vacunas orales : eficiencia de incorporación en los alimentos y resultados en isa … sandra...
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Vacunas orales : Eficiencia de incorporación
en los alimentos y resultados en ISA Y SRS
Sandra Arcos Peña.
Medico Veterinario-Ingeniero Acuícola
Laboratorio Centrovet
32 Años
“Laboratorio Centrovet”. Empresa nacional, que desde
1979 se dedica a la investigación, desarrollo y producción en salud animal.
Número de registros por empresas
productoras de vacunas
Empresa Proveedora Preparación antigénica registradas
Agrovet Ltda. 5
Bayer S.A. 2
Centrovet Ltda. 12
Intervet Chile Ltda. 2
Laboratorios Recalcine S.A. 3
Novartis Chile S.A. 10
Pharmaq AS Chile Ltda. 6
Schering Plough Cía. Ltda. 5
Veterquímica S.A. 2
TOTAL GENERAL 45
Planta de producción de vacunas
-18 profesionales y técnicos.
- Fabricación de acuerdo a
GMP e ISO9001:2008
Capacidad de producción
mes:
-28-30 millones de dosis
vacunas inyectables.
-25 millones de dosis de
vacunas orales.
Vacunas orales registradas (SAG) por
CENTROVET
• Vacuna contra p.salmonis, polvo liofilizado oral: marzo 2009. Reg. SAG N° 2027 BP
•Vacuna subunitaria contra ISA, polvo liofilizado oral : Diciembre 2009 Reg SAG N° 2063 BP
•Próximamente: oral SRS + ISA IPN oral
600 UTA APROX.
1. Inmunidad Humoral (Títulos de anticuerpos específicos)
2. Inmunidad celular (Títulos de Linfocitos T)
3. Portación o infección del patógeno
4. Reacciones Adversas (RAM)
Programa seguimiento inmunológico
Agua Dulce
Engorda
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
UTA post vacunación
Ab
so
rb
an
cia
450 n
m (
UR
)
Resultado Curva Ac específicos contra P. salmonis-ISAv
El problema del booster inyectable
Infección vía de Inyección
Stress asociado al manejo
Tiempos de Faena
Ayuno prolongado
Inmunosupresión post inyección
COSTOS
Vacuna Oral
Los peces son capaces de absorber y presentar antígeno en el segundo segmento del tracto intestinal.
Desventajas:
- Requiere que el pez “coma”
-Integridad del antígeno
- mantenga por un tpo mínimo
Ventajas:
-Ahorro inyección y efectos relacionados
-Posibilidad de booster(s)
Bacterias/virus(inactivadas)
son encapsuladas en matrices
que las protegen activamente
del pH del estómago.
Estas matrices son
hidrolizadas lentamente una
vez que llegan al intestino,
liberando así los antígenos de
la vacuna.
MicroMatrix Gastric Juice Duodenal Juice
MicroMatrixTM
Sistema de Liberación en el sitio objetivo
1. Antígeno: Elemento que entrega inmunidad específica.
2. Inmunoestimulante y encapsulante: Atrayente de células inmunológicas
(Macrófagos y Linfocitos).
3. Cobertura adherente con elementos nutrientes para flora intestinal:
Liberan el antígeno a la vez que se enriquece la flora intestinal, como se
adhiere, esto ocurre a medida que pasa el tiempo en la mucosa.
4. Cobertor de pH: Moléculas inertes, en presencia de ácido protegen
cualquier elemento que contengan.
Vacuna Oral contra P. salmonis/ISA Construyendo la Matriz
MicroMatrixTM
Sistema de Liberación en el sitio objetivo
La Vacuna es
agregada en el
alimento y luego
entregada como
alimento normal
-Dosis: 6 mg de vacuna diaria, durante 10
días. Adsorbida en el alimento.
-La dosis de antígeno diaria es equivalente
al de una inyección.
MicroMatrixTM
Sistema de Liberación en el sitio objetivo
SRS-MM no es afectada por
El ácido estomacal
La Vacuna es Liberada en
el Intestino distal
Vacuna oral SRS Estudios en condiciones
controladas
Estudios de primovacunación
-Salmón del Atlántico, 30 gramos de peso.
