central especialmene cerebro, produciendo encefalítis
y parálisis.
Ø PRECISION: Es el grado de ajuste entre los resultados de las pruebas
individuales, cuando el procedimiento analítico se aplica repetidas
veces a una muestra homogénea. La presición usualmente se expresa
como la desviación estándar. La presición es una medida de la
repetitividad y de la reproducibilidad de un método de análisis bajo
condiciones normales.
Ø PRODUCTO FARMACEUTICO: Todo medicamento destinado al uso
humano, presentado en su forma farmacéutica definitiva o como
materia prima destinada a usarse en dicha forma farmacéutica,
cuando está legalmente sujeto a inspección en el Estado miembro
exportador y en el Estado miembro importador.
Ø SUSPENSIÓN (CULTIVO): Células que crecen sin necesidad de
adherirse sobre el sustrato.
Ø SUSTRATO: Superficie sobre la cual descansan o se adhieren las
células mientras se multiplican.
Ø TITULO: Concentración de agentes infecciosos.
Ø TRIPSINIZACIÓN: Empleo de la enzima Tripsina para eliminar las
proteínas de adherencia de las superficies celulares.
Ø UNIDAD FORMADORA DE PLACA (UFP): Muerte de grupos
celulares que forman desprendimientos en forma redondeada y tamaño
bastante regular.
Ø VACUNAS: Productos Biológicos que contienen dentro de sus
componentes, el agente de una enfermedad, puede tenerlo vivo,
muerto o atenuado. Se inyecta en un ser, con el fin de producir
inmunidad.
Ø VACUNA ATENUADA: Su principio activo, ha perdido su virulencia,
pero todavía mantiene sus antígenos inmunizantes. Se obtiene,
retirando parte del agente que causa letalidad.
Ø VACUNA CONTRA FIEBRE AMARILLA: Es un producto biológico
liofilizado que se prepara mediante inoculación en embrión de pollo
SPF, utilizando cepa 17D de virus vivo modificado que satisface los
requerimientos formulados por la Organización Mundial de la Salud
(OMS)
Ø VALIDACIÓN: Estudio que permite determinar la capacidad de la
metodología, así como sus características y confiabilidad de
Resultados.
Ø VALIDACIÓN CONCURRENTE: Establecer evidencia documentada
de un proceso en implementación.
Ø VALIDACIÓN PROSPECTIVA: Establecer evidencia documentada
para metodologías nuevas, demostrando que cumplirá su propósito.
Ø VALIDACIÓN RETROSPECTIVA: Establecer evidencia documentada
de un proceso ya realizado-Histórica.
Ø VALOR P: Es el valor más pequeño para el cual la hipótesis nula
puede ser rechazada.
Ø VIRUS: Pequeñas partículas que contienen DNA o RNA pero nunca
ambos. No tienen ribosomas, mitocondrias u otros organelos celulares,
razón por la cual dependen de células huesped para la producción de
energía y síntesis de Proteínas.
Ø VISCEROTROPISMO: Cuando el virus tiene afinidad por los tejidos
viscerales como el hígado, bazo, riñón; producienedo destrucción
especialmente del hígado.
ANEXO No. 1
EQUIPOS
EQUIPO CARACTERISTICA UTILIDAD Agitador magnético
con plancha de calentamiento
Marca Lab_line Pyromagnestir Modelo 1266
Preparación de la agarosa.
Baño Serológico Marca Precision Modelo 283
Conservación de Solución de agarosa.
Cabina de flujo laminar Marca sterileGard Clase II Tipo A/B3 The Beaker Company
Desarrollo y manejo estéril de las pruebas.
Congelador vertical de -20°C
Marca Kenmore Sears Best Model 198.7191852
Sitio de conservación de la vacuna liofilizada.
Incubadora CO2 Marca Napco Modelo 5410
Sitio de proliferación celular e incubación del material.
Microscopio Invertido Wilo Vert. Marca Hund Werzlar Leitz Modelo CL58185
Visualización de la morfología celular.
Pipetiador automático Marca Drummond Pipet-Aid Serial No. D40090
Toma de reactivos.
Vortex Mistral Lab_line Modelo 1192
Agitación homogénea para las diluciones.
Balanza Marca Sartorius Modelo BP2100
Peso de medios y reactivos.
Micropipeta de 200-1000µµL
Marca Amersham Life Science
Toma de reactivos.
