USO DE TCNICAS CROMATOGRFICAS PARA LA PURIFICACIN DE PROTENAS.Snchez-Campos, A1.1Ingeniera Bioqumica, Escuela de Biologa. Instituto Tecnolgico de Costa Rica.

Cromatografa se define como el mtodo de anlisis qumico para la separacin de los componentes de una mezcla por distribucin entre dos fases, una estacionaria y otra mvil (Real Academia Espaola, 2001).Los procesos de separacin de protenas estn dominados principalmente por la cromatografa de lquidos. La resolucin de mezclas proteicas por esta tcnica se basa en el principio de que bajo un conjunto dado de condiciones, los solutos disueltos en una fase mvil interactan en grado diferente con la fase estacionaria contenida en la columna. El tipo de interaccin depende de las propiedades fsicas y qumicas de la fase estacionaria. De esta manera, la Cromatografa de lquidos explota las diferencias inherentes entre las protenas (tamao, hidrofobicidad, especificidad de unin y de carga) con el fin de lograr su separacin (Cummins et al, 2011).Es importante tener claro que un buen proceso de separacin debe asegurar la estabilidad y la pureza deseada del producto as como optimizar el rendimiento, ser reproducible, escalable, cumplir con las regulaciones establecidas y brindar un producto seguro. El grado de pureza necesario va a depender del uso que se va a dar a la protena; por ejemplo, para usos en investigacin, la escala es reducida y es ms importante la pureza que el rendimiento. Para usos teraputicos la escala es mayor y la pureza requerida es mxima. En cambio, para usos industriales, usualmente se requerir que el costo sea bajo gran cantidad del producto y probablemente una pureza menor. Ahora bien, si el inters est en la protena y no importa el organismo de origen, conviene buscar una fuente fcil de obtener, barata, que contenga esa protena en abundancia. As las cosas, una vez identificadas las caractersticas deseadas y la protena que se desea purificar se puede valorar el proceso ms adecuado.

Una de las opciones ms usadas es la Cromatografa de Afinidad (AFC), esta tcnica ofrece gran especificidad y selectividad para el aislamiento y purificacin de biomolculas.Se basa en interacciones bioespecficas gracias a las cuales la columna absorbe nicamente los componentes que presentan afinidad con los ligandos acoplados al soporte cromatogrfico. Cuando el compuesto retenido es eluido, se consiguen altos niveles de pureza, gracias a la elevada selectividad de estas interacciones de afinidad. La cromatografa de afinidad es una tcnica usada en el aislamiento de anticuerpos o antgenos puros. El principio es simple y su aplicacin, muy amplia. Numerosos estudios reportan que para purificacin de anticuerpos especficos la tcnica de AFC es recomendada, por ejemplo Trejos y Castao (2011) reportan buenos resultados en su estudio para la purificacin de anticuerpos monoclonales de ratn contra proteasa de cistena 5 recombinante de Entamoeba histolyticaa partir de fluido asctico y del sobrenadante utilizando esta tcnica. De igual forma, Merln et al (2001) reportan que los anticuerpos especficos aislados en su estudio por cromatografa de afinidad a partir de los antisueros policlonales permiten elevar considerablemente la especificidad y la sensibilidad de los mtodos en los que se utilizan, tambin cita que los resultados obtenidos con estos anticuerpos especficos son extraordinariamente superiores a los que se obtienen con el antisuero sin fraccionar.Otra metodologa muy empleada en la purificacin de protenas y otras molculas que presenten carga elctrica es la Cromatografa de Intercambio Inico.Las claves del poder de esta tcnica se hallan en su elevada capacidad, gran poder de resolucin y a su facilidad de escalado desde el nivel analtico al preparativo. En aplicaciones a mayor escala normalmente se utiliza el intercambio inico para purificar por ejemplo algn tipo de inmunoglobulina, en cambio en investigacin y en produccin a pequea escala se utiliza ms la purificacin por afinidad.El mecanismo operativo de la Cromatografa de Intercambio Inico se basa en el ligado reversible de las molculas cargadas sobre la superficie del soporte cromatogrfico.La fuerza con la que se produce este ligado est gobernada por la fuerza de la carga del sustrato, el pKa de la matriz de intercambio inico y por las propiedades del eluyente acuoso: pH y fuerza inica.Esta tcnica se puede resumir en cuatro etapas: 1. Equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas, 2. Aplicacin y lavado; 3. Elusin y 4. Regeneracin; este ltimo punto especialmente es importante y caracterstico por cuanto se remueven las partculas que an estn asociadas al intercambiador. Los iones que se adhieren a los sitios activos de la resina son de diferentes tipos y pueden ser removidos total o parcialmente durante el proceso de regeneracin. Una vez agotadas las resinas, se pueden regenerar a su forma inicial para reanudar la operacin de intercambio. As, el intercambio inico es un proceso cclico y no continuo. Algunos regenerantes son el cloruro de sodio, cloruro de amonio, amoniaco, cido clorhdrico, carbonato de sodio entre otros.Tambin es muy usada la cromatografa de exclusin por tamao, mediante esta tcnica, la separacin de biomolculas se da de acuerdo a su tamao cuando una solucin fluye a travs de una cama empacada con un medio poroso (Kostanski et al, 2004). Por lo general, se aplica a las grandes molculas o complejos macromoleculares, tales como protenas y polmeros industriales.Este proceso de separacin depender del tamao y del volumen hidrodinmico (volumen que ocupa una molcula en solucin), el cual define la capacidad de la molcula de penetrar o no en los poros de la fase estacionaria. De tal forma que, las molculas de alto peso molecular son excluidas de los poros debido a un efecto estrico y pasan rpidamente a travs de la matriz. En el caso de biomolculas pequeas, estas tienen diferente accesibilidad en las cavidades de la matriz porosa (Mayolo-Deloisa, et al, 2012). Como pudo verse, resultan evidentes las ventajas de las tcnicas cromatogrficas en la purificacin de protenas. Sin embargo, es importante considerar que la versatilidad de las tcnicas cromatogrficas genera un sin nmero de condiciones experimentales, que pueden depender de las caractersticas de cada protena.

Referencias Cummins, P, Dowling, O. y O'Connor, B. 2011.Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application to the Partial Purification of Soluble Mammalian Prolyl Oligopeptidase Protein Chromatography. In: Walls D, Loughran ST, editors: Humana Press. p 215-228. Kostanski, L, Keller, D y Hamielec, A. 2004. Size exclusin chromatography, a review of calibration methodologies.Journal of Biochemical and Biophysical Methods58, 159-186. Mayolo-Deloisa, K.; Martnez, L.; Rito-Palomares, M. 2012. Tcnicas cromatogrficas y su aplicacin a estudios de cambios conformacionales, estabilidad y replegamiento de protenas. Revista Mexicana de Ingeniera Qumica, vol. 11, nm. 3, pp. 415-429 Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Distrito Federal, Mxico. Merln, J; Villaescusa, R, Guerreiro, A; Gonzlez, J y Arce, A. 2001. Preparacin de un conjugado peroxidasa-anti IgG humana (cadena) en conejo. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(2):132-7. La Habana, Cuba. Real Academia Espaola. 2001.Diccionario de la lengua espaola(22.aed.). Madrid, Espaa. Trejos, J; Castao, J. 2011. Obtencin de anticuerpos monoclonales de ratn contra proteasa de cistena 5 recombinante de Entamoeba histolytica. Rev.MVZ Crdoba 17(2):3014-3023, 2012. Armenia, Colombia.