-Dosis: 6 mg de vacuna diaria, durante 10 días. Adsorbida en el alimento.
-La dosis de antígeno diaria es equivalente al de una inyección.
-Evaluación de
parámetros
inmunológicos y
sobrevivencia al desafío.
Inducción de la respuesta inmune
humoral
Título de anticuerpos sistémicos
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8Oral-SRS
Control
Inyectable-SRS
9824
734
761
594
813
70
UTA post vacunación
An
ticu
erp
os a
nti
-P.s
alm
on
is
Título de anticuerpos Intestinales
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28 Oral-SRS
Control
Inyectable-SRS
9824
734
761
594
813
70
UTA post vacunación
An
ticu
erp
os a
nti
-P.s
alm
on
is
Tobar y cols., Vaccine, 2011
La vacuna SRS-Oral entrega protección eficaz desde
las 300 UTA post vacunación.
0 10 20 30 40 50 600
20
40
60
80
100
120
Control
SRS-Oral
SRS-Inyectable
SRS libre
Días post desafío
% S
ob
reviv
en
cia
Tobar y cols., Vaccine, 2011
0 10 20 30 40 50 600
20
40
60
80
100
120
Control
SRS-Oral
SRS-Inyectable
SRS libre
Días post desafío
% S
ob
reviv
en
cia
Esta protección se mantiene al menos hasta las 600
UTA post vacunación.
Tobar y cols., Vaccine, 2011
La vacuna oral contra SRS no afecta la ganancia de
peso en peces vacunados
610 948 13700
20
40
60
80
100
120SRS-Oral
SRS-Inyectable
Control
UTA post vacunación
Peso
(g
)
Tobar y cols., Vaccine, 2011
Ensayo de eficacia en
Booster oral SRS
1200
Primer desafío 300 UTA post booster
(1500 UTA totales)
20 30 40 50 60 7020
40
60
80
100
120
Control
Booster
Días post desafío
% S
ob
reviv
en
cia
Tobar y cols., Vaccine, 2011
1500 (300 UTA)
20 30 40 50 60 7020
40
60
80
100
120
Control
Booster
Días post desafío
% S
ob
reviv
en
cia
Segundo desafío 600 UTA post booster
(1800 UTA totales)
Tobar y cols., Vaccine, 2011
1800 (600 UTA)
Anticuerpos sistémicos
0 98 196
294
420
700
0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.600.65
Control
Booster 10d
Booster 30d
UTA post vacunación
An
ticu
erp
os a
nti
-P.s
alm
on
is
Anticuerpos sistémicos
0 98 196
294
420
700
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Control
Booster 10d
Booster 30d
UTA post vacunaciónA
nti
cu
erp
os a
nti
-P.s
alm
on
is
Curva de anticuerpos (Ig M anti p.salmonis)
intestinales
Vacuna oral SRS Estudios en condiciones de
cultivo
Incorporación al vacío
Top coating
Vacunas Inyectables y oral aplicadas. 2010
62% 19%
6%
4% 3% 3% 2% 1%
SRS/ISA oral
IPN+SRS
IPN+SRS+Vo
SRS Inyectable
IPN Inyectable
Distribución de aplicaciones de vacuna
oral SRS según especie. Año 2010
Salar 23,6%
coho 38,4%
trucha 37,9%
Distribución de aplicaciones de vacuna oral SRS según tipo de agua en vacunación. 2010
Piscicultura 11%
Mar 69%
Estuario 20%
Distribución de aplicaciones de vacuna
oral SRS según estrategia de Vacunación. 2010
88%
11%
1% Booster a i.p.
Primovacunación (30 gs)
primovacunación (800 grs)
Vacuna utilizada en primovacunación con boosters Oral SRS Centrovet. 2010
En salmones, no existe una evidencia directa acerca de potenciales
diferencias en la respuesta cuando el booster es SIMILAR al primer
antígeno (Caso Otros Laboratorios) o IDÉNTICO al primer antígeno
(aso Centrovet)
Otros Laboratorios
60%
Centrovet 40%
Brotes SRS en el período y grupos analizados durante 2010
La presencia de brote no significa ineficiencia de la vacuna: - Mortalidades bajas (menores o iguales al RPS) - Manifestación del brote fuera del período de protección
Con Brote 20%
Sin Brote 80%
Distribución causa de mortalidad
La entrega tardía del Booster (en condiciones de bajo título de
anticuerpos) se correlaciona con signología o brote SRS.
