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34 Gómez-Fernández et al. ITEA (2015), Vol. 111 (1), 34-49

Uso del “ChemSensor” como herramienta de discriminaciónprecoz del semen de cerdo Ibérico en funciónde su congelabilidad

J. Gómez-Fernández1, C. Tomás2, J.A. Carrasco3, R. Sánchez-Sánchez4,A. González-Bulnes4, E. Gómez-Izquierdo1 y E. de Mercado1,*

1 Centro de Pruebas de Porcino. Área de Investigación Ganadera. Subdirección de Investigación y Tec-nología. Instituto Tecnológico Agrario. Consejería de Agricultura y Ganadería. Junta de Castilla yLeón. España. Ctra Riaza-Toro s/n, 40353 Hontalbilla, Segovia, España

2 Centro de Investigación y Tecnología Animal (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias(IVIA). Apdo. 187. 12400- Segorbe (Castellón), España

3 Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN), C/José Antonio Novais, 10, 28040Madrid, España.

4 Dpto. de Reproducción Animal, INIA, Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040 Madrid, España

Resumen

Para favorecer el uso de dosis de inseminación de semen de porcino congelado-descongelado a nivel co-mercial, sería interesante conocer de antemano si el semen de verraco congelará bien o mal. El objetivode este estudio fue evaluar el “ChemSensor” (cromatógrafo de gases-masas unido a un software de aná-lisis quimiométrico) como herramienta precoz de discriminación entre eyaculados según su congelabili-dad. Para ello se utilizaron 33 eyaculados de verracos de raza Ibérica de los cuales se cogió una alícuotade 1 ml de semen y se analizó con el “ChemSensor”, el resto del eyaculado fue congelado-descongeladousando un protocolo estandarizado, para determinar su congelabilidad (buenos y malos congeladores)en función del porcentaje de espermatozoides con la membrana plasmática intacta y el porcentaje deespermatozoides móviles totales post-descongelación. Para el análisis con el “ChemSensor”, las muestrasse volatilizaron e ionizaron descomponiéndolas en diferentes iones con un tamaño determinado, que seusaron como variables de discriminación, para separar los eyaculados en función de su congelabilidad.El “ChemSensor” fue capaz de discriminar todos los eyaculados de los buenos congeladores; y dentro delgrupo de los malos congeladores solamente una muestra fue clasificada erróneamente. Debido al re-ducido número de muestras, la distancia obtenida entre grupos (2,62), aunque no muy elevada, podríaconsiderarse como significativa, aunque sería necesario un mayor número de muestras para poder crearun modelo matemático más robusto. En conclusión, el “ChemSensor” es una posible herramienta ade-cuada para la discriminación precoz de eyaculados de cerdo Ibérico en función de su congelabilidad.

Palabras clave: Congelación, Cromatografía gases-masas, compuestos volátiles del semen, semen cerdoibérico.

* Autor para correspondencia: [email protected]

http://dx.doi.org/10.12706/itea.2015.003

Gómez-Fernández et al. ITEA (2015), Vol. 111 (1), 34-49 35

Introducción

La existencia de una elevada población de ve-rracos cuyos espermatozoides muestran malatolerancia permanente a la crioconservación,es un serio problema para la producción ren-table de dosis espermáticas con este sistemade conservación, siendo uno los principalesfactores que limitan el diseño efectivo deprotocolos de congelación (Medrano et al.,2002). Hasta ahora la selección de verracos haestado basada en los rendimientos producti-vos que estos brindan a su descendencia, y noen la selección de reproductores por su ca-pacidad de criopreservación espermática,como se viene haciendo durante años en elvacuno de leche (Vishwanath, 2003).

En la actualidad, los verracos suelen clasifi-carse principalmente en “buenos” y “malos”según su congelabilidad espermática, basán-dose principalmente en la motilidad y viabili-dad de sus espermatozoides post-desconge-lación (Watson, 1995; Thurston et al., 1999; Gilet al., 2005; Hernández et al., 2007; Barranco

et al., 2013). Esta clasificación se aplica a los ve-rracos, y se establece en todos sus eyaculados,ya que se ha demostrado que la congelabili-dad o susceptibilidad de que un eyaculadocongele bien viene determinado genética-mente por el animal (Thurston et al., 2001), ypor tanto es algo intrínseco del animal. Ade-más estudios posteriores determinaron, si den-tro de un mismo animal distintos eyaculadospodrían tener distinta congelabilidad (Roca etal., 2006), determinándose de nuevo que es elverraco y no el eyaculado el que determinamayoritariamente si uno de sus eyaculadoscongelará bien o mal. Sin embargo, lo que sedesconoce es cómo esas diferencias genéticasse expresan para que un eyaculado tenga unamayor o menor congelabilidad. Estas diferen-cias podrían estar representadas tanto poruna distinta composición lipídica o proteica dela membrana espermática, como por varia-ciones en la composición del plasma seminalsegún la funcionalidad de las glándulas acce-sorias (Holt et al., 2005).