Micropipeta de 50 – 200µµL
Marca Amersham Life Science
Toma de reactivos.
Pipeta repetidora Marca Nichyrio Toma y dispensión de reactivos cuantitativamente.
Jeringas para pipeta repetidora
Marca Nichyrio Modelo 8100 * 60 ml
Material volumétrico de 60ml.
Balanza Marca Sartorius Modelo BP2100
Pipeta repetidora Marca Nichyrio Micropipeta de 50 – 200µµL/ Micropipeta de 200-1000 µµL Marca Amersham Life Science
Microscopio Invertido Wilo Vert. Marca Hund Werzlar Leitz
Cabina de flujo laminar Marca sterileGard Clase II Tipo A/B3 The Beaker Company
MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES Y
REACTIVOS CARACTERÍSTICAS UTILIDAD
PRUEBA DE POTENCIA
PRUEBA DE IDENTIDAD
Medio 199 1X Marca Gibco CAT No. 31100 – 027
X X
Medio 199 2X Marca Gibco CAT No. 31100 – 027
X X
Tripsina 2.5% Marca SIGMA T 4799
X X
Bicarbonato de sodio Marca SIGMA S 5761
X X
Agarosa 1% Marca SIGMA CAT No. A 4018
X X
Suero fetal bovino Marca Gibco CAT No. 16140-071
X X
Solución de Formol 8%
Marca Merck X X
Cristal violeta 1% Marca SIGMA C 3886
X X
Gradillas para tubos serologicos
Capacidad para 60 tubos (12*6)
X X
Puntas para micropipetas 1000µµL
Marca Fisher Brand Redi-Tip CAT No. 21-197-8J
X X
Puntas para micropipetas 1-200µµL
Marca Fisher Brand Redi-Tip CAT No. 21-197-8H
X X
Placas de 24 pozos fondo plano
Marca NUNCLON CAT No. 143982
X
Placas de 6 pozos fondo plano
Marca NUNCLON CAT No. 152795
X
Frascos de Cultivo de 150 cm2
Marca Corning CAT No. 430823
X X
Frascos de cultivo de 75 cm2
Marca Corning CAT no. 430720
X X
Pipetas de vidrio Volumen de 1 , 5 , 10mL X X Bandeja de acero
inoxidable Tamaño de 40 * 26 cm X X
Tubos serológicos 12 * 150 X X Suero hiperinmune
de mono FIOCRUZ Vial liofilizado
X
Suero normal de mono
FIOCRUZ Vial liofilizado
X
ANEXO No. 2
CERTIFICADOS DE CALIBRACIÓN Y CALIFICACIÓN DE EQUIPOS
Bicarbonato al 7.5% (Derecha)
Medio 199 2X (izquierda)
Medio 199 1X (Derecha) Suero Fetal Bovino (izquierda)
Solución de Tripsina 2.5% Suero Normal de Mono (Derecha)
Suero Hiperinmune (Izquierda)
Placas de 6 pozos fondo plano (Izquierda) Placas 24 pozos fondo plano (Derecha) Ambas con monocapa
NOTA: Los certificados de calificación de la cabina de flujo laminar e
Incubadora de CO2, se encuentran en el Área de mantenimiento del
Instituto Nacional de Salud, y por razones de confidencialidad no fueron
anexados.
NOTA: Los certificados de calibración de la Balanza Digital, se
encuentran en el Área de mantenimiento del Instituto Nacional de Salud, y
por razones de confidencialidad no fueron anexados.
ANEXO No.3
CALIBRACIÓN DE LAS MICROPIPETAS MATERIALES
- Balanza Digital Calibrada*
- Beaker De 250 ml y 50 ml.
- Termómetro.
- Micropipetas de 50 – 200µ l y 200 - 1000µl
*Fecha de Calibración de la Balanza empleada: Feb 18 de 2001.
PROCEDIMIENTO • Se determino el manejo de las micropipetas de 2 maneras: En la
primera se manejaron las condiciones que se manejan diariamente en
el laboratorio (Se toma el líquido hasta el primer tope de la micropipeta
y se elimina hasta el segundo tope). En la Segunda se manejaron las
condiciones recomendadas normalmente para calibración de éste tipo
de aparatos volumétricos (Se toma el liquido en el segundo tope y se
elimina el primero, además se tiene en cuenta la gota final).