> 2000 UTA (Mar)
6%
Sin Vacuna 4%
Estuario 70%
>2000 UTA (Estuario)
20%
Vacuna liofilizada oral contra ISAv
Vacuna contra ISAv
La estrategia de formular una vacuna virina es compleja a escala industrial : → Células hospederas de crecimiento lento → Titulo viral bajo: entre 105 y 106; otros labs 108
• Estrategia: Generación de proteínas de superficie del V similares a las presentes en el virus, en forma Libre y NATIVA
Hemaglutinina
Matriz
Material genético
Proteína de fusión (NA)
Virus ISA Vacuna
Beneficio: concentración de proteínas específicas (y necesarias) mucho mayores,
optimizando los boosters de primovacunaciones. Equivalente a 1011 partículas virales. → No contiene material genético por lo que no es detectada por métodos de diagnóstico
como el RT-PCR.
Estudios de Eficacia Vacuna oral contra ISAv
Lotes Antígeno Hemaglutinina/ml
vacuna
Antígeno Neurominidasa/ml
vacuna
Lote 1 6 ug 6 ug
Lote 2 7,5 ug 7,5 ug
Lote 3 9 ug 9 ug
Vacuna ISA
Concentraciones antigénicas por ml de vacuna en cada
uno de las series pilotos:
Mortalidad acumulada al ser desafiados 310 UTA post vacunación ISA oral
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Mort
alid
ad A
cum
ula
da (%
)
Días post-desafío
Mortalidad Vacuna Experimental ISA Oral310 UTA Post vacunación
Control
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
VEX ISAVO-260209
Mortalidad acumulada al ser desafiados
650 UTA post vacunación ISA oral
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Mort
alid
ad A
cum
ula
da (%
)
Días post-desafío
Mortalidad Vacuna Experimental ISA Oral650 UTA Post vacunación
Control
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
VEX ISAVO-260209
Mortalidad acumulada al ser desafiados
830 UTA post vacunación ISA oral
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Mort
alid
ad A
cum
ula
da (%
)
Días post-desafío
Mortalidad Vacuna Experimental ISA Oral830 UTA Post vacunación
Control
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
VEX ISAVO-260209
Estudios de Eficacia vacuna ISA oral
Grupo Porcentaje de mortalidad
acumulada
RPS60 RPS
IA – 46120801 19 79 77
IA – 46130801 15 87 82
IA – 46140801 17 82 80
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
Mo
rtali
dad
(%
)
Días post desafío
Mortalidad acumulada específica post desafío con ISAv
Serie IO-21220901
Serie IO-22270901
Serie IO-23030901
Grupo Control
Pesos promedio peces vacunados (ISA oral) y no desafiados en cada serie mas el grupo control en cada uno de los tres desafíos (310, 650, y 830 UTA post vacunación).
0
5
10
15
20
25
VEX
ISA
VO
-20
02
09
VEX
ISA
VO
-23
02
09
VEX
ISA
VO
-26
02
09
Co
ntr
ol
VEX
ISA
VO
-20
02
09
VEX
ISA
VO
-23
02
09
VEX
ISA
VO
-26
02
09
Co
ntr
ol
VEX
ISA
VO
-20
02
09
VEX
ISA
VO
-23
02
09
VEX
ISA
VO
-26
02
09
Co
ntr
ol
310 UTA 650 UTA 830 UTA
Gra
mo
s
Peso previo al desafío
Figura 1. Gráfico de mortalidad acumulada post desafío del grupo de peces
vacunados con tres series piloto de vacuna inactivada oral contra ISA,
mezclada con el alimento y mantenida por 30 días a 25 C, y el grupo control
sin vacunar.
Figura 2. Mortalidad acumulada post desafío en un grupo control sin vacunar
y en las tres series piloto de vacuna inactivada oral contra ISAv, formulada y
utilizada inmediatamente después de producida la vacuna.