AbstractUse of “ChemSensor” as an early discrimination tool of Iberian pig semen according to their freezability

For the use of insemination dose of frozen-thawed boar sperm at the commercial level, it would be veryinteresting to know, in advance, if sperm from a boar will freeze well or poorly. So the aim of this studywas to evaluate the ability of the “ChemSensor” (gas chromatograph-mass coupled with chemomet-ric analysis software) as an early discrimination tool of Iberian pig ejaculates according to their freez-ability. For this, 33 ejaculates from Iberian breed boars were used and an aliquot of 1 ml of semen fromeach one was analyzed with the “ChemSensor”, the rest of the ejaculate was frozen-thawed using astandardized protocol to determine their freezability (good and bad freezers), depending on the per-centage of intact plasma membrane and total motile post-thaw sperm. For analysis of “ChemSensor”,sperm samples were volatilized and ionized, decomposing into different ions with a determined size,which were used as discrimination variables to determine if it is possible the separation of ejaculatesinto two freezability groups. The “ChemSensor” was able to discriminate all the ejaculates of the goodfreezers; and inside of bad freezers group only one sample was misclassified. Due to the small numberof samples, the distance obtained between groups (2.62), although not very high, it could be consid-ered significant, although a larger sample in order to create a more robust mathematical modelwould be necessary. In conclusion, the “ChemSensor” is a possible suitable tool for the early discrimi-nation of Iberian pig ejaculates according to their freezability.

Key words: Freezing, gas chromatography-mass spectroscopy; volatile components, Iberian boar semen.

El poder conocer de antemano si el semen deun verraco congelará bien o mal, sería unpunto vital para el uso comercial de la técnicade crioconservación espermática, ya que sehan correlacionado mayores niveles de fertili-dad cuando se usa semen de buenos conge-ladores que cuando se usa de malos congela-dores (Casas et al., 2010a). Además, el semende los buenos congeladores tiene una mayorcalidad, lo que permitiría mejorar notable-mente las muestras congeladas en los bancosde conservación de especies en peligro de ex-tinción, como sucede con algunas estirpes delcerdo Ibérico. Por ello, es necesario encontrarmétodos que permitan la determinación pre-coz de la congelabilidad de los eyaculados,siendo el “ChemSensor” una posible herra-mienta eficaz en la búsqueda de este objetivo.

El “ChemSensor” o también llamado Sensorquímico, es un cromatógrafo de gases-masas(GC-MS) unido a un software de análisis qui-miométrico, que tiene numerosas aplicacio-nes en las industrias alimentaria, farmacéu-tica y química, en tareas de discriminación dediferente tipo de muestras (Radovic et al.,2001; Ansorena et al., 2001; Landaud et al.,2008; Rodríguez-Bencomo et al., 2009; Perisy Escuder-Gilabert, 2009). En este tipo deequipos las muestras a clasificar son volatili-zadas, y aunque se obtiene un cromato-grama con los diferentes compuestos voláti-les, el análisis de clasificación lo realiza enbase al espectro de masas específico de cadamolécula, obtenido a partir de la fragmen-tación carga-masa iónica de todos los com-puestos volátiles en conjunto (Busto et al.,2002; Armanino et al., 2008; Cynkar et al.,2010; Vera et al., 2010). El detector de masasdel cromatógrafo fragmenta las moléculasmediante un impacto electrónico que pro-duce una serie de fracciones másicas conunos valores m/z (masa/carga) y con unaabundancia determinada de cada una de lasfracciones. La suma de las abundancias decada masa iónica, de cada uno de los espec-

tros, nos da una matriz de datos que puedesuperar los 500, pudiendo usar cada fracciónmásica como una verdadera variable para laclasificación. Para poder manipular este granconjunto de datos es necesario recurrir alanálisis multivariante mediante herramien-tas quimiométricas, como el método de re-conocimiento de patrones SIMCA (Soft Inde-pendent Modelling Class Analogy) (Peris yEscuder-Gilabert, 2009). Este método permiteasignar una clasificación previa al análisis denuestras muestras (en este caso grupos decongelabilidad), separando cada uno de losgrupos en función de la analogía que tienencada una de las muestras que lo integran me-diante un análisis de componentes principa-les (en este caso estos componentes serían lasfracciones másicas), determinándose así unmodelo para cada grupo de clasificación y es-tableciendo un límite entre las muestras per-tenecientes a cada uno los grupos de estudioy las muestras que no pertenecen a ninguno,para un nivel de confianza de 95%.

El uso combinado del “ChemSensor” con latécnica de análisis SIMCA ha sido reciente-mente puesto a punto por el Instituto deCiencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición(ICTAN) del CSIC, como una herramienta dis-criminatoria entre cerdos alimentados condiferentes dietas (Martín et al., 2009; Ca-rrasco y Duque, 2013), a partir de la infor-mación aportada por el cromatograma demuestras de ácidos grasos, y compuestos vo-látiles de muestras de tocino.

Así pues, si esta técnica híbrida da la posibi-lidad de discriminar una muestra de un ani-mal en función de una clasificación previa,cabe la posibilidad de poder discriminar en-tre muestras de semen de diferentes verra-cos, diferenciando entre “buenos” y “ma-los” congeladores, previa relación de losdatos obtenidos por el sensor químico con supotencial de congelabilidad (evaluación deparámetros de calidad espermática tras ladescongelación de las muestras).



Por todo esto, el objetivo de este estudiofue determinar la capacidad del “ChemSen-sor” como herramienta de discriminaciónprecoz del semen de cerdo Ibérico en funciónde su congelabilidad.