• Sobre la balanza se colocó un beaker de 30mL limpio y seco, se pesó
y taró. Aparte, se tomó un beaker de 250mL y se llenó con agua
destilada a 200mL.
• Tomamos la micropipeta de 50-200µL, y la graduamos en 50µL, como
lo recomienda el procedimiento de calibración que da el fabricante.
• Se tomó el agua del beaker de 250 y se eliminó dentro de beaker de 30
mL, anotando el peso obtenido.
• Se realizó el mismo procedimiento con la micropipeta de 200-1000µL.,
y se graduó en 200µL, como lo recomienda el procedimiento de
calibración que da el fabricante.
• Este procedimiento se realizó 21 veces para cada micropipeta.
• A los datos se les sacó la diferencia y se sacó la media de éstas
diferencias.
• Se utilizó la siguiente fórmula:
Media de las diferencias
Volumen = ---------------------------------------------------- Densidad del Agua a la T° Observada♣
♣Este dato se sacó de la tabla de Densidad del agua, libre de aire, en gr/cm3 a
diferentes Temperaturas.
• Al obtener el volúmen se le suma y se le resta el volúmen a calibrar y
así se obtiene el rango de calibración en que se encuentra la
micropipeta.
• Se tuvo en cuenta la siguiente tabla recomendada por el fabricante
para el rango permitido en el procedimiento de calibración.
Volumen de Micropipeta
Volumen a calibrar Rango de Volumen Permitido
50-200µµL 50µL 49.2 - 50.8
200-1000µµL 200µL 198- 202
RESULTADOS
• Micropipeta de 50 a 200µL manejada bajo condiciones diarias de
Laboratorio.
Repetición No. Peso Diferencia
1 0.176 0
2 0.348 0.172
3 0.526 0.178
4 0.703 0.177 Media: 3.563 / 20
5 0.880 0.177 Media: = 0.178
6 1.059 0.179
7 1.237 0.178 Volumen = 0.178 / 0.9970
8 1.416 0.179 Volumen = 0.178
9 1.595 0.179
10 1.773 0.178 Límite Superior :
11 1.952 0.179 50+0.178 = 50.1
12 2.130 0.178
13 2.309 0.179 Límite Inferior :
14 2.488 0.179 50 - 0.178= 49.8
15 2.667 0.179
16 2.845 0.178 Limites Permitidos:
17 3.024 0.179 49.2 – 50.8
18 3.203 0.179
19 3.381 0.178
20 3.560 0.179
21 3.739 0.179
TOTAL DIFERENCIA 3.563
Conclusión: Micropipeta calibrada.
• Micropipeta de 200 a 1000µL manejada bajo condiciones diarias de
Laboratorio.
Repetición No. Peso Diferencia
1 0.219 0
2 0.438 0.219 Media: 4.389 / 20
3 0.657 0.219 Media: = 0.219
4 0.876 0.219
5 1.096 0.22 Volumen = 0.219/ 0.9970
6 1.316 0.22 Volumen = 0.22
7 1.536 0.22
8 1.754 0.218 Límite Superior:
9 1.972 0.218 200+0.22 = 200.22
10 2.192 0.22
11 2.409 0.217 Límite Inferior
12 2.628 0.219 200 - 0.22= 199.78
13 2.849 0.221
14 3.069 0.222 Limites Permitidos
15 3.288 0.219 198 – 202
16 3.508 0.222
17 3.728 0.222
18 3.947 0.219
19 4.167 0.22
20 4.382 0.221
21 4.608 0.22
TOTAL DIFERENCIA 4.389
Conclusión: Micropipeta calibrada.
• Micropipeta de 50 a 200µL manejada bajo condiciones recomendadas
para calibración.
Repetición No. Peso Diferencia
1 0.050 0
2 0.101 0.051 Media: 1.011 / 20
3 0.151 0.05 Media: = 0.05055
4 0.200 0.049
5 0.250 0.05 Volumen = 0.05055 / 0.9972
6 0.301 0.051 Volumen = 0.05069
7 0.352 0.051
8 0.403 0.051 Límite Superior
9 0.454 0.051 50+0.05069 = 50.05
10 0.503 0.049
11 0.554 0.051 Límite Inferior
12 0.605 0.051 50 - 0.05069 = 49.94
13 0.656 0.051
14 0.707 0.051 Limites Permitidos
15 0.758 0.051 50.8- 49.2
16 0.808 0.05
17 0.858 0.05
18 0.910 0.051
19 0.960 0.05
20 1.011 0.051
21 1.061 0.05
TOTAL
DIFERENCIA
1.011
Conclusión: Micropipeta calibrada.
