universidad pablo de olavide - inst. de la grasaÁrea de nutriciÓn y bromatologÍa microbiología y...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR E INGENIERÍA BIOQUÍMICA ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA
Microbiología y Biotecnología de Levaduras
Eva Valero Blanco [email protected]
Aislamiento y caracterización de levaduras de flor de vinos finos
Proyecto RM2010-00009-C03-02
Microbiología
Mejora y ampliación de una colección de levaduras de interés biotecnológico con levaduras de sustratos específicos
MCINN-INIA. Recursos Microbianos (RM2010-00009-C03-00) IP (Coordinador IMIDRA): Teresa Arroyo Casado IP (Subproyecto UPO): Eva Mª Valero Blanco IP (Subproyecto US): Patricia Paneque Macias
Proyecto RM2010-00009-C03-02
Se han identificado los 1656 aislados.
Saccharomyces SSR (Vaudano y García-Moruno, 2008) ADN mitocondrial (RFLP ADN mit), HinfIII, RsaI (López et al. ,2001)
Se han obtenido un total de 22 patrones diferentes.
Patrón Patrón por polimorfismo de
microsatélites
Patrón por RFLP ADN
mitocondrial
A g 7
B e 4
C f 2
D f 6
E f 1
F g 4
G d 4
H a 5
I i 5
J h 5
K b 4
L j 5
M m 5
N l 5
O k 1
P c 1
Q m 1
R f 3
S g 2
T d 5
U g 5
V h 6
a b c a d e d 1 2 2 3 4 5 6
Mitocondriales a b c a d e d
Microsatélites 1 2 2 3 4 5 6
Cepas A B C D E F G
Microbiología
Caracterización fisiológica y metabólica de vinos finos envejecidos con cultivos puros de las levaduras de velo seleccionadas
0
0,5
1
1,5
2
0 20 40 60 80D
.O
Horas
A
B
C
D
E
F
G
L
curva de crecimiento
Velocidad de formación de velo en función de concentraciones de etanol (14, 14,5 y 15 % v/v) y Tª (20, 22,5 y 25 ºC)
Gen Flo11 y región deleción de 111pb en su promotor
Microbiología
Caracterización aromática: ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN VOLÁTIL
Microbiología
Impacto de levaduras comerciales en el viñedo
Diseminación de levaduras enológicas en el viñedo
¿Impacto sobre la microbiota? ¿Pueden sobrevivir en el viñedo? ¿Pueden influenciar fermentaciones del año siguiente?
Bodega - LSA
viñedo Puntos de muestreo 20–1000 m
Viento dominante
Sitios que utilizan LSA
mas de 5 años
Antes LSA remanencia
Después LSA diseminación inmediata
3 vendimias consecutivas
Microbiología
K1M (Lallemand) 1 x 106 cels/mL 1L/planta
Diseminación de levaduras enológicas en el viñedo
3 vendimias consecutivas Experimental vineyard (Madrid) Grapes High pressures dominant wind NE-SW
40° 31' N, -3° 17' W, 610 m altitude Leaves Low pressures dominant wind SW-NE
Soil
Wood
Grapes
Leaves
Soil
Wood
Grapes
Leaves
Soil
Wood
Grapes Grapes Grapes Grapes Grapes
Leaves Leaves Leaves Leaves Leaves
Soil Soil Soil Soil Soil
Wood Wood Wood Wood Wood
Grapes
Leaves
Soil
Wood
Grapes
Leaves
Soil
Wood
Grapes
Leaves
Soil
Wood
Sp
raye
d A
rea
100 m
50 m
25 m
50 m 100 m100 m 50 m 0
m
25 m
100 m
50 m
Sp
raye
d A
rea
Sampled at 24 and 36 months
Sam
ple
d a
t 2
4 a
nd
36
m
on
ths
Sampled at 24 and 36 months
Samp
led at 2
4 an
d 3
6
mo
nth
s
Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo
Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA)
CONSEJERÍA DE ECONOMÍA E
INNOVACIÓN TECNOLÓGICA
Comunidad de Madrid
Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo
Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA)
CONSEJERÍA DE ECONOMÍA E
INNOVACIÓN TECNOLÓGICA
Comunidad de Madrid
Impacto de levaduras comerciales en el viñedo
Microbiología
cave
100 400 600 800 1000
No
mb
re d
e so
uch
es
Distance de la cave (m)
50
100
150
200
250
300
231
18 11 7
10-50
29
200
94% a menos de 200 m 78% a menos de 50 m
Impacto de levaduras comerciales en el viñedo
Diseminación de levaduras enológicas en el viñedo
Microbiología
0
50
100
150
200
250
Nº
iso
late
s f
o K
1M
cfu
mL
-1Contr
ol
Time
0
1 W
eek
1 M
onth
3 M
onths
6 M
onths
8 M
onths
12 M
onths
18 M
onths
24 M
onths
36 M
onths
Time
Soil
Wood
Leaves
Grapes
Efecto de parámetros agronómicos en la biodiversidad de levaduras del viñedo
ESTUDIOS DE BIODIVERSIDAD
EDAD VID
MADUREZ UVA
CLIMATOLOGÍA TIPO DE SUELO
INFLUENCIA FITOSANITARIOS
OTROS FACTORES
? FACTORES INTRÍNSECOS DEL VIÑEDO
- VARIEDAD DE LA VID
- MANEJO DEL SUELO
- FUNGICIDAS UTILIZADOS
- SISTEMA DE DEFENSA BIOLÓGICA
3 años
Microbiología
¿Cuál alberga mayor biodiversidad?