Material y métodos

Recolección de los eyaculados

Se recogió un eyaculado de 33 verracos Ibé-ricos sexualmente maduros procedentes dediferentes centros de inseminación. Los ve-rracos tenían edades comprendidas entre los2 y 3 años y estaban alojados en celdas indi-viduales en un ambiente controlado (15-25ºC) con exposición diaria a luz natural suple-mentada con luz artificial hasta las 16 horasde luz diarias. Los animales tuvieron acceso adlibitum al agua y fueron alimentados con unadieta comercial adecuada para los requeri-mientos nutricionales de un verraco adulto. Eleyaculado fue obtenido usando el método dela mano enguantada, diluyéndolo inmedia-tamente en BTS atemperado a 37 ºC (1:1(vol:vol)). Para el análisis con el “ChemSensor”se tomó una alícuota de 1 mL de semen sin di-luir, que fue congelado a -80 ºC después de laextracción. Esta congelación se realiza paraque los componentes del eyaculado no sevean modificados hasta el momento de suanálisis.

Después de su recolección, se evaluaron las ca-racterísticas de calidad del eyaculado me-diante técnicas habituales de laboratorio. Sólose seleccionaron para ser congelados aquelloseyaculados que tenían una concentración de≥ 200x106 espermatozoides/ml, ≥ 85% de es-permatozoides con morfología normal, ≥ 75%de espermatozoides móviles, ≥ 80% de es-permatozoides viables y ≤ 1,5% de esperma-tozoides con el ADN fragmentado.

Congelación y descongelaciónde las muestras

Los espermatozoides fueron criopreservadosusando el proceso de congelación descrito porWestendorf et al. (1975), y modificado porThurston et al. (2001) y Carvajal et al. (2004).

Las muestras de semen diluidas fueron enfriadasa 15 ºC durante 2 horas. Posteriormente fueroncentrifugadas a 2400g durante 3 minutos a 15ºC, para la eliminación del diluyente y delplasma seminal. El pellet de espermatozoidesobtenido fue de nuevo diluido en el dilu-yente de congelación FEY (Fructosa-yema dehuevo; Thilmant, 1997) hasta una concen-tración de 1,5 x 109 células/mL. A continua-ción se enfriaron las muestras hasta los 5 ºCen un tiempo de 120 minutos en un baño ter-mostático programable, diluyéndolas poste-riormente con el diluyente FEY, que esta vezincorporaba glicerol como crioprotector prin-cipal, en un porcentaje final del 3% (pH 6,2,and 1650 ± 15 mOsm/kg), hasta una concen-tración final de 1 x 109 células/mL. Las muestrasresuspendidas fueron envasadas en pajuelasde 0,5 mL (Minitüb, Tiefenbach, Alemania), yse congelaron posteriormente en un biocon-gelador programable usando una curva decongelación adecuada (Carvajal et al., 2004).Las pajuelas se mantuvieron en nitrógeno lí-quido al menos 2 semanas antes de ser des-congeladas. La descongelación de las pajue-las fue realizada en un baño termostáticode agua a una temperatura de 37 ºC durante20 segundos. Así, una vez descongeladas, lasmuestras fueron diluidas en Beltsville Tha-wing Solution (BTS; Johnson et al., 1988) (1:1(vol/vol), 37 ºC) e incubadas en el baño ter-mostático a 37 ºC durante 30 minutos, mo-mento en el cual se procedió a el análisis desu calidad.

Evaluación de la calidad espermática

Medida de la movilidad espermáticapost-descongelación

La movilidad espermática fue analizada ob-jetivamente usando un sistema computeri-zado de análisis del movimiento espermático(Sperm Class Analyzer® Microptic, Barcelona,España), siguiendo el procedimiento descritopor Cremades et al. (2005). Para cada evalua-ción, tres campos fueron analizados contandoun mínimo de 100 espermatozoides por cam -po. Se determinaron el porcentaje de esper-matozoides mótiles totales (% EMT), mótilesprogresivos (% EMP) y mótiles progresivosrápidos (% EMPR). Así como los siguientesparámetros de calidad del moviendo: veloci-dad curvilínea (VCL, μm/s), velocidad rectilínea(VSL, μm/s), velocidad media (VAP, μm/s), ín-dice de linealidad (LIN, %), índice de rectitud(STR, %), índice de oscilación (WOB, %), am-plitud de desplazamiento lateral de la cabezadel espermatozoide (ALH, μm) y la media dela frecuencia de batida (BCF, Hz). Sólo el por-centaje de espermatozoides móviles totales(% EMT) fue considerado para la clasifica-ción por congelabilidad.

Medida de la integridad de la membranaplasmática

La determinación de la integridad de la mem-brana espermática fue analizada usando unaprueba de doble tinción fluorescente conSYBR-14 y Ioduro de propidio (IP) (L-7011,Live/Dead Sperm Viability Kit; Molecular Pro-bes Europe, Leiden, Países Bajos), descrito porGarner y Johnson (1995). Las muestras fueronevaluadas mediante un microscopio de fluo-rescencia (Nikon Eclipse E400, Tokyo, Japón)equipado con un filtro Nikon G-2A (excita-ción/barrera de 510/590), que permite la exci-tación simultánea del azul y el verde para elSYBR-14 y el IP respectivamente. Un mínimode 300 espermatozoides por muestra fueron

analizados. Sólo el porcentaje de espermato-zoides con la membrana plasmática intacta (%EMPI) fue considerado en los resultados.