Serie RPS Clásico
Incubada No incubada
IO-21220901 79 81
IO-22270901 87 82
IO-23030901 82 84
Tabla 2. Tabla de contingencia para los alores de RPS60 de cada lote de vacuna al vacunar peces con alimento formulado y
utilizado inmediatamente (No incubada) o con alimento formulado y utilizado 30 días después de la formulación (Incubada).
Estudios de estabilidad de la vacuna formulada en alimento
Estudios de primo vacunación oral contra
ISAv
primovacunación+ booster oral ISA
-Evaluación de sobrevivencia
al desafío.
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
Mo
rta
lid
ad
Acu
mu
lad
a (%
)
Días post desafío
Curva de mortalidad acumulada en peces control y vacunados contra
ISABooster: 1600 UTA; Desafío: 2500 UTA
Control
Vacunado
Vacunado + Booster
2500 UTA
20%
85%
60%
1600 UTA 900
Estudios de terreno: Resumen de vacunaciones
aplicadas 2009 - 2010
Distribución de aplicaciones de vacuna ISA según estrategia de Vacunación.
Año 2010
Con booster 27%
Sin booster 73%
Distribución de aplicaciones de vacuna ISA inyectable entregada.
Año 2009-2010
Con booster, 18%
Sin booster, 82%
Vacuna utilizada en primovacunación con boosters Oral ISA Centrovet
Centrovet 25%
Otros laboratorios
75%
El Booster oral recupera los niveles protectores de anticuerpos específicos anti p.salmonis e ISA
IgM anti-SRS/ISAmuestreo Vacuna inyectable
028
860
0
1083
1466
2039
2622
3563
0
1
2
3
4
UTA post vacunación
Absorb
ancia
450 n
m (
UR
)
IgM anti-SRS/ISA
muestreos vacuna+ Booster oral
017
960
091
0
1200
1770
2066
2579
3270
3460
3660
3889
0.0
0.5
1.0
1.5
UTA post vacunación
Ab
so
rba
nc
ia 4
50
nm
(U
R)
Ventana de susceptibilidad
Booster oral
Cinética de IgM desde la vacunación
Cinética curva anticuerpos vacuna
oral
IgM anti-P.salmonisMuestreos vacuna SRS Centrovet
0
246.
6
460.
3
689.
693
1
1269
.1
1617
.7
1943
.2
2053
.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
UTA post vacunación
Ab
so
rban
cia
450 n
m (
UR
)
Cinética curva anticuerpos vacuna
inyectable
PDI: 300 PDI: 600
Esquema vacunación sugerida
1700-1800 2600 UTA 1000
900-1000 pb
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
UTA post vacunación
Ab
so
rban
cia
450 n
m (
UR
)
600 UTA engorda
VACUNA LIOFILIZADA ORAL
Vía alimento
Respuesta inmune adquirida También llamada “adaptativa” ó “adaptable”
Mecanismo de defensa específico, donde participan diferentes tipos de
células.
Linfocitos B
(Inmunidad Humoral) CD8+
CD4+
Linfocitos T
(Inmunidad celular)
Célula presentadora
de Antígeno
Poca
Virulencia
Media
Virulencia
Alta
Virulencia
352-354 349-351 motivo
Hemaglutinina
HE
Entendiendo las condiciones de éxito de
una VACUNA
Además de los requerimientos básicos de una vacuna (Título,
representatividad, rango de acción, y efectos adversos)
El cómo mantener este intermediario como un buen respondedor es lo que
marcará la diferencia al momento de evaluar una misma vacuna.
CD4
CD8
B
Estudios de Eficacia ISA inyectable
Grupo RPS60 RPS % Mortalidad Acumulada
Vacuna 1.1 75 % 72 % 22
Vacuna 1.2 79 % 84 % 13
Vacuna 1.3 82 % 86 % 11
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
Mo
rta
lid
ad
Acu
mu
lad
a (%
)
Días post desafío
Curva de mortalidad acumulada en peces control y vacunados contra
ISADesafío: 600 UTA
Control
Vacunado
80%
20%
600 UTA
Incorporación al vacío
• Ingresa alimento extrusionado seco al aceitador al vacío, previamente pesado y se le aplica vacío, esto es, se baja la presión atmosférica dentro del aceitador a niveles de 70 milibar de presión.