C.T.T.V. “El Socorro” Es la primera vez que índices clásicos de ecología: riqueza (S), biodiversidad (H’) y dominancia (D) de especies han sido aplicados para estudiar la ecología de fermentaciones espontáneas de mosto de uva
Los tratamientos fitosanitarios afectan negativamente a la biodiversidad de
levaduras asociada a la uva, principalmente de especies fermentativas
El mejor sistema de manejo del suelo para una mayor presencia de
levaduras fermentativas es el suelo desnudo (laboreo o herbicidas)
La variedad Barbera es la mejor en términos de abundancia y diversidad de
especies fermentativas
La aplicación de fungicidas en 4 estadíos fenológicos de la vid tiene un
efecto perjudicial sobre la biodiversidad de levaduras, siendo más negativo
el penconazol. La mejor recomendación sería la aplicación de azufre en dos
etapas de crecimiento de la vid (floración y baya tamaño guisante)
Efecto de parámetros agronómicos en la biodiversidad de levaduras del viñedo
Microbiología
Identificación de genes implicados en la adaptación de S. cerevisiae a factores de estrés relacionados con la fermentación alcohólica por
distintas aproximaciones a escala genómica
Proyecto Motriz P10-AGR6544
Biotecnología
Estrés por etanol, estrés osmotico o por baja Tª, estudiados por transcriptómica
Estrategia HIP-HOP
Aproximación complementaria. Evolución dirigida
Algunas limitaciones de la transcriptómica
Sólo permite identificar genes cuyo nivel de expresión cambia en respuesta a los factores en estudio
Genes importantes para procesos biológicos, no están sujetos a regulación transcripcional en respuesta a las condiciones ambientales (Birrell et al 2002) No todos los genes sujetos a regulación transcripcional por las condiciones de cultivo, son necesarios para la supervivencia en esas condiciones (Tai et al. 2007)
Biotecnología
COLECCIONES de Mutantes de Deleción HaploInsuficiency Profiling/HOmozygous Profiling (HIP/HOP)
Reemplazamiento de cada ORF por el cassette KanMX4 y dos códigos de barras (UPTAG y DOWNTAG) específicos para cada gen.
Biotecnología
ANÁLISIS BAR-Seq
Biotecnología
CULTIVOS CONTINUOS
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0:00:00 4:48:00 9:36:00 14:24:00 19:12:00 24:00:00 28:48:00 33:36:00 38:24:00 43:12:00
VC
T [
mM
]
CT
R [
mM
/h]
Inoculation Time
Continuo EC1118 CENIT 24%
CTR3
VCT3
Permiten mantener durante varias generaciones seguidas las condiciones de la competición sin variaciones en fase de cultivo, disponibilidad de nutrientes, etc…
Algunas consideraciones acerca del análisis HIP/HOP en fermentaciones vínicas
• Experimentan cambios enormes con cambios en las condiciones ambientales • Bajo Nº generaciones en condiciones similares
Biotecnología
COMPETICIONES bajo presión selectiva en cultivo continuo
Cultivo continuo control y bajo presión selectiva con sorbitol (0,6 M) o glucosa (20%) durante 10 generaciones (colección heterozigota) o 20 generaciones (colección homozigota) Tª: 28ºC; pH: 3,5; Agitación: 500 rpm; D: 0,2 h-1 3 biological replicates for each of the above
Biotecnología
Resultados destacados
Control de calidad
Se revela la importancia de funciones no relacionadas hasta ahora con la tolerancia al estrés osmótico: Las células son muy dependientes del buen funcionamiento mitocondrial para tolerar el estrés por glucosa o del control de la gluconeogénesis y funciones del peroxisoma, en el caso del sorbitol.