Determinación del grado de fragmentacióndel ADN espermático

La determinación del grado de fragmenta-ción se realizó, por microscopía de fluores-cencia, usando el kit comercial Sperm-Sus-HA-LOMAX® (ChromaCell, España). Las muestrasfueron procesadas de acuerdo a las indica-ciones del fabricante. Así brevemente, 25 μLde cada una de las muestras descongeladas(diluidas en BTS hasta los 10 x 106 esperma-tozoides/mL), fueron añadidas al vial comer-cial de agarosa. Alícuotas de 1,7 mL de lasmuestras con agarosa se pusieron en el por-taobjetos pre-tratados, se cubrieron y se en-friaron a 4ºC durante 10 minutos. Pasadoeste tiempo se retiraron los cubres y se su-mergieron las muestras en la solución de lisispor 5 minutos. Pasado este tiempo las mues-tras se lavaron con agua destilada, y se des-hidrataron de manera secuencial en baños deetanol (70, 90 y 100%). Una vez secas lasmuestras se tiñeron con el fluorocromo ad-junto con el kit. Un mínimo de 300 esperma-tozoides por muestras fueron contados. Elporcentaje de espermatozoides fragmenta-dos se calculó en base al tamaño del halo al-rededor de la cabeza del espermatozoide.

Análisis con el “ChemSensor”

Análisis de los compuestos volátilesdel semen

Para analizar los compuestos volátiles del se-men, se utilizó una alícuota de 1 mL de semencompleto, que se homogenizó y se colocó enel vial de análisis. Los análisis se realizaron enun “ChemSensor” (cromatógrafo de gases-masas CG 6890, Agilent Technologies, PaloAlto, CA, EE. UU., acoplado al espacio de cabe -za dinámico). Las muestras fueron inyectadasautomáticamente y retenidas en la trampa



del espacio de cabeza dinámico, utilizandotres ciclos de purga/trampa (TurboMatrix HS-40 con Air Monitoring Trap, PerkinElmer, Wal-tham, MA, EE.UU.). A continuación, las mues-tras fueron desorbidas térmicamente (280 °C)de la trampa y fueron inyectadas (200 °C) enel equipo a través de una columna capilar(HP-5MS: 30 m x 0,32 mm i.d., 0,25 μm film deespesor). El espectrómetro de masas (MS5973MSD) constaba de un detector de cua-drupolo operando en modo de impacto elec-trónico, con una energía de ionización de70 eV, y línea de transferencia de 110 ºC. Elescaneo de masas se realizó en el rango defragmentos iónicos m/z = 50–200 a.m.u./q.

Los diferentes volátiles obtenidos fueron plas-mados en un cromatograma, e identificadosusando la librería Wiley del propio equipo,considerando que el compuesto identificadoera aquél que poseía el mayor porcentaje deprobabilidad, descartándose los que tuvieranuna probabilidad inferior al 50%.

Análisis quimiométrico

Una vez analizados los compuestos volátiles delsemen se utilizaron los resultados de las dife-rentes fracciones másicas para ser analizadascon el sistema quimiométrico. El sistema de tra-tamiento de datos fue el integrado en el pro-grama informático. Los análisis multivariantesse realizaron sobre los datos normalizados,utilizando el software quimiométrico (Pi-rouette 3.11, Infometrix Inc). La clasificaciónpredictiva de las muestras, de acuerdo con lacongelabilidad de las muestras (2 grupos,buenos y malos congeladores), se realizó me-diante el método de reconocimiento de pa-trones (Soft Independent Modelling ClassAnalogy, SIMCA). En este método cada claseo grupo (en este caso grupos de congelabili-dad) se modela usando un análisis de com-

ponentes principales de forma indepen-diente, de tal manera que cada gru po tieneun modelo específico, que lo describe el nú-mero óptimo de componentes principales (eneste caso estos componentes serían las frac-ciones másicas). De esta manera se puedeconstruir un espacio para cada grupo, cuyovolumen marca el límite entre las muestraspertenecientes a cada uno los grupos de es-tudio y las muestras que no pertenecen a nin-guno, para un nivel de confianza de 95%.

Los resultados obtenidos con este modelo seexpresan de dos maneras. La primera me-diante la clasificación predicha o esperada delas muestras, o lo que es lo mismo el modelonos indica el número de muestras que hapodido clasificar dentro de cada grupo o enninguno de ellos, describiéndonos el númerode muestras bien clasificadas o el número defalsos positivos (animales que congelan mal,clasificados como buenos congeladores) y elnúmero de falsos negativos (animales buenoscongeladores clasificados como malos con-geladores). El segundo por las distancias or-togonales de las muestras del conjunto res-pecto a las de las dos clases o grupos decongelabilidad definidos por el modelo. Deforma visual estas distancias de separaciónentre los grupos se representan medianteun diagrama de Coomans (Coomans et al.,1984) (Figura 1), donde observamos la buenao mala clasificación de las muestras obser-vando su posición respecto a los grupos,siendo el eje X para los malos congeladores,y el eje Y para los buenos congeladores. Asícuanto más próximos al cuadrante superiorizquierda (o dentro de este) estén los maloscongeladores, y más próximos al cuadranteinferior derecho (o dentro de este) estén losbuenos congeladores, mayor serán las dis-tancias ortogonales entre los grupos y portanto la validez de nuestro modelo.