• Se pesa el aceite de pescado según la fórmula en un estanque utilizando un agitador y a una temperatura promedio de 30°C.
• A ese aceite se incorpora el medicamento previamente pesado para el batch, y se mezcla por un tiempo no mayor a de 5 minutos
• se aplica el aceite-medicamento al alimento extrusionado seco.
• Una vez terminado el aceitado se abre la válvula de entrada de aire para llegar a la presión atmosférica.
Top coating
• Ingresa a la línea medicados, alimento extruido (producto terminado) que cumple las especificaciones de calidad respectivas (proximales garantizados, % Flotación, % polvo y partido, etc.) y previamente pesado.
• El producto se deposita en un mixer de mezclado; Mientras se agita por 30 segundos, se incorpora el medicamento previamente pesado para el batch.
• Se continúa la agitación del mixer por 150 segundos a velocidad constante, mientras se agrega un 0,1% de de aceite de pescado por aspersión, que formaran una película de recubrimiento del pellet medicado
• Se descarga el batch para dar paso a la siguiente.
RPS y RPS 60 obtenidos en los desafíos realizados a peces vacunados con las tres formulaciones experimentales de vacuna ISAV a diferentes UTA post vacunación ISA oral
0
20
40
60
80
100
310 650 830R
PS
UTA post-vacunación al desafío
RPS60 Vacuna ISA Oral Experimental
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
VEX ISAVO-260209
0
20
40
60
80
100
310 650 830
RP
S
UTA post-vacunación al desafío
RPS Vacuna ISA Oral Experimental
VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
VEX ISAVO-260209
Crecimiento en línea de células embrionarias de
Salmón Chinook (CHSE-214)
Infección genera un efecto citopático que es total
alrededor de los 7 días
Los títulos bacterianos oscilan
entre 106 a 107 TCID50/ml de
cultivo
Crecimiento de P. salmonis para desarrollo
de una Vacuna
Spodoptera frugiperda
Birkbeck et al. Infect Immun. 72:3693-3694. 2004.
Crecimiento de P. salmonis en células Sf-21
Vacuna con mayor título SRS del mercado 108,47
•Monovalentes: IPN, SRS, VO, ISA
•Bivalente: SRS+IPN IPN+VO •Trivalente: SRS+IPN+VO
•Cuádruple: SRS+IPN+VO+AS SRS+IPN+VO+ISA •Quintuple: SRS+IPN+VO+Ae+ ISA
•Vacunas orales: Oral SRS, oral ISA
•Próximamente: oral SRS+ ISA IPN oral; IPN inmersión *Registro Enviado al SAG
Vacunas para peces registradas por
CENTROVET
Ensayo en “terreno”
• Piscicultura Isla Chiloé •Vacunados con vacuna triple • 100 Salmones por grupo, peso prom. 1 Kg • Dos estrategias de vacunación:
•10 días seguidos •10 días c/descanso por 2 días
• Booster 1200 UTA post vacunación Grupos: Control MM1 MM1 por 10 días
Estructura del virus ISA
• ISA pertenece a la familia Orthomyxoviridae (influenza) del género Isavirus
• El virus presenta una forma esférica de 100-130 nm de diámetro y posee una envoltura lipídica
• Su genoma esta compuesto por 8 RNAs de hebra simple negativo
PROTEINA PROPIEDADES
1 PB2 Subunidad polimerasa
2 PB1 Subunidad polimerasa
3 NP Nucleoproteína
4 PA Subunidad polimerasa
5 F Proteína de fusión
6 HE Hemaglutinina esterasa
7 P32/NEP/p11
8 M1/p16 Proteína de matriz
Proteína de fusión
(NE)
Matriz
Hemaglutinina
HA
RNAs
1
2
3
4
5
6
7
8
Membrana
lipídica
Proteína de fusión
Esquema vacunación (primovacunación oral-booster iny)
900 2100 2800 UTA 300
Booster oral : cada 900 UTA posterior a las 900 UTA post primo vacunación oral,
1700 pb
3700
900 pb
300 UTA engorda
BOOSTER i.p