• Micropipeta de 200 a 1000µL manejada bajo condiciones
recomendadas de calibración.
Repetición No. Peso Diferencia
1 0.228 0
2 0.448 0.22 Media = 4.442 / 20
3 0.673 0.225 Media = 0.2221
4 0.897 0.224
5 1.121 0.224 Volumen = 0.2221 / 0.9972
6 1.346 0.225 Volumen = 0.222
7 1.565 0.219
8 1.786 0.221 Límite Superior:
9 2.002 0.216 200+0.222 = 200.2
10 2.222 0.22
11 2.448 0.226 Límite Inferior:
12 2.670 0.222 200 - 0.222= 199.7
13 2.893 0.223
14 3.114 0.221 Limites Permitidos:
15 3.337 0.223 198 – 202
16 3.561 0.224
17 3.783 0.222
18 4.005 0.222
19 4.227 0.222
20 4.447 0.22
21 4.670 0.223
TOTAL DIFERENCIA 4.442
Conclusión: Micropipeta calibrada.
ANEXO No.4
Técnica de Cultivo celular con células vero.
En una botella de cultivo Celular de 75cm2, con un recuento inicial de 1*105 células / ml; realizar una observación diaria de las células y Verificar que no haya contaminación, que su morfología sea uniforme, al igual que su multiplicación.
Obtener una monocapa confluente al tercer día, trabajando con medio de crecimiento
En cámara de flujo laminar, descartar el medio que contiene la botella de 75Cm2 , agregar 5ml de tripsina y pasar suavemente la tripsina por la monocapa repetidas veces.
Descartar totalmente la tripsina, agregar nuevamente 5ml de tripsina (concentración de 2.25ml/L) y pasarla por la monocapa
* S.F.B : Suero Fetal Bovino.
Incubar a 37°C hasta obtener una monocapa confluente.
Cuando las células se estén empezando a desprender, descartar la tripsina dejando un poco. Tapar la botella.
Llevar a incubar a 36ºC, a los 3 minutos sacar la botella para desprender la totalidad de la monocapa y observar que la monocapa este totalmente desprendida.
Con una pipeta de 10ml, tomar 5ml de células y resuspenderlas varias veces en la botella de cultivo hasta desprenderlas totalmente.
Aparte y para la ampliación, preparar en un frasco de vidrio 90ml de medio + 4% S.F.B.
Tomar la suspensión celular y transferirla al frasco de vidrio que contiene el medio, agitar y servir de a 30ml en bote llas de cultivo de 75cm2.
“Tomado del Procedimiento Operativo Estándar de Descongelación y
Cultivo Celular del Instituto Nacional de Salud del 2000.”
Foto 1: Descarte Del Medio 199 1X
Foto 2. Células con tripsina.
Foto 3. Preparación del medio para las nuevas células.
Foto 4. Incubación de los frascos con células y tripsina a 36°C y con 5% CO2
Foto 5. observación del desprendimiento de la monocapa por la tripsina.
Foto 6. Transferencia de la suspensión celular a frascos de 150 cm2.
Foto 7. Frascos de 150 cm2 con suspensión de células listas a incubar a 36°C con 5% CO2
CERTIFICADO DE CÉLULAS VERO
ANEXO No. 5
CERTIFICADO DE CALIDAD DE AVENTIS PASTEUR S.A.
ANEXO No. 6
Prueba de Potencia
Muestreo de tres viales de la Vacuna de Fiebre Amarilla paralelas, y almacenada a 4°C, para ser probadas individualmente
De la suspensión de las células Vero, realizar recuento y diluir con medio al 4% de S.F.B, de acuerdo con las condiciones deseadas: 1*105 células/ml a las 24 horas de incubación, 2*105 Células/ml a las 48 horas de incubación y 3*105 células/ml a las 72 horas de incubación.
En la preparación de las placas, distribuir la suspensión de células en los 6 pozos, (3ml por pozo) con una pipeta repetidora.
Incubar a 36ºC con 5% de CO2 y observar hasta que se forme una monocapa confluente.