Análisis de la sensibilidad y especificidaddel modelo

El análisis de la sensibilidad y especificidad, esusado para determinar la validez de un mo-delo frente a la presencia de falsos positivosy falsos negativos en los modelos de diag-nostico de enfermedades. Para nuestro casoconsideraremos que ser buen congelador espositivo y ser mal congelador es negativo. Asíla sensibilidad nos indicará la capacidad denuestro modelo para determinar que un ve-

rraco es un buen congelador cuando real-mente lo es, y la especificidad nos indica lacapacidad de nuestro modelo para determi-nar que un macho congelará mal cuando re-almente es un mal congelador. Así una altasensibilidad nos indicará que nuestro mo-delo es capaz de determinar correctamentelos buenos congeladores, y una alta especifi-cidad nos indicará la capacidad de nuestromodelo para determinar correctamente siun verraco es mal congelador.

Figura 1. Diagrama de Coomans. Representación visual de las distancias de separaciónentre los grupos de congelabilidad (buenos (azul) y malos (rojo) congeladores).

Las coordenadas de la gráfica son los valores predictivos de los grupos de congelabilidad(buenos y malos congeladores) en función del modelo de componentes principales de cada uno

de los grupos (X para los buenos congeladores; e Y para los malos congeladores).Las líneas de color rojo muestran 4 cuadrantes, y son la representación de las distancias

críticas que se corresponden con el intervalo de confianza del 95%

Figure 1. Coomans diagram, visual representation of the separation distancesbetween freezability groups (good (blue) and bad (red) freezers).

Análisis estadístico

Para la clasificación de los diferentes eyacula-dos en función de su congelabilidad, se realizóun análisis de clasificación por clusters o gru-pos con el programa estadístico Statgraphics(Versión 15.2.12., StatPoint Technologies, Inc.Warrenton, Virginia, EE. UU.), usando comocriterio de clasificación la media del grupo,donde la distancia entre dos clústers fue ladistancia media de las observaciones de unclúster a la del otro. Y la distancia métrica en-tre clústers usada fue la euclidiana al cua-drado, que es la suma de los cuadrados de lasdiferencias de los valores de las observacio-nes en los grupos. Como variables de discri-minación se usaron tan solo el número de es-permatozoides vivos totales y el porcentajede espermatozoides móviles totales a los 30minutos post-descongelación, debido a quela inclusión de más parámetros afectaba alsistema estadístico de clasificación, diminu-yendo notablemente el R-cuadrado de nues-tro modelo, y por tanto la validez del mismo.Además de forma general ya esta establecidopor otros autores que el uso de estas dos va-riables es suficiente para una adecuada cla-sificación de los eyaculados para su congela-bilidad (Roca et al., 2006; Barranco et al.,2013). Las diferencias entre las medias de losgrupos fueron contrastadas con el paqueteestadístico SAS (Versión 9.0, SAS InstituteInc., Cary, NC, EE. UU.) mediante un análisisGLM, para determinar si dichas diferenciasentre grupos eran significativas (P<0,05). Losresultados se expresan como medias con surespectivo Error Estándar de la Media (EEM).Fueron consideradas las diferencias signifi-cativas a P<0,05.

La clasificación realizada con el sensor quími -co se hizo mediante el programa informá ticoPirouette (Versión 3.10., Infometrics, INC, EE.UU.) usando el sistema de análisis quimio-métrico SIMCA (Soft Independent ModellingClass Analogy), como se ha descrito anterior -

mente. Y el análisis de la sensibilidad y espe-cificidad se realizo mediante el programa Ex-cel (Microsoft® Office Excel 2003).

Resultados

La clasificación de los diferentes eyaculadosen función de su congelabilidad, según el %EMPI y el % EMT se muestra en la Tabla 1. Enestos resultados se puede observar que 20 delos 33 eyaculados son considerados como per-tenecientes a machos buenos congeladores, y13 de los 33 a machos malos congeladores.Una vez fueron clasificadas las muestras deacuerdo a su congelabilidad, se relacionaroncon los resultados obtenidos de análisis de loscompuestos volátiles.

Resultados del análisis de los volátilesdel semen

No se encontraron diferencias significativasen el porcentaje de los diferentes volátilesdetectados e identificados entre los gruposde congelación (P > 0,05) (Tabla 2). El com-puesto volátil mayoritario fue el hexano, conun porcentaje de área respecto del total deáreas del 93%. Compuestos como octametil-ciclotetrasiloxano, decametil ciclopentasilo-xano, dodecametil ciclohexasiloxano y tetra-decametil ciclopentasiloxano se identificaroncomo residuos de la propia columna croma-tográfica con un porcentaje medio de 2-3%.El resto de componentes estuvieron presen-tes en una proporción menor de 0,5%.