Los resultados obtenidos son diferentes entre los experimentos con glucosa o sorbitol, aunque hay coincidencias, como el gen HOG1.
Biotecnología
Estrés por baja Tª 12ºC y 16ºC Estrés por SO2
Colección HOP
10 generaciones
www.icvv.es/winehiphop
Biotecnología
Evolución dirigida (estrategia complementaria)
Cultivo continuo en fase exponencial 600 generaciones CEN-pk113-7d Medio Sintético + Sorbitol (1.2 M) o Gluc 25% Tª 28ºC
Fermentaciones en Batch Medio Sintético con 35% Gluc
Biotecnología
Estudio fenotípico de clones evolucionados
Secuenciación de la cepa parental y 3 clones evolucionados
• Plataforma Illumina Solexa
• Alineamiento a S288C consensus genome
• Análisis de SNP
• Detección de pequeñas deleciones
• Cambios en el número de copias
• Reorganizaciones cromosómicas
Biotecnología
Análisis molecular de las interacciones entre cultivos iniciadores durante la vinificación. Proyecto INTERWINE 2015
Interacciones entre Saccharomyces cerevisiae y no-Saccharomyces Interacciones entre S. cerevisiae y cultivos iniciadores de la fermentación maloláctica, inoculación simultánea de S. cerevisiae y Oenococcus oeni
Pilares metodológicos: • Análisis transcriptómico • Uso de bioreactores para garantizar tanto unas condiciones
reproducibles de trabajo como un control de los parámetros • Métodos potentes para analizar los metabolitos de la fermentación.
Biotecnología
Producción de compuestos bioactivos derivados de aminoácidos aromáticos durante la fermentación alcohólica (BIOACTIYEAST)
AGL2013-47300-C3-2-R
Estudio de melatonina y otros compuestos indólicos relacionados con el metabolismo del triptófano
Biotecnología
Proyecto AGL2013-47300-C3-2-R
•S. cerevisiae (RED FRUIT) • S. cerevisiae (ES488) • S. cerevisiae (QA23) • T. delbrueckii • M. pulcherrima • S. cerevisiae (UVAFERM) • S. cerevisiae (ICV-GRE)
Proyecto AGL2013-47300-C3-2-R
Pulsos de compuestos indólicos • fermentación en cultivo continuo • 200 mL de SM con NH4Cl como única fuente de
nitrógeno • Pulsos de 6 compuestos indólicos a 0.5 mM. ( L-TRP,
5HTRP, SERO, NACSERO, MEL, 3-IAA y L-TRP EE). • Toma de muestra en diferentes momentos (0, 5 y 15
min) para extraer el contenido intracelular.
Biotecnología
EVALUACIÓN DEL POTENCIAL EFECTO SALUDABLE DE NUEVOS ALIMENTOS FUNCIONALES
EN LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE FACTORES DE RIESGO CARDIOVASCULAR
- Status antioxidante y estrés oxidativo - Metabolismo lipídico - Metabolismo glucídico - Función endotelial - Status de inflamación
VINO TINTO
Fermentación alcohólica
NUEVA BEBIDA DE NARANJA
Alcohol: 1 % v/v
Proyecto Motriz P09-AGR-4814
Profesora-Investigadora de Contacto: Soledad Fernández Pachón ([email protected])
Área Nutrición y Bromatología
Caracterización de nuevos alimentos
CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
- Compuestos fenólicos - Carotenoides - Melatonina
ESTUDIOS DE INTERVENCIÓN EN INDIVIDUOS SANOS / S.M. / HIPERCOLESTEROLEMIA
El consumo repetido de la bebida de naranja disminuye de forma significativa factores de riesgo cardiovascular.
El proceso de fermentación alcohólica mejora el perfil de compuestos bioactivos del zumo de naranja.
EVALUACIÓN DE BIODISPONIBILIDAD DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
- Compuestos fenólicos - Carotenoides - Melatonina
Profesora-Investigadora de Contacto: Soledad Fernández Pachón ([email protected])
COLABORACIONES ESTABLECIDAS
Instituto de la Grasa-CSIC. Sevilla. Dr. Dámaso Hornero.
Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura-CSIC. Murcia. (Dr.
Angel Gil)
Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS). Sevilla. (Dr. José Villar)
Universidad de Parma. Parma, Italia. (Dr. Daniele del Río)
Profesora-Investigadora de Contacto: Soledad Fernández Pachón ([email protected])
Caracterización de nuevos alimentos
Muchas gracias [email protected]