Aparte, reconstituir cada vial de vacuna de fiebre Amarilla Liofilizada según numero de dosis (o.5ml/dosis) de diluyente y dejar reposar durante 20 minutos en hielo, al igual que la
vacuna de control.
Pasar 0.5ml de la vacuna reconstituida a un tubo que contiene 4.5ml de medio con 4% de S.F.B (Dilución 1:10) . A partir de aquí, realizar diluciones en base 4 con medio con 4% de S.F.B., así:
Pasar 0.5ml al primer tubo que contiene 1.5ml de medio con 4% de S.F.B.; continuar con las diluciones 1:40, 1:160 , 1:640, 1: 2560, 1:10240 y 1: 40960.
Adicionar a la primera serie de 2 pozos, 0.2ml de medio con 4% de S.F.B (control de células).
Descartar de las placas de 6 pozos, el medio metabolizado por las células.
•• UFP : Unidades Formadoras de Placa.
Partiendo de la mayor a la menor Dilución (1:40960 a 1:160), inocular 0.2ml de cada una de las diluciones por duplicado en las placas marcadas para cada lote.
Incubar las placas a 36ºC y 5% de CO2 durante 1 hora y agitar cada 15 minutos.
Realizar el procedimiento con cada uno de los 3 viales.
Preparar la solución de agarosa: 50% de medio 2X (adicionar 2% Bicarbonato) + 50% de agarosa al 1% en agua destilada + 4% de S.F.B.
Pasado el tiempo de incubación, descartar el sobrenadante de cada pozo, luego, adicionar 3ml de solución de agarosa cada uno de los pozos de la placa. Dejar unos minutos y envolverlas en papel aluminio.
Incubar a 36ºC durante 7 días.
En cámara de extracción, adicionar a cada pozo 3ml de formol al 8% y dejarlo 20 minutos.
Lavar cada placa por inmersión con agua de llave (Fijación)
Adicionar a cada pozo 3ml de solución de Cristal Violeta al 1% y dejar durante 20 minutos.
Retirar el Cristal violeta, lavar cada placa por inmersión con agua de la llave y secar las placas a temperatura ambiente.
Contar en las placas las Unidades Formadoras de Placa (UFP) por cada dilución.
ANEXO No. 7
Cálculos para el titulo de la Prueba de Potencia
Ø Dilución Seleccionada: Se toma la dilución en la cual el promedio
de recuento de los 2 pozos no supera 30UFP, en éste ejemplo es
la Dilución 2560.
Ø Ajuste a la dilución seleccionada: Se obtiene multiplicando el
promedio de los 2 pozos de la dilución siguiente a la seleccionada
(1024) por 4 que es el factor de dilución, entonces: ( 2 X 4 = 8)
Ø UFP en Dilución Seleccionada: Se obtiene sumando el resultado
anterior con el promedio de pozos de la dilución seleccionada y
dividiendo entre 2. Entonces: (8 + 10) / 2 = 9
Ø UFP en 0.2mL: Se obtiene multiplicando el resultado anterior por la
dilución seleccionada. (9 x 2560 ) = 23040.
Ø UFP por Dosis Humana: Se obtiene multiplicando el resultado
anterior por 0.5 (dosis humana) y dividiendo en 0.2 (cantidad de
inóculo). Entonces:. (23040 x 0.5) / 0.2 =57.600.
Ø Log UFP en 0.5 ml / DH: es el logaritmo base 10 del resultado
anterior.
VIAL 1 DILUCION 1 POZO 2 POZO PROMED
40 INCONT INCONT INCONT
160 INCONT INCONT INCONT
640 28 36 32.00
2560 9 11 10.00
10240 3 1 2.00
CONTROL OK OK OK
DIL. SELECCIONADA 2560
AJUSTE A LA DIL SEL. 8.00
UFP EN DIL. SEL. 9.00
UFP EN 0.2 Ml 23040
UFP POR DOSIS HUMANA 57600
LOG. UFP EN 0.5mL/DH 4.76
ANEXO No. 9
La prueba de identidad
Preparar las diluciones Así:
Dilución de la Vacuna: Dilución 1 : 0.5ml de pool de
vacuna + 4.5ml de medio (1:10)
Dilución 2 : 0.5ml de Dln. 1 +1.5ml de medio (1:40) Dilución 3 : 0.5ml de Dln. 2 +1.5ml de medio (1:160) Dilución 4 : 0.5ml de Dln. 3 +1.5ml de medio (1:640) Dilución 5 : 0.5ml de Dln. 4 +1.5ml de medio (1:10240) Dilución 6 : 0.5ml de Dln. 5 +1.5ml de medio (1:40960)
Estas diluciones se realizan tambien a la vacuna de control.