Resultados del análisis quimiométrico

En la Tabla 3 se puede observar como en fun -ción de la clasificación por congelabilidad, elmodelo nos da una clasificación predicha oesperada de las diferentes muestras analiza-das. Así puede observarse que los animales



Tabla 1. Valores medios de la calidad espermática pre-congelación ypost-descongelación de los distintos grupos de congelabilidad

Table 1. Mean values of pre-freeze and post-thaw sperm quality ofthe different freezability groups

Variables Buenos congeladores Malos congeladores EEM1

Pre-Congelación

EMPI2 (%) 80,9 84,2 2,75

EAF3 (%) 0,82 0,99 1,2

EMT4 (%) 78,75 81 2,4

Post-Descongelación

EMPI2 (%) 57,8a 42,1b 1,32

EAF3 (%) 1,1 1,3 0,95

EMT4 (%) 50,3a 28,5b 1,42

EMP5 (%) 41,3a 24,8b 1,4

EMPR6 (%) 39,6a 22,8b 1,5

VCL7 (μm/s) 106,9 97,6 3,4

VSL8 (μm/s) 75,4 72,7 3,06

VAP9 (μm/s) 93,3 85,2 3

LIN10 (%) 70,7 74,4 2,02

STR11 (%) 80,9 85,1 1,93

WOB12 (%) 87,2 87,4 1,09

ALH13 (μm) 2,91 2,59 0,12

BCF14 (Hz) 7,68 7,87 0,15

N15 20 13

1 Error estándar de la media; 2 porcentaje de espermatozoides con la membrana plasmática intacta; 3 por-centaje de espermatozoides con el ADN fragmentado; 4 porcentaje de espermatozoides móviles tota-les; 5 porcentaje de espermatozoides mótiles progresivos; 6 porcentaje de espermatozoides mótiles pro-gresivos rápidos; 7 velocidad curvilínea, 8 velocidad rectilínea, 9 velocidad media; 10 índice de linealidad;11 índice de rectitud; 12 índice de oscilación; 13 amplitud de desplazamiento lateral de la cabeza del es-permatozoide; 14 media de la frecuencia de batida; 15 Número de machos incluidos en cada grupo.

Letras diferentes en la misma variable indican diferencias significativas (P< 0,05).


clasificados como buenos congeladores sondiscriminados de los malos congeladores. Encambio, en el grupo de los malos congela-dores aparece un animal clasificado comobueno, creando así un falso positivo. No seobservaron falsos negativos, ni hubo mues-tras que no pudieran ser clasificadas.

La distancia ortogonal de las muestras del con -junto respecto a la de los dos grupos de con-

gelabilidad definidos por el modelo fue de2,62 (Tabla 3). Al observar dichas distancias,puede determinarse que éstas son relativa-mente bajas, ya que para que se consideren di-ferentes significativamente, la distancia de-bería ser de al menos 3. Pero a pesar de ello,el modelo muestra un óptimo poder clasifica-torio, como puede observarse en el diagramade Coomans (Figura 1), donde se representan

Tabla 2. Porcentaje del área respecto del total de áreas de los distintoscompuestos volátiles identificados en la muestras de semen

Table 2. Percentage of area with respect to total area from the individualvolatile compounds identified in the semen samples

Compuesto Volátil Buenos congeladores Malos congeladores EEM1

(n = 20) (n = 13)

Hexano 92,45 92,56 0,81

Hexanol 0,2 0,09 0,071

Benzaldehído 0,43 0,43 0,003

Octametil Ciclotetrasiloxano 1,55 1,53 0,109

Nonanal 0,98 1,18 0,36

Decametil Ciclopentasiloxano 1,3 1,27 0,103

Dodecametil Ciclohexasiloxano 1,64 1,57 0,135

Trimetoxi-silano de Propilo 0,22 0,18 0,035

Tetradecametil Ciclopentasiloxano 1,01 1 0,082

1 Error estándar de la media.

Tabla 3. Clasificación predicha o esperada de las diferentes muestras analizadas en funciónde su congelabilidad y distancia ortogonal entre los dos grupos de congelabilidad

Table 3. Predicted or expected classification from the various samples analyzed accordingto their freezability and orthogonal distance between the two groups of freezability

Malos Buenos No Distancia entre lospredichos predichos clasificados grupos de congelabilidad

Malos congeladores 12 1 0 2,62

Buenos congeladores 0 20 0

cada una de las muestras analizadas en fun-ción de si son malos congeladores (eje X) obuenos congeladores (eje Y), observándoselos malos congeladores de color rojo cerca delcuadrante superior izquierdo, separados de losbuenos congeladores de color azul, cerca delcuadrante inferior derecho.

Resultados del análisis de sensibilidady especificidad

Los resultados predichos o estimados denuestro modelo determinaron que hubo unfalso positivo, es decir, un macho mal conge-lador que se clasificó como buen congelador.Para determinar, la validez del modelo secalculó la sensibilidad y especificidad delmismo. Así la sensibilidad es la división entreel número de animales buenos congeladoresreales entre la resta del número de animalesbuenos congeladores reales más los falsosnegativo. Por tanto el valor de la sensibilidadfue de 1 al no existir falsos negativos. Y la es-pecificidad es el número de malos congela-dores reales, divididos entre el número demalos congeladores reales más los falsos po-sitivos (hubo uno), siendo el valor de 0,93. Asíestos resultados muestran que nuestro mo-delo tiene una elevada sensibilidad y unaalta especificidad lo cual nos constata la ro-bustez de nuestro modelo en la predicción dela congelabilidad.