Mezclar el suero Hiperinmune (Dln. 1:256) con las diluciones de la vacuna así:
Dilución 1H : 0.2ml de Dln. 3 +0.2ml de suero Hiperinmune Dilución 2H : 0.2ml de Dln. 4 +0.2ml de suero Hiperinmune Dilución 3H : 0.2ml de Dln. 5 +0.2ml de suero Hiperinmune Dilución 4H : 0.2ml de Dln. 6 +0.2ml de suero Hiperinmune
A partir del cultivo Celular descrito Anteriormente, realizar el recuento celular de la suspensión de células vero obtenidas, y diluir con medio al 4% de S.F.B.
En la preparación de las placas de cultivo, distribuir la suspensión de células en los 24 pozos de fondo plano. (1ml)
Incubar a 36°C con el 5% de CO2 hasta que haya una monocapa confluente.
Tomar 5 viales de la Vacuna de Fiebre Amarilla, hidratar cada vial según número de dosis (0.5ml/dosis) y dejar en reposo durante 20 minutos, luego hacer un pool de todos los viales.
Agitar en el vortex cada vez que se realice una dilución
Incubar durante 1 hora a 36°C las Diluciones del Suero Hiperinmune y Normal. Los tubos son deben estar sellados con tapones de caucho estériles, para evitar riesgo de
contaminación.
Una vez adheridas las células al fondo de la placa (monocapa), descartar el medio metabolizado por las células. Retirar el exceso de medio con micropipeta.
Mezclar el suero normal con las diluciones de la vacuna así: Dilución 1N : 0.2ml de Dln. 3 +0.2ml de suero normal Dilución 2N : 0.2ml de Dln. 4 +0.2ml de suero normal Dilución 3N : 0.2ml de Dln. 5 +0.2ml de suero normal Dilución 4N : 0.2ml de Dln. 6 +0.2ml de suero normal
Adicionar a la ultima serie de 4 pozos 0.1ml de medio para control de células.
Partiendo de la mayor dilución a la menor dilución de suero Hiperinmune (3H a
1H), inocular 0.1ml de cada una. Repetir el proceso con las diluciones del suero
Preparar la solución de agarosa: 50% de medio 2X (adicionar 2% Bicarbonato) + 50% de agarosa al 1% en agua destilada + 4% de S.F.B.
Incubar las placas a 36°C y 5% de CO2 durante 1 hora
Mezclar suavemente cada 15 minutos con el fín de lograr una distribución homogénea de las células
Sacar las placas de la incubadora dentro de la cabina de flujo laminar, remover el inóculo de cada pozo con la micropipeta
Agregar a cada pozo después de la incubación 1.0ml de solución de agarosa , esperar 5 minutos para que solidifique.
Envolver en papel aluminio las placas e incubarlas durante 7 días a 36°C con 5% de CO2
Fijación: cumplido el tiempo de incubación, adicionar a cada pozo 1ml de solución de formol al 8% y dejarlo durante 15 minutos. Lavar cada placa por inmersión con agua en la bandeja.
Retirar el Cristal violeta, lavar cada placa por inmersión con agua de la llave y secar las placas a temperatura ambiente.
Se debe mirar como resultados que los pozos con suero Hiperinmune no forman UFP, mientras que los pozos con suero normal forman UFP y se reporta como identidad
confirmada.
Adicionar a cada pozo 1.0ml de una solución de Cristal violeta al 1% y dejar durante 20 minutos.
ANEXO No. 10
Formato de Reporte de Análisis de la Prueba de Identidad.
MUESTRA: Vacuna Fiebre Amarilla No. LOTE: T6763-2 PROCEDENCIA: Aventis Pasteur PRESENTACION: 1 ampolla1 dosis + 1 jeringa
solvente FECHA ANÁLISIS:
05/09/01 FECHA REPORTE: 12/09/01
ANALISTA Operador 1
ANALISIS METODO ESPECIFICACIONES RESULTADO Prueba de Identidad
Microtitulación In vitro
- No se observan UFP con suero Hiperinmune. - Se observan UFP con suero normal
Cumple
___________________ _______________
Analista Aprobado
Reporte de Análisis de la Prueba de Identidad.
MUESTRA: Vacuna Fiebre Amarilla No. LOTE: 784 PROCEDENCIA: Instituto Nacional de
Salud PRESENTACION: Vial con liofilizado para 10
dosis. FECHA ANÁLISIS:
15/08/01 FECHA REPORTE: 22/08/01
ANALISTA Operador 2
ANALISIS METODO ESPECIFICACIONES RESULTADO Prueba de Identidad
Microtitulación In vitro
- No se observan UFP con suero Hiperinmune. - Se observan UFP con suero normal
Cumple
___________________ _______________
Analista Aprobado
Reporte del numero de pruebas totales
FECHA OPERADOR VACUNA / LOTE
RESULTADO
05/09/01 Operador 1 Aventis / T6763-2 Cumple
06/09/01 Operador 1 Aventis / T6763-2 Cumple
06/09/01 Operador 1 Aventis / T6763-2 Cumple
07/09/01 Operador 1 Aventis / T6763-2 Cumple
07/09/01 Operador 1 Aventis / T6763-2 Cumple
1/08/01 Operador 1 INS / 784 Cumple
14/08/01 Operador 1 INS / 784 Cumple
FECHA OPERADOR VACUNA / LOTE
RESULTADO
05/09/01 Operador 2 Aventis / T6763-2 Cumple
06/09/01 Operador 2 Aventis / T6763-2 Cumple
06/09/01 Operador 2 Aventis / T6763-2 Cumple
07/09/01 Operador 2 Aventis / T6763-2 Cumple
07/09/01 Operador 2 Aventis / T6763-2 Cumple
2/08/01 Operador 2 INS / 784 Cumple
15/08/01 Operador 2 INS / 784 Cumple
ANEXO No. 11
Tablas del Análisis Estadístico
Tabla No. 1. Análisis de varianza de Interoperador
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrado de la media
Valor F
Valor P
A: operador B: Prueba
2.35627E8 3.5728E8
1 3
2.35627E8 1.19093E8
7.60 3.84
0.0140 0.0302
Interacción AB
2.78027E8 3 9.26756E7 2.99 0.0621
Error 4.96E8 16 3.1E7 Total 1.36693E9 23
Tabla No. 2. Análisis de Scheffé por Operador Operador Cantidad de
datos Significancia Grupos
homogéneos
1 2
12 12
52600.0 58866.7
X X
Contraste 1 – 2
Diferencia *-6266.67
+/- limites 4818.62
* Denota una diferencia estadística significativa. Prueba de múltiple rango para UFP por OPERADOR Método: 95% Scheffé
Tabla No.3. Análisis de Scheffé por Prueba Prueba Cantidad de
datos Significancia Grupos
homogéneos
1 2 3 4
6 6 6 6
50266.7 55266.7 56266.7 61133.3
X X X X X X
Contraste 1 – 2 1 – 3 1 – 4 2 – 3 2 – 4 3 – 4
Diferencia -6000.0 -5000.0
*-10866.7 1000.0
-4866.67 -5866.67
+/- limites 10020.6 10020.6 10020.6 10020.6 10020.6 10020.6
* Denota una diferencia estadística significativa. Prueba de múltiple rango para UFP por OPERADOR Método: 95% Scheffé
Tabla No.4. Análisis de Varianza de Interdía, Operador 1, Días 1 – 3. Tabla ANOVA
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrado de la media
Valor F
Valor P
Entre grupos 1.42107E8 1
1.42107E8 5.41 0.0806
Dentro de grupos
1.05067E8 4 2.62667E7
Total 2.47173E8 5 Tabla No.5. Análisis de Scheffé de Interdía, Operador 1, Días 1 – 3.
Día Cantidad de datos
Significancia Grupos homogéneos
1 3
3 3
43466.7 53200.0
X X
Contraste 1 - 3
Diferencia -9733.33
+/- limites 11618.4
Prueba de múltiple rango para UFP por DIA Método: 95% Scheffé
Tabla N.6. Análisis de Varianza de Interdía, Operador 1, Días 2 – 4. Tabla ANOVA
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrado de la media
Valor F
Valor P
Entre grupos 2.3064E8 1
2.3064E8 4.73 0.0953
Dentro de grupos
1.95093E8 4 4.87733E7
Total 4.25733E8 5 Tabla No.7. Análisis de Scheffé de Interdía, Operador 1, Días 2 – 4.