Discusión

Muchos investigadores han centrado sus es-tudios en determinar las diferencias entreun eyaculado de un macho buen congelador,y un eyaculado de un macho mal congelador(Thurston et al., 2002; Maldjian et al., 2005;Harshan et al., 2006; Esteso et al., 2006; Her-nández et al., 2006; Casas et al., 2010a). Peropocos han buscado un método que permitauna discriminación precoz de los eyaculados

en función de su futura congelabilidad (Pe-trunkina et al., 2004; Gil et al., 2005; Casas etal., 2009 y 2010b). La posibilidad de obtenerun modelo capaz de determinar la congela-bilidad de un eyaculado sin tener que con-gelarlo, descongelarlo y valorarlo, sería ungran avance para la utilización del semencongelado en la inseminación artificial por-cina, ya que permitiría determinar qué ani-males son los más adecuados para congelarsus espermatozoides y garantizar una ma-yor calidad a la descongelación, pudiendoasí rentabilizar los machos de alto interésgenético y crear óptimos bancos de esper-matozoides congelados.

El estudio de los componentes volátiles usandouna “pseudo-nariz electrónica” o “Chem-Sensor” es una técnica habitual en la inves-tigación de la calidad de los alimentos y laclasificación de muestras (Olsson et al., 2000;Radovic et al., 2001; Ansorena et al., 2001;Landaud et al., 2008; Rodríguez-Bencomo etal., 2009). El ChemSensor permite determinarqué compuestos aromáticos tiene una mues-tra biológica (Radovic et al., 2001; Ansorenaet al., 2001; Landaud et al., 2008) y, usandoesos compuestos, clasificar diferentes tipos demuestras independientemente de su origenen aspectos muy diferentes, como puede serel estado de curación de ciertos alimentos(Ruiz et al., 1999; Martín et al., 2009), la ca-lidad organoléptica (Rodríguez-Bencomo etal., 2009) o discriminar muestras contamina-das de otras que no lo están (Olsson et al.,2000), constituyendo el uso de esta herra-mienta una técnica de discriminación y clasi-ficación muy eficaz. Así la clara capacidadde discriminación que poseen equipos comoel “ChemSensor” usando como matriz mues-tras biológicas tan diferentes, nos hizo pen-sar que el estudio de los componentes volá-tiles del semen podría servir como un métodopara determinar de una forma rápida y pre-cisa, si una muestra de semen sería apta o nopara su criopreservación, tratando de corre-lacionar la proporción de alguno de estosvolátiles con la congelabilidad del macho.


Los resultados obtenidos muestran que loscomponentes volátiles detectados en semende porcino son muy escasos, en comparacióncon los obtenidos en análisis de otras mues-tras biológicas (Ansorena et al., 2001; Rado-vic et al., 2001; Martín et al., 2009; Rodríguez-Bencomo et al., 2009), determinándose quelos componentes volátiles detectados noaportan la información necesaria para poderusarlos como una herramienta de clasifica-ción en sí misma de la futura congelabilidadde los eyaculados. Sin embargo el estudiode la clasificación de los eyaculados por sucongelabilidad no termina con los resultadosde los cromatogramas obtenidos de las mues-tras, sino que el “ChemSensor” utiliza el es-pectro total de masas obtenido en estos aná-lisis, representando cada fracción másicaresultante de la separación por cromatogra-fía. Así cada fracción másica puede ser consi-derada como un potencial descriptor químicode una muestra y el conjunto de fraccionesmásicas es sujeto a un análisis multivariante(SIMCA) para, de esta manera, obtener in-formación cuantitativa o cualitativa quepueda predecir la calidad de una muestra(Laguerre et al., 2007). En este estudio se uti-lizó el espectro total de fracciones másicas ob-tenidas de cada perfil de compuestos voláti-les de las muestras de semen analizadas,clasificándolas previamente por grupos decongelabilidad, para tratar de realizar un aná-lisis discriminatorio de cada una de las mues-tras usando el método SIMCA. Los resultadosobtenidos permitieron el uso de hasta 500fracciones másicas como variables de discri-minación de las muestras, entre los diferentesgrupos (buenos y malos congeladores).

El modelo que se obtiene con este estudionos muestra que es capaz de discriminar loseyaculados de los buenos de los malos con-geladores, determinándose que los animalesclasificados como buenos congeladores nun -ca se clasifican como malos, es decir que noexisten falsos positivos. Teniendo en cuenta

los resultados observados de sensibilidad yespecificidad, al ser estos valores muy eleva-dos (la sensibilidad del modelo es de 1, y laespecificidad de 0,93), este modelo nos indicaque la probabilidad de que haya falsos posi-tivos es muy baja y menor aun de que existanfalsos negativos.

Al observar los resultados de las distancias or-togonales entre grupos los congelabilidad, sinos fijamos en el diagrama de Coomans (Fi-gura 1) el modelo muestra bien separados losbuenos de los malos congeladores, pero nocon una discriminación perfecta, que seríacuando los malos congeladores estuvierantodos enmarcados en el cuadrante superiorizquierdo, y los buenos congeladores en elcuadrante inferior derecho. Para que las dis-tancias entre grupos sean significativas suvalor debe ser mayor de 3 (Busto et al., 2002),pero nuestro estudio marca dichas distan-cias en un valor de 2,62. Este valor podría serinsuficiente para algunos autores, pero au-tores como Laguerre et al. (2007) determinanque distancias de separación entre grupospor encima de 2 se pueden considerar signi-ficativas si el número de muestras del que separte es bajo. Por tanto, en nuestro caso, sepuede considerar que la distancia inter-claseobtenida con este modelo sería significativa,ya que se trata de un estudio preliminar,donde se han utilizado 33 muestras de semende cerdo Ibérico, siendo este valor bajo parapoder crear un modelo matemático estable,pero suficientes para un estudio preliminarque buscaba determinar si este tipo de aná-lisis servirían para poder discriminar muestrasde semen por su grado de congelabilidad.

La capacidad de discriminación que ha mos-trado este modelo usando semen completonos indica la existencia de diferencias en lacomposición del semen de buenos y maloscongeladores. Pero se desconoce cuales sondichas diferencias. El “ChemSensor” aportainformación de discriminación con el uso demúltiples variables, las cuales en este caso son



fracciones másicas obtenidas del análisis delos compuestos volátiles del semen. Sin em-bargo es difícil la identificación individualde los componentes químicos responsablesde cualquiera de las diferencias observadas(Berlioz et al., 2006), y por tanto determinara qué compuestos o componentes corres-ponden estas fracciones es una labor com-plicada, más todavía a falta de algún trabajoreferencial que analice la composición defracciones másicas del semen.

Las diferencias entre los eyaculados de ma-chos buenos y malos congeladores en lo quese refiere a su composición han sido estudia-das por múltiples autores. Algunos autoresatribuyen que la mayor o menor resistenciaa la congelabilidad viene determinada por lacomposición lipídica de la membrana del es-permatozoide. Así la presencia de ácidos gra-sos poliinsaturados confiere una gran fluideza la membrana la cual podría dar una mejorresistencia al daño surgido por la formaciónde cristales de hielo durante la congelación(Maldjian et al., 2005; Waterhouse et al.,2006). O variaciones en la proporción de al-gunos ácidos grasos también se relacionancon la criotolerancia en el semen (Miller etal., 2005). Mientras que otros autores mues-tran resultados de que es la composición pro-teica de la membrana la responsable de estacongelabilidad (Casas et al., 2009 y 2010b).

Otro grupo de autores sin embargo, afirmanque la mayor o menor resistencia a la con-gelación viene determinada por la composi-ción del plasma seminal, ya sea por la pre-sencia de lípidos en el plasma seminal enforma de gránulos y vesículas membranosas(Piehl et al., 2006) denominadas como pros-tasomas, que contienen gran cantidad de co-lesterol y esfingomielina, y que podrían estarenvueltas en la estabilización de la mem-brana espermática y por tanto jugar un papelimportante en la respuesta a la crioconser-

vación espermática (He et al., 2001). O de-bido a la composición en proteínas del mismo(Hernández et al., 2007; Singh et al., 2014).

En cualquier caso parece no existir un únicofactor que determine la congelabilidad deuna muestra (Hernández et al., 2007), sinoque puede ser un conjunto de factores losque determinen la futura resistencia de uneyaculado a su congelación; factores entrelos que se podría incluir tanto la composi-ción del plasma seminal como la composi-ción de la membrana del espermatozoide.Así nuestro modelo predictivo, aunque pre-liminar, se muestra como un modelo eficaz,ya que incluye tanto los espermatozoidescomo el plasma seminal, y por tanto en-globa los factores que se han determinadocomo posibles responsables de la criotole-rancia de semen. Cuales de estos factoresson los que engloban el modelo es muy di-fícil de discernir, y menos sin otros trabajosque estudien aspectos similares. Por tanto sedebería determinar con más exactitud loscomponentes volátiles del semen y de dondeproceden, ya que muchos de estos com-puestos son producidos a partir ácidos gra-sos (Frankel, 1972; Forss, 1972), o pueden es-tar asociados a proteínas (Pérez, 2006), ypor tanto se podrán llegar a relacionar conlos resultados de congelabilidad encontra-dos por otros autores.

Por todo esto se puede concluir que el“ChemSensor” se muestra como una posibleherramienta adecuada para la discrimina-ción precoz entre buenos y malos congela-dores. El uso de este equipo para este tipo demuestras biológicas es del todo novedoso, yno ha sido descrito nunca en el semen deporcino, pero se trata de un trabajo prelimi-nar y sería necesario aumentar el númerode muestras analizadas para poder obtenerun modelo más eficaz, con mayores distan-cias de discriminación y sin falsos positivos.

Agradecimientos

Queremos dedicar este trabajo al Dr. AtanasioCarrasco Manzano que dedicó gran parte desu vida profesional a la mejora de las técnicasdiscriminantes mediante el “ChemSensor” endiferentes matrices. Desgraciadamente no hapodido ver finalizada esta publicación, falle-ciendo un mes antes de haberla concluido.Sirvan estas líneas de recuerdo y homenaje auna extraordinaria persona y ejemplo para laprofesión investigadora.

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(Aceptado para publicación el 10 de julio de 2014)

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