Día Cantidad de datos Ls Grupos homogéneos 2 4
3 3
50666.7 63066.7
X X
Contraste 2 - 4
Diferencia -12400.0
+/- limites 15832.0
Prueba de múltiple rango para UFP por DIA Método: 95% Scheffé
Tabla No.8. Análisis de varianza de Interdía, Operador 2, Días 1 – 3. Tabla ANOVA
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrado de la media
Valor F
Valor P
Entre grupos 106667.0 1
106667.0 0.00 0.9567
Dentro de grupos
1.27573E8 4 3.18933E7
Total 1.2768E8 5
Tabla No.9. Análisis de Scheffé de Interdía, Operador 2, Días 1 – 3.
Día Cantidad de datos
Significancia Grupos homogéneos
1 3
3 3
57066.7 57333.3
X X
Contraste 1 – 3
Diferencia -266.667
+/- limites 12802.5
Prueba de múltiple rango para UFP por DIA Método: 95% Scheffé
Tabla No. 10. Análisis de varianza de Interdía, Operador 2, Días 2 – 4. Tabla ANOVA
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrado de la media
Valor F
Valor P
Entre grupos 1.06667E7 1
1.06667E7 0.62 0.4734
Dentro de grupos
6.82667E7 4 1.70667E7
Total 7.89333E7 5 Tabla No.11. Análisis de Scheffé de Interdía, Operador 2, Días 2 – 4.
Día Cantidad de datos
Significancia Grupos homogéneos
2 4
3 3
59200.0 61866.7
X X
Contraste 2 – 4
Diferencia 2666.67
+/- limites 9365.25
Prueba de múltiple rango para UFP por DIA Método: 95% Scheffé
Tabla No.12. Análisis de varianza de Repetibilidad. Tabla ANOVA
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrado de la media
Valor F
Valor P
Entre grupos 4.32E6 1
4.32E6 0.18 0.6776
Dentro de grupos
2.35627E8 10 2.35627E7
Total 2.39947E8 11 Tabla No.13. Análisis de Scheffé de Repetibilidad.
Hora Cantidad de datos
Significancia Grupos homogéneos
a.m p.m
6 6
58266.7 X X
Contraste a.m. – p.m.
59466.7 Diferencia 1200.0
+/- limites 6244.46
Prueba de múltiple rango para UFP por DIA Método: 95% Scheffé
Tabla No.14. Análisis de Regresión de 1 Dilución Vs. Operador. Análisis de Regresión – Modelo lineal: Y=a+b*x Variable dependiente: UFP Variable independiente: Dilución
Parámetro Estimado Error estándar T Student Valor P
Intercepto 25,5375 2,32372
10,9899 0,0000
Pendiente -0,00243087 0,000380613 -6,38671 0,0000 Coeficiente de correlación = -0,738508 R-cuadrado = 54,5394 % Error estándar of Est. = 9,47195
Tabla No.15. Análisis de Regresión de Dilución Vs. Operador 2. Análisis de Regresión – Modelo lineal: Y=a+b*x Variable dependiente: UFP Variable independiente: Dilución
Parámetro Estimado Error estándar T Student Valor P
Intercepto 24,25 2,16225 11,2152 0,0000 Pendiente -0,00231585 0,000354165 -6,53889 0,0000
Coeficiente de correlación = -0,746354 R-cuadrado = 55,7044 % Error estándar of Est. = 8,81377 Tabla No.16. Análisis de Regresión de Dilución Vs. UFP total de datos. Análisis de Regresión – Modelo lineal: Y=a+b*x Variable dependiente: UFP Variable independiente: Dilución
Parámetro Estimado Error estándar T Student Valor P
Intercepto 24,8937 1,56626 15,8938 0,0000 Pendiente -0,00237336 0,000256545 9,25124 0,0000
Coeficiente de correlación = -0,741678 R-cuadrado = 55,0087% Error estándar of Est. = 9,02888
ANEXO No.12
REPORTE DE ANÁLISIS DE LA VACUNA DEL INS - LOTE 784
ANEXO No.13
CERTIFICADO DE SUEROS NORMAL E HIPERINMUNE
